На правах рукописи

САМОХИНА Людмила Сергеевна

БИОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ

ПЕПТИДОВ ЛАКТОФЕРРИНА И -ЛАКТАЛЬБУМИНА

НА ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНЫЙ ТРАКТ

Специальность 03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2013 2

Работа выполнена в ФГБУ Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН в лаборатории молекулярной инженерии и ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» на кафедре «Технология молока и молочных продуктов»

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Комолова Галина Сергеевна доктор химических наук, профессор Тишков Владимир Иванович

Официальные оппоненты:

Донская Галина Андреевна доктор биологических наук, профессор Заведующая лабораторией ресурсосберегающих процессов и специальной тематики Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности Гунар Людмила Эдуардовна доктор биологических наук, доцент Заведующая кафедрой технологии хранения и переработки плодов и овощей Российский государственный аграрный университет – Московская сельскохозяйственная академия К.А.Тимирязева

Ведущая организация: Федеральное государственное унитарное предприятие Государственный научно- исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Защита диссертации состоится 11 июня 2013 г в 15.30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.21 при Московском государственном университете им.

Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, д.1, стр. 12, биологический факультет МГУ, ауд. М-1.

Тел. 8(495)939-54-83, эл. почта: [email protected]

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан мая 2013 года.

ученый секретарь Диссертационного совета, к.б.н. Пискункова Нина Федоровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

В условиях неблагоприятной экологии рост вторичных иммунодефицитных состояний, определяет необходимость повышения неспецифической резистентности здоровых и больных людей, улучшения функционирования естественных систем детоксикации и механизмов обеспечения иммунобиологической реактивности организма. Это становится возможным за счет использования в качестве активной основы в продуктах профилактического и лечебного назначения природных физиологически активных соединений. Молоко и его компоненты, прежде всего белки - продукты питания животного происхождения, потребляемые с первых дней жизни. Они участвуют в энергетических и транспортных процессах, осуществляют регуляторную и защитную функции.

Особое внимание заслуживают сывороточные белки молока лактоферрин (ЛФ) и -лактальбумин (-ЛА). Лактоферрин в последние годы привлекает большое внимание исследователей в связи с его полифункциональностью, направленной на поддержание гомеостаза животного организма. Он обладает антибактериальным, противовирусным, бифидогенным действием, является фактором роста, переносчиком железа, участвует в метаболических процессах, способен катализировать различные биохимические реакции, обладая РНКазной, ДНКазной, лактопероксидазной активностями.

Что касается -ЛА, второго после -лактоглобулина по содержанию в молоке белка, то это прежде всего белок, который содержится в высоких концентрациях в молоке, при этом практически не иммуногенен и обладает целым рядом значимых защитных свойств: антимикробным, иммуномодулирующим, опоидным, антиоксидантным, противоязвенным, противоопухолевым, антигипертензивным, противострессовым, регулирующим клеточный рост.

В последние годы японскими исследователями было показано, что образующиеся при протеолизе пептиды по целому ряду показателей, оказались более активными, чем нативные белки. Открывается перспектива получения новых, более эффективных лечебных и профилактических средств на основе пептидных комплексов. Однако в этом аспекте требуются углубленные структурно-функциональные исследования пептидов при различных условиях протеолиза.

Современные работы в основном направлены на лечение пептидными препаратами заболеваний, в то время как, отсутствуют данные касающиеся их профилактического действия. Есть основание полагать, что наряду с созданием лечебных средств на основе высокоочищенных пептидов, практически целесообразно, в том числе и экономически, разрабатывать профилактические средства на основе комплексов пептидов с различными функциональными свойствами. Это расширяет их физиологическое действие. Данное исследование проводилось с учетом этих положений.

Список сокращений: ЖКТ-желудочно-кишечный тракт; ЛФ-бычий лактоферрин; -Лабычий -лактальбумин; БСА-бычий сывороточный альбумин; ЛФц - лактоферрицин; ЛФплактоферрампин; -ЛГ--лактоглобулин; ЛП-лактопероксидаза; ГT-галактозилтрансфераза;

ИПХИ-интегральный показатель хронической интоксикации; CAMP- база данных антимикробных пептидов; АА-антимикробная активность; RF- классификационное древо; SVM векторная машина; DA - дискриминантный анализ; АОЕ- антиоксидантная ёмкость; TEAC антиоксидантная ёмкость по отношению к катион - радикалу АБТС; ORAC - метод анализа антиоксидантной ёмкости по отношению к пероксильному радикалу; АБТС – 2,2’-азинобисэтил-бензотиазолинсульфонат); Mr- молекулярная масса; а.о. – аминокислотный остаток;

Цель и задачи исследований.

Целью настоящей работы являлось изучение защитного влияния пептидов ЛФ и -ЛА на желудочно-кишечный тракт и обоснование состава пептидного комплекса противоязвенного, антидисбактериозного, антиоксидантного действия. В соответствии с поставленной целью последовательно решались следующие задачи:

Изучить пептидный состав гидролизатов ЛФ и -ЛА и их защитные свойства против повреждений желудочно-кишечного тракта в зависимости от условий протеолитического процесса;

Установить функциональную связь между пептидным составом гидролизатов и их биологической активностью: противоинфекционной, бифидогенной, противоязвенной, антиоксидантной;

Изучить совместное защитное действие относительно желудочно-кишечного тракта пептидов ЛФ и -ЛА;

Разработать рекомендации по созданию полифункциональной пептидной композиции с защитным действием против повреждений желудочно-кишечного тракта.

