На правах рукописи

АКИНЧИЦ ЕЛЕНА КОНСТАНТИНОВНА

Анализ механизмов генерации и распространения вариабельного потенциала

у проростков тыквы и пшеницы

03.01.02 – биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2013

Работа выполнена на кафедре биофизики Биологического факультета федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского», г. Нижний Новгород.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Воденеев Владимир Анатольевич

Официальные оппоненты:

Булычев Александр Александрович, доктор биологических наук, профессор кафедры биофизики биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, г. Москва Иванов Борис Николаевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией фотосинтетического электронного транспорта ИФПБ РАН, г. Пущино

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, г. Москва.

Защита диссертации состоится «13» июня 2013 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.96 на базе Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова по адресу 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, МГУ, биологический факультет, аудитория 389.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Московского Государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « » мая 2013 года

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук М.Г. Страховская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Функционирование растения в меняющихся условиях окружающей среды требует непрерывной адаптации к действию неблагоприятных факторов. Развитие системного ответа при локальном воздействии возможно лишь при условии распространения стрессовых сигналов. У растений выделяют несколько типов стрессовых сигналов – химические, гидравлические и электрические. К электрическим сигналам относят потенциал действия (ПД) и вариабельный потенциал (ВП) (Stahlberg et al., 2006; Davies et al., 2006). Генерация ПД происходит при действии неповреждающего раздражения, а ВП, характерная только для высших растений электрическая реакция, возникает при повреждении. Основной отличительной чертой этой реакции является её нерегулярность (вариабельность). ВП отличается от ПД изменчивой формой и амплитудой, способностью возникать в период абсолютной рефрактерности после ПД, и меньшей скоростью распространения. Кроме того, ВП характеризуется значительно большей длительностью, особенно в фазе реполяризации (Опритов и др., 1991; Stankovic et al., 1998; Stahlberg et al., 2006).

Электрические сигналы у высших растений вызывают изменения их функционального состояния, такие как: увеличение интенсивности дыхания (Sinyukhin, Britikov 1967; Filek, Koscielniak 1997), временное снижение активности фотосинтеза (Bulychev et al. 2004; Koziolek et al. 2004; Lautner et al. 2005), индукция экспрессии генов pin2 (Stankovic, Davies, 1996; Fisahn et al. 2004), временное увеличение содержания АТФ (Сухов и др., 2005), индукция биосинтеза жасмоновой и абсцизовой кислоты (Hlavkov, 2007) и др. Вызванные электрическими сигналами изменения функциональной активности, вероятно, направлены на повышение устойчивости растений к действию неблагоприятных факторов (Пятыгин и др., 2008). Пути преобразования электрических сигналов в функциональный ответ на сегодняшний день не известны. Для их понимания необходимо изучение процессов генерации и распространения электрических сигналов.

В настоящее время достаточно хорошо изучены генерация и распространение ПД. Генерация ПД начинается с активации потенциал-зависимых кальциевых каналов и поступления в клетку Ca2+, который активирует хлорные каналы (Lunevsky et al., 1983; Lewis et al., 1997). Входящий поток Ca2+ и выходящий поток Cl- формируют фазу деполяризации ПД. Фаза реполяризации ПД формируется выходящим потоком K+ (Fromm, Spanswick, 1993). В генерации ПД участвует также Н+АТФаза плазмалеммы, вклад которой наиболее значителен в фазе реполяризации (Воденеев и др., 2006).

Сведения об ионном механизме генерации ВП противоречивы. В настоящее время сложилось мнение, что генерация ВП целиком обусловлена переходным изменением активности Н+-АТФазы, без возникновения пассивных потоков ионов (Julien et al., 1991; Stahlberg et al., 2006; Zimmermann et al., 2009). Однако сведений для формирования целостной картины генерации ВП недостаточно. Механизм распространения ВП также остаётся не установленным. В отличие от ПД, электрически распространяющегося по флоэме, распространение ВП связывают с ксилемой.

Существуют две гипотезы распространения ВП: химическая (Malone M., 1996;

Davies E., 2006) и гидравлическая (Malone M., 1996; Mancuso S., 1999; Stahlberg et al., 2006). Таким образом, несмотря на значительный период исследований, сведения о ВП у высших растений фрагментарны и остаются противоречивыми. Также отсутствует теоретическое (математическое) описание генерации и распространения ВП.

Цель и основные задачи исследования Целью работы явилось изучение механизмов генерации и распространения индуцированного локальным повреждением ВП у высших растений.

В связи с поставленной целью выполнялись следующие задачи:

1. Определение основных параметров электрических реакций, индуцированных ожогом;

2. Ингибиторный анализ механизма генерации ВП;

потенциометрическим методом при генерации ВП;

4. Анализ механизма распространения ВП на основании сопоставления скоростей распространения гидравлического сигнала и радиоактивной метки со скоростью ВП;

5. Составление общей схемы распространения и генерации ВП и разработка математической модели ВП.

Научная новизна Впервые показано, что в генерацию вариабельного потенциала, наряду с изменением активности электрогенного насоса, вносят вклад пассивные потоки ионов Ca2+ и Cl-.

Распространение ВП может быть обусловлено турбулентной диффузией некоего химического соединения («фактора Рикка») из зоны локального повреждения.

Экспериментально показано, что скорость распространения радиоактивной метки из зоны повреждения сопоставима со скоростью распространения ВП.

Предложена схема распространения и генерации ВП у высших растений, согласно которой формирование ВП связано с активацией лиганд-зависимых Ca2+каналов раневым фактором Рикка. Вход в клетку ионов Ca2+, вероятно, вызывает активацию анионных каналов и инактивацию H+-АТФазы.

На основании предложенной схемы разработана математическая модель генерации ВП у высших растений, которая включает в себя описание систем пассивного и активного (первичного и вторичного) транспорта ионов, а также изменения ионных концентраций в клетке, внеклеточной среде, буферные свойства цитоплазмы и апопласта. Верификация модели показала качественное сходство экспериментально зарегистрированных и симулированных изменений потенциала.

Научно-практическое значение Результаты работы важны для создания целостной картины формирования электрофизиологического ответа у высших растений на действие повреждающих раздражителей. Предложенная в работе схема генерации ВП способствует пониманию механизмов преобразования электрического сигнала в функциональный ответ у высших растений.

Основные выводы и результаты работы могут быть использованы в учебном процессе при разработке соответствующих спецкурсов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту 1. По мере удаления от зоны локального повреждения уменьшается амплитуда и скорость распространения электрической реакции, изменяется количество импульсов в составе ВП. Это свидетельствует об ослаблении индуцирующего электрический ответ сигнала, передаваемого по растению.

2. Ингибиторный анализ механизма генерации ВП и зарегистрированные потенциометрическим методом концентрационные сдвиги, сопровождающие реакцию, свидетельствуют об участии потоков Са2+, Н+ и Сl- в формировании ВП.

3. Инициация ВП обусловлена распространением химического вещества из зоны локального повреждения, о чём свидетельствует соответствие скоростей распространения по растению радиоактивной метки и ВП, а также отсутствие ВП при механическом блокировании распространения химического сигнала.

4. Изменения потенциала, описываемые математической моделью ВП, качественно соответствуют экспериментальным данным, что подтверждает основные положения предложенной модели.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 12-ой международной пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология – наука ХХI века» (Пущино, 2008), 13-ой Нижегородской сессии молодых ученых «Татинец» (Н. Новгород, 2008), 13-th Aunnual Symposium for Biology Students of Europe «SymBioSE 2009» «Biology: Expansion of Borders» (Казань, 2009), 14 Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2010), III Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010» (Н. Новгород. 2010), International Autumn School (Vulcan-Brasov, Romania, 2010), Всероссийском симпозиуме «Растения и стресс» (Москва, 2010), VII Съезде Общества физиологов растений России «Физиология растений – фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Н. Новгород, 2011), IV Съезде биофизиков России (Н.

Новгород, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ из них 4 статьи в рецензируемых изданиях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав (включая обзор литературы), заключения, выводов и списка литературы. Изложена на 109 страницах, содержит 28 рисунков и 3 таблицы. Список цитируемой литературы включает 164 работы, из них 136 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объект и методы исследования В качестве объекта исследований использовали 2-3-недельные проростки тыквы Cucurbita pepo L. сорта Мозолеевская и пшеницы Triticum aestivum L. сорта Московская-35. Растения выращивали гидропонным способом (керамзит, 50 % среда Хоглэнда-Арнона) в климатической камере (KBW-240, «Binder») при освещении люминесцентными лампами (16-ти часовой световой период) и температуре 24 оС.

Растения располагали на специально изготовленных подставках, корни помещали в чашку Петри, содержащую стандартный раствор (1 мМ KCl, 0.1 мМ NaCl, 0.5 мМ CaCl2, 2 мМ Tris-Mes (pH 6.0)).Внеклеточная регистрация электрической активности осуществлялась с помощью Ag/AgCl макроэлектродов ЭВЛ-1М3, усилителем служил иономер ИПЛ-113 с входным сопротивлением 1012Ом, соединенный с компьютером. Контакт электрода со стеблем тыквы или листом пшеницы осуществлялся через электропроводящий гель. Электрод сравнения помещали в раствор, омывающий корни проростков. Измерительные электроды располагали в трех точках на различных расстояниях от места раздражения в диапазоне от 1 до 15 см.

В качестве повреждающего раздражителя использовали локальный ожог открытым пламенем края листа в течение 2 секунд. Раздражение наносили на край семядольного листа проростка тыквы или на кончик листа пшеницы. Площадь повреждения семядольного листа проростка тыквы составляла около 0.3 см2, у проростка пшеницы был поврежден кончик листа длиной около 2 мм.

