На правах рукописи

Дацкевич Петр Николаевич

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ И СВОЙСТВ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ

ХИМЕР МАЛЫХ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА ЧЕЛОВЕКА

03.01.04 – биохимия

Автореферат диссертации

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2014

Работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Московского Государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Гусев Николай Борисович

Официальные оппоненты:

Белоусов Всеволод Вадимович доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, руководитель группы биологии активных форм кислорода Курганов Борис Иванович доктор химических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук, главный научный сотрудник лаборатории Структурной биохимии белка

Ведущая организация:

Институт экспериментальной кардиологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский кардиологический научно-производственный комплекс»

Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится 6 октября 2014 года в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 501.001.71 при Московском Государственном Университете имени М.В. Ломоносова по адресу 119991, Москва, Ленинские горы, д.1 стр. 12, биологический факультет Московского государственного университета имени М.В.

Ломоносова, аудитория ББА.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « » 2014 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Киселевский Дмитрий Борисович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Малые белки теплового шока – АТФ независимые шапероны, ключевой функцией которых является поддержание белкового гомеостаза за счет предотвращения накопления агрегатов неправильно свернутых или частично денатурированных белков. Кроме этого sHsp способны выполнять широкий спектр функций, затрагивающих практически все стороны жизнедеятельности клетки, например, такие как транспорт везикул и органелл, подвижность, пролиферация, программируемая гибель и многие другие [12, 15].

В геноме человека идентифицировано 10 генов, кодирующих 10 разных малых белков теплового шока. Некоторые из этих белков экспрессируются только в определенных тканях, другие представители этого семейства синтезируются повсеместно [13]. Малые белки теплового шока постоянно синтезируются в клетках, однако в условиях стресса может происходить существенное увеличение уровня экспрессии определенных членов этого семейства. Кроме того, уровень экспрессии некоторых sHsp изменяется в зависимости от стадии клеточного цикла и/или этапа развития организма в процессе онтогенеза [14].

Интерес к малым белкам теплового шока в последние десятилетия неуклонно растет, что обусловлено участием этих белков в регуляции ключевых процессов жизнедеятельности.

При повреждениях sHsp и утери их способности поддерживать гомеостаз создаются условия, зачастую приводящие к развитию патологий. На сегодняшний день установлена связь sHsp со многими заболеваниями, такими как различные виды миопатий и невропатий, онкологические заболевания, болезни Альцгеймера, Паркинсона и многие другие [2].

млекопитающих обладают очень подвижной структурой и способны sHsp образовывать сложно построенные динамичные олигомеры, что существенно затрудняет изучение их свойств. Эти особенности вынуждают разрабатывать и использовать различные методы для исследования sHsp [5, 8]. Одним из подходов, применяемых для изучения этих белков, является создание химер малых белков теплового шока и флуоресцентных белков.

Использование подобных химер представляет уникальную возможность для изучения свойств sHsp непосредственно в живых клетках [6], а также делает доступным новые Список сокращений: ДЛС – динамическое лазерное светорассеяние, ДТТ – дитиотрейтол, кДНК – комплементарная ДНК, -МЭ – -меркаптоэтанол, ECFP – улучшенный циановый флуоресцентный белков, EYFP – улучшенный желтый флуоресцентный белок, FP – флуоресцентный белок, FRET – фёрстеровский резонансный перенос энергии, IPTG – изопропил--D-1-тиогалактопиранозид, GFP – зеленый флуоресцентный белок, PMSF – фенилметансульфонил фторид, sHsp – малые белки теплового шока, WT – белок дикого типа подходы для исследования белок-белковых взаимодействий в условиях in vitro [7]. Следует заметить, что молекулярная масса мономеров sHsp человека не превышает 23 кДа, а масса флуоресцентного белка составляет 27 кДа. В ходе создания химер флуоресцентный белок прикрепляется либо к N-, либо к C- концу малых белков теплового шока, т.е. к тем участкам белка, которые задействованы в формировании олигомеров и в реализации функциональной функционирования участков может привести к изменению свойств sHsp. Поэтому прежде чем использовать такие химеры, необходимо сравнить их свойства со свойствами белков дикого типа. Удивительно, что несмотря на широкое использование флуоресцентных химер sHsp [3, 9, 11], до последнего времени не проводилось подробных исследований их структуры и свойств. Целью данной работы было создание и изучение свойств флуоресцентных химер малых белков теплового шока человека, и сравнение их свойств со свойствами белков дикого типа.

Цели и задачи работы. Целью данной работы был анализ структуры и свойств различных типов химерных флуоресцентных белков, состоящих из малых белков теплового шока человека HspB1, HspB5, HspB6, HspB8 и флуоресцентных белков ECFP или EYFP. Для достижения этой цели было необходимо решить следующие задачи:

Получить молекулярно-генетические конструкты, несущие кДНК химерных флуоресцентных белков, отличающихся по составу, комбинации частей химеры и длине и природе линкера.

Разработать методику выделения химерных флуоресцентных белков и получить их в гомогенном состоянии.

Исследовать четвертичную структуру флуоресцентных химер sHsp.

Проанализировать взаимодействие химерных белков между собой и белками дикого типа, их способность обмениваться субъединицами и формировать гетероолигомерные комплексы.

Исследовать шапероноподобную активность химерных белков.

