На правах рукописи

АРДАТСКАЯ МАРИЯ ДМИТРИЕВНА

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ КОРОТКОЦЕПОЧЕЧНЫХ ЖИРНЫХ

КИСЛОТ ПРИ ПАТОЛОГИИ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА.

14.00.05 – внутренние болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва 2003

Работа выполнена на кафедре гастроэнтерологии Учебно-научного центра Медицинского центра Управления делами Президента Российской Федерации

Научный консультант:

Доктор медицинских наук, профессор Минушкин Олег Николаевич

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Чорбинская Светлана Алексеевна Доктор медицинских наук, профессор Белоусова Елена Александровна Доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ Максимов Валерий Алексеевич

Ведущая организация:

Центральный Научно-исследовательский Институт Гастроэнтерологии

Защита диссертации состоится 15 декабря 2003 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 121.001.01 в Учебно-научном центре Медицинского центра Управления делами Президента РФ.

Адрес: 103875, Москва, ул. Воздвиженка,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Медицинского центра Управления делами Президента РФ (г. Москва, ул. Маршала Тимошенко, д. 21).

Автореферат разослан «------.» ноября 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Доктор медицинских наук Н.К.Розова

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

СРК – синдром раздраженного кишечника (СРК-З – СРК с преобладанием запора; СРК-Д – СРК с преобладанием диареи) НЯК - неспецифический язвенный колит ТК - толстая кишка ХГ – хронический гепатит (ХГ СА – ХГ слабой активности; ХГ УА – ХГ умеренно выраженной активности) ЦП – хронический гепатит в стадии цирроза печени ПЭ – печеночная энцефалопатия СБП – спонтанный бактериальный перитонит ЖКБ – желчнокаменная болезнь ХП – хронический панкреатит, ВСН ПЖ– внешнесекреторная недостаточность поджелудочной железы ЗЛ – заболевания легких;

ХНЗЛ – хронические неспецифические заболевания легких, ОЗЛ – острые заболевания легких ЦА – церебральный атеросклероз ДЭ – дисциркуляторная энцефалопатия СОТК - слизистая оболочка толстой кишки ГЖХ - газо-жидкостная хроматография КЖК – короткоцепочечные жирные кислоты АИ – анаэробный индекс, С2 – уксусная кислота, С3 – пропионовая кислота, IС4 – изомасляная кислота, С4 – масляная кислота, IС5 – изовалериановая кислота, C5 – валериановая кислота, IC6 – изокапроновая кислота, C6 – капроновая кислота 5-АСК – 5-аминосалициловая кислота БТ – базисная терапия Г – гепатосан Д – дюфалак Э – Энтеросан Эл – Энтерол ГК – глюкокортикоидные гормоны, М - метронидазол АБТ- антибактериальная терапия Актуальность темы определяется не только большой распространенностью и социальной значимостью патологии желудочно-кишечного тракта, но и различными издержками диагностических методов. К ним можно отнести: трудоемкость и высокую стоимость исследований, отсроченность ряда диагностических процедур в связи с тяжестью имеющейся патологии из-за их инвазивности и сложности; получаемые «ложноположительные» «ложноотрицательные»

неподдающиеся трактовке и т.п. (Шерлок Ш. 1999, Ивашкин В.Т. 2001, Белоусова Е.А. и др.). Этот далеко не полный перечень имеющихся недостатков определяет невозможность использования этих методов для установления тяжести патологических нарушений и оценке правильности проводимого лечения в необходимое для врача и пациента время.

Функциональные заболевания ЖКТ являются диагнозом «исключения» органической патологии, что делает его правомочным только после проведения всех имеющихся в арсенале врача диагностических процедур (Златкина А.Р., 1999, Минушкин О.Н. 2000, Шептулин А.А. 2001.).

Разнообразие фармакологических средств, относимых к одной группе, имеют различные точки приложения. Подбор препаратов и их дозы для лечения патологии ЖКТ осуществляется в течение длительного времени, что усложняет объективное и экономическое состояние пациентов.