Для ингибиторного анализа использовали 1 мМ раствор ЭГТА (хелатор ионов Са2+), 0.5 мМ NaN3 (ингибитор метаболизма) и 2 мМ этакриновую кислоту (ЭК, блокатор анионных каналов). Химический агент действовал локально на находящийся в кювете диаметром 1 см участок стебля. Агенты вносили за час до индукции ВП.

Изменения ионных концентраций в растворе, омывающем участок стебля, регистрировали потенциометрическим методом. Перед измерением у проростка тыквы с участка стебля, находящегося в кювете с раствором, удаляли эпидермис. К эксперименту приступали не ранее чем через 2 часа после удаления эпидермиса. Регистрацию изменений рН и рСl раствора осуществляли с помощью электродов ЭСК-10614 и ЭЛИС-131Cl соответственно.

Для определения механизма распространения ВП применяли оптическую когерентную микроскопию (ОКМ) и метод меченых атомов. С помощью когерентного микроскопа OCM1300SS Swept Source OCT Microscope System (Thorlabs) визуализировали изменения структуры листа (разрешение метода составляет 10 мкм). Растения располагали на столике микроскопа, одновременно регистрировали электрическую активность от трёх точек на различном расстоянии до зоны повреждения.

Регистрацию ОКМ-изображения проводили в районе расположения второго электрода (Э2). Двумерные ОКМ-изображения внутренней структуры листа получали каждые 3 с. Исходный размер получаемого изображения составлял 3х3 мм. Проводили серию измерений на различном расстоянии (от 5 до 15 см) между зонами раздражения и регистрации. Оценку изменения размеров листовой пластины производили на основании отдельных ОКМ-изображений с помощью графической программы CorelDRAW Graphics Suite X4.

Скорость распространения химического соединения из зоны локального повреждения определяли с помощью метода меченых атомов. В качестве метки использовали 14С в составе сахарозы. У проростков пшеницы не менее чем за 2 часа до опыта был подрезан кончик листа. На подрезанный кончик листа наносили ожог.

Сразу после ожога кончик листа опускали в бюкс с меченой сахарозой. У контрольных растений кончик листа погружали в содержащий метку раствор без нанесения ожога. Инкубация кончика листа в растворе составляла 100 или 200 с. После этого лист разрезали на фрагменты по 20 мм. Фрагменты высушивали и из них готовили фиксированные препараты. Активность препаратов регистрировали с помощью торцового счётчика МСТ-17, находящегося в свинцовом домике.

Математическая модель ВП была разработана на основании модификации математической модели ПД (Sukhov, Vodeneev, 2009). Полученная система уравнений решалась численно методом Эйлера. Начальные значения переменных модели и её параметры частично были взяты из предыдущей работы (Sukhov, Vodeneev, 2009), частично определялись на основе экспериментальных данных.

Эксперименты проводили в 5–10-кратной биологической повторности. Статистическую обработку результатов проводили методами вариационной статистики (Тейлор, 1985; Гланц, 1998) с использованием программ Microsoft Excel.

Результаты и их обсуждение Общая характеристика реакции, индуцированной локальным повреждением.

ВП представляет собой переходную деполяризацию нерегулярной формы и амплитуды (рис. 1). Амплитуда и длительность реакции могут значительно варьировать у отдельных растений. Несмотря на значительную вариабельность, можно выделить основные закономерности трансформации ВП по мере удаления от зоны повреждения. С увеличением расстояния глубокая деполяризация сменяется плавной волной деполяризации меньшей амплитуды, на фоне которой возникают импульсы (рис. 1). Амплитуда медленной волны и скорость распространения ВП падают с расстоянием (рис. 2А, Б). Изменения количества импульсов в ответе имеют более сложный характер (рис. 2В): тенденция к возрастанию их числа при увеличении расстояния от 4 до 10 см сменяется последующим снижением.

Основные закономерности трансформации реакции, обнаруженные в проростках тыквы – снижение амплитуды и скорости распространения ВП по мере удаления от зоны повреждения (рис. 3, рис. 4) – характерны и для ВП в листе пшеницы. Импульсов в составе реакции у проростков пшеницы не было обнаружено.

Рис. 1. Электрические ответы, индуцированные ожогом, в стебле проростка тыквы на расстоянии 7 см (Э1), 10,5 см (Э2) и 18,5 см (Э3) от места раздражения.

Рис. 2. Зависимость амплитуды (А), скорости распространения (Б) и количества импульсов (В) от расстояния до зоны раздражения для вариабельного потенциала, индуцированного ожогом семядольного листа тыквы.

Рис. 3. Электрические ответы, индуцированные ожогом, в листе проростка пшеницы на расстоянии 2 см (Э1), 4 см (Э2) и 8 см (Э3) от места раздражения.

Рис. 4. Зависимость амплитуды (А) и скорости распространения (Б) ВП от расстояния до зоны раздражения для вариабельного потенциала, индуцированного ожогом кончика листа пшеницы.

Параметры ВП, зарегистрированные нами в стебле проростков тыквы и листе пшеницы качественно сходны с характеристиками ВП, зарегистрированными на других растительных объектах (Malone, 1992; Stahlberg, 1996; Stankovik, 1997).

