На правах рукописи

МИХАЙЛОВ АЛЕКСАНДР ОЛЕГОВИЧ

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ

ПРОТИВ ВИРУСНОГО ЭНТЕРИТА ГУСЕЙ

06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,

микология с микотоксикологией и

иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

Санкт-Петербург — 2010 2

Работа выполнена в Государственном научном учреждении «Всероссийский научноисследовательский ветеринарный институт птицеводства» Российской сельскохозяйственной академии.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор ветеринарных наук, главный научный сотрудник Трефилов Борис Борисович ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор ветеринарных наук, профессор Придыбайло Николай Дмитриевич доктор ветеринарных наук Авилов Вячеслав Михайлович ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: ГНУ «Всероссийский научноисследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.

Коваленко»

Защита диссертации состоится «27» мая 2010 года в 11.00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.059.03 при ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» по адресу: 196084, Санкт-Петербург, ул.

Черниговская, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины».

Автореферат разослан «27» апреля 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Белова Лариса Михайловна 1.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Одним из основных направлений национального проекта «Развитие АПК» является ускоренное развитие гусеводства, цель которого – увеличение производства мяса на 7%. «Отраслевая целевая программа развития птицеводства в Российской Федерации на 2005-2007 гг. и на период до 2010 года» предусматривает произвести к 2010 году 2,2 млн.т. мяса птицы, в том числе гусиного мяса до 5 тыс.т.

Серьезным препятствием на пути развития промышленного гусеводства наряду с факторами нарушения технологического режима выращивания являются различные инфекционные болезни молодняка, среди которых особое место занимает вирусный энтерит (парвовирусная инфекция) гусей. Это заболевание до настоящего времени имеет широкое распространение среди молодняка 1-30-суточного возраста, протекает остро и характеризуется высокой смертностью,достигая до 90-100% (В.В. Малушко, 1982; Л.М.

Контримавичус, 1983; Б.Б. Трефилов, 2000; А. Белецкая, 2003; Б.Б. Трефилов с соавт., 2009;

Derzsy D. et al., 1966; Varga J., 2000).

С профилактической и терапевтической целью при вирусном энтерите гусей применяют цитратную кровь и сыворотку крови гусей – реконвалесцентов (Л.М.

Контримавичус, 1984; В.С. Фадин, 1975; Б.Б. Трефилов, 2009; Coudert M. et al, 1973), гипериммунную сыворотку млекопитающих ( В.В. Малушко с соавт., 1980; А.Ф. Бондаренко, 1982) и гипериммунную гусиную сыворотку крови ( Б.Б. Трефилов, 2008; Derzsy D., 1970;

Bernath S., Szalai F., 1970).

Однако в комплексе мероприятий по предупреждению и ликвидации вирусного энтерита гусей (ВЭГ) важная роль отведена вакцинопрофилактике.

Несмотря на широкое применение вирусвакцины ВНИВИП сухой культуральной против ВЭГ в Российской Федерации и странах СНГ, проблема борьбы с этой болезнью остается весьма актуальной.

Исходя из изложенного, разработка высокоэффективной и технологичной инактивированной вакцины против ВЭГ, применяемой в условиях промышленного гусеводства, фермерских хозяйств и личного подворья – остается востребованной в связи с:

- отсутствием отечественного инактивированного вакцинного препарата против вирусного энтерита гусей;

- недостаточно длительным напряженным иммунитетом при применении живых вакцин против вирусного энтерита гусей;

- сокращением количества вакцинаций с целью уменьшения стрессов и нагрузки на иммунную систему;

- потребностью в вакцинном препарате, не содержащем живого вируса.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась разработка технологии изготовления инактивированной вакцины против вирусного энтерита гусей и изучение ее иммунобиологических характеристик.

Для достижения ее было необходимо решить следующие задачи:

- подобрать производственный штамм вируса энтерита гусей и изучить его биологические характеристики;

- изучить оптимальные системы культивирования вируса и его инактивацию;

- разработать компонентный состав инактивированной вакцины против вирусного энтерита гусей;

- изучить физические параметры и иммунобиологические свойства инактивированной вакцины;

вакцинированных гусей.

