На правах рукописи

ШАБАЛИНА Ирина Алексеевна

МОДУЛЯЦИЯ СТРЕССОРНОЙ ВАЗОКОНСТРИКЦИИ ПРИ

СОЧЕТАННОЙ АКТИВАЦИИ µ- И -ОПИАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ

АГОНИСТАМИ С РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНЬЮ СТАБИЛЬНОСТИ

03.03.01 – физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учной степени кандидата биологических наук

Архангельск – 2012 2

Работа выполнена на кафедре медицинской биологии и генетики Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Северный государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Бебякова Наталья Александровна

Официальные оппоненты: Совершаева Светлана Леонидовна доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Северный государственный медицинский университет», заведующая кафедрой физиологии и восстановительной медицины Поскотинова Лилия Владимировна доктор биологических наук, доцент, заведующая лабораторией биоритмологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Уральского отделения Российской академии наук

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «15» мая 2012 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 212.008.04 при Северном (Арктическом) федеральном университете имени М.В. Ломоносова по адресу 163045, Архангельск, пр. Бадигина, д.3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Северного (Арктического) федерального университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «13» апреля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, Старцева Лариса Фдоровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В настоящее время показано, что опиоидергическая система играет важную роль в модуляции деятельности сердечно-сосудистой системы, в том числе в условиях стрессорных воздействий. При изучении влияния опиоидной системы на различные вегетативные функции используют синтетические аналоги эндогенных опиоидных пептидов. Даларгин – первый отечественный препарат, аналог эндогенного лей-энкефалина, неселективный агонист µ- и -опиатных рецепторов (ОР) (Н.В. Коробов, 1988). Экспериментальные и клинические исследования демонстрируют высокую кардиоваскулярную активность данного препарата (С.Г. Донич, 1991, Л.Н. Маслов, Ю.Б. Лишманов, 1993, Н.А. Бебякова, 1997, А.В. Хромова, 2002, Т.В. Ласукова и соавт., 2004, Т.М. Командресова, С.Н. Курицын, 2006, Ю.Б. Лишманов и соавт., 2007, Л.Н. Маслов и соавт., 2008). Вместе с тем, значимые количества даларгина не удатся зафиксировать радиоимунным методом уже через 2-3 минуты после его введения в кровь, что обусловлено не только рецепторным захватом, но и ферментативным гидролизом пептида (Е.И Каленикова и соавт., 1988).

Определнные замены в структуре молекул пептидов позволяют создавать аналоги, более защищнные от действия пептидаз. С целью защиты молекулы даларгина от деградации ферментами был создан ряд его стабилизированных аналогов (Б.Л. Пекелис, 1981). Учитывая, что даларгин обладает высокой кардиоваскулярной активностью, снижает общее периферическое сопротивление и тонус сосудов (Л.Н. Маслов и соавт., 2003, Т.М. Командресова, 2006, С.Н. Курицын, 2007), важно оценить влияние стабилизации молекулы на вазоактивный эффект пептида.

Даларгин считается препаратом периферического действия, реализующим свои эффекты через активацию периферических µ- и -ОР, поскольку его проникновение через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) затруднено (М.И. Титов, 1985). Вместе с тем, даларгин вс же способен преодолевать ГЭБ при введении его в дозах от 500 – 1000 мкг/кг и выше (В.М. Полонский и соавт., 1980), а значит активировать и центральные опиатные рецепторы. Кроме того, исследования демонстрируют, что активация периферических ОР носит дозозависимый характер (М.Б. Самаренко и соавт., 1983, S.Y. Hugghins et al., 2000, Z.C. Chen et al., 2011). Поэтому необходимо изучить влияние даларгина и его стабилизированных аналогов на тонус сосудистой стенки в дозах, способных активировать как периферические, так и центральные ОР.