Научная новизна.

Впервые показано профилактическое и защитное действие пептидов ЛФ, -ЛА и их комплекса относительно повреждений ЖКТ (противоязвенное, антидисбактериозное);

Установлено наличие в мембране Bifidobacterium Adolecsentis B-1 белка (58 кДа), связывающего лактоферрин и его пептиды;

Теоретически и экспериментально обоснован состав нового пептидного комплекса, рекомендуемого в качестве биологически активной основы средств относительно защиты ЖКТ.

Практическая значимость работы.

С учетом установленных в работе биологических свойств пептидов ЛФ и -ЛА результаты исследований могут быть использованы в биотехнологических схемах разработок физиологически эффективных препаратов медицинского, косметического, пищевого назначения.

Примененные в работе методологические подходы в исследовании структурнофункциональных свойств пептидов ЛФ и -ЛА могут рассматриваться как адекватные в разработках методов скрининга пептидов различной функциональной направленности.

На основе пептидного комплекса разработан препарат «ЖКТ-НОРМ», обладающий антимикробным, бифидогенным, антидисбактериозным, антиоксидантным, противоязвенным действием.

Результаты исследования включены в учебный курс лекций по дисциплине «Биологически активные вещества молока».

Апробация работы.

Результаты диссертационной работы были представлены на международных конгрессах, конференциях: Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2010 г.); Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва, 2012 г.); 10-й международной научнопрактической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (в конкурсе молодых ученых на лучшую научно-исследовательскую работу получен диплом и присуждена медаль); Пленарном заседании 10-й международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2012); Работа выполнялась в рамках гранта РФФИ 10А.

Публикации.

По материалам диссертационной работы опубликовано 9 публикаций (из них статьи в журналах, рекомендованных ВАК и 5 тезисов докладов конференций).

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, аналитического обзора литературы, объектов и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы, приложений. Основной текст работы изложен на страницах машинописного текста, содержит 24 таблицы и 32 рисунка. Библиография представлена 288 источниками, в том числе 199 зарубежных.

Благодарности Автор выражает благодарность зав. каф. «Технология молока и молочных продуктов» проф., д.т.н. В.И. Ганиной, проф., д.т.н. Н.А. Тихомировой, доц., к.т.н. И.И.

Ионовой, аспиранту Е.С. Шаталовой, аспиранту М.А. Головину, проф. каф. «Химия пищи и пищевая биотехнология» Т.И.Громовых за помощь, оказанную при работе над диссертацией; руководителю лаборатории молекулярных основ биотрансформаций Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук проф., д.б.н. О.В. Королевой за предоставление базы лаборатории для проведения экспериментальных исследований; к.б.н. И.В. Николаеву, аспиранту А.А. Торковой за помощь в проведении исследований; к.ф.-м.н. Кононихину А.А. и сотрудникам лаборатории масспектрометрии биомакромолекул Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимической физики им. Н.М. Эммануэля Российской академии наук.

Благодарность сотрудникам ООО «Афродита» - Сторожук Л.Н., Карпову А.Б, Величко Е.А; сотрудникам ЗАО «Захаровский молочный завод»- Коеву Р.А., Косоруковой Л.Н., Тереховой Е.Г., Мишиной Е.В. Благодарность за безграничную помощь, терпение и поддержку к.т.н. С.Н. Лисицыну, к.х.н. А.Б. Лисицыной.

Отдельная благодарность научным руководителям проф., д.б.н. Г.С. Комоловой, проф., д.х.н. В.И. Тишкову за неоценимую помощь, понимание, терпение и поддержку на всех этапах работы над диссертацией.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Пептиды ЛФ Получение и характеристика Лактоферрин получали катионнообменной хроматографией на сорбенте MacroPrep СМ - Support (рис.1).

Рисунок 1 - Хроматографическая очистка ЛФ из коровьего молока на катионообменнике Macro Prep СМ – Support (Sigma, США) Белок, соответствующий на хроматограмме пику 2, согласно электрофоретическому и иммуноферментному анализу - ЛФ. Полученный белок гидролизовали свиным пепсином (Sigma, США) с активностью 90 U/мг при 37 °С, рН 2,0 (рис.2).

Рисунок 2 - Трицин-ПААГ электрофорез пептидных композиций, полученных при гидролизе ЛФ пепсином: А - 2ч (I ЛФ), Б – 4ч (II ЛФ), В – 8ч (III ЛФ), Г – 24 ч (IV ЛФ). М – маркерные белки При протеолизе пепсином бычьего ЛФ в реакционной среде уже в первые часы отмечалось накопление продуктов распада ЛФ с молекулярной массой ниже 4 кДа. К 4 часам пептидное пятно увеличилось за счет накопления низкомолекулярных пептидов, образующихся при пролонгировании протеолитического процесса. В интервале - 24 часа уровень низкомолекулярной компоненты гетерогенной популяции пептидов существенно не менялся.

Хроматомасспектрометрический анализ полученных гидролизатов ЛФ показан в табл. 1.

Таблица 1 - Хроматомасспектрометрический анализ гидролизатов ЛФ протеолиза, ч - остатки редокс-активных аминокислот (Tyr, Trp, Met, Cys, His), входящих в состав ответственных за антиоксидантную активность пептидов.

Проанализированы данные в сравнении с Insilico моделированием протеолиза ЛФ с помощью программы Peptide Cutter. Сравнение результатов представленных в табл.1 с модельными данными позволяет заключить, что в гидролизатах в большинстве случаев пептиды прогнозируемы. Присутствуют и не прогнозируемые. Образование их может быть обусловлено тем, что в процессе вторичного протеолиза, за счет изменения вторичной структуры, может изменением доступа сайтов для атаки ферментов. Используя базу данных CAMP на основании аминокислотной последовательности пептиды ЛФ были прогнозированы на наличие или отсутствие антимикробной активности (АА) по трем алгоритмам прогноза: векторной машине (SVM), классификационному древу (RF), дискриминантному анализу (DA) (табл.2).

Таблица 2 - Insilico анализ антимикробной активности пептидов идентифицированных в гидролизатах ЛФ Гидролизат * - антимикробная активность пептида; ** - пептид по прогнозам считается антимикробным, если дискриминант балл меньше – 0,251.

- совпадает 1 тест; - совпадает 2 теста; - совпадает 3 теста При совпадении 2, 3 тестов (табл.2) есть основание предположить, что пептид обладает антимикробной активностью. На основании анализа полученных данных следует заключить, что гидролизаты отличаются по антимикробной активности и наиболее активным является IV ЛФ, что подтверждается, в частности, ингибированием E. coli O157:Н7 - чувствительного к ЛФ микроорганизма (рис.3).

Рисунок 3 - Влияние на рост E. coli O157:Н7 ЛФ и его гидролизатов Доза 6 мкг/см3 соответствует ID30 для ЛФ.

Пептиды ЛФ вызывают антибактериальное действие, более выраженное, чем нативный белок. Эффект наиболее выражен для пептидов образующихся на позднем этапе протеолитического процесса в период от 4 часов до 24 часов. Значение ID 100%-ной инактивации гидролизатами IV ЛФ на несколько порядков ниже, чем соответствующая величина полученная для нативного ЛФ (табл. 3).

Таблица 3 - Ингибирующая активность ЛФ и его гидролизатов Обозначение Антибактериальная активность ID*, мкг/см *- минимальная концентрация активного вещества, соответствующая 100% ингибированию роста бактерий (E. coli O157:Н7).

Влияние на рост и бактерицидность микроорганизмов полезной микрофлоры кишечника Чувствительность и характер реакции разных пробиотических клеток на ЛФ и продукты его протеолиза может значительно отличаться. Имеет место выраженная штаммозависимость, которая в значительной мере отражает многофакторность механизмов защиты микроорганизмов от агентов, способных нарушать структуру и функцию клеточных систем. По крайней мере два основных механизма, вероятно, определяют характер и выраженность реакций пробиотических культур на ЛФ и его гидролизаты. Это механизмы: 1. реализуемый через связывание ЛФ с мембранными рецепторами клетки, 2 связанный с передачей клеткам Fe3+ - важного для процессов клеточного метаболизма элемента. Из изучаемых нами пробиотических бактерий под действием ЛФ активировался рост, например, L. Acidophilus АТ-44, однако, только в том случае если ЛФ был в достаточной степени насыщен железом. Для апо - формы эффект отсутствовал. О роли в механизме действия на пробиотические клетки рецепторного механизма свидетельствуют данные о корреляции между эффектами ЛФ по активации роста и связыванием его с поверхностными структурами пробиотических клеток. Было установлено, что ЛФ действует на исследуемые пробиотики согласно следующему порядку: Bifidobacterium adolescentis В-1> Lactobacillus acidophilus > Lactobacillus plantarum 885 > Lactobacillus fermentum LFM-2. В том же порядке располагаются клетки по связыванию с меченным люминисцентной меткой ЛФ-м (рис.4).

Рисунок 4 - Связывание бЛФ с поверхностными структурами бактериальных клеток:

1 - Bifidobacterium adolescentis В-1;

2- 1Lactobacillus acidophilus 887;

3 - Lactobacillus plantarum 885;

4 - Lactobacillus fermentum LFM-2.

На основании результатов исследования различных пробиотиков по активации роста и связыванию их клеточной стенкой меченого люминисцентной меткой ЛФ в качестве модельной клетки в исследовании рецептора ЛФ была принята B.

adolescentis B-1. Эта бифидобактерия проявляет положительную дозозависимую ростовую реакцию на ЛФ независимо от содержания Fe3+ в его молекуле. Пептиды ЛФ более активное действие на рост B. adolescentis В-1 чем нативный ЛФ. Наиболее активным является гидролизат IV ЛФ. Как следует из диаграммы, представленной на рис.5. эффект дозозависим. Существенно отметить, что ростовые эффекты ЛФ и его пептидов не сказываются на других функциях бифидобактерий и, прежде всего, бактерицидности относительно патогенных микроорганизмов. Как следует из результатов, приведенных на рис.6, синтез бактериоцинов B. adolescentis B-1 под влиянием гидролизата IV ЛФ значительно превышает интактный контроль и эффективнее нативного ЛФ.

