На правах рукописи

Безжонова Оксана Владимировна

Комплексы видов кровососущих комаров

рода Anopheles (Diptera, Culicidae)

России и ближнего зарубежья

Специальности 03.02.05 – энтомология и 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

МОСКВА – 2011

Работа выполнена на кафедре энтомологии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и в лаборатории сравнительной генетики животных Учреждения Российской академии наук Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Научный руководители: кандидат биологических наук Федорова Марина Вадимовна кандидат биологических наук Горячева Ирина Игоревна

Официальные оппоненты: кандидат биологических наук Андрианов Борис Витальевич Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН доктор биологических наук Ганушкина Людмила Алимпиевна Институт медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского ММА имени И.М. Сеченова

Ведущая организация: Московский Государственный областной университет

Защита диссертации состоится «10» октября 2011 г. в «17» часов «00» минут на заседании диссертационного совета Д 501.001.20 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, ГСП-1,Москва, Ленинские горы, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, д. 1 стр. 12, Биологический факультет, ауд. М-1.

Факс: 8(495)939-17-46; E-mail: [email protected]

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан « » сентября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, И.Р. Бёме доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. До настоящего времени малярия остается одним из самых распространенных трансмиссивных заболеваний: ежегодно в мире этой инфекцией болеют около 300 миллионов человек, а количество летальных случаев исчисляется сотнями тысяч (WHO, 2009, 2010).

В результате интенсивных мероприятий на европейском континенте и на всей территории СССР передача малярии была практически прервана к 1950г., и в 1955г. ВОