На правах рукописи

ГАЙНУЛЛИНА

КАРИНА ПЕТРОВНА

ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА

ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ ГОРОХА (PISUM SATIVUM L.)

В УСЛОВИЯХ ПРЕДУРАЛЬСКОЙ СТЕПИ БАШКОРТОСТАНА

Специальность 06. 01. 05. – Селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт – Петербург 2013 1 Диссертационная работа выполнена в лаборатории селекции и семеноводства зернобобовых культур и лаборатории молекулярно-генетической экспертизы Государственного научного учреждения Башкирский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Россельхозакадемии в 2009-2012 гг.

доктор сельскохозяйственных наук

Научный руководитель Фирзинат Аглямович Давлетов заведующий лабораторией селекции и семеноводства зернобобовых культур ГНУ БНИИСХ Россельхозакадемии доктор биологических наук

Официальные оппоненты Ирина Николаевна Анисимова ведущий научный сотрудник отдела генетики ГНУ ВИР Россельхозакадемии кандидат сельскохозяйственных наук Светлана Михайловна Синицына главный специалист Северо-Западного регионального научного центра Россельхозакадемии

Ведущая организация ГНУ Татарский НИИСХ Россельхозакадемии

Защита диссертации состоится 18 декабря 2013 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 006.041.01 при ГНУ Всероссийский научноисследовательский институт растениеводства им. Н.И. Вавилова Россельхозакадемии по адресу: 190000, Санкт-Петербург, ул. Большая Морская, 44; факс 812-571-87-28; e-mail:

[email protected]

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИР Россельхозакадемии.

Автореферат разослан и размещен на официальном сайте ВАК Минобрнауки РФ http://vak.ed.gov.ru и на сайте ГНУ ВИР Россельхозакадемии 17 ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, Вера Алексеевна доктор биологических наук Гаврилова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Одна из важнейших зернобобовых культур в мире – горох посевной (Pisum sativum L.). Российская Федерация занимает второе место в мире по посевным площадям зернового гороха – 1160,2 тыс. га при средней урожайности 1, т/га (www.faostat.fao.org).

Сравнительно низкие урожаи зерна гороха в нашей стране связаны с несовершенством технологий возделывания, отсутствием комплекса уборочных машин.

Выращиваемые сорта в производстве еще недостаточно устойчивы к неблагоприятным условиям возделывания, болезням и вредителям, нуждаются в улучшении по целому ряду признаков и свойств. Актуальной задачей селекции на современном этапе является создание новых, высокотехнологичных сортов зернового гороха, наиболее полно реализующих почвенно-климатический потенциал региона и отвечающих требованиям сельскохозяйственного производства (Давлетов Ф.А., 2008).

Ключевую роль в создании новых высокопродуктивных и адаптивных сортов должен играть исходный материал для селекции, источником которого служит коллекция гороха ВИР. Генофонд гороха, сохраняемый в коллекции, отражает мировое разнообразие этой ценной, экономически значимой культуры, поэтому его изучение играет большую роль для развития селекции гороха (Макашева Р.Х., 1979; Соболев Д.В., 2009; Вишнякова М.А., 2012). В настоящее время с развитием молекулярной биологии и генетики появились методы, позволяющие проводить оценку полиморфизма на уровне ДНК.

Одним из наиболее современных методов ДНК-анализа является изучение микросателлитных локусов. В геноме гороха посевного было обнаружено большое число микросателлитов, однако распределение их аллелей в генотипах отдельных линий и сортов практически не исследовано (Loridon K. et al., 2005). Типирование с помощью микросателлитных маркеров позволяет создавать базы данных для идентификации и паспортизации сортов и линий гороха, а также для дальнейшего планирования эффективных скрещиваний, в которых выявляется наибольший генетический полиморфизм (Дрибноходова О.П., 2009).

В Республике Башкортостан, в Чишминском селекционном центре по растениеводству селекцией гороха занимаются более 70 лет. Здесь создана целая серия сортов, отвечающих требованиям своего времени. Современная селекция сталкивается с узкой генетической основой исходного материала и необходимостью оценки его генетического разнообразия. Ранее в Республике Башкортостан оценка исходного материала гороха проводилась только по биологическим и агрономическим признакам.

Широкое использование в гибридизации получил принцип подбора родительских пар на основе генетической отдаленности сортов, которую определяют по расчетам фенотипической и генотипической вариансы и коэффициента наследуемости (Давлетов Ф.А., 1996, 2006). Эта методика крайне трудоемка, поскольку требует оценки структуры урожая у больших выборок образцов. Для выявления генетического разнообразия исходного материала необходимо привлечение качественно новых, в частности, молекулярно-генетических методов, многократно снижающих трудоемкость и время анализа.

Цель работы – выявление генетического разнообразия и оценка селекционной ценности образцов зернового гороха из коллекции ВИР для дальнейшего их использования при создании сортов в условиях Предуральской степи Башкортостана.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить фенологию образцов гороха;

2. Изучить важнейшие морфоструктурные признаки, установить их связь с продуктивностью;

3. Оценить образцы по ряду биологических признаков: засухоустойчивость, содержание белка в семенах, разваримость;

4. Выявить образцы со стабильной продуктивностью в меняющихся условиях среды, выделить источники ценных признаков, перспективные для селекции;

5. Изучить генетический полиморфизм образцов гороха и выявить дифференциацию изученного генофонда на основе ДНК-типирования;

6. Составить генетические паспорта изученных сортов и линий.

Научная новизна. Впервые в Республике Башкортостан проведен анализ молекулярно-генетического полиморфизма коллекционного материала зернового гороха с помощью микросателлитных маркеров. Установлен характер распределения аллелей микросателлитных локусов у изученных образцов, проведена оценка их генетического разнообразия. Показана возможность быстрой идентификации ряда коллекционных образцов гороха по наличию у них уникальных аллелей.

Установлены достоверные связи ряда качественных признаков с частотами аллелей изученных микросателлитных локусов.

По результатам комплексной оценки образцов гороха, впервые изученных в условиях Предуральской степи Башкортостана, выделены источники для селекции по ряду хозяйственно-ценных признаков и свойств.

Практическая значимость исследования. Выделены и рекомендованы для использования в селекции источники ценных свойств и признаков: продуктивности, скороспелости, неполегаемости, засухоустойчивости, высокого качества зерна.

Составлена база данных, представляющая собой молекулярно-генетическое описание исследованных образцов гороха. Полученные генетические паспорта сортов и линий гороха могут быть в дальнейшем использованы в селекции, при передаче сортов в Госкомиссию и для контроля чистоты посевного материала, а также для поиска маркеров хозяйственно-ценных признаков.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всероссийской научно-практической конференции «Роль науки в инновационном развитии сельского хозяйства», посвященной 75-летию со дня рождения У.Г. Гусманова (Уфа, 2010), Шатиловских чтениях «Новые сорта сельскохозяйственных культур – составная часть инновационных технологий в растениеводстве», посвящённых 115-летию Шатиловской СХОС (Орел, 2011), Всероссийской молодежной конференции «Актуальные проблемы генетики и молекулярной биологии» (Уфа, 2012), Региональном конкурсе молодых ученых «Современные научные исследования в свете учений Н.И. Вавилова и П.Н. Константинова», посвященном 125-летию со дня рождения Н.И. Вавилова и 135летию со дня рождения П.Н. Константинова (Усть-Кинельский, 2012), Конкурсе на лучшую научную работу молодых ученых вузов и научных учреждений Республики Башкортостан (Уфа, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, в том числе публикации в изданиях, рекомендуемых ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 156 страницах, содержит 17 рисунков и 12 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждений, заключения, выводов, списка цитированной литературы, включающего 200 работ, и приложений.

УСЛОВИЯ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводили в 2009-2012 гг. в ГНУ Башкирский НИИ сельского хозяйства РАСХН. Полевые опыты закладывали на опытном поле Чишминского селекционного центра по растениеводству. Молекулярно-генетическое изучение образцов гороха осуществлялось в лаборатории молекулярно-генетической экспертизы.

Почвы опытного участка – карбонатные черноземы средней мощности, среднесуглинистые. Содержание гумуса в верхнем слое почвы – 8,3-8,5%, общего азота – 0,4%, подвижного калия на 100 г почвы – 42,1 мг, окиси фосфора – 23,7 мг. Почва имеет нейтральную реакцию (pH=6,5-7,0). Предшественник в опытах – озимые культуры.

Агроклиматические условия в годы проведения исследований были контрастными: от засушливо-жарких в 2010 г. до относительно благоприятных по гидротермическому режиму в 2009, 2011, 2012 гг. Таким образом, погодные условия в годы проведения исследований дали возможность всесторонне оценить изучаемый селекционный материал по адаптивной возможности к условиям региона.

Материалом исследования служили 77 образцов гороха посевного (Pisum sativum L.) из коллекции мировых генетических ресурсов ВИРа, Башкирского НИИСХ и других научно-исследовательских учреждений. В 2009-2011 гг. в изучении находилось образцов гороха, в том числе 34 местной, 19 инорайонной отечественной и 15 зарубежной селекции. В 2010-2012 гг. дополнительно было изучено 9 образцов зарубежной селекции.

Посев проводили селекционной сеялкой СКС-6-10. Площадь делянки – 3 м2. В качестве стандарта использовали сорт Чишминский 95. Площадь питания растений – 205 см.

Фенологические наблюдения, учеты и измерения проводили по методике ГНУ Всероссийский НИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова (1985), принятой для коллекционного питомника. Отмечали даты всходов, цветения и полной спелости. За начало каждой из этих фаз принимался день, когда в нее вступали 10-15% растений, а за полное наступление фазы – когда она наблюдалась примерно у 75% растений. На основании полученных данных по каждому образцу определяли продолжительность вегетационного периода от всходов до полной спелости.

Ежегодно для характеристики и сравнения образцов по морфологическим признакам и элементам структуры урожая отбирали во время уборки пробные снопы.

После просушки растений в снопах проводили структурный анализ по селекционноценным признакам 20 растений каждого сорта.

Коэффициент устойчивости образцов к полеганию рассчитывали как отношение высоты стеблестоя перед уборкой к высоте растений. Чем ближе данная величина к единице, тем более устойчив сорт к полеганию (Хухлаев И.И., 2009).

Оценку коллекционных образцов гороха на засухоустойчивость проводили методом контрастных лет (Абрамов В.К., Корнев А.И, 1984). За критерий засухоустойчивости принимали степень снижения продуктивности растений в засушливый 2010 г. (опытный вариант – засуха) по сравнению со средней продуктивностью растений за остальные годы изучения.

Для определения процентного содержания белка использовали метод микроКьельдаля. Разваримость семян определяли по методике А.В. Соснина (1927). Учет урожая семян проводили по методике государственного сортоиспытания сельскохозяйственных культур (1985).

Результаты исследований подвергали математической обработке общепринятыми методами (Молостов А.С., 1966; Доспехов Б.А., 2011). Дисперсионный, корреляционный и кластерный анализ проводили с помощью программы StatSoft Statistica 6.0.

Для молекулярно-генетического анализа было отобрано 33 образца гороха посевного, в том числе 12 образцов местной, 4 инорайонной отечественной и зарубежной селекции. Анализ полиморфизма исследованных образцов проводили с помощью метода SSR-ПЦР.

Тотальную ДНК выделяли из молодой слабопигментированной ткани пророщенных растений гороха с помощью коммерческого набора «Genomic DNA Purification Kit» («Fermentas»). Для анализа было использовано 5 микросателлитных локусов, которые ранее применялись для исследования межлинейного полиморфизма у линий, сортов и мутантов гороха посевного (Дрибноходова О.П., 2009). Полимеразную цепную реакцию проводили в амплификаторе «ДТ-322» фирмы «ДНК-Технология» по программе: денатурация при 94°C – 1 мин.; 3 цикла: денатурация при 94°С – 30 сек., отжиг праймеров при 58°С – 20 сек., элонгация при 72°С – 5 сек.; 33 цикла: денатурация при 94°С – 15 сек., отжиг праймеров при 58°С – 20 сек., элонгация при 72°С – 1 мин.;

конечная элонгация при 72°С – 30 мин.

Продукты амплификации с длиной амплифицируемого фрагмента менее 250 п.н.

разделяли электрофоретически в 6% неденатурирующем полиакриламидном геле, а с длиной фрагмента более 250 п.н. – в 3% агарозном геле. Горизонтальный электрофорез проводили при напряженности электрического поля 120 В течение 3-4 часов, вертикальный электрофорез – при 300 В в течение 3-3,5 часов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Оценка коллекционных образцов гороха по морфобиологическим и хозяйственноценным признакам и свойствам вегетационного периода у каждого образца изменялась по годам в зависимости от обеспеченности теплом и количеством осадков в период от цветения до созревания. Так, засушливо-жаркие условия, сложившиеся в период вегетации гороха в 2010 г. несколько сократили продолжительность вегетационного периода у изученных образцов.

В наших исследованиях в среднем за 2009-2012 гг. продолжительность периода всходы – созревание находилась в пределах 59,3±2,6 64,3±3,3 сут (НСР05=3,9).

Наименьшая продолжительность вегетационного периода (59,3±2,6 – 60,3±3,2 сут) отмечена у образцов Чишминский 80, Л-26335 (Орел 11 Л-18253), Л-27312 (КС3/ Чишминский 95), Л-28158 (ГВГ1156 Усач), Л-29477 (Усач Кормовой 5), Л-29825 (ЛКормовой 5), Л-29865 (Усач Чишминский 95), Л-30346 (Чишминский 229 ЛК-6753 (Чехия). В селекции на раннеспелость представляют интерес образцы Чишминский 95, Чишминский 75, Чишминский 80, Л-23654 (Поп.15-79 Труженик), 8247НО, К-8750 (Португалия), имеющие короткий вегетационный период и сочетающие скороспелость с высокой продуктивностью семян.

Высота растений. Известно, что высота стебля определяет технологичность сорта, влияет на устойчивость к полеганию. Высокорослые сорта, как правило, дают более высокие урожаи по сравнению с низкорослыми сортами, но склонны к полеганию.

Поэтому в селекционном плане особую ценность представляют короткостебельные формы. В наших исследованиях в течение ряда лет (2009–2012 гг.) высота растений варьировала от 24,0±0 см до 75,3±22,9 см (НСР05=15,6).

Для практической селекции представляют интерес образцы с высотой стебля не менее 55 см с усатым типом листа, а именно: Л-26335 (Орел 11 Л-18253) – 55,7±5,8 см, Л-26742 ((Улад. юб. Шихан) Шихан) – 55,7±12,3 см, Л-27591 (К-6369 Усач) – 65,3±8,8 см, Л-27592 (К-6369 Усач) – 62,7±9,3 см, Л-27593 (К-6369 Усач) – 65,0±9, см, Л-27602 (КС4/89НПО Дон Л-23148) – 63,0±7,2 см, Л-28158 (ГВГ1156 Усач) – 60,0±8,4 см, Л-28724 (Чишминский 80 Усач) – 58,0±12,2 см, Л-29477 (Усач Кормовой 5) – 55,0±17,6 см, Л-29825 (Л-27264 Кормовой 5) – 65,7±19,3 см, Л-29865 (Усач Чишминский 95) – 58,3±19,5 см, Л-30346 (Чишминский 229 Л-27266) – 60,0±18,5 см, Орел 11 – 58,0±6,0 см, Спрут – 65,3±10,4 см, Флагман 9 – 55,3±7,4 см, И-0141086 Тюмень (ВИР) – 60,3±10,2 см, К-8393 Орел 2144 – 69,0±7,2 см, К-8396 Орел 2141 – 66,3±4,7 см, Усатый 90 – 61,0±11,2 см, К-9109 Харвус 1 (Украина) – 57,3±10,7 см (НСР05=15,6).

Число продуктивных узлов. В среднем за 2009-2012 гг. число продуктивных узлов у образцов варьировало от 1,6±0,2 шт до 3,3±0,7 шт (НСР05=0,7).

В 2009 г. статистически достоверно превысили стандарт – сорт Чишминский образцы Мелкосемянный 2, 8247НО, Зеленозерный 1, Красноуфимский 93, К-8396 Орел 2141, Уладовский 287 (Украина) (2,6±0,2 – 3,3±0,2 шт, НСР05=0,4), в 2010 г. – Ирэндек, Кормовой 5, Уфа 75, Чишминский 75, Шихан, Л-27201 (КС3/89НПО Дон Чишминский 75), Л-27602 (КС4/89НПО Дон Л-23148), Батрак, Красноуфимский, Кузбасс, Белковая гроздь (Украина), Труженик (Украина), К-6753 (Чехия), К-7992 (Корея) (2,2±0,2 – 4,0±0, шт, НСР05=0,3), в 2011 г. – Чишминский 75 (5,2±0,3 шт, НСР05=0,7), в 2012 г. – К- (США), К-7044 (Ливия) (2,9±0,2 – 3,0±0,2 шт, НСР05=0,5).

Число бобов на растении зависит от числа продуктивных узлов и бобов на продуктивном узле. В среднем в 2009-2012 гг. в наших опытах число бобов на растении у изученных образцов изменялось от 2,1±0,3 шт до 4,8±1,7 шт (НСР05=0,9).

Достоверно высокими значениями по данному признаку на 5% уровне значимости в 2009 г. отличались образцы Красноуфимский 93, Флаванда, К-8396 Орел 2141 (3,9±0,3 – 4,5±0,3 шт, НСР05=0,5), в 2010 г. – Кормовой 5, Чишминский ранний, Чишминский 75, Чишминский 80, Чишминский 229, Шихан, Л-27259 (К-7779 Труженик), Л-27262 (КТруженик), Л-28158 (ГВГ1156 Усач), 8247НО, Казанец, Красноуфимский 93, Спрут, Флаванда, И-0141086 (ВИР), К-8393 Орел 2144, К-8396 Орел (3,0±0,4 – 5,8±0,3 шт, НСР05=0,6), в 2011 г. – Чишминский 75 (8,2±0,5 шт, НСР05=0,9), в 2012 г. – К- (Индия), К-7779 (Англия) (2,9±0,2 – 3,1±0,1 шт, НСР05=0,5).