Рисунок 5 - Активация роста B. adolescentis В-1 ЛФ-ом и пептидным комплексом (IV ЛФ). За 100% принята концентрация клеток в логарифмической фазе роста в контроле (без активирующих агентов) см Рисунок 6 - Влияние ЛФ и IV ЛФ на образование бактериоцинов культурой B. Adolescentis. Варианты: 1-интактный контроль (без воздействия); 2 - ЛФ;

3 – IV ЛФ.

Заслуживает внимание тот факт, что не чувствительные к ЛФ бифидобактерии оказались также инертны и относительно его пептидов, что может указывать на возможность реализации действия на клеточную мишень ЛФ и продуктов его ограниченного протеолиза через единый механизм, скорее всего рецепторный.

Из мембраны бактерий B. adolescentis В-1 были выделены белки, которые были проверены методом Western-блоттинга на наличие ЛФ – связывающих (рис.7).

Рисунок 7 - Идентификация рецептора ЛФ А. Электрофоретическое разделение мембранных белков (1). Б. Western-блоттинг с биотинилированным ЛФ (1) и IV ЛФ (2) в качестве тест-пробы на ЛФ-связывающий белок. М-маркерные белки.

Согласно электрофореграммы в мембране исследуемого пробиотика содержатся белки с различной молекулярной массой (А). Блоттирование показало, что нативный бЛФ связывается только с одним белком. Его молекулярная масса около 58 кДа. Аналогичные результаты получены и для биотинилированных фрагментов бЛФ. Они связываются с тем же белком клеточной мембраны пробиотика (Б), что соответствует представлению о рецепторном механизме действия на бактерию как лактоферрина, так и его пептидов.

Защитные свойства пептидов ЛФ относительно ЖКТ Язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки возникает в результате дисбаланса между действием в них вредных и защитных факторов. Индуцировать язвенные повреждения в желудке могут патогенные микроорганизмы, агрессивные химические вещества, стресс и другие агенты. Наиболее общими нарушениями в слизистой желудка при индукции язвы является возникновение некротических повреждений слизистой за счет снижения кровотока. Из-за нарушений функции слизистая меньше синтезирует слизи, выполняющей барьерную роль. В желудке повышается кислотность, снижается уровень предшественников антиоксидантов и, как следствие, повышается уровень активных форм кислорода. Эти характерные для патогенеза язвы различной природы нарушения не исключают безусловно и специфических, присущих преимущественно данному некротизирующему агенту. В настоящей работе рассматривается цитопротекторное действие пепсиновых гидролизатов ЛФ в экспериментальной модели - индуцирование in vivo язвенных повреждений подкисленным этанолом. Слизистая желудка крыс группы интактного контроля не имеет некротических повреждений (Рис.8А). Введение орально физиологического раствора в объеме мл не оказывало влияния на её состояние (Рис.8Б). Глубокие и обширные некротические повреждения, однако, отмечались уже через 60 мин при введении в желудок 5 мл смеси: 100мМ НСl+60%C2Н5ОН (Рис.8В).

A - интактный контроль В - Через 60 мин после введения 5 мл: Г- За 30 мин до индуцирования язвы индуцирующей язву смеси: 100мМ вводили 5 мл пептидов IV ЛФ НСl+60%C2Н5ОН Рисунок 8 - Слизистая желудка крыс Если за 30 минут до введения индуктора язвы крысам внутрижелудочно вводить ЛФ или его пептиды в зависимости от дозы «индекс язвы», интегральный показатель длины образующихся в слизистой желудка некротических повреждений, снижался или повреждения вообще не проявлялись (Табл.4-6). Как в случае нативного ЛФ, так и его пептидов, отмечалась четкая дозовая зависимость протекторного эффекта.

Таблица 4 -Защитное действие ЛФ против индуцирования этанолом повреждений в желудке крыс Таблица 5 - Защитное действие II ЛФ против индуцирования этанолом повреждений в желудке крыс Таблица 6 - Защитное действие IV ЛФ против индуцирования этанолом повреждений в желудке крыс Минимальная доза ЛФ, при которой некротические повреждения в желудке практически уже отсутствовали, составляла приблизительно 300 мг/кг массы тела животного. Пептиды ЛФ, согласно полученным данным, значительно эффективнее нативного ЛФ. Их протекторная активность различна и зависит от времени протеолиза ЛФ, проявляясь, наиболее выражено при длительной обработке пепсином. Для пептидов II ЛФ минимальная доза, снимающая индукцию язвенных повреждений слизистой желудка приблизительно в 3 раза ниже установленной для нативного ЛФ.

Пептиды IV ЛФ практически на порядок оказались эффективнее, чем II ЛФ. Уже при дозе 5 мг/кг массы тела у крыс с введенным в желудок пептидов IV ЛФ не было отмечено индуцируемых этанолом повреждений (Табл.4-6). Не исключено, что высвобождаясь из сложной структуры нативного белка соответствующие функциональные домены становятся более контактными с клеточными системами, обуславливающими устойчивость слизистой к повреждениям, в том числе и индуцируемым этанолом.

Следует учитывать гетерогенность популяции полученных пептидов. Значимой составляющей в механизме патогенеза язвы, в том числе и индуцируемой этанолом, является потеря антиоксидантов слизистой при повышении уровня активных форм кислорода. Супероксид (О2 -) и гидроксил (-ОН) – радикалы приводят к перекисному окислению липидов, что чревато образованием в желудке раковых опухолей. Противостоять этому могут химические соединения с антиокислительным действием. Известно, что ЛФ обладает антиоксидантным свойством.

Анализ полученных нами гидролизатов ЛФ показал, что они обладают антиоксидантным действием, более выраженным, чем нативный белок. Наиболее эффективными оказались пептиды с низкой молекулярной массой, образующиеся при длительном протеолизе ЛФ за счет содержания остатков редокс-активных аминокислот (Tyr, Trp, Met, Cys, His) (табл.7).

Таблица 7 - Антиоксидантная емкость пепсиновых гидролизатов ЛФ Сравнение результатов антиоксидантной и противоязвенной активностей пепсиновых гидролизатов позволяет заключить о наличии корреляции между этими показателями. Не исключено, что пептиды, по сравнению с нативным белком, более легко in vivo проникают в клетки слизистой, взаимодействуя с системами, отвечающими за уровень антиоксидантов, в значительной мере обуславливающими ее устойчивость к повреждениям. Согласно современным представлениям, основная роль в патогенезе язвенных повреждений желудка и двенадцатиперстной кишки принадлежит грамотрицательной бактерии Helicobacter pylori (H. Pylori). Используемая в работе модель язвы с этанолом в основном предусматривает острые повреждения слизистой желудка, вызываемые например агрессивными химическими соединениями, сильным стрессом. Острые нарушения предшествуют хроническим, в патогенезе которых ведущая роль может принадлежать H.pylori. Во всяком случае, при условии инфецирования этой бактерией нарушения в слизистой желудка благоприятствуют реализации индуцирования ею хронической язвы и пептиды могут её предотвратить.

Пептиды -ЛА Получение и характеристика Нативный -ЛА был получен анионообменной хроматографией на сорбенте Macro-Prep DEAE Support (рис.9).

Рисунок 9. Хроматограмма разделения анионных сывороточных белков на Macro-Prep DEAE Support при ступенчатом градиенте элюента Электрофоретические исследования показали, что по молекулярной массе белок, вышедший первым пиком соответствовал -ЛА, вторым и третьим БСА и -ЛГ соответственно. Протеолиз -ЛА проводили трипсином (Sigma-Aldrich, США) с активностью 90 U/мг при 37 °С, рН 7,8. Как следует из электрофореграммы (рис.10), при обработке трипсином -ЛА через 6 часов уже отсутствует нативный белок. Глубокое расщепление белка отмечено в период с 12 по 24 часа – молекулярная масса гетерогенной популяции пептидов ниже 1,4 кДа. Хроматомасспектрометрический анализ гидролизатов -ЛА показан в табл. 8.

Рисунок 10 - Трицин-ПААГ электрофорез пептидных композиций, полученных при гидролизе -ЛА трипсином: 1 - 6ч (I -ЛА), 2 – 12ч (II -ЛА), 3 – 24ч (III -ЛА).

М – маркерные белки Таблица 8 - Хроматомасспектрометрический анализ гидролизатов -ЛА протеолиза, ч Экспозиция

FLDDDLTDD

FLDDDLTD

FLDDDLTDDIM

ILDKVGINYW

GYGGVSLPEWV

LDQWLCEK

VGINYWLAHK

- остатки редокс-активных аминокислот (Tyr, Trp, Met, Cys, His), входящих в состав ответственных за антиоксидантную активность пептидов.

Проанализированы данные в сравнении с Insilico моделированием протеолиза ЛФ с помощью программы Peptide Cutter. Сравнение результатов, представленных в табл.8 с модельными данными позволяет заключить, что в гидролизатах в большинстве случаев пептиды прогнозируемые, некоторые из прогнозируемых отсутствовали.

Выявлены непрогнозируемые пептиды.

Используя базу данных CAMP исследуемые пептиды ЛФ были на основании аминокислотной последовательности прогнозированы на наличие или отсутствие антимикробной активности (АА) по трем алгоритмам прогноза: векторной машине (SVM), классификационному древу - Random Forest (RF), дискриминантному анализу Discriminant analysis (DA) (табл.9).

Таблица 9 - Insilico анализ антимикробной активности пептидов идентифицированных в гидролизатах -ЛА

SVM RF DA

Обозначение гидролизата * -антимикробная активность пептида; **- пептид по прогнозам считается антимикробным, если дискриминант балл меньше – 0,251.

- сопадает 3 теста; - совпадает 2 теста; - совпадает 1 тест При совпадении 2, 3 тестов (табл.9) есть основание предположить, что пептид обладает антимикробной активностью. На основании полученных данных можно считать, что в гидролизате III -ЛА содержится больше, обладающих антимикробной активностью пептидов, чем в других гидролизатах.

Защитные свойства пептидов -ЛА против повреждений желудка Представлены медико-биологические исследования по изучению профилактического действия трипсиновых пептидов -ЛА на профилактику индуцирования этанолом язвенных повреждений в слизистой желудка крыс. Если за 30 минут до индуцирования язвы внутрижелудочно вводили -ЛА или его пептиды в зависимости от дозы повреждения были менее выраженны или вообще отсутствовали (рис. 11, Б - Г).

А - Через 60 мин после введения в Б - За 30 минут до индукции язвенных В - За 30 минут до индукции язвен- Г- За 30 минут до индукции язвенных ных повреждений в желудок крыс повреждений в желудок крыс введен введен -ЛА в дозе 300 мг/кг массы гидролизат III -ЛА в дозе 5 мг/кг массы Рисунок 11 - Слизистая желудка крыс Согласно данным, приведенным на рис. 12, защитный эффект дозозависим. Для нативного -ЛА минимальная доза, при которой имела место 100% защита, составляла 280 мг/кг, для пептидных комплексов - I -ЛА и III -ЛА соответственно и 2 мг/кг массы тела животного.

Рисунок 12 Дозовая зависимость противоязвенной активности нативного -ЛА и гидролизатов Следует заметить, что сопутствующие проведению эксперимента факторы и, прежде всего, введение в желудок 5 мл жидкости, в том числе двухкратное с интервалом в 30 минут, согласно исследованиям животных соответствующих контрольных групп, не оказывали влияние как на морфологическое состояние слизистой желудка, так и на степень язвенных повреждений в желудке крыс обеих опытных групп (без введения и с введением протекторов). Вероятно, этому способствовали условия и специальные процедуры, предусматривающие минимизацию при инстилляции в желудок жидкостей, стрессовых явлений. Полученные данные свидетельствуют о том, что трипсиновые пептиды -ЛА, так же как и нативный белок, оказывают противоязвенное действие, причем более эффективное. Сравнение протекторного эффекта гидролизатов при дозе, соответствующей 50%- ной защите, -ЛА-ом (140 мг/кг массы тела) показало, что наиболее выраженное противоязвенное действие оказывают пептиды с более низкой молекулярной массой. Исследование пептидов -ЛА на антиоксидантную активность методом определения антиоксидантной емкости по двум радикалам:

пероксильному и катион-радикалу АБТС показало, что гидролизаты обладают более высокой антиоксидантной активностью, чем нативный белок. Наиболее эффективными оказались пептидные комплексы с низкой молекулярной массой, содержащие остатки редокс-активных аминокислот (табл.10).

Таблица 10 - Антиоксидантная емкость пептидных комплексов -ЛА Сравнение результатов антиоксидантной и противоязвенной активностей трипсиновых гидролизатов позволяет заключить о наличии корреляции между этими показателями.

Комплекс лечебно-профилактической направленности на основе пептидов ЛФ+ -ЛА Интегральным показателем состояния микрофлоры кишечника (патогенная и полезная) можно рассматривать дисбактериоз. Дисбактериоз - качественное изменение бактериальной микрофлоры организма, главным образом, кишечника. Дисбактериоз возникает в результате нарушения равновесия кишечной микрофлоры из-за различных причин: применения антибактериальных средств, в частности антибиотиков, неправильного питания, нарушения функции иммунитета. Как уже установлено пептиды ЛФ и -ЛА действуют сильнее на патогенную и полезную микрофлору, чем нативные белки. С учетом к тому же расширяющей биоактивный спектр штаммоспецифичности компонентов, есть основание полагать, что их комплекс окажется средством с повышенной эффективностью против дисбактериоза. Дисбактериоз у крыс индуцировали введением в желудок антибиотика-10 % фторхиналон байтрила (Bayer HealthCare Animal Health), содержащего в качестве действующего вещества энрофлоксацин ( мг/мл) в дозе 10 мг на 1 кг массы тела. При оральном введении крысам фторхиналон байтрила, уже через 5 суток в ЖКТ имеют место, по сравнению с интактным контролем, изменения, свидетельствующие о развитии умеренного дисбактериоза. Прежде всего, это касается состава микрофлоры кишечника. Наряду с вызываемым антибиотиком частичном ингибированием патогенной отмечено и подавление полезной микрофлоры. Так, в толстом кишечнике уровень лактобацилл снижался на 33,4%, бифидобактерий – на 49,8%. Изменения касались и морфологических показателей слизистой как тонкого, так и толстого отделов кишечника. На фотографиях видны структурные изменения в ткани кишечника, особенно четко проявляемые относительно длины, а также диаметра ворсинок и крипт. Они существенно снижены. Ведение животным орально в объеме 5 мл физиологического раствора или воды не выявило каких-либо изменений в ЖКТ, по сравнению с интактным контролем. Следовательно, отмеченные при введении крысам антибиотика изменения в ЖКТ не обусловлены сопутствующими факторами, связанными с процедурой инстилляции препарата в желудок с использованием зонда. Если за 30 мин до введения антибиотика крысы получили орально комплексные препараты ЛФ и -ЛА или их гидролизаты (в соотношении 1:1 по весу) характерных для дисбактериоза нарушений по морфологическим и микробиологическим показателям было меньше. На основании дозовых закономерностей установлено, что для комплекса нативных белков доза, соответствующая 100%-й профилактики дисбактериоза, составляла 350 мг/кг, для гидролизатов - в 100 раз меньше.