Изучить влияние состава и длины линкерных последовательностей на свойства химерных белков.

Основные положения, выносимые на защиту.

Присоединение флуоресцентного белка к малым белкам теплового шока человека оказывает заметное влияние на их свойства.

Четвертичная структура, склонность к агрегации и шапероноподобная активность химерных sHsp существенно зависят от локализации флуоресцентного белка в составе Флуоресцентные химеры могут быть использованы для изучения белок-белковых взаимодействий in vitro.

Состав и длина линкерных последовательностей влияют на свойства химер sHsp, при этом влияние уменьшается по мере увеличения длины и подвижности линкера.

Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе выполнения работы была разработана методика экспрессии и выделения флуоресцентных химер sHsp, позволяющая получать до 110 мг целевого белка из 1 л бактериальной культуры.

Проанализированы свойства 14 различных флуоресцентных химер sHsp человека.

С помощью метода гель-хроматографии установлено, что олигомеры флуоресцентных химер малых белков теплового шока, склонных образовывать крупные комплексы (HspB1, HspB5), содержат меньшее количество субъединиц, чем соответствующие беки дикого типа.

Олигомерный состав химер малых белков теплового шока, склонных образовывать только малые олигомеры (HspB6, HspB8), не отличается от олигомерного состава белков дикого типа. При модификации N-концевого участка sHsp, участвующего в формировании крупных олигомеров, наблюдается более сильное изменение структуры комплексов флуоресцентных химер, чем при модификации C-концевого участка. Методом ДЛС показано, что С-концевые химеры HspB1 и HspB5 обладают повышенной гетерогенностью и наибольшим размером олигомеров. Таким образом, установлено, что присоединение флуоресцентного белка, влияет на четвертичную структуру, которая во многом определяет функциональную активность sHsp.

Гетероолигомерные комплексы, сформированные флуоресцентными химерами, отличаются по своему составу от гетероолигомерных комплексов, образованных соответствующими белками дикого типа. При этом сохраняется специфичность взаимодействия различных малых белков теплового шока, что делает возможным использование флуоресцентных химер для исследования белок-белковых взаимодействий in vitro.

С использованием модельных белков-субстратов исследована шапероноподобная активность химерных белков. Установлено, что шапероноподобная активность зависит как от локализации флуоресцентного белка (на N- или С-конце малых белков теплового шока), так и от природы флуоресцентного белка (ECFP или EYFP). Показано, что наибольшей шапероноподобной активностью обладают N-концевые химеры, что согласуется с существенным уменьшением размера олигомеров у этих типов химерных белков. Состав и длина линкера также влияют на шапероноподобную активность химер, при этом химеры с длинными высокоподвижными линкерами в наименьшей степени отличаются по своей шапероноподобной активности от белков дикого типа.

С помощью метода гомо-FRET исследованы взаимодействия химерных белков с различными sHsp дикого типа. По изменениям анизотропии флуоресценции химерных белков рассчитаны кажущиеся константы скорости обмена субъединиц различных малых белков теплового шока человека. Продемонстрирована возможность использования флуоресцентных химер для выявления белок-белковых взаимодействий in vitro и измерения скорости обмена субъединиц в гетероолигомерных комплексах. Изучение свойств химерных sHsp, различающихся как по типу присоединенного флуоресцентного белка и его локализации, так и по составу и длине линкерной последовательности, позволило сформулировать рекомендации для получения флуоресцентных химер, в наименьшей степени отличающихся от белков дикого типа. При этом оптимальным представляется использование химер, содержащих флуоресцентный белок, прикрепленный к N-концу малых белков теплового шока длинным гибким линкером.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ; на 38-м Международном Конгрессе Европейских Биохимических Обществ (FEBS) в 2013 г. (Санкт-Петербург); на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» в 2011-2013 гг. (Москва).

рецензируемых научных журналах из списка ВАК.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 106 страницах, иллюстрирована 36 рисунками и 8 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В обзоре литературы рассмотрены основные положения, касающиеся структуры и свойств семейства малых белков теплового шока. Приведено описание структуры sHsp и ее особенностей у белков из разных таксонов живых организмов. Проанализированы различные функции малых белков теплового шока человека. Описана классификация, строение и свойства флуоресцентных белков, производных GFP. Приведены примеры использования флуоресцентных белков для создания химер и проанализированы данные по получению и использованию флуоресцентных химер малых белков теплового шока.

Плазмиды, несущие кДНК химерных белков, получали путем амплификации кодирующих последовательностей и флуоресцентных белков с праймерами, содержащими участки будущей линкерной последовательности и участки узнавания определенных рестриктаз. После амплификации фрагменты ДНК обрабатывали рестриктазами и лигировали для получения полноразмерной кДНК химерного белка. Этот фрагмент клонировали в вектор pET23b(+) по участкам рестрикции NdeI и XhoI. Полученные плазмиды проверяли секвенированием. В работе были получены 15 образцов флуоресцентных химер. Восемь N-концевых химерных белков (FP-sHsp) с общим типом линкера (GGGSGGGTGGG), содержащих два разных флуоресцентных белка (ECFP и EYFP) и четыре разных sHsp (HspB1, HspB5, HspB6, HspB8), четыре C-концевых химеры (sHspEYFP) с тем же линкером, а также три химеры EYFP-HspB1 с разными линкерами (L1 – GSAGSAATGGSA, L2 – AEAAAKEAAAKA, L3 – APAPAPGPAPAP). Векторы, содержащие кДНК N-концевых химерных белков с общим типом линкера, были получены и предоставлены к.б.н. А.А. Шеметовым и к.б.н. Н.Н. Случанко, векторы, несущие кДНК флуоресцентных белков, были получены и предоставлены к.б.н. Е.В. Мымриковым.

