[ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
имени М.В. ЛОМОНОСОВА
Химический факультет
На правах рукописи
Орлова София Ивановна
КОМПЛЕКСНАЯ СИСТЕМА ОЦЕНКИ АНТИОКСИДАНТНОЙ
АКТИВНОСТИ ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫХ
ЭЛЕМЕНТООРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ И КОМПЛЕКСОВ
БИОМЕТАЛЛОВ
02.00.16 – медицинская химия 02.00.08 – химия элементоорганических соединенийАВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва - 2012
Работа выполнена на кафедре органической химии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Научные руководители: Милаева Елена Рудольфовна, доктор химических наук, профессор Шевцова Елена Феофановна, кандидат химических наук (Институт физиологически активных веществ РАН, зав. лабораторией)
Официальные оппоненты: Кузнецова Светлана Александровна, доктор химических наук (кафедра химии природных соединений Химического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова, ведущий научный сотрудник) Санина Наталия Алексеевна, доктор химических наук (Институт проблем химической физики РАН, зав. отделом) Федеральное государственное
Ведущая организация:
бюджетное учреждение науки Институт элементоорганических соединений им.
А.Н.Несмеянова Российской академии наук
Защита диссертации состоится «19» декабря 2012 г. в 1100 час. на заседании Диссертационного Совета Д 501.001.69 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, Химический факультет, ауд. 446.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан « 19 » ноября 2012 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета доктор химических наук, профессор Т.В. Магдесиева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Одной из важных задач медицинской химии на пути создания лекарственных препаратов является отбор перспективных физиологически активных соединений с помощью системы первичного скрининга. На ранних этапах тестирования того или иного вида активности используют модельные реакции и процессы, либо in vitro биохимические системы, максимально приближенные к физиологическим условиям.
В последние годы резко возрос интерес к получению новых веществ, обладающих антиоксидантной активностью. Этот интерес во многом обусловлен массивом экспериментальных данных об участии окислительного стресса организма в патогенезе большого числа заболеваний (рак, диабет, нейродегенерация, ишемия и др.) В организме роль антиоксидантов выполняют низкомолекулярные соединения (-токоферол, аксорбиновая кислота, глутатион) и ферменты (каталаза, супероксиддисмутаза), действующие по принципиально различным механизмам и на различные мишени.
При изучении антиоксидантной активности синтетических низкомолекулярных веществ – кандидатов лекарственных препаратов, как правило, выбирается один-два метода определения активности. Такой подход позволяет регистрировать активность в целом, но не дает полного представления о природе антиоксидантного действия конкретного вещества, которое определяется его реакционной способностью. Однако новые синтетические подходы, позволяющие конструировать политопные молекулы с различными реакционными центрами, требуют сочетания различных методов и различных принципов выявления антиоксидантного действия для оценки интегрального вклада каждого из возможных типов активности. Существенным многообразием реакционных маршрутов характеризуются полифункциональные соединения, содержащие в составе молекул атомы металла/элемента.
Для таких веществ можно ожидать проявления синэргизма антиоксидантного действия за счет участия не только органического фармакофора, но и вовлечения металла/элемента.
Получены синтетические аналоги витамина Е, содержащие металл, или, так называемые «каталитические антиоксиданты» - миметики супероксиддисмутазы, включающие Fe, Mn, Co. И, наконец, введение металла в фенольные миметики -токоферола, как известно, приводит к стабилизации феноксильных радикалов, ответственных за механизм антиоксидантного действия, и предотвращает нежелательное образование вторичных хиноидных продуктов окисления, обладающих прооксидантным эффектом. В связи с этим возникает необходимость создания сетевой структуры методов оценки, в которой количественные характеристики антиоксидантной активности учитывают все особенности механизмов действия каждого тестируемого вещества.
Цель работы. Целью данной работы является разработка общего подхода для элементоорганических соединений и комплексов биогенных металлов.
В задачи работы входило: 1) рациональный подбор методов количественного определения антиоксидантной активности, основанных на модельных химических реакциях, с целью выявления основных маршрутов реакционной способности полифункциональных элементоорганических соединений и комплексов металлов; 2) изучение взаимного влияния металлосодержащего центра при оценке общей антиоксидантной активности полифункциональных соединений; 3) применение ряда in vitro методов с использованием в качестве тест-систем липосом, митохондрий и гомогенатов мозга крыс, а также фермента липоксигеназа с целью отбора перспективных кандидатов в ряду элементоорганических соединений и комплексов металлов – полифункциональных антиоксидантов, стабилизаторов мембран и нейропротекторов.
Научная новизна. Предложен новый подход для разработки сетевой структуры методов оценки антиоксидантной активности полифункциональных элементоорганических соединений и комплексов биометаллов, основанный на принципе «механизм - метод».
С использованием предложенной комплексной системы тестирования показано, что введение в 2,6-ди-трет-бутилфенолы элементоорганической группы (фосфонатные и фосфинатные), металлоорганического фрагмента (ферроцен) и металлосодержащего координационного узла (комплексы металлов с дипиколиламином) приводит к существенному возрастанию общей антиоксидантной активности по сравнению с известным органическим антиоксидантом ионолом (2,6-ди–трет-бутил-4-метилфенол).