Анализ исследований последних лет (Roediger W.E.W 1994, Cummings J.H. 1997, Ивашкин А.Т. 2001, Белоусова Е.А. 2001, Минушкин О.Н 2002) свидетельствует о существовании «белых пятен» в развитии ряда заболеваний ЖКТ, гепатобилиарной системы и их осложнений. В этой связи часто упоминают индигенную микрофлору макроорганизма (Бабин В.Н., Дубинин А.В. 1994, Шендеров Б.А.1999). Необходимо отметить, что исторические этапы изучения микрофлоры базировались на микробиологическом подходе с использованием экспериментальных данных (Гамалеи Н.Ф., Перетц Л.Г., Шендеров Б.А.

1960 –1998гг). Это положительно сказалось на познании функций и роли микрофлоры, но микробиологический термин «дисбактериоз» в полном его понимании остался на том же уровне, на каком был внедрен в клинику в конце 60-х годов прошлого века. На настоящий момент это приводит к недооценке основной патологии, переоценке синдрома «дисбактериоза» и полипрагмазии.

Выявленный в последние годы фундаментальный факт обмена низкомолекулярными метаболитами индигенной микрофлоры и макроорганизмом послужил основой для создания принципиально новых методов оценки состояния микробиоценоза (Roediger W.E.W 1987, 1994, Cummings J.H. 1997, Тамм А.О. 1993) и участия ее метаболитов в обеспечении локальных и системных функций макроорганизма (Шендеров Б.А., 1998, Бабин В.Н.и соавт.

1998). В экспериментах установлено, что к метаболитам, ответственным за энергообеспечение эпителия, поставке субстратов липо- и глюконеогенеза, поддержание ионного обмена, активации местного иммунитета, регуляции и дифференцировке эпителия и др., относят короткоцепочечные монокарбоновые кислоты и их соли, продуцируемые анаэробными микрорганизмами в результате сахаро- и протеолизиса (Roediger W.E.W 1994, Cummings J.H. 1997).

Для изучения метаболитов микрофлоры в последние годы используются хроматографические методы: газожидкостная, ионная, высокоэффективная жидкостная хроматография, газохромато-массспектрометрия (Бабин В.Н., Ляховецкий Ю.И. 1996, Иванов А.Н. 1997, Осипов Г.А., Парфенов А.И. 1999). Однако, первый метод исследования обладает трудоемкой пробоподготовкой с потерей 20% общего пула КЖК, неудовлетворительным разделением изомеров кислот (Бабин В.Н., Ляховецкий Ю.И. 1996 и др); другие - использованием дорогостоящих приборов и длительностью исследования (Осипов Г.А. 1995, Иванов А.Н. 1997).

Все вышеизложенное послужило основанием для формулирования цели и задач исследования.

Цель работы: определить место и значение исследования КЖК в различных биосубстратах методом ГЖХ-анализа при патологии ЖКТ.

Задачи исследования:

1.Модифицировать и внедрить метод определения КЖК в различных биологических субстратах с использованием газожидкостной хроматографии (ГЖХ) для скриннингового обследования больных с заболеваниями ЖКТ.

2.Изучить содержание КЖК методом ГЖХ-анализа в норме иу больных с патологией ЖКТ.

3. Оценить диагностическое значение изучения КЖК при патологии ЖКТ.

4. Оценить возможность использования КЖК в оценке эффективности лечения больных с патологией ЖКТ.

5. Изучить чувствительность и специфичность исследования КЖК при патологии ЖКТ и традиционного бактериологического исследования кала в диагностике нарушений микробиоценоза кишечника.

6. Оценить перспективу использования и развития метода изучения КЖК при патологии ЖКТ.

Научная новизна. Разработан метод определения КЖК в различных биосубстратах с использованием газожидкостной хроматографии, отличающийся высокой точностью, чувствительностью, дешевой себестоимостью, быстротой получения ответа, высокой воспроизводимостью результатов, что позволило отнести его к скрининговым методам. На основании полученных данных исследования КЖК в различных биологических субстратах впервые сформулирован новый методический подход, включающий диагностический и лечебные аспекты. Впервые продемонстрирована возможность использования КЖК в качестве диагностических маркеров, в ряде случаев заменяющих инвазивные методы исследования органов ЖКТ, обладающих более высокой специфичностью и чувствительностью по сравнению с традиционными методами исследования при сокращении времени получения результата и снижении стоимости исследования. Впервые создана база данных содержания и спектра КЖК в различных биосубстратах и их динамика при патологии ЖКТ на фоне лечения препаратами различных фармгрупп, что дает возможность оценивать эффективность проводимого лечения, позволяет индивидуализировать подбор лекарственных средств и своевременно изменять тактику терапии.