Наличие ОР как в высших вегетативных центрах головного мозга, регулирующих состояние сердечно-сосудистой системы (J. A. Kiritsy-Roy et al., 1986, Hassen A.H et al., 1987), так и на периферии в симпатических окончаниях, иннервирующих артерии (P.Illes et al., 1987) свидетельствует о том, что опиоидная система играет важную роль в регуляции деятельности сердечнососудистой системы. Вместе с тем, ОР обнаружены и на эндотелии сосудов (G.B. Stefano et al., 1998), который синтезирует и выделяет ряд вазоактивных факторов, обеспечивающих сокращение или расслабление гладких мышц сосудистой стенки. Результаты исследования Hugghins S.Y. еt al (2000) демонстрируют наличие эндотелийзависимых механизмов расслабления сосудистой стенки на фоне активации ОР. Экспериментально показано, что активация периферических ОР даларгином сопровождалась изменением содержания вазоактивных эндотелиальных факторов (Т.М. Командресова, 2006, С.Н. Курицын, 2007). Таким образом, гипотензивный эффект данного пептида может быть опосредован эндотелиальными механизмами. Исходя из этого, изучение эндотелиопротективного действия стабилизированных аналогов даларгина актуально как с теоретической, так и с практической точки зрения.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования было выявление механизмов участия неселективного агониста µ- и -опиатных рецепторов даларгина и его стабилизированных аналогов в модуляции стрессорной вазоконстрикции.

В рамках поставленной цели решались следующие задачи:

1. Установить влияние неселективной активации периферических µ- и опиатных рецепторов даларгином и его стабилизированными аналогами на стрессобусловленные изменения сосудистого тонуса в дозах, в которых пептиды активируют периферические опиатные рецепторы (10, 100 мкг/кг).

2. Выявить участие центральных опиатных рецепторов в модуляции стрессорной вазоконстрикции при сочетанной активации µ- и -опиатных рецепторов даларгином и его стабилизированными аналогами в дозе, в которой они проникают через гематоэнцефалический барьер (1000 мкг/кг).

3. Выявить участие вазоактивных эндотелиальных факторов (эндотелина-1 и оксида азота) в регуляции периферического сосудистого тонуса на фоне острого стресса при сочетанной активации µ- и -опиатных рецепторов агонистами с различной степенью стабильности.

Положения, выносимые на защиту.

1. Активация периферических µ- и -опиатных рецепторов даларгином и его стабилизированными аналогами (доза 10 мкг/кг) оказывала разнонаправленный эффект на периферический тонус сосудов в условиях стресса: даларгин, аналог 2 и аналог 3 ограничивали стрессобусловленные изменения тонуса сосудов, в то время как аналог 1 усиливал стрессорную вазоконстрикцию. Введение даларгина и его аналогов в дозе 100 мкг/кг сопровождалось ограничением стрессобусловленного роста сосудистого тонуса, при этом наиболее выраженный эффект в этой дозе оказывали даларгин и аналог 3.

2. Введение даларгина и его аналогов в дозе 1000 мкг/кг, в которой пептиды способны активировать центральные опиатные рецепторы, приводило к усилению стрессобусловленной вазоконстрикции.

3. Антиконстрикторный эффект даларгина в условиях острого стресса связан с увеличением уровня стабильных метаболитов оксида азота. Усиление стрессорной вазоконстрикции на фоне активации µ- и -опиатных рецепторов даларгином и его аналогами сопровождалось увеличением уровня эндотелина – 1 и снижением содержания стабильных метаболитов оксида азота, в то время как на фоне введения аналогов даларгина подобных изменений не наблюдалось.

Научная новизна исследования. Впервые выявлено дозозависимое действие даларгина и его аналогов на тонус сосудистой стенки в условиях острого стресса. При этом установлено, что введение даларгина и его аналогов в дозах 10 и 100 мкг/кг, сопровождалось снижением стрессобусловленного тонуса сосудов, за исключением этиламида даларгина (аналог 1), который в дозе 10 мкг/кг не оказывал протективного эффекта на стрессобусловленную вазоконстрикцию. Введение даларгина и его аналогов в дозе 1000 мкг/кг, наоборот, сопровождалось провокационным эффектом на стрессобусловленные изменения тонуса периферических сосудов.

Установлено участие оксида азота в антиконстриктороном эффекте активации µ- и -ОР аналогом 1 и аналогом 3 даларгина в условиях острого стресса.

Показано, что усиление стрессорной вазоконстрикции в условиях введения высокой дозы даларгина (1000 мкг/кг) сопровождалось увеличением концентрации эндотелина-1 и снижением содержания стабильных метаболитов оксида азота.