В ряду ферроценов с 2,6-ди-трет-бутилфенольным заместителем выявлены эффективные ингибиторы пероксидного окисления липидов гомогенатов мозга крыс со значением IC50 3,9 ± 1,8 М, что позволяет проводить на их основе поиск веществ нейропротекторного действия.
Обнаружены комплексы Mn с дипиколиламиновым лигандом, содержащим 2,6-дитрет-бутилфенол, - высокоэффективные стабилизаторы однослойных липосом, состоящих из фосфатидилхолина и кардиолипина, которые представляют интерес для создания систем доставки лекарственных препаратов.
При изучении фермента липоксигеназа (LOX 1-B) и проведении молекулярного докинга найдены новые ингибиторы LOX 1-B – комплексы Cu с нитронилнитроксильными радикалами и комплексы Sb с N,S-гетероциклическими лигандами, значения IC50 для которых лежат в диапазоне 1729 М.
Практическая ценность. Для проведения первичного скрининга антиоксидантной активности и отбора веществ-лидеров предложено использовать сетевую структуру методов оценки, основанную на комплексном анализе возможных маршрутов реакционной способности тестируемых соединений. Найдены комплексы марганца, содержащие в дипиколиловом лиганде группу 2,6-ди-трет-бутилфенола, которые можно использовать в качестве перспективных стабилизаторов липосом. Предложен новый эффективный ингибитор фармакологически важной мишени – фермента липоксигеназа – комплекс меди, который представляет интерес для поиска противовоспалительных и антипролиферативных агентов.
Апробация работы. Материалы, вошедшие в диссертационную работу, были представлены на Международной конференции по металлоорганической и координационной химии (Россия, Нижний Новгород, 2008); 9-ой и 10-ой Европейской конференции по биологической неорганической химии (Польша, Вроцлав, 2008; Греция, Салоники, 2010);
XXIV и XXV Международной Чугаевской конференции по координационной химии (Россия, Санкт-Петербург, 2009; Суздаль, 2011); Всероссийской конференции «Итоги и перспективы химии элементоорганических соединений» (Москва, 2009); 1-ом Турецко-Российском симпозиуме по органической и медицинской химии (Турция, 2009); Третьем Европейском симпозиуме по липидным медиаторам (Франция, Париж, 2010); VIII Всероссийской конференции с международным участием «Химия и медицина» (Уфа, 2010); XI Международном симпозиуме по бионеорганической химии (Польша, Кудова-Здруй, 2010); 4ой Европейской конференции по химии наук о жизни (Венгрия, Будапешт, 2011); XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 6 статей, 13 тезисов докладов, получен 1 патент.
Объем и структура диссертации. Материал диссертационной работы изложен на страницах, включает 13 таблиц, 28 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 172 наименования.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (гранты 08-03-00844-а, 09-03-00090-а, 10-03а, 11-03-12088-офи-м, 12-03-00776-а) и ФЦП (N Госконтракта16.512.11.2278).
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Обзор литературы посвящен анализу известных данных о методах оценки антиоксидантной активности.
2. Обсуждение результатов посвящено разработке и использованию сетевой структуры методов оценки антиоксидантной активности полифункциональных элементоорганических соединений и комплексов биометаллов.
Исследуемые соединения стали результатом реализации двух направлений дизайна синтетических антиоксидантов: создание фенольных аналогов -токоферола – «ловушек»
свободных радикалов и создание миметиков активных центров ферментов антиоксидантной защитной системы (супероксиддисмутазы и каталазы) – редокс-активных комплексов металлов, способных взаимодействовать с активными метаболитами кислорода (АМК). На схеме представлена условная обобщенная формула объектов исследования, отражающая механизм их антиоксидантного действия: перенос атома водорода Н (путь А) и/или перенос электрона (путь Б) (Схема 1).
В состав молекул исследуемых соединений в различной комбинации входят следующие функциональные фрагменты:
RН, R – 2,6-диалкилзамещенные фенолы – миметики природных антиоксидантов, нитронилнитроксильные радикалы, орто-семихиноны, пирокатехины;
Q - координирующие группы, необходимые для обеспечения заданной геометрии комплексов, возможности введения дополнительных лигандов в окружение иона металла, а также устойчивости связи металл-лиганд при изменении степени окисления металла;
[М] - элементоорганический структурный блок, ион металла (Fe, Co, Cu, Mn, Ni, Zn, Sb).
Органическими соединениями общей формулы (RH)Q – объектами исследования в данной работе, являются пространственно-затрудненные 2,6-диалкилфенолы, а также замещенные гидроксиламины – предшественники феноксильных и нитронилнитроксильных радикалов (R)Q. Модификацию химической структуры 2,6-диалкилфенолов осуществляли заменой объемного заместителя в орто-положениях, либо функционального фрагмента в пара-положении бензольного кольца. Структурные вариации нитронилнитроксильных радикалов представлены различными заместителями в кольце имидазола, участвующего в координации с металлом. В орто-семихиноновых комплексах варьировали сочетание различного набора пара- и диамагнитных лигандов.