Число семян в бобе. В среднем в 2009-2012 гг. число семян в бобе у изученных нами образцов варьировало от 2,7±0,7 шт до 5,8±0,1 шт (НСР05=0,4).

В наших опытах в 2009 г. достоверно высокой озерненностью бобов на 5% уровне значимости отличились образцы Мелкосемянный 2, Л-23654 (Поп.15-79 Труженик), ЛКС3/89НПО Дон Чишминский 75), Л-27218 (К-7779 Труженик), Л- (КС3/89 Чишминский 95), Л-27591 (К-6369 Усач), Л-27592 (К-6369 Усач), Л- (К-6369 Усач), Л-29477 (Усач Кормовой 5), Л-30346 (Чишминский 229 Л-27266), 8247НО, Батрак, И-0141086 Тюмень (ВИР), Кузбасс, Белковая гроздь (Украина), К- Харвус 1 (Украина) (4,6±0,3 – 5,6±0,2 шт, НСР05=0,7), в 2010 г. – Ирэндек, Мелкосемянный 2, Памяти Хангильдина, Уладовский юбилейный Усач, Чишминский ранний, Л-27259 (К-7779 Труженик), Л-27602 (КС4/89НПО Дон Л-23148), Л- (Чишминский 80 Усач), Л-29825 (Л-27264 Кормовой 5), Зеленозерный 1, Казанец, Мультик, Орел 11, Тюменец, К-8977 Орел, Труженик (Украина), Уладовский (Украина), Усач (Украина), К-4954 (Франция), К-6017 (Франция), К-6299 (Марокко), ККорея) (4,2±0,6 – 6,2±0,5 шт, НСР05=1,0), в 2011 г. – Л-27602 (КС4/89НПО Дон ЛЛ-29825 (Л-27264 Кормовой 5), Зеленозерный 1, Уладовский 287 (Украина), КФранция), К-7779 (Англия) (5,0±0,7 – 5,8±0,3 шт, НСР05=1,0), в 2012 г. – К- (Франция) (6,2±0,6 шт, НСР05=1,0).

Число семян с растения. Один из наиболее важных признаков в структуре урожая гороха – число семян на растении. В среднем за 2009-2012 гг. в наших опытах число семян с растения у изученных образцов находилось в пределах от 8,0±2,0 шт до 17,9±5,9 шт (НСР05=3,5).

В 2009 г. наибольшее число семян с растения, достоверно превышающее стандарт, имели образцы Мелкосемянный 2, Чишминский 229, Л-23654 (Поп.15-79 Труженик), ЛК-7779 Труженик), Л-27591 (К-6369 Усач), Л-27592 (К-6369 Усач), Л- (КС4/89НПО Дон Л-23148), Арендатор, Красноуфимский 93, Флагман 9, К-8393 Орел 2144, К-8396 Орел 2141 (15,0±1,2 – 18,7±1,6 шт, НСР05=2,6), в 2010 г. – Ирэндек, Кормовой 5, Мелкосемянный 2, Памяти Хангильдина, Уладовский юбилейный Усач, Чишминский ранний, Чишминский 75, Чишминский 80, Чишминский 229, Шихан, ЛК-7779 Труженик), Л-27262 (К-7779 Труженик), Л-27602 (КС4/89НПО Дон Л-23148), Л-28158 (ГВГ1156 Усач), 8247 НО, Зеленозерный 1, Казанец, Красноуфимский 93, Кузбасс, Мультик, Тюменец, К-8393 Орел 2144, К-8977 Орел, Смарагд (Германия), Труженик (Украина), Уладовский 287 (Украина), К-4954 (Франция), К-6017 (Франция), К-6299 (Марокко), К-6548 (Индия), К-6753 (Чехия), К-7992 (Корея), КНидерланды), К-8500 (Белоруссия), К-8750 (Португалия), К-9109 Харвус (Украина) (10,0±1,0 – 17,2±0,9 шт, НСР05=2,5), в 2011 г. – Чишминский 75 (29,6±2,7, НСР05=3,9), в 2012 г. – К-8814 (США) и К-7779 (Англия) (11,8±0,9 – 13,5±1,3 шт, НСР05=2,1).

Масса 1000 семян. В среднем за 2009-2012 гг. у изученных образцов масса семян колебалась от 117,3±12,0 г до 292,3±33,4 г (НСР05=21,5). Однофакторный дисперсионный анализ показал наличие достоверных отличий лет изучения (2009- гг.) на 5% уровне значимости: в среднем за 2009 г. масса 1000 семян составила 242,9±4, г, за 2010 г. – 234,1±4,1 г, за 2011 г. – 206,2±3,8 г (НСР05=0,7). Таким образом, крупность семян зависит не только от сорта, но и от условий среды.

Масса семян с растения (продуктивность). Семенная продуктивность растений гороха – поликомпонентный признак и слагается из различных элементов структуры урожая. В 2009 году в наших опытах по продуктивности достоверно превысили стандарт образцы Л-23654 (Поп. 15-79 Труженник), Арендатор, Флаванда, Флагман 9, К- Орел 2141 (4,0±0,2 – 4,9±0,3 г/растение, НСР05=0,7), в 2010 г. – Памяти Хангильдина, Уладовский юбилейный Усач, Чишминский ранний, Чишминский 80, Чишминский 229, Шихан, Л-27259 (К-7779 Труженик), Л-27262 (К-7779 Труженик), Л- (КС4/89НПО Дон Л-23148), Л-28158 (ГВГ1156 Усач), 8247НО, Казанец, Тюменец, Смарагд (Германия), Топаз (Украина), Топаз 2 (Украина), Труженик (Украина), Уладовский 287 (Украина), К-4954 (Франция), К-6299 (Марокко), К-6753 (Чехия), К- (Корея), К-8289 (Нидерланды), К-8500 (Белоруссия), К-8750 (Португалия), К-8814 (США) (2,5±0,3 – 4,1±0,4 г/растение, НСР05=0,6), в 2011 г. Чишминский 75, К-7779 (Англия) (5,0±0,3 – 6,4±0,6 г/растение, НСР05=0,8), в 2012 г. – К-8814 (США) (2,8±0,2 г/растение, НСР05=0,5).