По результатам работы предложен новый подход в понимании микробиоценоза человека и доказано, что он соответствует требованиям функциональных систем и главному из них саморегуляции.

Практическая значимость работы. Разработка и внедрение нового методического подхода на основе определения КЖК методом ГЖХ-анализа в практику комплексного обследования пациентов с заболеваниями ЖКТ позволяет ускорить и удешевить диагностику ряда заболеваний кишечника, гепатобилиарной системы и поджелудочной железы. На основе созданной базы данных содержания и спектра КЖК в различных биосубстратах, разработана адекватная система прогнозирования и мониторирования клинического течения, степени тяжести, стадии патологического процесса и развития осложнений патологии ЖКТ. Сформулированы адекватные подходы к лечению пациентов с заболеваниями кишечника и гепатобилиарной системы с учетом индивидуальных показаний, включающие своевременную оценку эффективности терапии, подбор эффективной дозы препаратов, проведение комбинированного лечения для достижения максимальной эффективности терапии и предотвращение резистентности. В результате работы разработаны критерии индивидуального подбора фармсредств для лечения патологии кишечника и печени. Новый подход в понимании дисбиотических сдвигов позволяет уменьшить ошибки в диагностике и лечении патологии органов ЖКТ.

Внедрение результатов работы в практику. Материалы диссертации используются в учебных программах на кафедре гастронтерологии УНЦ МЦ УДПРФ при чтении лекций в рамках циклов усовершенствования врачей.

Результаты работы внедрены в практику лечебных учреждений Медицинского Центра Управления делами Президента РФ, 51 Городской клинической больницы, кафедры хирургии 1ММА им. И.М.Сеченова, Центрального Военного госпиталя им. Бурденко Н.Н.

МО РФ.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Разработан и внедрен в практику способ определения КЖК фракции С2-С6 в различных биологических субстратах методом ГЖХ-анализа, дающий возможность работать с жидкими средами и малыми объемами биологических субстратов (в т.ч.

содержащих низкую концентрацию КЖК), обеспечивающий минимальные потери КЖК при пробоподготовке, полное выделения КЖК из субстрата, высокую степень разделения кислот на фракции и получение результата за 8-10 минут. Скорость получения ответа относит данный метод к скрининговым 2.Качественный состав КЖК в различных биологических субстратах коррелирует с результатами клинических и лабораторно-инструментальных показателей у больных с патологией ЖКТ. Исследование КЖК обладает высокой чувствительностью и специфичностью и может быть использовано в качестве:

уточняющего теста наличия патологии, в частности СРК;

«промежуточного» неинвазивного теста за слежением распространенности и активности воспалительного процесса в толстой кишке - при НЯК.

теста, оценивающего дезинтоксикационную функцию печени - при ХГ и ЦП маркеров интенсивности портосистемного шунтирования и портальной диагностического теста наличия и стадии печеночной энцефалопатии теста оценки состояния энтерогепатической циркуляции желчных кислот теста, определяющего наличие внешнесекреторной недостаточности ПЖ у 3.Качественный состав КЖК при заболеваниях кишечника и печени достоверно изменяется в процессе лечения и соответствует клинической динамике; может использоваться в качестве скринингового теста оценки эффективности проводимой терапии, ее коррекции и индивидуальном подборе терапии у больных данных групп.

4. Перспектива использования метода лежит в расширении спектра нозологических форм, их осложнений и лечения с использованием препаратов различных фармгрупп, и не ограничивается гастроэнтерологией, а может быть использован при изучении различных бактериальных пулов в пульмонологической, отоларингологической, стоматологической, урологической, гинекологической и др. дисциплинах.

5. Изучение КЖК при патологии ЖКТ обладает более высокой чувствительностью и специфичностью по сравнению с традиционным бактериологическим исследованием кала, позволяет рассмотреть состояние микробиоценоза на молекулярно-биохимическом уровне и приводит к выводу, что микробное сообщество является саморегулирующейся, самовосстанавливающейся функциональной системой.

Материалы диссертации доложены и представлены на Международном симпозиуме FALK, Санкт-Петербург, 1996, 4-8 Российских гастроэнтерологических неделях, Москва, 1998-2002, 2-ом Съезде научного общества гастроэнтерологов России, Москва, 1999, VI-IX Российском национальном конгрессе Человек и лекарство, Москва, 1999-2002, на международном симпозиуме Falk по заболеваниям печени, Basel 1999, 3-ем международном конгресса «Парентеральное и энтеральное питание», Москва, 1999, Российских Симпозиумах «Воспалительные и функциональные заболевания толстой кишки» (Левитановские чтения), Москва 1998-2003, на научных сессиях Центрального НИИ Гастроэнтерологии, Москва, 1999-2003, на международном Falk Workshop по ВЗК, Любляны, 2001, на 4--7ой конференции «Гепатология сегодня», 2000, 2003, на 27-31-ой конференциях межрегиональной ассоциации гастроэнтерологов Смоленск (1999-2003) и др..

По материалам диссертации сделано 45 докладов.

Апробация диссертации состоялась 10 июня 2003 года на научно-практической конференции кафедр гастроэнтерологии, эндоскопии, кардиологии, семейной медицины Учебно-научного Центра МЦ УД Президента РФ с участием сотрудников кафедры хирургии и пропедевтики внутренних болезней ММА им. И.М. Сеченова, кафедры гастроэнтерологии Государственного института усовершенствования врачей МО РФ, врачей 51 ГКБ.

Публикации. По теме диссертации опубликована 41 научная работа.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит их введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы и приложений. Материалы диссертации изложены на страницах, представлены в таблицах, иллюстрированы рисунками (хроматограммами), клиническими демонстрациями и примерами.

Указатель литературы содержит 168 отечественных и 234 зарубежных источников.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Для решения поставленных задач было обследовано 467 больных, проходивших обследование и лечение на базе 51 ГКБ г. Москвы. Контрольную группу составили практически здоровых лиц. Распределение больных по нозологии, полу, возрасту и продолжительности заболевания представлено в таблице 1.

Диагноз у обследованных больных был верифицирован на основании результатов комплексного клинического и лабораторно-инструментального обследования с применением современных диагностических методов (биохимических, вирусологических, рентгенологических, ультрасонографических, эндоскопических, морфологических, микробиологических и др.) Патология кишечника была представлена синдромом раздраженного кишечника (СРК) (больные были отобраны согласно Римским критериям II 1999г), протекающим с различным Таблица 1. Общая характеристика групп больных.

(ОЗЛ,ХНЗЛ**) типом нарушения стула – СРК с преобладанием диареи (индекс Д) – 65 человек и СРК с преобладанием запора (индекс З) – 35 человек, и неспецифическим язвенным колитом – человек. Диагноз НЯК был верифицирован эндоскопически и морфологически. По характеру течения больные НЯК распределились следующим образом: у 78 (92%)– рецидивирующего течения и у 7 (8%)– непрерывного течения; по распространенности воспалительного процесса: у 35 чел (41%)-дистальное поражение, у 30 (35%)– левостороннее и у 20 (24%)– тотальное; Эндоскопическая активность была определена как минимальная у 27 человек (32%), умеренная – у 48 (56%), резко выраженная – у 10 больных (12%). Согласно степени тяжести легкое течение диагностировано у 38 больных (45%), среднетяжелое– 43 (51%), тяжелое у 4 больных (4%).

Больные с патологией кишечника были обследованы на фоне лечения. В зависимости от варианта терапии больные СРК были разделены на 3 группы: 1 группа – 35 человек СРКД на фоне лечения препаратом «Энтеросан», 2 группа – 30 человек СРК-Д на фоне лечения препаратом «Энтерол», 3 группа – 35 человек СРК-З на фоне лечения препаратом «Перистил». Оценка эффективности терапии проводилась по динамике клинических симптомов и данных лабораторно-инструментальных методов обследования.

Проводимое лечение 75 больных НЯК включало монотерапию препаратами 5-АСК («Пентаса», «Салофальк», «Мезакол») в среднетерапевтической дозе 3,0г в течение 28- дней до достижения клинической и эндоскопической ремиссии или наступление ремиссии по одному из показателей или стихание процесса по другому (45 человек (60%)). В случае неэффективности монотерапии (с учетом использования максимальных терапевтических доз 5-АСК), отмеченной у 30 пациентов (40%) проводилось комбинированное лечение препаратами 5-АСК и гидрокортизоном (12 больных), 5-АСК и «Энтеросаном» (11 человек), 5-АСК и метронидазолом (7 человек).