Возможность введения в 2,6-ди-трет-бутилфенолы благоприятных для координации металла заместителей Q создает возможность конструирования полифункциональных Вариабельность природы пара-заместителя в 2,6-ди-трет-бутилфенолах является также основой для введения элементоорганических групп.
В молекулах металлоорганических и координационных соединений общей формулы (RH)Q[M] присутствует реакционный центр (ион металла), способный вовлекаться в процесс переноса электрона. Кроме того, собственно атом металла в парамагнитном или биохимического действия как по пути переноса электрона, так и по пути координации в значимых сайтах биохимических мишеней.
Таким образом, объектами исследования являются полифункциональные соединения, которые являются «ловушками» радикалов и/или переносчиками электрона, а также способны встраиваться в сайты белковых мишеней.
Для установления общей антиоксидантной активности данных полифункциональных соединений в работе предложена сетевая структура комплексной системы методов оценки (Рис.1).
С этой целью в настоящей работе использован набор 10 методов, позволяющих учесть все возможные маршруты химической реакционной способности исследуемых соединений в зависимости от строения их молекул:
1. Исследование молекулярных механизмов активности соединений с использованием модельных тестов:
1.1. ДФПГ-тест 1.2. CUPRAC-тест 1.6. Пероксидное окисление структурного фрагмента липидов на примере олеиновой и линолевой кислот 1.7. Влияние на активность фермента липоксигеназа (LOX 1-B) 2. Исследование in vitro анти-/прооксидантной активности с использованием биологических тест-систем:
2.1. Пероксидное окисление липидов (ПОЛ) митохондрий, изолированных из печени 2.2. Пероксидное окисление липидов гомогенатов печени и мозга крыс.
В работе осуществлено тестирование 96 соединений.
неферментативное пероксидное окисление олеиновой и линолевой кислот реакция Габера-Вейса ОБЩАЯ in vitro АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ Рис. 1. Общая схема комплекса методов оценки антиоксидантной активности.
2.1. Синтетические эталонные антиоксиданты С целью проведения сравнительного анализа и выбора эталонов сравнения в работе использованы известные применяемые антиоксиданты фенольного типа (1-5), аскорбиновая кислота (6) и галловая кислота (7).
HO O HO O O
исследованных антиоксидантов интерес для дальнейшего сравнительного анализа в качестве эталонов представляют тролокс (1) и ионол (3) (Таблица 1).Таблица 1. Параметры активности эталонных антиоксидантов (1-7) по данным различных методов.
* активность при концентрации соединения 1,2 мМ; ** неферментативное пероксидное окисление линолевой кислоты, % ингибирования при концентрации соединения 2,4 мМ; *** % ингибирования при концентрации соединения 0,8 мМ; IC50 - концентрация ингибирования на 50%, ЕС50 – эффективная концентрация антиоксиданта, необходимая для уменьшения концентрации ДФПГ на 50%; TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) – активность в сравнении с тролоксом (1).
Соединение синтезировано под руководством к.х.н. А.Ю. Спивак (Институт нефтехимии и катализа РАН, Уфа) и передано для дальнейших исследований.
2.2. 2,6-ди-трет-бутилфенолы с гетероциклическими заместителями С целью выявления роли фармакофорных азотсодержащих гетероциклических фрагментов в проявлении антиоксидантной активности 2,6-ди-трет-бутилфенолами в работе исследованы следующие соединения1 * общей формулы (RH)Q: F
NN NN NN
N NH N NH N NH
NN N NN N NN N
По данным ДФПГ-теста соединение 14 имеет значение ЕС50 =32,2 ±1,3 М и активнее тролокса (1) (Табл. 1). Это же соединение проявило высокую активность в CUPRAC-тесте (TEAC = 2,42±0,23). При изучении общей антиоксидантной активности на примере модельной реакции пероксидного окисления Z-9-октадеценовой (олеиновой) кислоты и ПОЛ гомогенатов печени крыс in vitro (Рис. 2) в сравнении с ионолом (3) показано, что максимальной активностью обладает тетразин 13. Таким образом, в качестве перспективных антиоксидантов можно рассматривать соединения, в состав молекул которых входят как 2,6ди-трет-бутилфенол, так и 1,2,4,5-тетразин.Рис. 2. Активность соединений 10-13, 16 и 3 в процессе пероксидного окисления олеиновой кислоты и липидов гомогената печени крыс in vitro (37оС; FeSO4• 4H2O; буфер HEPES; рН 7,4; 30 мин).
Соединения синтезированы под руководством к.х.н. Г.Л. Русинова (Институт органического синтеза им. И.Я.
Постовского УрО РАН) и переданы для дальнейших исследований.
2.3. 2- и 2,6-Изоборнилфенолы Сравнительное исследование антиоксидантной активности полусинтетических ортоизоборнилфенолов2 * (18-25) в сопоставлении с ионолом демонстрирует перспективность данных соединений.
Особый интерес представляет «диборнол» (18), аналог ионола (19) и фенол 22 (Табл.
2).
Таблица 2. Параметры активности соединений (18-25) по данным различных методов.
* активность при концентрации соединения 1,2 мМ; ** % ингибирования при концентрации соединения 100 М *** % ингибирования при концентрации соединения 500 М; **** неферментативное пероксидное окисление линолевой кислоты, % ингибирования при концентрации соединения 0,8 мМ.