По результатам изучения образцов гороха посевного в 2009-2011 гг. нами был проведен корреляционный анализ полученных данных, результаты которого представлены в таблице 1.

Коэффициенты корреляции средних значений морфобиологических и хозяйственно-ценных признаков изученных образцов в 2009-2011 гг.

период всходы – цветение, сут период цветение – созревание, сут период всходы – созревание, сут число продуктивных узлов, шт число бобов на растении, число семян с растения, корреляции.

Установлено, что масса семян с растения в большей степени зависит от числа бобов и семян с растения: за годы изучения между этими показателями наблюдались положительные корреляции (r=0,65 и r=0,59 соответственно). В меньшей степени продуктивность зависела от массы 1000 семян (r=0,45) и от числа продуктивных узлов (r=0,42). Результаты наших исследований показали, что масса 1000 семян имеет отрицательную связь с числом семян с растения (r=-0,44), числом семян в бобе (r=-0,55) и с продолжительностью периода всходы – цветение (r=-0,34). Продолжительный период цветение – созревание способствует повышению массы 1000 семян (r=0,23). Между длиной периода всходы – цветение и периода цветение – созревание была выявлена отрицательная связь (r=-0,53). Также продолжительность межфазного периода всходы – цветение отрицательно коррелировала с числом продуктивных узлов на растении (r= -0,24). Напротив, удлинение периода всходы – цветение приводило к увеличению числа семян в бобе (r=0,25). Продолжительность полного вегетационного периода зависит от продолжительности межфазных периодов всходы – цветение (r=0,40) и цветение – созревание (r=0,57). Средние коэффициенты корреляции были отмечены между числом продуктивных узлов и числом бобов на растении (r=0,69), числом продуктивных узлов и числом семян с растения (r=0,52), числом бобов на растении и числом семян с растения (r=0,62). Число продуктивных узлов в наших исследованиях положительно зависело от высоты растения (r=0,23), а число семян с растения – от числа семян в бобе (r=0,47).

Отрицательная связь (r=-0,37) была установлена между числом бобов на растении и числом семян в бобе.

Засухоустойчивость. Для сельскохозяйственного производства республики необходимы сорта гороха, обладающие высокой пластичностью, продуктивностью и засухоустойчивостью. В процессе работы нам удалось выделить образцы гороха, различающиеся по реакции на дефицит влаги (рис. 1).

Очевидно, что у образцов с повышением засухоустойчивости снижается продуктивность. По нашим данным, среди изученного набора образцов выделено два высокопродуктивных и одновременно засухоустойчивых образца. В селекции на засухоустойчивость особый интерес представляют следующие образцы:

1. Высокопродуктивные и высокозасухоустойчивые: Чишминский 229, К- (Португалия).

2. Высокопродуктивные и среднезасухоустойчивые: Чишминский 95, Чишминский 80, Памяти Хангильдина, 8247НО, Топаз (Украина).

3. Среднепродуктивные и высокозасухоустойчивые: Уладовский юбилейный Усач, Л-27259 (К-7779 Труженик), Л-27602 (КС4/89НПО Дон Л-23148), Л- (ГВГ1156 Усач), Казанец, К-8393 Орел 2144, К-6753 (Чехия), К-7992 (Корея), К- (Белоруссия).

4. Среднепродуктивные и среднезасухоустойчивые: Кормовой 5, Уфа 75, Шихан, Л-26665 (Чишминский 75 Л-21924), Л-26742 ((Улад. юб. Шихан) Шихан), Л- (КС3/89НПОДон Чишминский 75), Л-27218 (К-7779 Труженик), Л-27262 (К- Труженик), Л-27312 (КС3/89 Чишминский 95), Л-28724 (Чишминский 80 Усач), Зеленозерный 1, Красноуфимский 93, Кузбасс, Орловчанин, Тюменец, Смарагд (Германия), Топаз 2 (Украина), Труженик (Украина), Уладовский 287 (Украина), Усач (Украина), К-2601 (Италия), К-8814 (США), К-9109 Харвус 1 (Украина).

Критерий засухоустойвоти, % Устойчивость к полеганию. Среди изученных образцов наибольшей устойчивостью к полеганию (0,75-0,87) отличались: Памяти Хангильдина, Уфа 75, ЛК-7779 Труженик), Л-27262 (К-7779 Труженик), Батрак, Казанец, Мультик, Флагман, Флагман 9, К-8714 (Адыгея), Чарльстон (Англия). Большинство образцов усатого типа характеризовались высокой устойчивостью к полеганию.

Оценка на качество. Содержание белка в семенах гороха в годы изучения варьировало от 19,4% до 22,5%. В среднем по трехлетним данным выделено 12 образцов, превысивших стандартный сорт Чишминский 95. К ним относятся образцы Памяти Хангильдина, Мультик, Л-27602 (КС4/89НПОДон Л-23148), Л-29012, Л-29108, Л-29476, Л-29477 (Усач Кормовой 5), Л-29488, Л-29561, Л-29825 (Л-27264 Кормовой 5), ЛУсач Чишминский 95), Л-30050.

Различия между образцами по коэффициенту разваримости семян составляли 0,2единиц, а по продолжительности варки – 0,9-26,5 минут. Образцы Чишминский 95, Памяти Хангильдина, Л-27200, Л-27270, Л-27602 (КС4/89НПОДон Л-23148), Л- (Усач Чишминский 95) характеризовались хорошей разваримостью семян.

Кроме перечисленных изученных признаков все образцы были классифицированы по признакам окраски семян, осыпаемости семян и типу листа (усатый и листочковый морфотипы).