Патологию печени имели 143 пациента. Хронический гепатит вирусной (В,С, В+С, алкогольной и смешанной этиологии), различной активности диагностирован у пациентов. По этиологическому фактору ХГ больные распределились следующим образом:

вирусный гепатит установлен у 30 человек: (вирус В – 10 чел, С- 16, В+С- 4); алкогольный1 чел, токсический - 2, аутоиммунный 2 типа - 1, криптогенный – 6 человек. По активности процесса: ХГ слабой активности выявлен у 28 пациентов, умеренной активности – у пациентов. Хроническими гепатитом в стадии цирроза печени страдали 85 пациентов По этиологическому фактору больные распределились следующим образом –вирусный ЦП установлен у 20 человек: (вирус В - 6 человек, С – 8, В+С – 5); алкогольный1 - 47 человек, токсический-2 человека, аутоиммунный-1 чел, криптогенный – 6 чел. По тяжести процесса ЦП класса В (по Чайльд Пью) выявлен у 40 больных, класс С – 45 больных.

Стадия ПЭ устанавливалась по совокупности клинических, психоневрологических проявлений и результатов психометрического тестирования с использованием теста связи чисел. По стадиям ПЭ больные распределились следующим образом: исходно 1 стадия выявлена у 7 (8,6%) больных, 2 стадия – у 52 (61,4%), 3 стадия – у 26 больных (30%).

В программу лечения больных с ХГ входило применение гепатопротективных средств (ГП)2, дезинтоксикационных мероприятий. Специфической противовирусной терапии больным этой группы не проводилось.

В зависимости от варианта терапии больные с хроническим гепатитом в стадии цирроза печени были разделены на 3 группы: 1 группа – 35 человек на фоне применения гепатопротективных средств (ГП) и базисной терапии (БТ), включающей мероприятия, направленные на коррекцию электролитных нарушений, нормализацию водного баланса, коррекцию портальной гипертензии, 2 группа – 20 человек на фоне применения гепатопротектора «Гепатосан», содержащего лиофилизированные гепатоциты свиньи, и БТ, 3 группа – 30 человек на фоне применения гепатопротекторов (ГП), проведения БТ и включением в схему синтетического дисахарида лактулозы «Дюфалак» (Солвей Фарма).

Эффективность терапии оценивалась на основании динамики клинического симптомокомплекса, результатов лабораторно-инструментальных методов исследования Алкогольная этиология устанавливалась по полиорганности поражения и оценке клинико-лабораторных признаков с помощью дискриминантного анализа, предложенного Жарковым О.Б., 1989.

ГП-«Силимарин» (Вилар), «Легалон» (Madaus), «Хофитол» («Фик Медикаль») (биохимического исследования, УЗИ, ЭГДС и др). Пациентам ЦП с ПЭ проводилось психометрическое тестирование в динамике.

У 15 пациентов ЦП с резистентным асцитом проведено микробиологическое исследование асцитической жидкости (забор асцитической жидкости осуществлялся при парацентезе или в результате пункции брюшной полости под контролем УЗИ). У пациентов при бактериологическом исследовании асцитической жидкости выявлен рост E.

Coli, аэробных стафилококков, стрептококков (6 чел), анаэробных бактерий рода Bacteroides и рода Clostridium (5 человек); у 4 пациентов– роста микрофлоры выявлено не было.

Для определения диагностических маркеров портосистемной энцефалопатии обследована группа (группа сравнения*) пациентов церебральным атеросклерозом с синдромом ДЭ, состоящая из 30 больных. Дисциркуляторный характер энцефалопатии подтверждался анамнестическими, клиническими и инструментальными данными, а также при помощи подсчета суммы баллов по ишемической шкале Хачинского. Всем пациентам проводилось психометрическое тестирование с использованием теста связи чисел.

Группу больных желчнокаменной болезнью составили 35 пациентов. Для оценки влияния нарушения моторно-эвакуаторной функции кишечника на изменение энтерогепатической циркуляции желчных кислот (ЭГЦЖК) и процесс камнеобразования проводилось исследование времени транзита карболена по пищеварительному тракту: у человек (71,4%) выявлено замедление времени транзита (52,4±3,1 час), у 4 (11,5%) и (17,1%) человек соответственно– ускорение времени транзита или норма (13,5±2,1 и 22,6±2,2 час).