Изоборнилфенолы 18-20, 22 исследованы в качестве ингибиторов фермента липоксигеназа. Значения IC50 представлены на рис. 3. Все соединения обладают ингибирующей активностью. Наиболее активным в ряду исследованных изоборнилфенолов является структурный аналог ионола (19) (IC50 = 36,7 М).
Исследуемые вещества (18-25) получены в Институте химии Коми НЦ УрО РАН (г. Сыктывкар) под руководством член-корр. РАН А.В. Кучина и переданы для дальнейших исследований.
Рис. 3. Значения IC50 для соединений 18-20, 22 Таблица 3. Ингибирование in vitro ПОЛ в процессе ингибирования боратный буфер, 25оС, рН 9,0). Fe(NH4)(SO4)2).
Результаты исследования in vitro ПОЛ гомогенатов мозга крыс в присутствии 18-20, 22 показали, что при концентрации 30 М данные соединения ингибируют ПОЛ, индуцированное трет-бутилгидропероксидом (tBHP) на ~ 30%. Однако важно отметить, что при индукции ПОЛ с использованием Fe3+ процент ингибирования 50% наблюдается при концентрациях < 6 М и достигает максимума (~90%) при концентрациях 30 М (Табл. 3).
Несомненным лидером по совокупности методов является, таким образом, соединение 19 – структурный аналог ионола (3).
2.4. Фосфорсодержащие элементоорганические соединения В качестве элементоорганических соединений исследованы 2,6-ди-третбутилфенолы с фосфонатными и фосфинатными группами3 (26-42). Данные представлены в Таблице 4.
Показано, что максимальной активностью обладают соединения 27, 28 и 42.
Результаты ДФПГ-теста свидетельствуют о том, что большинство соединений не являются гидроксильного радикала все соединения малоактивны. Однако результаты CUPRAC-теста показывают, что фосфонаты и фосфинаты участвуют в процессе восстановления ионов меди и являются переносчиками электрона, а также эффективно ингибируют неферментативное пероксидное окисление линолевой кислоты (до 95,4% для 30) (Табл. 4).
Соединения синтезированы под руководством к.х.н. А.А. Прищенко на кафедре органической химии Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова и использованы для дальнейших исследований.
But R'' R' R=OH, R’= OH, R’’= (CH2)2Py -4 (35); R=H, R’= OH, R’’= CH(OH)Py-3 (36).
P OH HO OH
Таблица 4. Параметры активности фосфорорганических соединений (26-43) по данным различных методов.Эфир дифосфоновой кислоты (30) проявил крайне высокую активность как ингибитор ПОЛ митохондрий печени крыс, индуцированном Fe3+ (IC50 = 1,1 М), что, по-видимому, свидетельствует о преимущественном вкладе редокс-маршрута в механизм его действия.
Рис. 4. Выживаемость культуры клеток гранулярных нейронов мозжечка при различных концентрациях соединения 28 в наблюдается максимальный протекторный токсичности.
Таким образом, фосфонаты и фосфинаты могут представлять интерес с точки зрения поиска физиологически активных соединений, обладающих высокой антиоксидантной активностью и способных выступать в роли цитопротекторов.
2.5. Металлоорганические соединения на основе ферроцена Введение ферроценила в качестве редокс-активного заместителя в молекулу 2,6-дитрет-бутилфенола является одним из способов реализации идеи создания полифункциональных антиоксидантов. В настоящей работе исследована серия соединений с различными линкерами между 2,6-ди-трет-бутилфенолом и ферроценом4 *, что позволило оценить (Табл. 5) следующие факторы:
1) роль 2,6-ди-трет-бутилфенольной группы;
2) роль редокс-активного центра ферроцена;
3) влияние природы линкера.
Доказано, что соединения, содержащие фенол, намного активнее, чем их фенильные аналоги как в ДФПГ- и CUPRAC-тестах, так и в пероксидном окислении линолевой кислоты (для фенильных аналогов характерны реакции только с участием ферроценового центра), (Табл. 5).
Соединения ферроценового ряда были получены в лабораториях биоэлементоорганической химии и физической органической химии кафедры органической химии Химического факультета МГУ имени М.В.
Ломоносова под руководством к.х.н. Н.Н. Мелешонковой и использованы для дальнейших исследований.
Таблица 5. Параметры активности соединений, содержащих фрагмент ферроцена, (44-60) по данным различных методов.
соедикислоты** * активность при концентрации соединения 100 М; ** % ингибирования при концентрации соединения 1, мМ; † % ингибирования при концентрации соединения 150 М; ‡ % ингибирования при концентрации соединения 214 М.