Снижение амплитуды и скорости распространения реакции с расстоянием может быть связано с ослаблением индуцирующего электрический ответ сигнала, передаваемого по растению.

Анализ ионного механизма генерации вариабельного потенциала.

В развитие переходной деполяризации растительных клеток наиболее вероятен вклад ионов Са2+, Н+, Сl-, поскольку для них на мембранах в состоянии покоя существуют наибольшие градиенты (Пятыгин и др., 2006; Stahlberg et al., 2006) и, как известно, эти же ионы принимают участие в генерации другого типа электрического сигнала – ПД (Опритов и др., 1991; Воденеев и др., 2006; Trebacz et al., 2006). В связи с этим основное внимание в работе было уделено возможной роли Са2+, Н+ и Сl- в генерации ВП.

Ингибиторный анализ генерации электрических реакций в случае с ВП встречает ряд трудностей, обусловленных его вариабельностью. В связи с этим было использовано локальное действие специфических ингибиторов. Электрическую активность регистрировали в зоне действия агента (Э2), а также выше (Э1) и ниже (Э3) нее (рис. 5). В контроле было показано последовательное снижение амплитуды ВП с увеличением расстояния (рис. 2А), следовательно, отклонение от такой зависимости указывает на влияние агента на генерацию ВП.

На первом этапе определяли влияние блокирования входящего потока Ca2+ на генерацию ВП, для чего проводили эксперименты в бескальциевой среде (рис.

5А). Внесение 1 мМ ЭГТА существенно подавляло амплитуду и скорость развития деполяризации (рис. 5А), что указывает на необходимость входящего потока Ca2+ для формирования ВП у проростков тыквы. Опираясь на сведения о генерации ПД у высших растений (Опритов и др., 1991; Воденеев и др., 2006; Trebacz et al., 2006), можно предположить, что в случае ВП ионы Ca2+ также являются скорее сигнальным фактором, нежели непосредственным носителем заряда. Сходное предположение высказано в работах (Julien et al., 1991; Rousset et al., 2002).

Известно, что увеличение концентрации Ca2+ в клетке инактивирует H+АТФазу плазмалеммы (Kinoshita et al., 1995; Lino et al., 1998; De Nisi et al., 1999) и активирует анионные каналы (Lunevsky et al., 1983; Lewis et al., 1997). В дальнейшем определяли возможную роль указанных систем в генерации ВП.

Роль H+-АТФазы в генерации ВП определяли с использованием снижающего ее активность ингибитора метаболизма NaN3 (Reid et al., 1985). Внесение NaN3 значительно подавляет амплитуду ВП (рис. 5Б), что указывает на участие Н+-АТФазы в формировании ВП. Однако, такой результат нельзя считать однозначным, поскольку угнетение Н+-насоса приводит также к деполяризации мембраны и к диссипации градиентов других ионов.

Более прямые сведения об участии Н+-АТФазы в генерации ВП могут быть получены на основании исследований изменений рН. На рис. 6А представлена запись одновременной регистрации индуцированных ожогом изменений электрического потенциала и рН внеклеточной среды. При генерации ВП наблюдается обратимое повышение рН раствора. Такое изменение концентрации Н+ во внеклеточной среде может быть вызвано временным угнетением активности протонной АТФазы.

Рис. 5. Влияние хелатора двухвалентных катионов (1 мМ ЭГТА) (А), ингибитора метаболизма (0.5 мМ NaN3) (Б) и блокатора анионных каналов (2 мМ этакриновой кислоты) (В) на генерацию вариабельного потенциала.

Слева приведены типичные записи электрических ответов, справа – средние значения их амплитуд, внизу – схема проведения измерений. Время инкубации в присутствии агента составляло не менее 30 мин. Расстояние между электродами Э1-Э2 составляло 5 см, Э2-Э3 – 3. см. Расстояние от зоны раздражения до Э1 – от 6 до 8 см.

Для оценки роли выхода анионов в генерации ВП применяли блокатор анионных каналов этакриновую кислоту (ЭК). ЭК вызывает снижение амплитуды ВП и существенное замедление скорости деполяризации (рис. 5В), что указывает на активацию анионных каналов при развитии ВП. Роль ионов Cl- в развитии деполяризации оценивали по изменению его содержания во внеклеточной среде (рис. 6Б).

Генерация переднего фронта ВП, а также электрических импульсов, входящих в состав ВП, сопровождается временным увеличением концентрации Cl-. Можно полагать, что это связано с переходной активацией анионных каналов.

Рис. 6. Изменение концентрации ионов Н+ (А) и Cl- (Б) внеклеточной среде при генерации вариабельного потенциала.

Концентрацию ионов H+ и Cl- регистрировали в растворе, омывающем участок стебля, в той же зоне регистрировали электрическую активность.