Хроническим панкреатитом страдали 40 пациентов. По этиологическому фактору пациенты ХП распределились следующим образом- хронический панкреатит алкогольной этиологии был выявлен у 26 (64%) пациентов, билиарнозависимый - у 14 пациентов (36%).

Для верификации внешнесекреторной недостаточности ПЖ у больных ХП проводилось исследование эластазы 1 в кале. Отсутствие внешнесекреторной недостаточности ПЖ выявлено у 18 больных (45%), умеренно-легкая (УЛ) недостаточность выявлена у 5 больных ХП (12,5%), тяжелая (Т) степень – у 17 больных (42,5%). УЗИпризнаки обострения ХП были выявлены в 100% случаев.

Для оценки влияния антибактериальной терапии на микробиоценоз кишечника была обследована группа больных с заболеваниями легких (34 пациента).

По основному заболеванию больные распределились следующим образом: острыми заболеваниями легких (острые очаговые пневмонии) страдали 22 человека; хроническими заболеваниями легких в стадии обострения – 12 человек (хронический бронхит – 5 человек, инфекционно-аллергическая бронхиальная астма – 7 человек).

В программу лечения больных с заболеваниями легких входило назначение антибактериальных средств (перентерального и перорального путей введения) широкого ( человек) и избирательного (20 человек) спектра действия. Влияние АБТ на состояние микрофлоры кишечника оценивалось динамикой симптомов кишечной диспепсии и результатов бактериологического исследования кала.

Всем больным с патологией кишечника, печени и заболеваниями легких для оценки влияния основной патологии и направленного на нее терапевтического воздействия на состояние кишечной микрофлоры, и больным ЖКБ для оценки влияния изменения кишечного микробиоценоза на нарушение ЭГЦЖК, а также для установления специфичности и чувствительности метода проводилось бактериологическое исследование кала, при котором в 100% случаев исходно был выявлен дисбактериоз кишечника 1- степени тяжести (по классификации Эпштейн-Литвак Р.В., Вильшанской Ф.Л., 1977).

Исходно изменения определялись в главной, сопутствующей и остаточной микрофлоре.

Специфических изменений в составе микрофлоры для каждой из данных патологий выявлено не было.

Методики определения короткоцепочечных жирных кислот (С2-С6) в различных биологических субстратах с использованием ГЖХ- анализа.

Разработанные нами способы определения КЖК (С2-С6 с изомерами) в биосубстратах складываются из двух этапов: процесса пробоподготовки и непосредственно газожидкостного хроматографического анализа (ГЖХ). В качестве эталонов в работе были использованы коммерческие наборы уксусной, пропионовой, масляной, изо-масляной, валериановой, изо- валериановой, капроновой, изо-капроновой кислот.

В первом случае, анализ образца методом ГЖХ проводится на хроматографе с детектором ионизации в пламени, используя кварцевую капиллярную колонку длинной м., внутренним диаметром 0,25 мм., с неподвижной фазой типа FFAP (сополимер полиэтиленгликоля с тринитротерефталевой кислотой) и толщиной пленки 0,25 мкм. Режим работы – изотермический с температурой термостата 140 С, с температурой испарителя и детектора 230 С. Газ-носитель – азот, с давлением на входе в колонку 1,8 ати. Расход газаносителя 2 мл/ мин, водорода 25 мл/ мин, воздуха 300 мл/ мин. Соотношение потоков газаносителя на сброс и в колонку – 50:1. Время анализа – 10 мин.

Процесс пробоподготовки фекальных образцов включал: отбор образца в стерильную пробирку, его взвешивание (вес образца около 2г), гомогенизацию в 3 мл дистиллированной воды и 2 мл внутреннего стандарта (,-диметилмаслянной кислоты). Одна часть получаемого гомогенизата использовалась после центрифугирования (7000 об/мин в течение 10 мин.) для ГЖХ анализа (определение несвязанных КЖК). Во вторую часть вышеуказанного гомогенизата добавляли 2 мл. 1 N раствора соляной кислоты (для определения суммарного количества кислот), перемешивали и центрифугировали ( об/мин в течение 10 мин). Затем микрошприцем вводили пробы надосадочной жидкости объемом 1 мкл в испаритель хроматографа. Данный объем был установлен в результате контрольной работы. Из полученных хроматограмм содержание отдельной кислоты в мг/г образца, определяли по формуле: Pn = P’ Sn Kn / S’ Po, где P’- вес внутреннего стандарта в анализируемом образце, мг, Sn- площадь пика анализируемой кислоты, S’- площадь пика внутреннего стандарта, Po- вес анализируемого образца, мг, Kn- весовые поправочные коэффициенты: К2/уксусная кислота/=2,54 (0,01); К3/пропионовая кислота/=1,55 (0,01);

К4/масляная и изомасляная/=1,19(0,01); К5/валериановая и изовалериановая/=1,08 (0,01).