антиоксидантной активности в процессе соединения, содержащие группу 2,6-дитрет-бутилфенола, представляет значительный интерес по сравнению с их фенильными аналогами (Рис. 5) и Для соединений 44 и 48, в молекулах которых существует единая система сопряжения «ферроцен-линкер-фенол», наблюдается высокая эффективность антиоксидантного действия (IC50 составляет 3,7 и 3,9 М для 44 и 48 соответственно). Полученные значения IC подтверждают несомненное преимущество комбинирования фрагментов фенола и ферроцена в одной молекуле (IC50 для изолированных 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенола и ферроценов 45 и 49, составляют 60,1, 70,4 и 47,8 М соответственно). Столь значительное повышение активности объясняется, как было показано, возможностью внутримолекулярного переноса электрона между двумя редокс-активными центрами – 2,6-ди-трет-бутилфенолом и ферроценом, что обусловливает синэргизм действия.
ферроценсодержащих ингибиторов липоксигеназы LOX 1-B.
соединения Выявлена зависимость структура-активность: величина IC50 растет с увеличением объема заместителя.
2.6. Комплексы металлов с дипиколиламином, содержащим 2,6-ди-третбутилфенол Сочетание в одной молекуле антиоксидантной 2,6-ди-трет-бутилфенольной группы в лиганде и биогенного металла, способного менять степень окисления, открывает Таким образом, исследуемая серия соединений позволяет не только оценить вклад иона металла, но и проследить изменение активности в зависимости от природы металла и лиганда Х (Cl, OCOMe) (Табл. 7.) Таблица 7. Параметры активности комплексов металлов с дипиколиламином, содержащим 2,6-ди-трет-бутилфенол (61-73), по данным различных методов.
* активность при концентрации соединения 2 мМ; ** % ингибирования при концентрации соединения 2 мМ;
*** % ингибирования при концентрации соединения 0,2 мМ; **** % ингибирования при концентрации соединения 0,1 мМ.
Соединения синтезированы в лаборатории биоэлементоорганической химии кафедры органической химии Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова под руководством к.х.н. Д.Б. Шпаковского и использованы для дальнейших исследований.
Из полученных данных (Табл. 7) следует, что потенциальной антирадикальной активностью обладают комплекс железа (63), комплексы марганца (66 и 72) и лиганд (61), причем лиганд является наиболее активным антиоксидантом по результатам ДФПГ-теста. В CUPRAC-тесте значимой активностью в ряду всех исследуемых соединений обладают только комплексы железа (63 и 69). При изучении взаимодействия соединений с Н2О обнаружено, что исходный органический лиганд (61) не проявляет активности. В ряду комплексов независимо от лиганда Х наименее низкие значения ЕС50 получены для соединений Ni (122,6 µM (67) и 90,5 µM (73) соответственно). Из сравнения активностей хлоридов и ацетатов следует, что последние являются более активными в процессе распада Н2О2, что связано, по-видимому, с их большей гидрофильностью.
Все исследованные комплексы являются ингибиторами фермента липоксигеназа и имеют значения IC50 в области 1641 µМ. В данном ряду наиболее эффективным ингибитором является комплекс Cu (64), а наиболее слабым – комплекс Zn (62). При этом, важно отметить, что лиганд 61 не оказывает влияния на активность фермента LOX 1-B.
В качестве моделей клеточных и митохондриальных мембран для изучения пероксидного окисления были использованы малые одноламеллярные (однослойные) Комплексы Mn 66 и 72 являются наиболее активными ингибиторами окислительной деструкции липосом, представляющих интерес для создания систем доставки лекарственных препаратов. Соединение 72 является несомненным лидером, его значение IC50 составляет 21,0 µМ, что ниже, чем для тролокса (1) (IC50 = 98,3 µМ) и ионола (3) (IC50 = 29,3 µМ).
2.7. Нитронилнитроксильные радикалы и комплексы меди (II) на их основе В работе исследована серия нитронилнитроксильных радикалов 76 и 77, их диамагнитных предшественников 74 и 75, а также комплексов Cu (78 и 79)7 †. F
NH NH N O N
Для диамагнитных предшественников нитроксильных радикалов (74 и 75), содержащих ОН-группу, способную к транспорту атома водорода, проведен ДФПГ-тест.Липосомы получены на кафедре высокомолекулярных соединений Химического факультета МГУ имени М.В.
Ломоносова под руководством д.х.н. проф. Ярославова А.А. и предоставлены для дальнейших исследований.
Соединениня синтезированы в Международном томографическом центре СО РАН (г. Новосибирск) под руководством член-корр. РАН В.И. Овчаренко и переданы для дальнейших исследований.
Сравнение соединений 74 (ЕС50 = 58,0 М) и 75 (ЕС50 = 55,5 М), отличающихся заместителем в кольце имидазола показало, что соединение 75, содержащее дополнительную метильную группу, более активно.
закономерность – нитронилнитроксильный радикал с метильным заместителем более активен, как и комплекс Cu (79) с данным лигандом. Аналогичные результаты получены и в CUPRAC-тесте. По отношению к O2 сами радикалы оказались неактивны, а для комплексов М для 78 и 79 соответственно).
Для комплексов Cu 78 и 79 в работе проведены детальные исследования процесса ингибирования фермента липоксигеназы. Определение типа ингибирования фермента показало, что комплекс с лигандом, содержащим метильный заместитель, является неконкурентным ингибитором, а комплекс с лигандом без метильного заместителя – конкурентным (Табл. 8). Полученный результат позволяет предположить, что изменение структуры (увеличение размера молекулы и пространственного расположения заместителя) приводит к полной смене типа ингибирования.