Научно-практическая значимость исследования. Результаты исследования вносят определнный вклад в развитие теоретических представлений о механизмах опиоидергической модуляции тонуса сосудистой стенки, а так же служат предпосылкой для дальнейшего изучения и разработки новых средств, модулирующих состояние сердца и сосудов. Полученные экспериментальные данные позволяют предложить для дальнейшего изучения в качестве потенциальных средств коррекции стрессобусловленной вазоконстрикции даларгин и его N-метилированный аналог.

Материалы диссертационного исследования используются в преподавании курса физиологии в программе обучения студентов Института естественных наук и биомедицины на кафедре физиологии человека и животных (акт внедрения от 03.11.2011) Северного (Арктического) федерального университета, на кафедрах нормальной физиологии и патологической физиологии Коми филиала Кировской государственной медицинской академии (акт внедрения от 01.12.2011).

Диссертационное исследование выполнено в ГБОУ ВПО «Северный государственный медицинский университет (г. Архангельск) Министерства здравоохранения и социального развития РФ» при поддержке гранта РФФИ и администрации Архангельской области «Опиоидергическая модуляция стрессорной вазоконстрикции при сочетанной активации µ- и -опиатных рецепторов агонистами с различной степенью стабильности», проект № 08-04-98817 (2008–2010 гг).

Апробация результатов исследования. Основные результаты исследования были представлены и обсуждены на XVII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учных ЛомоносовМосква, 2010), XXI Съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (г. Калуга, 2010), IV Международной школе молодых учных по молекулярной генетике «Геномика и биология клетки» (Звенигород, 2010), IV Архангельской международной междисциплинарной конференции молодых учных и студентов (г. Архангельск, 2010), Седьмом международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии»

(г. Судак, 2011).

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора научной литературы, раздела, посвящнного материалам и методам исследования, глав, содержащих результаты собственных исследований и их обсуждение, заключения и выводов. Работа содержит 11 таблиц и 22 рисунка, библиографический указатель содержит 213 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальное исследование было проведено на половозрелых бодрствующих самцах крыс популяции Wistar массой 200-250 г., характеризующихся вазоконстрикторными реакциями на острый стресс (А.В. Хромова, 2002, Т.В. Командресова, 2006). Экспериментальные животные содержались в условиях вивария СГМУ по 7–8 особей в клетке при свободном доступе к воде и пище при 9–10-часовом световом режиме. Масса крыс соответствовала весовым показателям возрастных норм. Всего в эксперименте было использовано 210 особей, которые составили 14 экспериментальных групп (фон, стресс-контроль и 12 опытных групп) по 15 животных в каждой группе. Протокол исследования одобрен Комитетом по этике при СГМУ (протокол № 04/08 от 24.03.2008 г.).

В данной работе в качестве модели острого стресса использовали иммобилизацию животных в течение 1 часа в прозрачных пластиковых пеналах. Такое воздействие сопровождается выраженными изменениями параметров гемодинамики (К.В. Судаков и соавт., 1981,1988).

Измерение тонуса сосудистой стенки производили методом тетраполярной реографии с использованием многофункционального диагностического комплекса «Диастом-01» (ГОСТ 15.013-94) (Н.А. Бебякова и соавт., 2002) в течение часа с интервалом в 15 мин. Функциональное состояние периферических сосудов оценивали с использованием количественных показателей: индекс периферического сопротивления (ИПС), индекс эластичности (ИЭ).