Определение содержания КЖК в сыворотке крови и асцитической жидкости. Образец сыворотки крови или асцитической жилкости объемом 2 мл. помещали в центрифужную пробирку, добавляли 1 мл. стандартного раствора и подкисляли 6N соляной кислотой.

Скоагулированные белки центрифугировали при 7000 об/мин в течение 10 мин.

Надосадочную жидкость объемом 1мкл трижды вводили в испаритель хроматографа.

Содержание КЖК для каждой кислоты отдельно в мг/ мл пробы определяли по указанной выше формуле.

Чувствительность этого способа недостаточна при малых пробах биологических образцов (меньших чем 2,0 г), а также в случаях низкого содержания кислот в биологических субстратах (спиномозговая жидкость, биоптаты СОТК и др.).

Поставленная задача решается разделением смеси жирных кислот фракции С2-С методом газожидкостной хроматографии, включающим обработку пробы биологического субстрата водой или водным раствором реагента (как в первом случае), введение надосадочной жидкости в испаритель хроматографа и разделение на кварцевой капиллярной колонке длиной 32-40 метров с внутренним диаметром 0,28-0,35 мм с использованием в качестве неподвижной фазы пленки сополимера полиэтиленгликоля с терефталевой кислотой. При этом используют пленку толщиной 0,26-0,35 мкм и температуру термостата поддерживают равной 145-155оС.

Представленная модификация приводит к удешевлению стоимости колонок при сохранении хорошего разделения смесей, содержащих кислоты, способствует увеличению чувствительности способа в определении кислот в более низких концентрациях («следовых»), позволяет снизить вес исследуемого образца, уменьшить расход реактивов при пробоподготовке, обеспечить «долговременность» использования неподвижной фазы при сокращении времени анализа до 8 минут.

Достоверность методики подтверждена в контрольных опытах на модельных смесях Воспроизводимость результатов 982%.

Запатентованные способы позволяют проводить выделение, разделение и определение КЖК для анализа биологических и иных объектов с высокой точностью.

Определение КЖК в кале методом ГЖХ-анализа обладает более высокой воспроизводимостью результатов по сравнению с бактериологическим исследованием ( 6,56 для р=0,05, DF=4 и 2 3,74, р=0,05,DF=4 соответственно). Для профиля кислот - 2 9,36, р=0,05, DF=4.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием интегрированной системы статистической обработки и графической визуализации данных STATGRAPHICS и стандартного статистического пакета Microsoft Excel для вероятности 95%. Для протяженных переменных рассчитывали средние величины, их стандартные отклонения и ошибки ( Мm для р< 0,05). Для сравнения средних показателей между изучаемыми группами и подтверждения их достоверности использовали линейный регрессионный анализ с вычислением доверительных интервалов угла наклона (а) и свободного члена (b) в уравнениях регрессии. Для получения количественной оценки характера и достоверности полученных данных рассчитывали множественный коэффициент детерминации R2. Для изучения корреляции избранных показателей проводили корреляционный анализ с расчетом коэффициента корреляции (r). Для оценки принадлежности показателей к генеральной совокупности с нормальным распределением оценивалась, достоверности полученных различий определялось значение (распределение Пирсона) и его статистическая значимость. Для сравнения результатов традиционных методов исследования и результатов изучения КЖК при патологии ЖКТ рассчитывали чувствительность и специфичность.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1.Результаты изучения КЖК в различных биосубстратах у больных с патологией Изучение абсолютного содержания КЖК у пациентов с СРК и НЯК демонстрирует различные значения концентраций кислот по сравнению с нормой. Абсолютные концентрации КЖК могут быть выражены следующим рядом: СРК-З>Норма>НЯК>СРК-Д (6,18±1,12>10,51±2,50>11,64±2,65>19,85±3,61мг/г).