Таблица 8. Параметры ингибирования LOX 1-B в присутствии комплексов 78 и 79.
Km – константа Михаэлиса, Vmax – максимальная скорость ферментативной реакции ингибирования был проведен молекулярный докинг8 * для соединений 78 и 79 (Рис. 6).
Показано, что для обоих соединений характерно расположение в гидрофобном кармане активного центра.
Молекулярный докинг осуществлен к.х.н. Осолодкиным Д.И. на кафедре органической химии Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова Рис. 6. Результаты докинга соединений (а) 78 и (б) 79 (указаны расстояния между атомами Cu (зеленый цвет) и атомом Fe (красный цвет) в 78 (7,37 ) и 79 (9,15 ) в активном центре).
Таким образом, на основании полученных данных можно заключить, что «ловушками» свободных радикалов. Нитронилнитроксильные радикалы 76, 77 малоактивны в реакциях с активными метаболитами кислорода, а комплексы меди 78, 79 активны по отношению к супероксид анион-радикалу, а также являются перспективными ингибиторами липоксигеназы.
2.8. Комплексы редокс-неактивных металлов с радикальными лигандами С целью изучения влияния парамагнитного центра в органическом лиганде комплекса редокс-неактивного металла исследованы комплексы Sb, Ga, In, Ge, Sn с орто-семихинонами 83-86, а также их катехолатные аналоги 80-829 *. F Соединения 80-82 активно восстанавливают стабильный радикал ДФПГ и имеют значения ЕС50 36,2 ± 0,7 (80); 56,5 ± 0,6 (81) и 54,0 ± 0,3 (82) µМ соответственно. В то же время комплексы 83-86, в лиганде которых присутствует свободный радикал, проявляют незначительную активность в ДФПГ-тесте.
Комплексы синтезированы в Институте металлоорганической химии имени Г.А. Разуваева РАН (г. Нижний Новгород) под руководством член-корр. РАН В.К. Черкасова и переданы для дальнейших исследований.
Можно высказать предположение о том, что механизм взаимодействия комплексов сурьмы 80-82 определяется возможностью реакции радикального замещения в лигандном окружении металла. Соединения 80-82 являются эффективными ингибиторами пероксидного окисления линолевой кислоты и имеют следующие значения ЕС50: 1,06 ± 0,04 (80); 2,95 ± 0,40 (81) и 1,25 ± 0,30 (82) мМ.
В CUPRAC-тесте соединения 80, 81, 84 и 86 проявили активность, равную или превышающую таковую для тролокса как эталона (значения ТЕАС близки к 1, Рис. 7).
Рис. 7. Результаты CUPRAC-теста для соединений 80, 81, 84 и 86 (25оС, ацетатный буфер, рН 7,0, 30 мин).
Изучение влияния комплексов Sb, Ga, In, Ge и Sn на активность фермента липоксигеназа показало, что для соединений 80-82, 83 и 86 характерны высокие значения IC50 ( > 150 М). Значение IC50 для комплекса In (85) составляет 12,1 ± 0,8 М, что позволяет рассматривать данное соединение как потенциальный ингибитор липоксигеназы.
Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что комплексы сурьмы 80являются активными антиоксидантами и способны взаимодействовать с активными метаболитами кислорода. В свою очередь комплексы 83-86, несмотря на имеющийся радикальный фрагмент, в целом не проявляют свойств «ловушек» свободных радикалов, однако комплексы Ge (84) и Sn (86) активно восстанавливают ион меди в CUPRAC-тесте, и могут представлять интерес в качестве редокс-ингибиторов АМК.
2.9. Комплексы сурьмы – ингибиторы липоксигеназы Известно, что комплексы сурьмы представляют интерес как физиологически активные вещества, способные встраиваться в белковые молекулы, выступая в качестве ингибиторов различных ферментов.
В работе изучено влияние серии комплексов сурьмы 87-961 * на активность фермента 0F LOX 1-B с целью отбора потенциальных ингибиторов липоксигеназы, участвующих в патогенезе воспалительных и опухолевых заболеваний. Выбор гетероциклических лигандов, содержащих как атомы N, так и атомы S, обусловлен их собственной физиологической активностью, в том числе, и в процессе канцерогенеза.
В ряду исследуемых комплексов Sb наиболее активными ингибиторами LOX 1-B являются соединения 91 (IC50 = 23,5 ± 4,7 М) и 95 (IC50 = 17,1 ± 1,6 М). Данные, полученные при определении типа ингибирования для комплексов 91 и 95 графически в липоксигеназа по типу бесконкурентного ингибирования.
Результаты сравнительного анализа активности с использованием сетевой структуры методов оценки Предложенный в работе комплексный подход для оценки антиоксидантной активности соединений, содержащих различные реакционноспособные центры, позволяет выявить вещества-лидеры.
Использование сетевой структуры методов оценки активности предполагает перекрестное сопоставление результатов (Табл. 9), полученных для различных серий соединений в соответствии с тремя основными маршрутами реакционной способности:
(1) антирадикальная активность, (2) редокс-активность, (3) связывание с белковой мишенью.