В качестве агонистов ОР применяли отечественный препарат даларгин – синтетический аналог лей-энкефалина, неселективный агонист µ- и -ОР (утверждн Фармакологическим комитетом 03.03.92 в качестве средства для лечения язвенной болезни) и ряд его структурных аналогов: H-Tyr-D-Ala-GlyPhe-Leu-Arg-NHEt (аналог 1), модификация которого проведена за счт этиламидирования С-концевого карбоксила; H-Tyr-D-Ala-Gly-МеPhe-Leu-ArgNHEt (аналог 2), модификация которого заключалась в этиламидировании Сконцевого карбоксила и N-метилировании фенилаланинового остатка; H-Tyr-DAla-Gly-МеPhe-Leu-Arg-OH (аналог 3), модифицированный за счт Nметилирования фенилаланинового остатка (Б.Л. Пекелис, 1981). Синтетические аналоги произведены и предоставлены лабораторией синтеза пептидов Российского Кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ (рук. к.х.н. Беспалова Ж.Д.). Опытным группам животных пептиды вводили в объме 0,9 мл. раствора Рингера внутрибрюшинно за 5 мин. до начала эксперимента в дозах, в которых пептиды не проникают через ГЭБ (10 и мкг/кг) и проникают через ГЭБ (500-1000 мкг/кг) (М.И. Титов и соавт., 1985, Ю.Б. Лишманов и соавт., 2002). Контрольной группе вводили 0,9 мл. раствора Рингера внутрибрюшинно.

Концентрацию вазоактивных эндотелиальных факторов и кортикостерона определяли в плазме крови, стабилизированной ЭДТА. Уровень NO оценивали по его стабильным метаболитам (нитритам и нитратам) в реакции Грисса с использованием набора R&D Systems и молекулярных фильтров Amicon Ultra 0.5ML 10K (Millipore). Концентрацию ЭТ-1 и кортикостерона определяли иммуноферментным методом с использованием наборов фирм Biomedica и Assay Desings.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы SPSS 18.0. Для проверки типа распределения собранных количественных данных применяли критерий Шапиро-Уилка. Оценку статистических различий внутри групп проводили с использованием критерия Фридмана, с последующими апостериорными сравнениями с применением критерия Вилкоксона. Оценку статистических различий между группами проводили с использованием критерия Краскела-Уоллиса, с последующими попарными сравнениями с применением критерия Вилкоксона.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

У животных контрольной серии (стресс на фоне введения раствора Рингера) наблюдались вазоконстрикторные реакции, что выражалось в изменении показателей тонуса сосудов: ИПС увеличивался на 82,8% (р=0,001), а ИЭ снижался на 48,7% (р=0,001) по сравнению с 5-й мин. стрессирования.

Иммобилизация сопровождалась увеличением уровня кортикостерона в контрольной группе животных по сравнению с интактными особями на 129,9% (р=0,002), а также некоторым изменением баланса вазоактивных эндотелиальных факторов в сторону констрикторных влияний (табл.).

Для установления участия даларгина и его стабилизированных аналогов в модуляции изменений периферического сосудистого тонуса в условиях острого стресса пептиды вводили в дозах 10, 100, 1000 мкг/кг. Для выявления эндотелиальных механизмов коррекции стрессобусловленного тонуса сосудов на фоне активации ОР даларгином и его стабилизированными аналогами в плазме крови животных всех экспериментальных групп определяли концентрацию эндотелина-1 (ЭТ-1) и уровень стабильных метаболитов (нитритов/нитратов), который отражает продукцию оксида азота (NO) в организме.

Активация периферических ОР даларгином и его стабилизированными аналогами в дозе 10 мкг/кг вызывала разнонаправленные эффекты на тонус сосудов в условиях стресса. Протективный эффект на стрессорную вазоконстрикцию в данной дозе оказывал даларгин, N-метилированный этиламид даларгина (аналог 2) и N-метилированный аналог даларгина (аналог 3) (рис. 1в, 1с). Протективный эффект даларгина и аналога 2 наблюдался с 15-й мин. стрессирования и сохранялся к концу эксперимента: ИПС к 60-й мин. был ниже на 13,5% (р=0,003) на фоне введения даларгина и на 7,7% (р=0,001) на фоне введения его аналога по сравнению со стресс-контролем (рис. 1в). ИЭ к концу стрессирования остался выше на 51,9% (р=0,001) и 26,6% (р=0,001) на фоне введения даларгина и его аналога 2 соответственно в сравнении с контрольными значениями показателя.

Рис. 1. Изменение ИПС на фоне введения даларгина и его стабилизированных аналогов в дозе 10 мкг/кг.

Примечание: * - статистически значимые различия по сравнению со стрессом: * - р0,05, ** - р0,01, *** - р0, В то время как ведение аналога 3 в данной дозе уже с 5-й мин.

сопровождалось снижением ИПС на 17,8% (р=0,005), а к 60-й мин. разница с