Белки экспрессировали в оптимальных условиях, выбранных по результатам тестовой экспресии. Препаративную экспрессию всех N-концевых химер, кроме EYFP-HspB5, а также HspB6-EYFP и HspB1-EYFP осуществляли в клетках BL21 (DE3) по методу автоиндукции с инкубацией 7 часов при 37С и затем 18 часов при 30С. EYFP-HspB5 экспрессировали по методу автоиндукции при этом температура инкубации на втором этапе экспрессии составляла 20С. HspB5-EYFP экспрессировали в клетках штамма C43 (DE3) с добавлением IPTG и последующей инкубацией 21 час при 30С.

Выделение рекомбинантных белков проводили по разработанной методике, согласно которой экстракт клеток фракционировали сульфатом аммония, после чего белки очищали ионообменной хроматографией на колонке HiTrapQ мл и гель-фильтрацией на колонке Superdex200 HiLoad 26/60. Очищенные и сконцентрированные белки хранили при -20С в буфере Б (20 мМ Трис-ацетат рН 7,6, 10 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 2 мМ ДТТ, 0,1 мМ PMSF).

Для выделения белков из телец включения обрабатывали отмытые тельца включения буфером, содержащим гуанидин хлорид (50 мМ Трис-HCl pH 8,0, 50 мМ NaCl, 10 мМ -МЭ, 7 М гуанидин хлорид), затем осаждали белки быстрым разведением и центрифугировали.

Растворяли осадок белков в буфере с 8 М мочевиной. Раствор по каплям добавляли в буфер для рефолдинга (20 мМ Трис-HCl pH 8,0, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ GSH) и инкубировали на холоду два дня после чего проводили ионообменную хроматографию на Q-сефарозе. Полученный белок концентрирование и хранили в буфере Б при -20С.

Исследование олигомерного состояния. Гомоолигомеры химерных белков анализировали с помощью методов ДЛС и гель-фильтрации на колонке Superdex200 HR 10/30. ДЛС измеряли на приборе Zetasizer Nano (Malvern) при температуре 25С, угле измерения 173 и концентрации белка 0,3 мг/мл. Для каждого образца проводили 10 серий из 10 измерений по 15 секунд каждое.

Пробы объемом 150 мкл, содержащие от 10 до 200 мкг белка, наносили на колонку Superdex 200 HR 10/30, уравновешенную буфером Б, содержащим 150 мМ NaCl. В ходе элюции собирали фракции по 400 мкл. По положению максимумов пиков на профилях элюции определяли кажущиеся молекулярные массы образуемых олигомеров.

Для исследования формирования гетероолигомеров sHsp WT и их химер пробы, содержащие исследуемые белки (1 мг/мл), инкубировали час при 37С в присутствии 15 мМ ДТТ, после чего смешивали равные объемы двух образцов и инкубировали 1 час при 42С или 4С. Полученные образцы анализировали методом гель-фильтрации. Исследования проводили для пар белков “химера - химера” “белок дикого типа - химера” “белок дикого типа – белок дикого типа”. Белковый состав собранных фракций анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (по методу Леммли). При изучении формирования гетероолигомерных комплексов в парах “химера химера”, в отобранных фракциях измеряли FRET между флуоресцентными белками в составе химер.

Измерение спектров возбуждения и флуоресценции химерных sHsp и изолированных флуоресцентных белков проводили на спектрофлуориметре Varian Cary Eclipse. К 100 мкл образца добавляли 500 мкл буфера Ф (20 мМ HEPES-NaOH pH 7,5, 150 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 15 мМ -МЭ). Спектры возбуждения ECFP измеряли в диапазоне длин волн возбуждающего света 350-460 нм на длине волны флуоресценции 478 нм, спектры флуоресценции ECFP - при длине волны возбуждающего света 438 нм в диапазоне 450- нм. Для EYFP измерение спектров возбуждения флуоресценции проводили в области 420нм при длине волны флуоресценции 528 нм. Флуоресценцию EYFP возбуждали светом с длиной волны 514 нм, регистрировали в интервале 520-650 нм.

Измерение FRET между химерами с разными флуоресцентными белками (гетероиспользовали для исследования обмена субъединиц при формировании FRET) гетероолигомерных комплексов химерных sHsp. Для этого в отобранных после гельхроматографии фракциях измеряли собственную флуоресценцию ECFP (ex 438 нм, em 478 нм) и флуоресценцию EYFP при возбуждении ECFP (ex 438 нм, em 528 нм) (FRET).