абсолютного содержания КЖК в кале при патологии кишечника могут быть связаны с количественным и качественным изменением состава микроорганизмов, среды их обитания, нарушением моторики и другими причинами.

Для объективизации полученных данных нами были рассчитаны профили (Сn/(C2+C3+C4)) уксусной (С2), пропионовой (С3) и масляной (С4) кислот, вносящих основной вклад в общий пул кислот. Результаты изучения данных параметров у больных с патологией кишечника представлены в таблице 2, из которой видно, что у больных СРК-З отмечается повышение содержания уксусной кислоты, а СРК-Д и НЯК - повышение пропионовой и масляной кислот (повышение масляной кислоты при НЯК выражено больше). Результаты изучения значений Анаэробных индексов3, отражающих окислительно–восстановительный потенциал внутрипросветной среды, что при СРК-З значения АИ смещены в область слабоотрицательных, при СРК-Д и НЯК – в область резкоотрицательных значений по сравнению с нормой (таблица 2).

При изучении соотношения содержания изокислоты/короткоцепочечные жирные кислоты с неразветвленной цепью (iCn/Cn,iC5/C5) (таблица 2) отмечены разнонаправленные сдвиги в продукции изомеров кислот при различных формах СРК и НЯК: при СРК-З происходит увеличение значений данных параметров, при СРК-Д- снижение значений, при НЯК- резкое увеличение соотношения изовалериановой кислоты к валериановой.

Анализ изучения профилей и АИ свидетельствует об изменении состава микрофлоры, связанного с переключением метаболизма колоноцитов с цикла Кребса на активацию гексозомонофосфатного шунтирования (ГМШ), что при СРК-З приводит к увеличению продукции токсичных форм кислорода и «аэробизации» среды; при СРК-Д - к активации анаэробного типа гликолиза, угнетению жизнедеятельности облигатных анаэробов за счет блокирования терминальных ферредоксинсодержащих ферментов и активизации условнопатогенных штаммов анаэробов, в частности штаммов условно-патогенных бактероидов.

При НЯКе колоноциты перестают утилизировать КЖК в нормальном режиме (метаболический блок окисления масляной кислоты). Полученные данные согласуются с результатами экспериментальных исследований ряда авторов (Готтшалк Г, 1982, Roediger W.E.W 1994, Шендеров Б.А.1998, Chapman M..A.S., Cole A. 1999, Simpson E.J. et al 2000).

Изменение продукции изокислот при СРК-З объясняется увеличением активности аэробной микрофлоры (кишечные палочки, фекальные стрептококки рассматриваются как сильнейшие протеолитики) (Готтшалк Г, 1982,, Шендеров Б.А.1998, Покровский В.И., 1999), при СРК-Д – увеличением активности анаэробов (рода Bacteroides spp.), обладающих слабой протеолитической активностью и усилением экскреции слизи с фекальными массами. Резкое увеличение продукции изокислот и особенно изовалериановой кислоты при НЯКе, что связано с активизацией «микроорганизмов-гемолитиков», способных к протеолизу, при повышенном содержании крови у больных НЯК вследствие кишечной кровоточивости (гемолитические штаммы аэробов-E.coli и анаэробов-Клостридии).

В сыворотке крови у больных НЯК отмечается повышение абсолютного содержания ЖКЖ по сравнению с нормой и группой СРК (0,503±0,004; 0,195±0,004 и 0,193±0,004 мг/г соответственно). При этом в профиле С2-С4 (таблица 2) выявлено снижение доли уксусной АИ – отношение содержания суммы более восстановленных кислот (пропионовой и масляной) к содержанию менее восстановленной уксусной кислоте (Гунзалус И., Стайнер Р. 1963) Таблица 2. Профили КЖК С2-С4, анаэробные индексы, отношение суммарного содержания отдельных изокислот (изоСп, изоС4, изоС5) к кислотам (Сп, С4, С5) и отдельно изоС5/С5 в фекалиях и сыворотке крови у больных исследуемых групп (СРК Норма 0,689±0,002*,** 0,169±0,006*,** 0,143±0,002*,** 0,568±0,002*,** 0,249±0,007*,** 0,183±0,004*,** 0,553±0,002*,** 0,211±0,006*,** 0,236±0,006*,**