В целом, предположена следующая последовательность событий при генерации ВП: начало деполяризации связано с поступлением в клетку ионов Ca2+, которые вызывают активацию Cl–-каналов и инактивацию Н+-АТФазы. С инактивацией Н+-АТФазы связано развитие медленной волны деполяризации, а анионные каналы принимают участие, главным образом, в развитии переднего фронта ВП и импульсов в составе реакции. Фаза реполяризации формируется активным потоком Н+, связанным с реактивацией H+-АТФазы.

Анализ механизма распространения вариабельного потенциала.

В настоящее время существуют две основные гипотезы механизма распространения ВП: гидравлическая (Stahlberg, Cosgrove, 1997; Stankoviс, Davies, 1997) и химическая (Houwink, 1935; Sibaoka, 1969; Malone et al., 1994; Malone, 1996). Также обсуждался электрический механизм распространения ВП, подобно ПД (Цаплев, Зацепина, 1980). Однако впоследствии эта гипотеза не была подтверждена. В нашей работе также было показано (рис. 5), что локальное подавление генерации ВП не влияет на дальнейшее его распространение, что также противоречит электрической гипотезе.

Изучение механизма распространения ВП было основано, в первую очередь, на сопоставлении скоростей гидравлического сигнала и распространения радиоактивной метки из зоны повреждения со скоростью ВП.

Распространение гидравлического сигнала определяли по структурным изменениям листа пшеницы на расстоянии от зоны локального повреждения с помощью оптической когерентной микроскопии (ОКМ). На рис.7Б приведено типичное ОКМ-изображение листа пшеницы в сравнении с гистологическим срезом (рис.

7А).

Рис. 7. Гистологический срез листа пшеницы (А), ОКМ-изображение (Б) и схема деформации листа, индуцированной повреждением (В) Методом ОКМ была зарегистрирована вызванная ожогом быстрая деформация листа на расстоянии от зоны повреждения (рис. 7 В). Динамику деформации оценивали по изменению расстояния между двумя противоположными симметрично расположенными точками листа (параметр А на рис. 7Б, В). Такая деформация листа отражает распространение гидравлического сигнала – волны повышенного давления – по растительным тканям при повреждении как описано в работах (Malone, 1992; Stankovic et al., 1998; Mancuso, 1999). Следовательно, по началу деформации можно судить о моменте прохождения гидравлического сигнала.

Проводили одновременную регистрацию электрической активности и ОКМизображений из одной зоны (рис. 8). Как видно из графика, начало деформации опережает электрический ответ. Это согласуется с предположениями о том, что гидравлический сигнал индуцирует генерацию ВП, высказанными в работах (Stahlberg, Cosgrove, 1997; Stankovic et al., 1998; Malone, 1992; Mancuso, 1999).

Тем не менее, было обнаружено значительное несоответствие в скоростях распространения электрического и гидравлического сигналов. На рис.9 показано нелинейное возрастание временного интервала (t) между раздражением и началом деформации листа при увеличении расстояния, что соответствует снижению скорости распространения ВП, отмеченное как в нашей работе (рис. 2, 4), так и в работах других авторов (Stankovic et al., 1998). Разница в величинах t значительно растет с увеличением расстояния (r).

Рис. 8. Одновременная регистрация изменений электрической активности и параметра А, отражающего деформацию листа при нанесении локального повреждения.

Полученные в наших экспериментах данные, расходятся с результатами работы (Malone, 1992), демонстрирующей соответствие между скоростями электрического и гидравлического сигналов. В то же время, по данным (Stahlberg, Cosgrove, 1997) скорость гидравлического сигнала превышает скорость ВП. Возрастание лагпериода между гидравлическим сигналом и ВП объясняется авторами диссипацией давления с увеличением расстояния от зоны повреждения (Stahlberg, Cosgrove, 1997). С другой стороны, несоответствие в скоростях распространения может быть объяснено с привлечением химической гипотезы распространения ВП.

Рис. 9. Зависимость временного интервала (t) между раздражением и началом движения листовой пластины (кривая 1) или началом развития электрической реакции (кривая 2) от расстояния между зонами раздражения и регистрации. Кривая 3 отражает теоретическую зависимость для одномерной диффузии.

Коэффициент диффузии, использованный при построении теоретической зависимости интервала времени от расстояния до места нанесения раздражения: D = 4,510-2 см2/с В соответствии с химической гипотезой распространение ВП происходит за счёт перемещения некого химического вещества («фактора Рикка»), которое вызывает активацию ионтранспортирующих систем. Предполагали, что распространение «фактора Рикка» происходит путем его диффузии по проводящим пучкам. Для описания распространения индуцирующего электрический ответ химического агента было использовано диффузионное уравнение:

где c(x,t) – функция зависимости концентрации (c) диффундирующего вещества от времени (t) и координаты (x), D – коэффициент диффузии.

Так как продольные размеры проводящего пучка много больше, чем поперечные, диффузию в сосуде можно рассматривать как одномерную. Было принято, что при действии повреждающего фактора происходит мгновенное возрастание концентрации раневого вещества в точке повреждения (t=0, x=0). В этом случае решение диффузионного уравнения будет иметь вид (Джаксон, 2009):

где С0 – общее количество раневого вещества, выделившегося в точке r = 0, в момент времени t = 0, r – расстояние до зоны повреждения.