Измерение гомо-FRET использовали для исследования взаимодействия флуоресцентных химер с белками дикого типа. Для этого в анализируемых пробах измеряли анизотропию флуоресценции в ходе реакции обмена субъединиц, проводимой при разных температурах. К пробам в буфере Ф с конечным объемом 500 мкл, содержащим химерный белок в концентрации 1 мкМ, добавляли белок дикого типа до концентрации 5 мкМ, инициируя реакцию обмена субъединиц. В ходе протекания реакции измеряли флуоресценцию в плоскостях, параллельной и перпендикулярной плоскости поляризации возбуждающего света. Измерения проводили каждые 5 минут в течение первых 30 минут реакции и каждые 10 минут в остальное время проведения эксперимента, каждый эксперимент проводили минимум в двух повторностях. Анализируя изменение анизотропии флуоресценции во времени, рассчитывали кажущиеся константы скорости реакции обмена между субъединицами различных малых белков теплового шока и их химер по методу, предложенному Бова [4].

Шапероноподобную активность измеряли по способности малых белков теплового шока предотвращать агрегацию модельных белков-субстратов, лизоцима и инсулина.

термостатировали при 37оС и вносили sHsp до конечной концентрации 0-10 мкМ. Агрегацию модельных белков индуцировали добавлением ДТТ до конечной концентрации 20 мМ. За процессом агрегации следили по увеличению оптической плотности при 360 или 340 нм на спектрофотометре Ultrospec 3100 Pro (Amersham Pharmacia).

Электронную микроскопию sHsp и их флуоресцентных химер проводили на просвечивающем электронном микроскопе JEOL JEM-1400 при напряжении 100 кВ и увеличении 20000 или 50000 раз. Образцы готовили, нанося на сетки с формваровой пленкой 5 мкл раствора белка с концентрацией 2 мкМ. Через 10 сек удаляли избыток жидкости фильтровальной бумагой, наносили 10 мкл 2% водного раствора уранил ацетата и инкубировали 30 сек. Удаляли избыток красителя и высушивали сетки на воздухе в течение 10-20 мин. Автор благодарен д.б.н. И.И. Кирееву за проведение электронной микроскопии и В.В. Нефёдовой за помощь в проведении опытов по электронной микроскопии.

Рис. 1. Тестовая экспрессия химерных преимуществами по сравнению со стандартным белков. А) Сравнение условий автоиндукция, IPTG – индукция IPTG. Б) Оптимизация условий экспрессии EYFPHspB5. Экспрессия с автоиндукцией при этот способ экспрессии. Кроме того, поскольку для различных температурах на втором этапе.

Стрелкой указано положение целевого белка. s – растворимая фракция, p – необходимо добиться их высокого содержания в нерастворимая фракция.

оптимизировать условия автоиндукции. Оказалось, что в некоторых случаях удается получить лучшие результаты при понижении температуры экспрессии на втором этапе экспрессии (рис. 1 Б). Это может быть обусловлено тем, что при понижении температуры увеличивается растворимость кислорода в среде инкубации, что улучшает условия культивирования бактерий. Кроме того, понижение температуры замедляет скорость синтеза белка и позволяет вновь синтезируемым белкам принять нативную структуру. К сожалению, в настоящее время невозможно сформулировать какие-то общие принципы экспрессии разных химер, потому что в зависимости от природы малого белка теплового шока и прикрепленного к нему флуоресцентного белка оптимальные условиях экспрессии могут сильно варьировать. Так экспрессия методом автоиндукции при 30С на втором этапе позволяла получать заметные количества N-концевых химер с общим типом линкера, но такие же условия оказались совершенно неэффективными в случае С-концевой химеры HspB5-EYFP. Тем не менее, варьируя условия экспрессии в достаточно широких пределах, мы смогли получить почти все исследуемые белки (за исключением HspB8-EYFP) в препаративных количествах.

10 до 120 мг белка из 1 л бактериальной культуры. Столь значительный разброс в величине выхода обусловлен различиями в свойствах флуоресцентных химер. Так выходы N-концевых химер с общим типом линкера обычно были больше таковых для аналогичных С-концевых химер, что может быть обусловлено склонностью С-концевых химер к агрегации, приводящей к тому, что большая часть указанных химер обнаруживалась в тельцах включения. В С-концевой области большинства малых белков теплового шока располагается консервативный I-X-I мотив, обеспечивающий взаимодействие мономеров в составе олигомера. Прикрепление к С-концу sHsp массивного флуоресцентного белка, вероятно, Нормированное поглощение, % спектры поглощения HspB5и проводя поэтапную ренатурацию, мы смогли получить EYFP. Сплошная линия – белок после ренатурации, пунктирная линия – белок из растворимой сильно отличаются от аналогичных белков, полученных из растворимой фракции и не подвергавшихся рефолдингу. Действительно, соотношение оптических плотностей при (максимум поглощения EYFP) и 280 нм для белков, полученных методом рефолдинга, существенно отличалось от аналогичного соотношения, полученного для растворимых белков (рис. 2). Существенное изменение спектральных свойств может быть следствием того, что белки, перешедшие в тельца включения, неправильно свернуты, вследствие чего не происходит созревания флуорофора. Указанные обстоятельства сделали невозможным экспериментах.

Четвертичная структура тесно связана с функциональной активностью sHsp.

Поскольку при создании флуоресцентных химер модифицируются либо N-, либо С-концевые участки, играющие важную роль в формировании четвертичной структуры sHsp, закономерно ожидать изменения олигомерного состояния химер по сравнению с белками дикого типа. Это в свою очередь может влиять на взаимодействия sHsp с различными белками-партнерами и жизнедеятельность клетки. Исследуя олигомерное состояние sHsp, методом гель-фильтрации, мы установили, что четвертичная структура флуоресцентных химер, действительно, отличается от структуры белков дикого типа (рис. 3 А-В). При этом химеры тех sHsp, которые в норме образуют крупные комплексы (HspB1, HspB5), формировали олигомеры существенно меньших размеров, чем белки дикого типа. В то же время четвертичная структура химер sHsp, в норме формирующих небольшие олигомеры, (HspB6, HspB8), практически не менялась. Так, например, HspB1, в норме образующий комплексы из 24-28 субъединиц, после присоединения EYFP к N-концу формировал олигомеры, содержащие не больше 10 субъединиц, и эти олигомеры были нестабильны и диссоциировали при разведении. Вероятно, такое поведение обусловлено тем, что Nконцевые последовательности играют важную роль в формировании крупных олигомеров, Объем элюции, мл расположить в следующем порядке: белок дикого типа > C-концевые химеры > N-концевые химеры. Другими словами N-концевые химеры в наибольшей степени отличались от белков дикого типа. Эти результаты хорошо согласуются с данными о том, что N-конец sHsp «строительных блоков» промежуточного размера, состоящих из нескольких субъединиц.

Вероятно, именно поэтому модификация N-конца некоторых sHsp сопровождается диссоциацией крупных олигомеров до промежуточных «строительных блоков». С-конец sHsp также играет важную роль при формировании комплексов промежуточных размера [8].

Модификация С-конца может препятствовать правильному образованию таких комплексов, но не приводит к полной диссоциации крупных олигомеров.

показало, что их олигомерное состояние практически не отличается между собой и от аналогичной химеры EYFP-HspB1 с общим типом линкера (рис. 4). Олигомеры химер с разными линкерами также содержали меньше субъединиц и были менее стабильны, чем HspB1 дикого типа. Таким образом, мы не выявили существенного влияния состава Объем элюции, мл Количество белка, нанесенного на колонку, мкг Рис. 4. Исследование олигомерного состояния химер HspB1 с разным типом линкера. L1-L3 – химеры с химеры, чем изменение аминокислотного состава соответственно.

Исследование четвертичной структуры химер с общим типом линкера методом ДЛС во многом подтвердило данные, полученные с помощью гель-хроматографии. Олигомерные комплексы химерных белков отличались по размерам, как между разными типами химер, так и по сравнению с sHsp WT. Наибольшая полидисперсность была характерна для С-концевых химер. При этом С-концевые химеры содержали в своем составе частицы очень крупных размеров, наличие которых, вероятно, обусловлено склонностью к агрегации С-концевых химер.

Полученные нами данные электронной микроскопии свидетельствуют о том, что HspB1 дикого типа формирует в основном симметричные сферические олигомеры с диаметром около 20 нм (рис. 5 А). В то же время химера EYFP-HspB1 представлена набором Рис. 5. Электронная микроскопия HspB1 (А) и EYFP-HspB1 (Б).

Концентрация белков 2 мкМ, шкала Гетероолигомерные комплексы малых белков теплового шока и их химер Малые белки теплового шока способны образовывать гетероолигомерные комплексы, содержащие в своем составе субъединицы разной природы. Считается, что формирование гетероолигомеров повышает разнообразие конформационных состояний sHsp, и придает им способность взаимодействовать с новыми партнерами или денатурированными субстратами.

Механизм формирования гетероолигомерных комплексов, а также способность отдельных малых белков теплового шока образовывать гетероолигомерные комплексы являются предметом детальных исследований, а полученные к настоящему времени данные остаются довольно противоречивыми [7, 16]. Флуоресцентные химеры могут быть удобным инструментом для изучения гетероолигомеров малых белков теплового шока.

Полученные нами флуоресцентные химеры оказались способны образовывать гетероолигомерные комплексы между собой или с sHsp дикого типа, сохраняя при этом специфичность взаимодействий, характерную для белков дикого типа. В то же время размер гетероолигомеров, образуемых флуоресцентными химерами, может отличаться от размеров соответствующих гетероолигомеров, образуемых белками дикого типа. Так, например, HspB1 и HspB6 дикого типа формируют два вида гетероолигомерных комплексов с кажущимися молекулярными массами 300 и 110 кДа соответственно (рис. 6 А). Учитывая, что в изолированном состоянии HspB1 образует крупные олигомеры с массой ~670 кДа, а HspB6 – небольшие олигомеры около 50 кДа (предположительно димеры), смешанные комплексы этих белков можно легко детектировать при гель-фильтрации. В свою очередь флуоресцентные химеры EYFP-HspB1 и ECFP-HspB6 образуют только один тип гетероолигомеров с кажущейся молекулярной массой ~280 кДа (Рис. 6 Б). Эти белки прочно взаимодействуют друг с другом, в результате чего на профиле элюции практически Иммунохимическое окрашивание (рис. 6 В, Г) и данные FRET (рис. 6 Д, Е) также убедительно свидетельствуют о способности флуоресцентных химер HspB1 и HspB формировать прочные гетероолигомерные комплексы. Аналогичные подходы были использованы при исследовании N-концевых химер HspB5 и HspB6. Оказалось, что указанные химеры (также как и белки дикого типа) способны формировать прочные молекулярной массы гетероолигомерных комплексов сформированных белками дикого типа (470 кДа).