Поиск молекулярно-генетических различий между образцами. В результате молекулярно-генетического исследования 33 образцов гороха посевного методом SSRPCR нами были получены данные по аллельному состоянию 5 микросателлитных локусов (АА255, AА200, D21, AD147, AB28). Все проанализированные образцы отличались уникальным сочетанием аллелей, а сами аллели хорошо распознавались при повторных анализах (рис. 2, 3).

Рисунок 2. SSR-спектры образцов гороха в агарозном геле, полученные при Число аллелей, амплифицирующихся в конкретном локусе, менялось от 3 (АА255, АА200) до 7 (D21). Число полученных аллелей составило 23, то есть в среднем 4, аллелей на локус. Индекс полиморфизма микросателлиных локусов менялся от 0, (АА200) до 0,78 (AD147), составляя в среднем 0,63. Полученные нами данные по генотипированию изученных образцов являются основой для расчета уровня внутривидовой изменчивости гороха посевного и определения сортовой принадлежности образцов.

Рисунок 3. SSR-спектры образцов гороха в полиакриламидном геле, полученные при Идентификация образцов гороха. Проведение генетической паспортизации считается актуальной задачей современной селекции. Наиболее быстрый и эффективный метод идентификации сортов – определение сортовой принадлежности по ДНК-маркерам.

Мы определяли возможность идентификации 33 образцов гороха посевного местной, инорайонной отечественной и зарубежной селекции с помощью пяти микросателлитных маркеров. На основе полученных данных были составлены генетические формулы, характеризующие полиморфизм каждого из 33 проанализированных образцов по использованным микросателлитным локусам. При составлении генетического паспорта записывали название микросателлитного маркера, номер аллеля указывали в виде правого верхнего индекса, размер самого короткого аллеля – в виде правого нижнего индекса (табл. 2).

Генетические паспорта образцов гороха посевного Л-26742 ((Улад. юб. Шихан) Шихан) AA255 3 AA200 1 D21 3 AD147 300 AB Л-29825 (Л-27264 Кормовой 5) AA255 2 AA200 1 D21 2 AD147 300 AB Л-29865 (Усач Чишминский 95) AA255 2 AA200 3 D21 2 AD147 5 AB Л-30346 (Чишминский 229 Л-27266) AA255 3 AA200 3 D21 2 AD147 300 AB К-9109 Харвус 1 (Украина) AA255 3 AA200 3 D21 9 AD147 3 AB Поиск взаимосвязей между данными молекулярно-генетического анализа и оценки хозяйственно-ценных признаков. Урожайность семян – сложный признак, слагающийся из многих элементов. Среди изученных нами количественных признаков наибольший вклад в продуктивность растений гороха вносит число бобов с растения, а также масса и число семян с растения. Попытки определить количество генов, обусловливающих сортовые различия по признаку продуктивности, не дали результата.

Это свидетельствует о наличии сложного взаимодействия между генами (Давлетов Ф.А., 2008). В литературных источниках имеется ряд публикаций, в которых микросателлиты рассматриваются как маркеры, дающие возможность определять корреляцию между хозяйственно-ценными признаками и определяющими их генетическими структурами и вести отбор сельскохозяйственных растений и животных с желательным генотипом.

(Ogorevc J. et al., 2009) В результате проведенных опытов нами были установлены достоверные связи некоторых качественных признаков с частотами аллелей изученных микросателлитных локусов (табл. 3).

При анализе ДНК-полиморфизма у выделенных нами двух высокопродуктивных и одновременно засухоустойчивых образцов – Чишминский 229 и К-8750 (Португалия) выявлено специфическое сочетание аллелей по локусам AA200, D21 и AD147, отсутствующее у других изученных нами образцов. Данное сочетание аллелей по 3 SSRлокусам (AA200 3 D21 2 AD147 1 ) может служить дополнительным критерием при отборе и прогнозировании высокой продуктивности и засухоустойчивости гороха посевного.

Частоты аллелей некоторых SSR-локусов у образцов, различающихся по признакам Исследование молекулярно-генетических различий между образцами. Средний уровень межгруппового полиморфизма микросателлитных локусов среди образцов местного, инорайонного отечественного и зарубежного происхождения составил 58,37%.

Максимальный уровень различий был равен 100%, минимальный – 20%.

Анализ частот встречаемости аллелей среди изученных образцов. Данные по распределению частот аллелей по исследованным микросателлитным локусам отражены в диаграммах (рис. 4-8).

Рисунок 4. Распределение аллелей локуса AA255 у исследованных образцов гороха.

Диаграмма, представленная на рис. 4 свидетельствует, что у исследованных нами образцов гороха по локусу AA255 наиболее часто встречается аллель 2 (70%). Аллели 1 и 3 являются менее распространенными.

На рис. 5 представлена диаграмма, отражающая распределение аллелей локуса AA200. По данному локусу у изученных образцов гороха преобладал аллель 3 (76%). С меньшей частотой встречался аллель 1 (21%). Аллель 2 был выявлен только у образца Шихан, что позволяет использовать локус AA200 для экспресс-диагностики данного сорта.

Рисунок 5. Частоты аллелей локуса AA200 у изученных образцов гороха.

По локусу D21 (рис. 6) нами было выявлено наибольшее число аллелей по сравнению с другими локусами, использованными в работе для молекулярногенетического анализа. По частоте встречаемости преобладали аллели 2 (39%) и 9 (21%).

Реже встречались аллели 3 (9%), 6 (12%) и 7 (12%). Наименее распространенными оказались аллели 8 (3%) и 4 (3%). По данному локусу было выявлено несколько сортоспецифических маркеров: аллель 4 обнаружен только у образца К-6548 (Индия), а аллель 8 – только у образца К-8289 (Нидерланды). Таким образом, локус D21 можно использовать для экспресс-диагностики указанных образцов.

Рисунок 6. Процентное соотношение аллелей локуса D На рис. 7 представлена диаграмма, отражающая процентное соотношение аллелей локуса AD147 у изученных образцов. Очевидно, что аллели данного локуса распределены относительно равномерно.