Если предположить, что для генерации ВП необходимо превышение концентрацией раневого вещества некоторого порогового уровня (сth), то на основании приведённого выше уравнения для случая одномерной диффузии можно найти зависимость расстояния, на которое распространяется ВП, от времени, в течение которого происходит распространение:

На основании этого уравнения было подобрано значение D при котором наблюдается достаточно хорошее соответствие между экспериментальной и теоретической кривой зависимости интервала времени (t), необходимого для распространения ВП, от расстояния (r) до зоны повреждения (рис. 9). Значение, найденного коэффициента диффузии составило 4,5*10-2 см2/с. Такое значение более чем на 3 порядка превышает значения коэффициентов молекулярной диффузии для небольших молекул в жидкостях (~10-5 см2/с) (Левич, 1959).

Противоречие может быть связано с протекающей в проводящих путях не только молекулярной, но и турбулентной диффузией. Поток жидкости может приобретать турбулентный характер даже при невысокой скорости ее течения в том случае, если сосуд, по которому происходит движение, имеет сложную геометрию, в частности - переменный диаметр сечения. Сосуды ксилемы удовлетворяют этому условию и, как теоретически показано в работе (Roth, 1996), движение водных потоков в них имеет сложный характер, отличный от ламинарного течения. При наличии потоков итоговый коэффициент диффузии представляет собой сумму молекулярного и турбулентного коэффициентов диффузии. Причём значение коэффициента турбулентной диффузии на несколько порядков больше молекулярной (составляет порядка 10-2 – 10-1 см2/с) (Левич, 1959).

Турбулентность потоков усиливается при наличии градиентов давления (Левич, 1959). Гидравлический сигнал, возникающий при повреждении, представляет собой распространение области повышенного давления в сосудах ксилемы. Следовательно, генерацию ВП может вызывать распространение «фактора Рикка» из зоны повреждения, скорость перемещения которого значительно возрастает вследствие турбулентных потоков, индуцированных гидравлической волной.

Для экспериментальной проверки возможности распространения какого-либо соединения со столь высокой скоростью исследовали распространение радиоактивной метки по растению из зоны локального повреждения. На рис. представлена зависимость скорости счёта фиксированных препаратов от расстояния до места нанесения раздражения. Время, в течение которого происходило распространение радиоактивной метки из зоны повреждения, составляло (рис. 10А) и 200 (рис. 10Б) секунд. По истечении указанного времени растения были разделены на фрагменты длиной 2 см, активность которых представлена на графике. Полученные данные были использованы для определения коэффициента диффузии меченого соединения на основании уравнения одномерной диффузии.

Значение коэффициента диффузии для меченой сахарозы листа пшеницы составило 6*10-2 см2/с в опыте (при повреждении) и 1,8*10-2 см2/с в контроле (в отсутствие повреждения). Таким образом, нанесение повреждения ведет к заметному увеличению скорости распространения радиоактивной метки.

Рис. 10. Зависимость скорости счета препаратов от расстояния до места нанесения раздражения. Время инкубации – 100 с (А), Время инкубации – 200 с (В) Dэксп ~ 6*10-2 см2/с, Dконтр ~1,810-2 см2/с Необходимо отметить, что высокая скорость распространения соединения из зоны локального ожога обнаружена не только в нашей работе, но и была показана также ранее в работе (Rhodes et al., 1999) с использованием флуоресцентного зонда.

Далее исследовали возможность распространения ВП при блокировании передачи химического сигнала. Для этого лист пшеницы был перерезан через определённое время после нанесения ожога. Так как гидравлическая волна распространяется очень быстро, то перерезание листа сразу после ожога не должно сказаться на распространении ВП при условии, что распространение связано с прохождением гидравлической волны. Было показано, что сам факт перерезания листа пшеницы без нанесения ожога не вызывает электрической реакции (рис. 11А). После перерезания листа через 1 с после ожога не происходило распространения ВП (рис. 11Б).

Рис. 11. Изменения электрической активности, вызванные перерезанием листа без нанесения ожога (А), и после нанесения ожога через различные интервалы времени (Б – 1 с, В – 3 с, Г – 6 с). Расстояния от зоны ожога до места перерзания составляло см, до электродов Е1, Е2 и Е3 – 3, 5 и 7 см соответственно.

Перерезание листа через 3 с приводило к тому, что ВП распространялся до первого электрода, через 6 с – до первого и до второго электродов (рис. 11В, Г). Это также свидетельствует в пользу химической гипотезы.

Таким образом, полученные результаты указывают на возможность распространения ВП в соответствии с химической гипотезой, то есть инициация ВП происходит в результате действия некого химического соединения, ускорению распространения которого способствует прохождение гидравлической волны.

Математическая модель распространения и генерации вариабельного потенциала.