Научная новизна. Впервые разработана отечественная инактивированная эмульсионная вакцина против вирусного энтерита гусей.

Отработана оптимальная схема получения вируссодержащего сырья из вакцинного производственного «клона 6» вируса энтерита гусей, депонированного в ФГУ ВГНКИ №71, патент РФ №1499917 «Штамм Goosa parvovirus для приготовления вакцинных препаратов против вирусного энтерита гусей», с использованием культуры клеток эмбрионов гусей.

Обоснованы режимы инактивации вируса энтерита гусей формальдегидом и димерэтиленимином. Изучена кинетика инактивации вируса.

Научно обоснован компонентный состав инактивированной сорбированной и эмульсионной вакцины, определены оптимальные соотношения антигена и адъювантов.

Доказана ее безвредность и высокая антигенность и способность индуцировать длительный поствакцинальный иммунитет у гусынь по сравнению с вирусвакциной ВНИВИП.

Практическая значимость работы. Полученные результаты исследований послужили основанием для разработки технологии изготовления инактивированной вакцины и подготовки нормативной документации на вакцину против вирусного энтерита гусей:

инактивированную эмульсионную» (проект).

инактивированной эмульсионной», временная утверждена директором ГНУ «ВНИВИП»

Россельхозакадемии, 2010 года.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

Характеристика производственного вакцинного «клона 6» вируса энтерита гусей;

Схема получения вируссодержащего сырья для изготовления инактивированной Инактивация вируса энтерита гусей димерэтиленимином;

Компонентный состав инактивированной сорбированной и эмульсионной вакцины;

Физические и иммуногенные характеристики инактивированной вакцины против вирусного энтерита гусей.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Методического совета отдела вирусологии, опухолевых болезней птиц и иммунофармакологии и Ученого совета ГНУ «ВНИВИП» (2006-2009), на Международных агропромышленных конгрессах (СПб, 2007,2009), Международных конференциях ВНАП (2009), науно-практической конференции 3-4 июня 2008 (СПб, г.Ломоносов, 2008).

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы выполнены совместно с ведущим научным сотрудником Никитиной Н.В., за что автор выражает ей сердечную благодарность.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных статей, в том числе одна работа в издании, рекомендованном ВАК РФ, уведомление о поступлении и регистрации заявки №2010100456 от 12.01.2010 г.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 109 страницах компьютерного текста и состоит из следующих разделов: обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения и список литературы, приложения. Диссертация иллюстрирована 12 таблицами, 6 рисунками.

Список использованной литературы включает 243 источника, из них 121 зарубежный.

Работа выполнена в 2006-2009 гг. в соответствии с отраслевым планом НИР ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии по заданию 08.07.06.

В работе использовали следующие материалы:

Вирус, вакцина и диагностикум:

- производственный вакцинный «клон 6» парвовируса гусей, получен в ГНУ ВНИВИП (Штамм Goosa parvovirus для приготовления вакцинных препаратов против вирусного энтерита гусей, патент РФ №1499917.-1993).

Хранение матровой расплодки вируса осуществляли во флаконах при температуре минус 20°С и поддерживали в культуре клеток гусиных эмбрионов.

- вирусвакцина сухая культуральная ВНИВИП против вирусного энтерита гусей (СТО 00495674-0008-2008).

- набор для выявления антител к вирусу энтерита гусей иммуноферментным методом (ГНУ ВНИВИП), [ патент РФ №2323743 от 10.12.2007, RU].

Постановку ИФА и обработку результатов проводили согласно инструкции по применению и «Методическим указаниям для лабораторной диагностики вирусного энтерита (парвовирусной инфекции) гусей методом ИФА», 2005.