Рисунок 7. Распределение аллелей локуса AD147 у изученных образцов гороха.

Аллели локуса AB28 также встречались с приблизительно одинаковой частотой, за исключением аллеля 1, распространенность которого среди исследованных нами образцов гороха составила 6% (рис. 8).

Рисунок 8. Частоты аллелей локуса AB28 у исследованных образцов гороха.

Кластерный анализ на основе данных молекулярно-генетической оценки образцов. На основе общей матрицы полученных и обработанных данных SSR-анализа ДНК образцов гороха была построена дендрограмма, отображающая генетическое разнообразие и кластеризацию изученных образцов (рис. 9).

Для интерпретации такой дендрограммы нужно обладать данными о родословных и подробными характеристиками образцов. Педигри доступны нам только для сортов местной селекции (Давлетов Ф.А., 2006), поэтому постараемся проанализировать их положение в этой дендрограмме.

Рисунок 9. Дендрограмма генетических различий 33 образцов гороха, построенная на основе SSR-анализа (подчеркиванием выделены образцы местной селекции).

На дендрограмме четко обособлены 3 большие группы (A, B и C), которые, в свою очередь, делятся на несколько минорных.

Большинство изученных образцов местной селекции (8 из 12) сгруппировались в большом кластере А. Все эти образцы имеют в своих родословных наряду с инородным материал местной селекции. Очень тесную близость обнаруживают линия Л-29865 (Усач Чишминский 95) и сорт Чишминский 229 – оба образца созданы методом гибридизации на основе сорта Чишминский 95. В свою очередь сорт Чишминский 229, участвующий в создании линии местной селекции Л-30346 (Чишминский 229 Л-27266), находится по отношению к ней в соседнем минорном кластере: А2а и А2b соответственно. Сложнее объяснить тесную близость укосно-зернового сорта местной селекции Кормовой 5 и зернового сорта Чишминский 80, созданных на разной генетической основе, но имеющих признак неосыпаемости, белые цветки, желто-розовые округлые семена и относящихся к одной ботанической разновидности – var. ecaducum Makash. – неопадающая.

В большом кластере В оказались две линии местной селекции, созданные на основе украинских сортов и сортов местной селекции Кормового 5 и Шихана, которые также относятся к одной ботанической разновидности ecaducum.

В большом кластере С в соседних минорных кластерах С1а и С1b сосредоточились 2 сорта местной селекции: Шихан и Чишминский 95 (оба разновидности ecaducum), очень близкие по своей генетической природе. Сорт Шихан создан на основе отборов из гибрида Чишминский 210 Приекульский 380, а сорт Чишминский 95 имеет в своей родословной и сорт Чишминский 210, и сорт Шихан. В соседнем подкластере В находится линия местной селекции Л-26742 ((Улад. юб. Шихан) Шихан), в родословной которой также присутствует сорт Шихан.

Благодаря наличию разнообразного исходного материала, поставляемого ВИРом в течение многих лет в Башкирский НИИСХ, в родословной каждого сорта и линии можно увидеть самый различный по происхождению материал. На наш взгляд, главный смысл анализируемой дендрограммы – визуализация генетической близости/удаленности образцов. Используемый ранее в Чишминском селекцентре принцип – подбор пар для гибридизации по наличию контрастных признаков и по расчетам генетической удаленности образцов на основе полевой оценки может быть дополнен результатами молекулярно-генетических исследований.

ВЫВОДЫ

1. В результате изучения в 2009-2012 годах в условиях Республики Башкортостан 77 образцов гороха посевного из коллекции Всероссийского НИИ растениеводства им. Н.

И. Вавилова и других научно-исследовательских учреждений выделены и рекомендованы следующие перспективные для селекции источники:

– скороспелости: Чишминский 80, Л-26335 (Орел 11 Л-18253), Л-27312 (КС3/ Чишминский 95), Л-28158 (ГВГ1156 Усач), Л-29477 (Усач Кормовой 5), Л-29825 (ЛКормовой 5), Л-29865 (Усач Чишминский 95), Л-30346 (Чишминский 229 ЛК-6753 (Чехия);

– высокой семенной продуктивности: Л-23654 (Поп.15-79 Труженик), Л- (К-7779 Труженик), Л-27602 (КС4/89НПО Дон Л-23148), Чишминский ранний, Чишминский 75, Чишминский 229, Арендатор, Казанец, Флаванда, Флагман 9, К- Орел 2141, К-7779 (Англия), К-7992 (Корея), К-8289 (Нидерланды), К-8500 (Белоруссия), К-8750 (Португалия), К-8814 (США);

– сочетающие скороспелость с высокой семенной продуктивностью: Чишминский 75, Чишминский 80, Чишминский 95, Л-23654 (Поп.15-79 Труженик), 8247НО, К- (Португалия);

– высокопродуктивные и высокозасухоустойчивые: Чишминский 229, К- (Португалия);

– устойчивые к полеганию и осыпанию семян: Памяти Хангильдина, Л-27259 (КТруженик), Л-27262 (К-7779 Труженик), Батрак, Казанец, Мультик, Флагман 9, К-8714 (Адыгея);

– с относительно высоким в условиях Республики Башкортостан и стабильным содержанием белка и хорошей разваримостью семян: Л-27602 (КС4/89НПО Дон ЛЛ-29865 (Усач Чишминский 95).

2. Выявлены достоверные корреляции между хозяйственно-ценными признаками, определяющими продуктивность гороха:

– масса семян с растения зависит от числа бобов на растении (r=0,65) и числа семян с растения (r=0,59);

– период цветение – созревание имеет отрицательную связь с периодом входы – цветение (r=-0,53) и положительную связь с полным вегетационным периодом (r=0,57);

– число бобов на растении и число семян с растения положительно связаны с числом продуктивных узлов (r=0,69 и r=0,52 соответственно);

– число семян с растения зависит от числа бобов на растении (r=0,62).