Рис. 6. Исследование взаимодействия HspB1 и HspB6. А) Гель-хроматография изолированного HspB1 (1), изолированного HspB6 (2), смеси белков, инкубированной при 4С (3) или 42С (4). Для наглядности кривая 3 сдвинута на 5 mAu вверх. Б) Гель-хроматография изолированного EYFP-HspB1 (1), изолированного ECFP-HspB6 (2), смеси белков, инкубированной при 4С (3) или 42С (4). Для наглядности кривая 3 сдвинута на 10 mAu вверх. В-Г) Иммунохимическое окрашивание проб после гель-хроматографии смеси FP-HspB1 и FP-HspB6, инкубированной при 4С (В) или 42С (Г). Номера проб указаны над дорожками. Д-Е) Распределение интенсивности флуоресценции ECFP, (-•-) и FRET () на профиле элюции смеси химерных белков, инкубированных при 4С (Д) или 42С (Е).

Следует отметить, что скорость обмена субъединиц малых белков теплового шока сильно зависит от температуры. Как видно на рис. 6, обмен субъединиц протекает при повышенной температуре (42оС) и практически полностью блокируется при понижении температуры до 4оС.

Мы также предприняли попытку исследовать взаимодействие HspB8 с HspB1 и Используя метод гель-фильтрации, успешно примененный при анализе HspB5.

взаимодействия в двух ранее описанных парах малых белков теплового шока, мы не смогли выявить взаимодействия ни с одним из исследуемых белков. В связи с тем, что использованные нами методы FRET и иммунохимического окрашивания отличаются высокой чувствительностью, мы можем заключить, что флуоресцентные химеры HspB8 не способны образовывать стабильные гетероолигомерные комплексы с HspB1 и HspB5. Эти результаты противоречат данным, полученным в лаборатории Бенндорфа [10], но согласуются с результатами, полученными ранее в нашей лаборатории [16]. Указанное противоречие может быть обусловлено тем, что в двух лабораториях использовались различные методы, кроме того даже в опытах группы Бенндорфа отмечалось, что их результаты относительно гетероолигомерных комплексов, образуемые HspB8, могут быть противоречивыми и такие комплексы выявляются не всегда.

В описанных ранее экспериментах мы исследовали способность различных химер образовывать гетероолигомерные комплексы. Не менее важным представлялся вопрос о том, способны ли полученные нами флуоресцентные химеры взаимодействовать с белками дикого типа. Этот вопрос становится особенно важным при экспрессии флуоресцентных химер в живых клетках. Оказалось, что большинство N- и С-концевых химер с общим типом линкера способны взаимодействовать с соответствующими белками дикого типа, а образующиеся при этом олигомеры, содержащие в своем составе, как субъединицы белка дикого типа, так и субъединицы флуоресцентных химер, отличаются по олигомерному строению от комплексов, образованных только из субъединиц белка дикого типа. Это обстоятельство следует учитывать при использовании флуоресцентных химер in vivo. Дело в том, что экспрессированные в клетке флуоресцентные химеры могут взаимодействовать с белками дикого типа и, меняя их олигомерное состояние, влиять на их нормальное функционирование.

Метод гель-фильтрации имеет свои ограничения, с его помощью затруднительно исследовать формирование гетероолигомеров между белками, комплексы которых обладают сходными молекулярными массами, например HspB1 и HspB5 или HspB6 и HspB8. В некоторых случаях для исследования взаимодействия между белками мы использовали метод, основанный на явлении гомо-FRET.

Резонансный перенос энергии между флуорофорами одинаковой природы (гомоFRET) можно детектировать только по измерению анизотропии флуоресценции. Если между деполяризации флуоресценции или ее анизотропию. Чем больше количество молекул, которые участвуют в переносе энергии, тем сильнее будет деполяризоваться флуоресценция.

Следовательно, при изменении олигомерного состояния белка и количества флуорофоров в олигомере будет изменяться анизотропия флуоресценции образца. Поэтому, измеряя анизотропию флуоресценции, можно следить за реакцией обмена субъединиц sHsp и их химер.

r(t)/r(0) Рис. 7. Исследование обмена субъединиц с использованием метода гомо-FRET. А) Изменение анизотропии флуоресценции в ходе реакции обмена субъединиц между EYFP-HspB1 и HspB WT. 1 – 10С, 2 – 15С, 3 – 20С, 4 – 25С, 5 – 30С. Б) Кажущиеся EYFP-HspB6 с соответствующими белками дикого типа.

раз (рис. 7 Б). Константы скорости обмена субъединиц между sHsp разного типа (EYFPHspB1 и HspB6 WT или EYFP-HspB6 и HspB1 WT) также зависят от температуры и на порядок меньше констант скорости реакции обмена субъединиц между sHsp одного типа.

Таким образом, обмен субъединиц между гомоолигомерами sHsp протекает гораздо эффективнее, чем между гетероолигомерами.

Завершая этот раздел, можно заключить, что флуоресцентные химеры способны образовывать гетероолигомерные комплексы, и при этом сохраняется специфичность, характерная для белков дикого типа. Несмотря на то, что свойства гетероолигомеров, образованных флуоресцентными химерами, могут отличаться от свойств аналогичных использовать для изучения кинетики обмена субъединиц и белок-белковых взаимодействий.

Шапероноподобная активность по отношению к широкому спектру субстратов свойственна большинству малых белков теплового шока человека. Флуоресцентные химеры также оказались способны предотвращать агрегацию денатурированных белков. При этом исследование шапероноподобной активности флуоресцентных химер sHsp на двух модельных субстратах показало, что практически все химеры обладают шапероноподобной активностью, отличающейся от белков дикого типа. Причем в зависимости от типа химеры, А360, Рис. 8. Шапероноподобная увеличению шапероноподобной активности, при этом активность химерных белков, измеренная с использованием инсулина (50 мкМ) (А, Б) или лизоцима (10 мкМ) (В) в качестве модельных субстратов. А) HspB5 (рис. 8 Б). Указанную зависимость довольно трудно (5 мкМ). Б) HspB1 (1 мкМ). 1 – изолированный инсулин, 2 – белок дикого типа, 3 – ECFP-sHsp, 4 – особенности обусловлены различной степенью гомологии EYFP-sHsp. В) HspB1 (5 мкМ). 1 – изолированный лизоцим, 2 – HspB1 WT, 3 – EYFP-HspB1, 4 – HspB1-EYFP.

другой ветви этого же семейства [1]. Белки, относящиеся к одной ветви филогенетического древа, одинаково реагируют на присоединение флуоресцентного белка, и эта реакция отличается от реакции белков, относящихся к другой ветви филогенетического древа. По сравнению с N-концевыми, С-концевые химерные белки обладали заметно пониженной шапероноподобной активностью, а в некоторых случаях не только не предотвращали, но, наоборот, способствовали агрегации исследуемого субстрата (рис. 8 В).

Любопытным представляется тот факт, что шапероноподобная активность может зависеть от природы входящего в состав химеры флуоресцентного белка. Это особенно удивительно, если учесть, что различия в структуре ECFP и EYFP минимальны и эксперименты показали, что для изменения шапероноподобной активности необходимо изолированного флуоресцентного белка и малого белка теплового шока не сопровождается сколько-нибудь заметными изменениями шапероноподобной активности sHsp. Это означает, флуоресцентного белка к sHsp, что сопровождается появлением нового типа взаимодействия между ними, эффективность которого зависит от природы флуоресцентного белка, его ориентации в составе химеры и природы sHsp. Наблюдаемые изменения шапероноподобной активности у химер, вероятно, связаны с влиянием флуоресцентного белка на способность малых белков теплового шока взаимодействовать с белками-мишенями и/или влиянием флуоресцентного белка на свойства N- и С-концевых участков и олигомерное состояние малых белков теплового шока.

Действительно, в литературе показано увеличение шапероноподобной активности А340, отн. ед.

изолированный лизоцим (10 негативным последствиям, уменьшая шапероноподобную EYFP-L1-HspB1, 4 – EYFP-HspB1.

С-концевом домене располагается консервативный гидрофобный мотив, обеспечивающий взаимодействие с кристаллиновым доменом и регулирующий динамику обмена субъединиц и растворимость комплексов sHsp с белками-мишенями. Присоединение флуоресцентного белка может нарушать все эти взаимодействия и приводить к увеличению гидрофобности и, как следствие, склонности С-концевых химер к агрегации, что проявляется уже на стадии их экспрессии и выделения. Вследствие этих причин C-концевые химеры обладают существенно пониженной шапероноподобной активностью.

N-концевых химер с различной природой линкера показало, что исследуемые линкеры могут В целом указанные химеры обладали повышенной шапероноподобной активностью по сравнению с белками дикого типа, и этот эффект был наиболее заметен для жесткого линкера L2. Химеры с жестким пролиновым линкером L3 и «мягким» подвижным линкером L1, слабее предотвращали агрегацию субстрата. При этом химера с линкером L1 была в наибольшей степени похожа на белок дикого типа (рис. 9 Б). Опираясь на полученные результаты, можно предположить, что N-концевые химеры с «мягким» линкером типа L при увеличении длины линкера будут все более приближаться по свойствам к sHsp дикого типа. Причем, вероятно, наибольшего прогресса в этой области можно достичь, работая с малыми белками теплового шока человека, склонными к формированию небольших олигомеров, поскольку их олигомерная структура в наименьшей степени изменяется при присоединении флуоресцентного белка.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что прикрепление флуоресцентных белков как к N-, так и к С-концу малых белков теплового шока влияет на способность sHsp образовывать гомо- и гетероолигомерные комплексы, но, как правило, не влияет на образование димеров. Флуоресцентные химеры сохраняют специфичность взаимодействий белков дикого типа при образовании гетероолигомерных комплексов и могут быть использованы для анализа процесса обмена субъединиц в составе олигомеров.

Шапероноподобная активность флуоресцентных химер сложным образом зависит как от природы малого белка теплового шока, так и от природы флуоресцентного белка. Все это накладывает определенные ограничения на использование флуоресцентных химер малых белков теплового шока in vivo, которые, к сожалению, не учитывались в ранее проведенных исследованиях. Результаты работы позволяют наметить пути для получения таких химерных белков, свойства которых в наименьшей степени отличались бы от свойств белков дикого типа.

ВЫВОДЫ

Получены молекулярно-генетические конструкции, подобраны условия экспрессии и разработаны методы выделения рекомбинантных флуоресцентных химер малых белков теплового шока человека.