Инкубационное яйцо, птицы:

- яйца инкубационные гусиные 200 штук, ООО «Утиный бройлер»;

- гуси взрослые 100 голов ОАО «Утиный бройлер»;

- гуси родительское стадо ООО «Катайский гусекомплекс».

Культура клеток. Для проведения исследований была выбрана первичнотрипсинизированная культура клеток гусиных эмбрионов (КЭГ), которую готовили из кожно-мышечной ткани 14-15 – суточных гусиных эмбрионов по методике Dulbecco R. & Vogt M. (1954) в модификации Youngner J.S. (1954). В качестве ростовой питательной среды использовали среду Игла МЕМ и №199 в соотношении 2:1 с добавлением 10% нормальной сыворотки крупного рогатого скота, а также антибиотиков: пенициллина – 100 ЕД/см и стрептомицина – 100 мкг/см.

Раствор, использованный для диспергирования ткани, состоял из 0,25%-ного раствора трипсина, 0,02%-ного раствора версена и раствора Хенкса в соотношении 1:2:2.

Клеточную суспензию разливали в пробирки, матрасы и роллерные сосуды по 2, 250 и 500 см соответственно и инкубировали в термостате под углом ~ 5 (пробирки) при температуре 37С, а баллоны на роллере. В течение 24-48 часов на поверхности стекла формировался клеточный монослой, пригодный для инфицирования.

Титрование вируса на культуре клеток по цитопатогенному действию (ЦПД) проводили в чувствительной культуре КЭГ методом десятикратных разведений и с соответствующими контролями. Из культуральной вируссодержащей жидкости готовили 10кратные разведения 101108 на поддерживающей среде без добавления сыворотки.

Каждым разведением вируса заражали 4 пробирки с культурой КЭГ. Время контакта вируса с клеточным монослоем составляло 30 минут при комнатной температуре. Затем во все пробирки добавляли по 1,8 см3 поддерживающей среды Игла МЕМ. Зараженные и контрольные культуры инкубировали при температуре 37С. Ежедневно в течение 5-7 суток проводили учет ЦПД, выражая его по 4-крестовой системе.

Величину титра вычисляли по методу Reed L.J. & Muench (1938) и выражали в lg ТЦД50 в 1,0 см (тканевая цитопатогенная доза).

Проведение серологических исследований.

Реакция нейтрализации (РН). В основу РН брали стандартный, классический метод, описанный в руководствах по вирусологии.

РН ставили в культуре клеток со специфическими сыворотками, полученными от вакцинированных гусей.

Вариантами реакции были:

1. Прямая РН с постоянной дозой гомологичной сыворотки и десятикратным разведением вируса (-вариант);

2. Прямая РН с постоянной дозой вируса 100 или 1000 ТЦД50 с двукратными разведениями гомологичной сыворотки (-вариант).

Для выявления в сыворотке крови специфических антител к ВЭГ и при оценке динамики поствакционального иммунитета, применяли иммуноферментный анализ (ИФА).

В исследованиях использовали диагностический набор производства ВНИВИП.

Постановку реакции осуществляли согласно инструкции по применению. Результаты реакции учитывали на иммуноферментном анализаторе «УНИПЛАН – 2000» при длине волны – 450 нм.

Культивирование вируса энтерита гусей. Процесс культивирования ВЭГ включал следующие этапы:

- выращивание культуры клеток гусиных эмбрионов в 1,5-литровых матрасах или 5литровых роллерных сосудах;

- инфицирование культуры КЭГ вирусом энтерита;

- культивирование инфицированной культуры в стационарных условиях или на роллерах;

- микроскопия инфицированной культуры клеток;

- снятие матрасов или роллерных сосудов для замораживания при температуре минус (20±2)°С;

- трехкратное замораживание и оттаивание вируссодержащего материала (ВСМ);

- отбор проб для контроля на стерильность и инфекционную активность.