Полученные результаты указывают на комплексный характер процессов генерации и распространения ВП у высших растений. Одной из проблем изучения подобных процессов является сложность интерпретации экспериментальных данных, что делает актуальной теоретическую проверку предложенных в работе механизмов генерации и распространения ВП. Математическое моделирование ВП позволяет провести такой анализ и дополнительно подтвердить или опровергнуть предполагаемые механизмы его генерации и распространения.

В основу модели ВП была положена, ранее разработанная математическая модель генерации ПД (Sukhov, Vodeneev, 2009, Sukhov et al., 2011). Модель ВП учитывает работу систем пассивного и активного транспорта, буферную ёмкость клеток и апопласта, а также диффузию раневого вещества (рис. 12).

В качестве систем пассивного транспорта клетки рассматривались: Сl-каналы, Са-каналы двух типов (потенциал зависимые и лиганд-управляемые), К-каналы (входящего направления и выходящего направления). Для описания потока этих ионов использовали уравнение Голдмана-Ходжкина-Каца. Первичный активный транспорт (представленный кальциевой и протонной АТФазой) был описан моделью, учитывающей 2 состояния переносчика: свободное и связанное с ионом, в зависимости от концентрации ионов и мембранного потенциала. Вторичный активный транспорт, представленный 2H+/Cl--симпортером и H+/K+-антипортером, был описан как разность потоков в клетку и из неё. В случае электрогенного транспорта учитывали влияние потенциала с помощью уравнения Голдмана-Ходжкина-Каца.

Полагали, что раневое вещество способно активировать Са2+-каналы. Динамика концентрации раневого вещества на расстоянии от зоны локального повреждения описана с помощью приведенного выше уравнения одномерной диффузии.

Турбулентная диффузия «фактора Рикка»

Рис. 12. Схема электрофизиологической модели клетки высшего растения, использованная при математическом моделировании ВП.

Была проведена верификация математической модели. На рис. 13 представлены экспериментальные (рис. 13А) и симулированные моделью (рис. 13Б) примеры изменения электрического потенциала на различном расстоянии от зоны локального повреждения. Как уже отмечалось выше и видно из рис. 13, ответная реакция может значительно варьировать у отдельных растений. В модельных экспериментах мы изменяли начальное количество «фактора Рикка» в зоне повреждения. В результате при моделировании были получены различные типы электрических ответов, которые соответствуют экспериментальным. Это указывает на то, что вариабельность индуцированной повреждением реакции может быть во многом обусловлена различиями в начальном количестве «фактора Рикка».

Модель хорошо описывает такие свойства ВП как затухание амплитуды и скорости медленной волны при распространении, а также двухфазное изменение количества импульсов в составе реакции. Изменения параметров реакции могут быть обусловлены уменьшением концентрации «фактора Рикка» с расстоянием.

На основании модели оценивали роль потоков ионов Са2+, Н+ и Сl- в генерации ВП. Симулированное и экспериментальное влияние исключения ионов Са2+ на изменения потенциала показано на рис. 14А. Как видно из рисунка, удаление Са2+ как в эксперименте, так и в модели, ведёт к подавлению ВП.

Рис. 13. Электрические ответы, индуцированные ожогом, на различном расстоянии от места раздражения А – экспериментально зарегистрированные, Б - cимулированные моделью электрические ответы. [SW0] – начальное количество раневого вещества в зоне повреждения. [SW0]1>[SW0]2>[SW0]3.

Угнетение АТФазы симулированное моделью, так же как и в эксперименте, приводит к снижению амплитуды реакции (рис. 14Б). Симулированное моделью снижение активности Сl-каналов и экспериментальное – к замедлению фазы деполяризации и снижению амплитуды (рис.14В). В целом, симулированные моделью изменения потенциала качественно соответствуют экспериментальным. Это указывает на правомерность наших предположений, которые были положены в основу модели.

Рис. 14. Влияние угнетения потоков Н+ (А), Са2+ (Б) и Сl- (В) на генерацию ВП (слева экспериментальные, справа – симулированные моделью)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В целом, на основании полученных результатов можно предложить следующую схему событий при развитии ВП. Нанесение повреждающего воздействия вызывает выделение и последующее распространение по сосудам «фактора Рикка», скорость перемещения которого возрастает вследствие прохождения гидравлической волны. По мере распространения «фактор Рикка» активирует лигандуправляемые кальциевые каналы. Увеличение концентрации ионов кальция в клетке вызывает снижение активности Н+- АТФазы, а также активацию анионных каналов, что ведет к возникновению выходящего потока хлора, вносящего существенный вклад в деполяризацию. Затем, по-видимому, происходит восстановление концентрации кальция в цитозоле. Можно полагать, что такое снижение концентрации кальция сначала ведет к инактивации хлорных каналов, при подавленной активности Н+-АТФазы, а дальнейшее снижение приводит к реактивации Н+АТФазы, которая вносит основной вклад в формирование фазы реполяризации ВП.