На рис.13 показано протекторное действие комплекса «ЛФ + -ЛА» и пептидных комплексов «IVЛФ+III -ЛА» на морфологические показатели тонкого отдела кишечника.

Микроструктура гистологических срезов тонкого отдела кишечника крыс А – Интактный контроль Б - Оральное введение антибиотика В - Оральное введение за 30 мин до ан- Г - Оральное введение за 30 мин до антитибиотика комплекса (50% ЛФ + 50% биотика комплекса (50% IV ЛФ + 50% -ЛА) доза 350 мг/кг массы тела III -ЛА) доза 3,5 мг/кг массы тела Рисунок 13 - Морфологические показатели слизистой тонкого отдела кишечника Аналогичные данные получены и для толстого кишечника. В случае пептидного варианта исследуемые величины даже превышают установленные для интактного контроля, то есть пептиды проявляют свое свойство, как фактор роста. Измерение длины ворсинок, крипт и величины их диаметров показало, что у крыс с предшествующим антибиотику введением комплексных препаратов повышается длина тканевых органелл (Рис.14). Запуск механизма активации клеточной пролиферации может быть компенсаторной адаптационной реакцией клеток на отрицательное влияние антибиотика относительно рассматриваемых показателей. Более выраженное защитное действие гидролизатных комплексов установлено также относительно микрофлоры кишечника. Заслуживает внимания тот факт, что уровень лактобацилл и бифидобактерий в случае предварительного введения животным пептидного комплекса, содержащего «IV ЛФ + III -ЛА» не только нормализовался, но и превысил более чем в 2 раза соответствующие показатели интактного контроля.

Рисунок 14 - Влияние комплексов «ЛФ + -ЛА» и «IVЛФ + III-ЛА» на некоторые морфологические показатели тонкого отдела кишечника крыс при индуцировании дисбактериоза. Варианты: А – Без введения защитных средств (Контроль, принятый за 100%); Б – Ведение «ЛФ + -ЛА» в дозе 350 мг/кг массы тела); В - Введение «IV ЛФ + III -ЛА» в дозе 3,5 мг/кг массы тела).

Протекторный эффект, характеризующийся аддитивным взаимодействием компонентов, установлен также и по противоязвенному действию пептидных комплексов (рис.15).

Рисунок 15 - Протекторное действие пептидного комплекса IV ЛФ и III -ЛА (1:1) против индуцирования этанолом повреждений в желудке крыс.

Пептидный комплекс обладает антиоксидантным свойством (табл.11) Таблица 11 - Антиоксидантная емкость пептидных комплексов Как следует из данных представленных в табл. 11 пептидный комплекс обладает антиоксидантным свойством. Максимальное действие оказывает комплекс IV ЛФ + III -ЛА, что коррелирует с его противоязвенной активностью. С одной стороны, антиоксидантная активность – один из компонентов механизма повышения противоязвенного действия пептидов, с другой - ее следует рассматривать как самостоятельный защитный фактор в биоактивности пептидного комплекса.

Пептидный комплекс как активная основа полифункционального препарата «ЖКТ-НОРМ»

Полученные данные о биоактивных свойствах пептидного комплекса ЛФ и -ЛА позволяет рассматривать его в качестве основы профилактического препарата с антимикробным, противоязвенным, антидисбактериозным, антиоксидантным действием.

Принципиальная схема производства пептидного комплекса, названного «ЖКТНОРМ» приведена на рис.16.

Получение ЛФ с использованием катио- Получение -ЛА с использованием анионообменника Мacro Prep High Q-Support нообменника Macro-Prep-DEAM-Support Получение протеолизом пепсином водных Получение протеолизом трипсином водрастворов целевых пептидов ЛФ ных растворов целевых пептидов -ЛА Асептическая процедура смешивания пептидов ЛФ и -ЛА в соотношении 1: Хранение:жидкая форма:(20±2)0С-6 мес.;(4±2)0С-12 мес.;сухая форма:

-200С – 1 год Рисунок 16 - Принципиальная схема получения пептидного комплекса «ЖКТ-НОРМ»

Характеристика выработанного в лабораторных условиях образца «ЖКТ-НОРМ»

приведена в табл.12-14.

Таблица 12 - Органолептические свойства пептидного комплекса «ЖКТ-НОРМ»

Прозрачная жидкость или однородный сыпучий порошок. Допускается присутствие неВнешний вид, консистенция Таблица 13 - Физико-химические свойства пептидного комплекса «ЖКТ-НОРМ»

Наименование показателя Активная кислотность восстановленного продукта, рН, ед.

Таблица 14 - Микробиологические свойства пептидного комплекса «ЖКТ-НОРМ»

Содержание дрожжей и плесневых грибов в 1,0 г препарата, КОЕ Бактерии группы кишечных палочек в 1,0 г препарата Патогенные микроорганизмы, в т.ч.