Из роллерных сосудов (матрасов) с плотным монослоем культуры КЭГ сливали ростовую среду и вносили ВСМ в поддерживающей среде pH 7,2-7,3 с множественностью заражения 0,1-1,0 ТЦД50/клетку. Инфицированную культуру культивировали в течение 3- суток при температуре (37±0,5)°С. При микроскопировании учитывали интенсивность проявления цитопатогенного действия вируса на клетки. При полной деструкции клеточного монослоя сосуды переносили в низкотемпературный холодильник (минус 20±2С°). Перед инактивацией ВСМ подвергали трехкратному замораживанию и оттаиванию.

Определение стирильности проводили в соответствии с ГОСТом 28085-90 «Препараты биологические. Методы бактериологического контроля стерильности» и согласно «Руководству МЭБ по стандартам для диагностических тестов и вакцин» на бактериальное загрязнение, исключение контаминации грибами и микоплазмами (Manual of Diagnostic Tests and Vaccine for Terrestrial Animals, 2004).

Проверку материалов на бактериальную контаминацию проводили путем высевов на питательные среды МПА, МПБ, Китт-Тароцци, а грибковую – на агар или бульон Сабуро.

О стерильности материалов судили по отсутствии роста микроорганизмов на этих питательных средах.

Инактивацию ВЭГ осуществляли путем добавления в ВСМ раствора формальдегида или димерэтиленимина в различных концентрациях при постоянном перемешивании на магнитной мешалке инкубированием при температуре (37,0±0,5)°С в течение 24 часов. Через каждые 6 часов инкубирования отбирали пробы для определения снижения титра и полноты инактивации вируса.

Полноту инактивации проверяли методом трехкратных «слепых» пассажей ВСМ в культуре КЭГ на питательной среде Игла МЕМ с 2% сывороткой крупного рогатого скота.

Отсутствие цитопатических изменений в культуре клеток в течение 5-7 суток подтверждает полноту инактивации ВЭГ.

Изготовление сорбированной формы инактивированной вакцины. Лабораторные образцы сорбированной вакцины против ВЭГ готовили с использованием 6% геля гидроокиси алюминия (ГОА), конечная концентрация составляла 0,2 и 0,3% в инактивированной вируссодержащей суспензии. ГОА добавляли при постоянном перемешивании на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 30 минут.

Изготовление эмульсионной формы инактивированной вакцины. При изготовлении лабораторных образцов инактивированной эмульсионной вакцины использовали масляный адъювант Montanide ISA 70 производства фирмы «SEPPIC», образующий эмульсию обратного типа. Инактивированный ВСМ и масло смешивали, в соотношении рекомендованном производителем адъюванта, на гомогенизаторе в течение 5-10 минут при скорости вращения винта 3000 оборотов/минуту и температуре 10С.

Готовые образцы инактивированной вакцины хранили при температуре +(2 – 8)С.

Контроль инактивированной вакцины против ВЭГ. Контроль сорбированной и эмульсионной форм инактивированной вакцины против ВЭГ осуществляли определением физических (кинетическая вязкость, стабильность эмульсии) и иммунобиологических свойств (стерильность, безвредность, антигенная и иммуногенная активность).

Определение типа вакцинной эмульсии осуществляли «капельным методом» (Stone H.D., 1997).

Стабильность эмульсии определяли центрифугированием при 3000 оборотов/минуту в течение 30 минут, методом «быстрого старения» в течение 14-суточной выдержки при температуре (37,5±0,5)С и экспресс-методом, при котором эмульсии выдерживали при температуре минус 20С в течение 1 часа, а затем при температуре (37,5±0,5)С в течение часа с последующей визуальной оценкой на предмет расслоения эмульсии.

Эмульсию считали стабильной, если после выше перечисленных испытаний в процессе визуального контроля не обнаружено никаких изменений содержимого во флаконе или высота столба прозрачной фракции, сформировавшейся в верхней части флакона, не превышала 10% от общей высоты столба эмульсии.