Прикрепление флуоресцентного белка как к N-, так и к С-концу малых белков теплового шока, склонных к образованию крупных олигомеров (HspB1, HspB5), приводит к дестабилизации их четвертичной структуры и образованию олигомеров, содержащих меньшее число субъединиц. Прикрепление флуоресцентного белка к малым белкам теплового шока, способным образовывать только небольшие олигомеры (HspB6, HspB8), не сопровождается существенным изменением их четвертичной структуры.

Флуоресцентные химеры способны образовывать гетероолигомерные комплексы, размеры которых отличаются от размеров комплексов, образуемых белками дикого типа, но при этом сохраняют специфичность взаимодействий, характерную для белков дикого типа.

Шапероноподобная активность флуоресцентных химер малых белков теплового шока зависит от природы флуоресцентного белка, его локализации в составе химеры и от природы малого белка теплового шока и может быть как меньше, так и больше шапероноподобной активности белка дикого типа.

Предложены рекомендации по созданию флуоресцентных химер, свойства которых будут в наименьшей степени отличаться от свойств малых белков теплового шока дикого типа.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Datskevich P.N., Mymrikov E.V., Sluchanko N.N., Shemetov A.A., Sudnitsyna M.V., Gusev N.B. Expression, purication and some properties of uorescent chimeras of human small heat shock proteins. Prot Exp Purif, 2012. 82: p. 45-54.

Datskevich P.N., Mymrikov E.V., Gusev N.B., Utilization of uorescent chimeras for investigation of heterooligomeric complexes formed by human small heat shock proteins.

Biochimie, 2012. 94: p. 1794-1804.

3. Datskevich P.N., Gusev N.B., Structure and properties of chimeric small heat shock proteins containing yellow fluorescent protein attached to their C-terminal ends. Cell Stress Chap, 2013. DOI: 10.1007/s12192-013-0477-0.

4. Seit-Nebi A.S., Datskevich P.N., Gusev N.B., Commentary on paper: Small heat shock proteins and the cytoskeleton: An essential interplay for cell integrity? (Wettstein et al.) Int J Biochem Cell Biol, 2013. 45: p. 344-346.

Данное исследование проводилось при поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований (проекты 10-04-00026, 13-0400015 и 14-04-31197).

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Панасенко, О.О., М.В. Ким, Н.Б. Гусев, Структура и свойства малых белков теплового шока. Успехи биологической химии, 2003. 43: p. 59-98.

2. Arrigo, A.P., Pathology-Dependent Effects Linked to Small Heat Shock Proteins Expression: An Update. Scientifica, 2012. 2012.

3. Borrelli, M.J., et al., Stress protection by a fluorescent Hsp27 chimera that is independent of nuclear translocation or multimeric dissociation. Cell Stress Chaperones, 2002. 7(3): p.

4. Bova, M.P., et al., Subunit exchange of small heat shock proteins. Analysis of oligomer formation of alphaA-crystallin and Hsp27 by fluorescence resonance energy transfer and site-directed truncations. J Biol Chem, 2000. 275(2): p. 1035-42.

5. Braun, N., et al., Multiple molecular architectures of the eye lens chaperone alphaBcrystallin elucidated by a triple hybrid approach. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011. 108(51):

6. Chudakov, D.M., et al., Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiological Reviews, 2010. 90(3): p. 1103-63.

7. Datskevich, P.N., E.V. Mymrikov, and N.B. Gusev, Utilization of fluorescent chimeras for investigation of heterooligomeric complexes formed by human small heat shock proteins.

Biochimie, 2012. 94(8): p. 1794-804.

8. Delbecq, S.P. and R.E. Klevit, One size does not fit all: the oligomeric states of alphaB crystallin. FEBS Lett, 2013. 587(8): p. 1073-80.

9. Evgrafov, O.V., et al., Mutant small heat-shock protein 27 causes axonal Charcot-MarieTooth disease and distal hereditary motor neuropathy. Nat Genet, 2004. 36(6): p. 602-6.

10. Fontaine, J.M., et al., Interactions of HSP22 (HSPB8) with HSP20, alphaB-crystallin, and HSPB3. Biochem Biophys Res Commun, 2005. 337(3): p. 1006-11.

11. Fontaine, J.M., et al., Abnormal small heat shock protein interactions involving neuropathyassociated HSP22 (HSPB8) mutants. FASEB J, 2006. 20(12): p. 2168-70.

12. Hilton, G.R., et al., Small heat-shock proteins: paramedics of the cell. Top Curr Chem, 2013. 328: p. 69-98.

13. Kappe, G., et al., The human genome encodes 10 alpha-crystallin-related small heat shock proteins: HspB1-10. Cell Stress Chaperones, 2003. 8(1): p. 53-61.

14. Morrow, G. and R.M. Tanguay, Small heat shock protein expression and functions during development. Int J Biochem Cell Biol, 2012. 44(10): p. 1613-21.

15. Mymrikov, E.V., A.S. Seit-Nebi, and N.B. Gusev, Large potentials of small heat shock proteins. Physiol Rev, 2011. 91(4): p. 1123-59.

16. Mymrikov, E.V., A.S. Seit-Nebi, and N.B. Gusev, Heterooligomeric complexes of human small heat shock proteins. Cell Stress Chaperones, 2012. 17(2): p. 157-69.

ДЛЯ ЗАМЕТОК

ДЛЯ ЗАМЕТОК

ДЛЯ ЗАМЕТОК