Соединения 87-96 получены на химическом факультете Университета Иоаннины (Греция) под руководством проф. С. Хаджикакоу и переданы для дальнейших исследований в рамках межвузовского сотрудничества.
Таблица 9. Соединения-лидеры по данным сетевой структуры методов тестирования.
Полученные данные позволяют выбрать несколько наиболее перспективных соединений, представляющих интерес для дальнейших исследований:
АНТИОКСИДАНТ НЕЙРОПРОТЕКТОР
СТАБИЛИЗАТОР ЛИПОСОМ ИНГИБИТОР ЛИПОКСИГЕНАЗЫ
1. Предложен новый подход к разработке сетевой структуры методов оценки антиоксидантной активности полифункциональных элементоорганических соединений и комплексов биометаллов, основанный на принципе «механизм - метод».2. С использованием предложенной комплексной системы тестирования показано, что введение в 2,6-ди-трет-бутилфенолы элементоорганической группы (фосфонатные и фосфинатные), металлоорганического фрагмента (ферроцен) и металлосодержащего координационного узла (комплексы дипиколиламина) приводит к существенному возрастанию общей антиоксидантной активности по сравнению с известным органическим антиоксидантом ионолом.
3. В ряду ферроценов с 2,6-ди-трет-бутилфенольным заместителем выявлен эффективный ингибитор пероксидного окисления липидов гомогенатов мозга крыс со значением IC50 = 3,9 М, что позволяет проводить на их основе поиск веществ нейропротекторного действия.
4. Обнаружены комплексы Mn с дипиколиламиновым лигандом, содержащим 2,6-дитрет-бутилфенол, - высокоэффективные стабилизаторы однослойных липосом, состоящих из фосфатидилхолина и кардиолипина, представляющих интерес для создания систем доставки лекарственных препаратов.
5. При изучении фермента липоксигеназа (LOX 1-B) и проведении молекулярного докинга найден новый ингибитор LOX 1-B – комплекс Cu с нитронилнитроксильными радикалами, значение IC50 для которого составляет 20 М.
Основное содержание работы
изложено в следующих публикациях:
Е.Р. Милаева, Н.Н. Мелешонкова, Д.Б. Шпаковский, В.В. Павловец, С.И. Орлова, Д.И.
Осолодкин, В.А. Палюлин, С.В. Логинов, П.А. Стороженко, Н.С. Зефиров. Политопный дипиколиламиновый комплекс цинка, содержащий фрагмент ферроцена, - новый ингибитор липоксигеназы LOX I-B. Доклады академии наук, 2012, том 443, № 2, с. 186– 2. I. Ozturk, A.K. Metsios, S. Filimonova-Orlova, N. Kourkoumelis, S.K. Hadjikakou, M.
Manos, A.J. Tasiopoulos, S. Karkabounas, E.R. Milaeva, N. Hadjiliadis. Study on single crystal structure of the antimony(III) bromide complex with 3-methyl-2-mercaptobenzothiazole and biological activity of some antimony(III) bromide complexes with thioamides. Medicinal Chemistry Research, 2012, vol. 21, p. 3523-3531.
Е.Р. Милаева, С.И. Орлова, Д.И. Осолодкин, В.А. Палюлин, Е.Ю. Фурсова, В.И.
Овчаренко, Н.С. Зефиров. Комплексы меди с нитронилнитроксильными радикалами – ингибиторы липоксигеназы с антиоксидантной активностью. Известия Академии наук.
Серия химическая, 2011, № 12, с. 2514-2521.
E.R. Milaeva, S.I. Filimonova (С.И. Орлова), B.N. Tarasevich, A.A. Prishchenko, M.V.
Livantsov, O.P. Novikova, L.I. Livantsova, L.G. Dubova, E.F. Shevtsova. Novel antioxidants based on phosphonates bearing 2,6-di-tert-butylphenol. EUROBIC10 Proceedings, Medimond Publ., Italy, 2010, p. 15-23.
E.R. Milaeva, S.I. Filimonova (С.И. Орлова), L.G. Dubova, E.F. Shevtsova, S.O. Bachurin, N.S. Zefirov. Antioxidative activity of ferrocenes bearing 2,6-di-tert-butylphenol moieties.
Bioinorganic Chemistry and Applications, 2010, vol. 2010, ID 165482, 6 pages.
I. Ozturk, S. Filimonova (С.И. Орлова), S.K. Hadjikakou, N. Kourkoumelis, V. Dokorou, M.J. Manos, A.J. Tasiopoulos, M.M. Barsan, I.S. Butler, E.R. Milaeva, J. Balzarini, N.
Hadjiliadis. Structural motifs and biological studies of new antimony(III) iodide complexes with thiones. Inorganic Chemistry, 2010, vol. 49, No. 2, p. 488-501.
В.В. Павловец, С.И. Орлова, Д.Б. Шпаковский, Н.Н. Мелешонкова, Е.Ф. Шевцова, Е.Г.
Киреева, Л.Г. Дубова, Е.Р. Милаева. Физиологическая активность новых дипиколиламиновых комплексов металлов. XIX Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, 25–30 сентября, 2011, Волгоград, Россия, Т.1, с. 564.