Кинематическую вязкость измеряли капиллярным вискозиметорм ВПЖ-2 и выражали в мм/сек. Определение вязкости проводили при температуре вакцины +20С, измеряя время истечения вакцины от первого до второго мениска с точностью 0,2 сек. Кинематическую вязкость вычисляли по формуле В = С·Г, где В – кинематическая вязкость, мм/сек; С – постоянная вискозиметра; Г – средняя арифметическая времени истечения вакцины, сек.

Гранулометрический состав вакцины определяли методом световой микроскопии.

Вакцину перед микроскопией разбавляли масляным адъювантом в соотношении 1:3, затем мкл препарата помещали под покровное стекло и исследовали под микроскопом.

Эмульсию считали хорошего качества, если в поле зрения микроскопа наблюдали равномерную мелкозернистую структуру.

Определение безвредности вакцины. Визуальную оценку степени поражения тканей в месте введения эмульсионной вакцины проводили через 28 и 42 сут после иммунизации в прививочной и пятикратной дозе вакцины по критериям, предложенным Stone H.D. (1991).

Определение антигенной и иммуногенной активности вакцины. Сущность метода заключалась в изучении способности вакцины индуцировать у вакцинированных гусей выработку специфических антител к инактивированному антигену, уровень которых определяли в PH или ИФА с применением диагностического набора ВНИВИП согласно «Методическим указаниям для лабораторной диагностики вирусного энтерита (парвовирусной инфекции) гусей методом иммуноферментного анализа», а иммуногенную активность — по результатам контрольного заражения гусят эпизоотическим штаммом П- вируса энтерита гусей.

Статистическая обработка результатов исследований.. При анализе и обобщении результатов исследований использовали статистические методы, описанные И.П.

Ашмариным с соавт. (1975) и компьютерную программу Microsoft Excel.

2.2.1 Характеристика производственного вакцинного «клона 6» вируса В разработке технологии изготовления инактивированной вакцины важное место занимает получение вирусного сырья, что, в свою очередь, зависит от выбора штамма вируса, обеспечивающего выработку напряженного и продолжительного иммунитета у вакцинированной птицы.

На первом этапе исследований нами проведена работа по изучению некоторых иммунобиологических параметров «клона 6», характеризующих как парвовирус гусей, и определению его стабильности в процессе лабораторных пассажей при изготовлении живой вирусвакцины.

На различных биологических моделях нами установлено, что вакцинный «клон 6» ДНКсодержащий вирус, размер вирусной частицы составлял 19-22 nm, апатогенный для гусиных эмбрионов и суточных гусят, ареверсибельный, резистентный к воздействию эфира, хлороформа и нагреванию при температуре 60°С, генетически однородный (сформировывал мелкие однотипные бляшки под агаром), в культурах клеток вызывал острую форму вирусной инфекции и накапливался в высоких титрах (7,5±0,5) lg ТЦД50/см3. У гусей вызывал формирование напряженного иммунитета, обеспечивающего невосприимчивость гусят к заражению.

На основании полученных данных в качестве производственного штамма вируса энтерита гусей (ВЭГ) был выбран вакцинный «клон 6», депонированный во ФГУ ВГНКИ №71, который предложен для изготовления вирусвакцины против вирусного энтерита гусей (Б.Б.

Трефилов, 2000) 2.2.2 Разработка оптимальной схемы получения вирусного сырья Успех производства вакцины во многом обусловлен качеством исходного биологического сырья. Поэтому культивирование вируса является одним из основных этапов в технологии изготовления биопрепарата.

Главной задачей данного этапа работы было изыскание оптимального метода культивирования вируса, множественности инфицирования культуры КЭГ и времени накопления вируса.

С целью максимального накопления антигена были определены оптимальные условия репродукции вируса в стандартных, суспензионных и роллерных культурах при различных концентрациях клеток 1106 – 1,5106 см и множественности инокуляции. Результаты опытов представлены в табл. 2.2.2.

Данные, приведенные в табл. 2.2.2.1 показывают, что при роллерном способе культивирования, множественности заражения 1,0 ТЦД50/кл и концентрация 1,510 6 клеток