Таким образом, генерация ВП связана как с пассивными потоками ионов Ca2+ и Cl-, так и с изменением активности H+-АТФазы. Необходимо подчеркнуть, что генерация ПД происходит при участии тех же потоков ионов, что говорит об универсальности механизмов генерации электрических сигналов различного типа у высших растений.

ВЫВОДЫ

С увеличением расстояния от зоны локального повреждения происходит снижение амплитуды и скорости распространения ВП, а также изменение количества импульсов в его составе. Такое затухание реакции может свидетельствовать об ослаблении индуцирующего электрический ответ сигнала, передаваемого по растению.

Подавление входящего потока Ca2+, ингибирование H+-АТФазы и блокирование анионных каналов ведет к угнетению генерации ВП. Генерация ВП сопровождается переходным защелачиванием апопласта и временным увеличением концентрации Cl-. Совокупность полученных данных указывает на совместное участие Н+-АТФазы и пассивных потоков ионов Ca2+ и Cl- в процессе генерации ВП.

Индукцию ВП вызывает распространение из зоны локального повреждения «фактора Рикка», на что указывают следующие факты: скорость распространения гидравлической волны значительно превышает скорость распространения ВП; скорость распространения радиоактивной метки из зоны локального повреждения соответствует скорости распространения ВП; блокирование передачи «фактора Рикка» из зоны локального повреждения подавляет распространение ВП.

Разработана математическая модель генерации и распространения ВП, учитывающая совместное участие активного и пассивного транспорта ионов в процессе генерации, а также диффузию «фактора Рикка». Описываемые моделью изменения потенциала хорошо соответствуют экспериментальным, что служит подтверждением основных положений модели.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

.

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК:

Воденеев В.А., Сухов В.С., Опритов В.А., Царёва Ю.В., Яковлева Е.В., Неруш В.Н., Акинчиц Е.К. Динамика внеклеточной концентрации ионов хлора при генерации холодоиндуцированного потенциала действия у высших растений//Вестник ННГУ. 2009. №2. С. 111-115.

Воденеев В.А., Акинчиц Е.К., Орлова Л.А., Сухов В.С. Анализ роли ионов Сa2+, H+, Cl- в генерации вариабельного потенциала у высшего растения Cucurbita pepo L.//Физиология растений. 2011. № 6 (58). С. 826-833.

3. Vodeneev V., Orlova A., Morozova E., Orlova L., Akinchits E., Orlova O., Sukhov V..

The mechanism of propagation of variation potentials in wheat leaves//J Plant Physiol.

2012. V. 169. P. 949-954.

4. Sukhov V., Akinchits E. Katicheva L., Vodeneev V. Simulation of Variation Potential in Higher Plant Cells//J Membrane Biol. 2013. V. 264. P. 287-296.

Акинчиц Е.К., Орлова Л.А. Количественное определение внеклеточного рН у высших растений методом спектрофлуорометрии//12-я международная школаконференция «Биология наука ХХI века». Пущино, 2008. тез. док. с. 165-166;

6. L.A. Orlova, E.K. Akinchic. Changes of extracellular pH by generation potentials in plants//13-th unnual Symposium for Biology Students of Europe «SymBioSE 2009»

«Biology: Expansion of Borders». Kazan. 2009. abstract. p. 91-91;

Акинчиц Е.К., Неруш В.Н., Орлова Л.А., Воденеев В.А. Изучение изменения концентраций ионов Н+ и Cl- при генерации потенциалов возбуждения у высших растений//«Биология – наука XXI века» «14 Международная Пущинская школаконференция молодых ученых». Пущино. 2010. с. 199-199;

Акинчиц Е.К., Мишина Е.Н., Неруш В.Н., Изучение механизма распространения индуцированного ожогом вариабельного потенциала у проростков пшеницы//III Всероссийская с международным участием конгресс студентов и аспирантовбиологов «Симбиоз-Россия 2010» Н.Новгород. 2010. с. 161-161;

9. Orlova L.A., Akinchic E.K., Balalaeva I.V., Vodeneev V.A. Research of ionic concentration changes at generation of excitation potentials in higher plants by confocal microscopy//International Autumn School. Vulcan-Brasov. Romania. 2010. р. 11-11;

Акинчиц Е.К., Орлова Л.А., Неруш В.Н., Воденеев В.А. Участие ионов Ca2+, Cl- и 10.

H+ в генерации вариабельного потенциала у проростков тыквы (Cucurbita pepo)// «Растения и стресс». Москва. 2010. с. 29-30;

Акинчиц Е.К., Орлова Л.А., Неруш Н.В., Грибков А.Л., Воденеев В.А. Изучение 11.

ионного механизма генерации вариабельного потенциала у высших растений//VII Съезд Общества физиологов растений. Н. Новгород. 2011, с. 34-35;

Акинчиц Е.К., Катичева Л.А., Мысягин С.А., Неруш В.Н., Воденеев В.А. Изучение 12.

ионного механизма генерации вариабельного потенциала у высших растений//IV Съезд биофизиков России. Н. Новгород. 2012. с. 13.