сальмонеллы, в 25,0 г препарата Для исследования возможного негативного действия пептидного комплекса проводили медико-биологическим исследования его токсичности. Крысы были разделены на две группы: контрольную и опытную. Животные опытной группы в течение дней непосредственно перед едой перорально получали препараты в десятикратной дозировке, в то время как животные группы интактного контроля пищевую добавку не получали. В обеих группах отмечалась хорошая поедаемость корма. Выживаемость всех подопытных животных была полной (100 %). В течение всего эксперимента у животных опытной группы не отмечали каких-либо клинических отклонений в состоянии здоровья. Двигательная активность не снижена. Случаев изменения поведенческих реакций (угнетения, возбуждения) не выявлено. В ходе всего эксперимента шерсть животных, получавших препарат, сохраняла блеск и плотное прилегание, кожа - бледно-розовый цвет без сыпей и повреждений. Признаков воспаления не обнаружено. По окончании эксперимента патологоанатомическое исследование животных (табл.15), не выявило внешних проявлений патологических процессов во внутренних органах – пищеварительном тракте, поджелудочной железе и печени, дыхательной системе, органах кровообращения и кроветворения, мочевыделительной системе. Не происходило изменений в массе тимуса, чувствительном, как известно, показателе на стресс.

Таблица 15 - Абсолютная масса тела и интегральный показатель хронической интоксикации лабораторных животных Рассчитанный показатель хронической интоксикации селезенки, почек, печени и сердца не выявил каких-либо значимых различий у животных опытной и контрольной групп. Полученные данные свидетельствует о том, что десятикратное увеличение рекомендуемой физиологически эффективной дозы препарата не оказывает токсичного действия на животный организм. Введение в рацион животных пептидного комплекса не оказало негативного влияния на массу тела, подтверждая отсутствие кумулятивного токсического его эффекта. При соотношении компонентов 1:1 минимальная доза рассматриваемых пептидов составляет 3,5 мкг на 1 кг массы тела животного. Разработанная технология получения «ЖКТ-НОРМ» в принципе применима и в промышленных условиях. Производство нового биологически-активного препарата на основе пептидного комплекса сывороточных белков молока целесообразно рекомендовать для включения в качестве одного из звеньев в схему безотходной переработки молочного сырья.

ВЫВОДЫ

1. Пептиды ЛФ и -ЛА молока обладают противоязвенным, антидисбактериозным, антиоксидантным действием в значительной мере более выраженным, чем нативные белки.

2. Установлена функциональная связь между составом пептидных комплексов полученных при различных условиях протеолиза и их биологической активностью: противоязвенной, противоинфекционной, бифидогенной, антиоксидантной.

3. Пептиды -ЛА, по сравнению с пептидами ЛФ, более эффективны против повреждений слизистой желудка, но менее эффективны против дисбактериозной профилактики. В комплексных препаратах эффекты в отношении профилактики язвенных повреждений и дисбактериоза показывают аддитивность.

4. Обоснован состав пептидной композиции «IV ЛФ + III -ЛА», названной «ЖКТ-НОРМ».

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи 1. Самохина Л.С., Головин М.А., Комолова Г.С., Ганина В.И., Ионова И.И., Шаталова Е.С. Антибактериальная активность лактоферрина из коровьего молока // Молочная промышленность.-2012.- №7.- С. 56-57.

2. Самохина Л.С., Комолова Г.С., Ионова И.И., Семенов Г.В. // Противоязвенное действие лактоферрина и его гидролизатов. Хранение и переработка сельхозсырья.- 2012.- №9.- С.21-23.

3. Самохина Л.С., Комолова Г.С., Ганина В.И., Ионова И.И., Семенов Г.В.// Противодисбактериозное действие композиции гидролизатов -лактальбумина и лактоферрина // Известия вузов. Пищевая технология.- 2012.- № 5-6.- С.17-20.

4. Самохина Л.С., Ионова И.И., Тишков В.И., Комолова Г.С. Защитное действие продуктов протеолиза -лактальбумина против язвенных повреждений слизистой желудка крыс // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии (в печати) Тезисы конференций 1. Самохина Л.С., Шаталова Е.С. Выделение и идентификация препарата лактоферрина. Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы 8 международной научной конференции студентов и молодых ученых.- М.:

МГУПБ, 2010.- С.20-21.

2. Петров Д.А., Александрова А.А., Кузьмина А.Л., Кислова В.А., Самохина Л.С., Овчинникова О.Е. Очистка -лактальбумина из коровьего молока с использованием гель-фильтрации. Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы 8 международной научной конференции студентов и молодых ученых.- М.: МГУПБ, 23-24 ноября 2010.- С.71-72.

3. Самохина Л.С., Петрова С.Н., Комолова Г.С., Ионова И.И. Изучение динамики образования в процессе протеолиза лактоферрина пептидов, активных против E.Coli. Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы международной научной конференции студентов и молодых ученых.- М.:

МГУПБ, 2011.- С.54-55.

4. Самохина Л.С. Противоязвенное действие пептидов -лактальбумина и лактоферрина. Фармацевтические и медицинские биотехнологии: Материалы международной научно-практической конференции.- М.: 2012.- С. 175-176.

5. Самохина Л.С., Кузьмина А.А., Комолова Г.С. Влияние -лактальбумина и его гидролизатов на защитную функцию ЖКТ. Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы 10 международной научной конференции студентов и молодых ученых.- М.: МГУПБ, 2012, С.63-64.