С.И. Орлова, Ю.А. Грачева, В.Ю. Тюрин, Е.Ф. Шевцова, Е.Р. Милаева. Комлексное in vitro биотестирование антиоксидантной активности перспективных физиологически активных веществ. XIX Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, 25- сентября, 2011, Волгоград, Россия, т. 4, с. 383.
9. S.I. Orlova, N.N. Meleshonkova, E.R. Milaeva, E.F. Shevtsova. The antioxidative activity mechanism of 2,6-di-tert-butylphenol containing ferrocenes. 4th European Conference on Chemistry for Life Sciences (4ECCLS), Aug. 31– Sept. 3, 2011, Budapest, Hungary, p. 112.
Е.Р. Милаева, С.И. Орлова, Е.Ю. Фурсова, Е.В. Третьяков, В.И. Овчаренко. Комплексы 10.
меди с нитронилнитроксильными радикалами как ингибиторы липоксигеназы. XXV Международная Чугаевская конференция по координационной химии, 6–11 июня 2011, Суздаль, Россия, c. 472.
11. Y.A. Gracheva, D.B. Shpakovsky, S.I. Filimonova (С.И. Орлова), E.R. Milaeva, Multifactor antioxidative activity assay of dipicolylamine metal complexes. XI International Symposium on Bioinorganic Chemistry, 4 – 8 September, 2010, Kudowa Zdroj, Poland, P18.
12. E.R. Milaeva, D.B. Shpakovsky, S.I. Filimonova (С.И. Орлова), Yu.A. Gracheva, E.F.
Shevtsova, S.O. Bachurin, N.S. Zefirov. Novel metal-based antioxidants - potential therapeutic candidates for prevention the oxidative stress. XI International Symposium on Bioinorganic Chemistry, 4 – 8 September, 2010, Kudowa Zdroj, Poland, 2010, L17.
13. E.R. Milaeva, D.B. Shpakovsky, S.I. Filimonova (С.И. Орлова), Y.A. Gracheva, E.F.
Shevtsova, S.O. Bachurin, N.S. Zefirov. Novel metal based antioxidants as protectors against the oxidative stress. 10 European Biological Inorganic Chemistry Conference, 22-26 June, 2010, Thessaloniki, Greece, SL07.
14. S.I. Filimonova (С.И. Орлова), Yu.A. Gracheva, E.F. Shevtsova, E.R. Milaeva. The impact of membrane active synthetic antioxidants on in vitro and ex vivo lipid peroxidation level and lipoxygenase activity. Third Europian Workshop on Lipid Mediators. Paster Institute, June 3-4, 2010, Paris, France, p. 113.
15. E.R. Milaeva, D.B. Shpakovsky, Zhang Jingwei, S.I. Filimonova (С.И. Орлова), E.F.
Shevtsova, S.O. Bachurin, N.S. Zefirov. Biomimetic metal based antioxidants as protectors of the oxidative stress. 1st Turkish-Russian joint meeting on organic and medicinal chemistry, October 14-17, 2009, Turkey, p. 27.
16. S. Filimonova (С.И. Орлова), I.I. Ozturk, E.R. Milaeva, N Kourkoumelis, S.K. Hadjikakou, N. Hadjiliadis. Biological studies of new antimony(III) iodide complexes with thioamides. The Russian Conference “Chemistry of Organoelement Compounds: Results and Prospects”, devoted to 110th anniversary of academician A.N. Nesmeyanov, September 28 - October 2, 2009, Moscow, Russia, p. 290.
17. Е.Р. Милаева, Д.Б. Шпаковский, С.И. Филимонова (С.И. Орлова), Е.Ф. Шевцова, С.О.
Бачурин, Н.С. Зефиров. Новый подход к созданию протекторов окислительного стресса на основе комплексов металлов. XXIV Международная Чугаевская конференция по координационной химии. 15–19 июня 2009 г., Санкт-Петербург, Россия, с. 115.
18. E. Milaeva, D.Shpakovsky, Zhang Jingwei, S. Filimonova (С.И. Орлова), E. Shevtsova, S.
Bachurin, Z. Zefirov. Polytopic metal complexes with 2,6-di-tert-butylphenol pendants in cellular oxidation processes. 9th European Biological Inorganic Chemistry Conference. 2008, Wroclaw, Poland, P 47.
19. S.I. Filimonova (С.И. Орлова), L.G. Dubova, E.F. Shevtsova, E.R. Milaeva. Antioxidative activity assay of 2,6-di-tert-butylphenols based on DPPH test and lipid peroxidation in intact mitochondria. International conference on Organometallic and Coordination Chemistry. 2008, N. Novgorod, P27.
20. Н.Т. Берберова, В.П. Осипова, М.Н. Коляда, Н.А. Антонова, Н.С. Зефиров, Е.Р. Милаева, С.И. Филимонова (С.И. Орлова), Ю.А. Грачева, А.А. Прищенко, М.В. Ливанцов, Л.И.
Ливанцова, О.П. Новикова. Способ снижения уровня пероксидного окисления липидов.
Патент № RU 2405032 C1, МПК С11В 5/00 (2006.01). Заявлено 28.05.2009, опубликовано 27.11.2010. Бюл. №33.
«