3. Молекулярно-генетический анализ 33 образцов гороха по 5 микросателлитным локусам показал наличие у них выраженной генетической дифференциации. В каждом из 5 изученных микросателлитных локусов идентифицировано от 3 до 7 аллелей, в среднем 4,6 аллелей на локус. Средний уровень полиморфизма по SSR-маркерам среди изученных форм составляет 63%.

4. Выявлены достоверные связи между признаками осыпаемости семян, окраски семян и типа листа с аллелями микросателлитных локусов AB28, AD147. У образцов Чишминский 229 и К-8750 (Португалия), выделившихся как засухоустойчивые и высокопродуктивные, обнаружено специфическое сочетание аллелей – AA200 205 D21 200 AD147 300, отсутствующее у других изученных образцов. Данное сочетание аллелей по 3 микросателлитным локусам может служить дополнительным критерием при отборе и прогнозировании высокой продуктивности и засухоустойчивости гороха посевного.

5. Для однозначной идентификации исследованных образцов гороха достаточно использовать 5 микросателлитных локусов – АА255, AА200, D21, AD147, AB28.

Наибольшую эффективность для генетической паспортизации показали микросателлитные локусы D21, AD147, AB28, характеризующиеся высоким индексом полиморфности (PIC=0,76-0,78).

6. Для зарубежных образцов К-6548 (Индия) и К-8289 (Нидерланды) установлено наличие уникальных аллелей по локусу D21, а для сорта местной селекции Шихан – по локусу АА200, что даёт возможность проводить их быструю идентификацию.

7. Составлены генетические паспорта, позволяющие идентифицировать 33 образца местной, инорайонной отечественной и зарубежной селекции.

РЕКОМЕНДАЦИИ СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКЕ

1. При селекции гороха на скороспелость, высокую продуктивность в условиях Республики Башкортостан целесообразно вовлекать в гибридизацию образцы Чишминский 75, Чишминский 80, Чишминский 95, Л-23654 (Поп.15-79 Труженик), 8247НО, К-8750 (Португалия).

2. Для селекции на высокую урожайность и засухоустойчивость рекомендуется использовать образцы Чишминский 229, К-8750 (Португалия).

3. Оценку генетического разнообразия и сортовую идентификацию гороха посевного следует проводить с помощью микросателлитных маркеров.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

В журналах из перечня ВАК:

1. Давлетов, Ф.А. Особенности роста и развития сортов и линий гороха различных морфотипов в условиях Южного Урала / Ф.А. Давлетов, К.П. Гайнуллина, А.Р.

Ашиев // Зерновое хозяйство России – Зерноград, 2011. – № 5. – С. 22-31.

2. Давлетов, Ф.А. Влияние метеорологических условий на результаты гибридизации / Ф.А. Давлетов, К.П. Гайнуллина // Аграрный вестник Урала. – Екатеринбург, 2011.

3. Давлетов, Ф.А. Высокотехнологичный сорт гороха Памяти Хангильдина / Ф.А.

Давлетов, К.П. Гайнуллина, А.Р. Ашиев // Зерновое хозяйство России. – Зерноград, 4. Давлетов, Ф.А. Изучение полиморфизма микросателлитных локусов гороха посевного (Pisum sativum L.) / Ф.А. Давлетов, К.П. Гайнуллина // Вестник Башкирского государственного аграрного университета. – Уфа, 2013. – № 2. – С.

В других изданиях:

5. Давлетов, Ф.А. Наследование морфологических признаков у гороха / Ф.А.

Давлетов, К.П. Гайнуллина // Сб. науч. тр., посвященный 75-летию со дня рождения У.Г. Гусманова «Роль науки в инновационном развитии сельского хозяйства. Часть 2. Инновационные технологии – основа конкурентоспособности сельского хозяйства». – Уфа, 2010. – С. 83-87.

6. Гайнуллина, К.П. Использование метода гибридизации в селекции гороха / Ф.А.

Давлетов, К.П. Гайнуллина // Сб. науч. тр., посвященный 75-летию со дня рождения У.Г. Гусманова «Роль науки в инновационном развитии сельского хозяйства. Часть 2. Инновационные технологии – основа конкурентоспособности сельского хозяйства». – Уфа, 2010. – С. 52-55.

7. Давлетов, Ф.А. Горох – культура традиционная и перспективная / Ф.А. Давлетов, К.П. Гайнуллина, Э.А. Гиззатуллина // Сельские узоры. – Уфа, 2010. – № 2. – С. 12.

8. Давлетов, Ф.А. Меры борьбы с гороховой зерновкой / Ф.А. Давлетов, К.П.

Гайнуллина // Сельские узоры. – Уфа, 2010. – № 5. – С. 31.

9. Давлетов, Ф.А. Результаты селекции гороха в Башкортостане / Ф.А. Давлетов, К.П.

Гайнуллина, А.Р. Ашиев // Сб. науч. тр. ГНУ ВНИИЗ и К «Новые сорта сельскохозяйственных культур – составная часть инновационных технологий в растениеводстве». – Орел: ГНУ ВНИИЗБК, 2011. – С. 286-291.

10. Давлетов, Ф.А. Горох Чишминский 229 / Ф.А. Давлетов, К.П. Гайнуллина, А.Р.

Ашиев, М.К. Азналин, Д.А. Шарипов // Агропаспорт. – Чишмы, 2011. – 2 с.

11. Давлетов, Ф.А. Горох Чишминский 95 / Ф.А. Давлетов, К.П. Гайнуллина, А.Р.

Ашиев, М.К. Азналин, Д.А. Шарипов // Агропаспорт. – Чишмы, 2011. – 2 с.

12. Давлетов, Ф.А. Наследование признаков продуктивности гибридов гороха посевного (Pisum sativum L.) / Ф.А. Давлетов, К.П. Гайнуллина, А.Р. Ашиев // Вестник Академии наук РБ. – Уфа, 2013. – Т. 18, № 1. – С. 25-34.

Подписано в печать 14/11/13. Формат 60x84 1/16.

Бумага офсетная. Печать ризографическая. Тира100 экз. Заказ 1175.

Гарнитура «TimesNewRoman». Отпечатано в типографии Объем 1 п.л. Уфа, Карла Маркса 12 корп. 5.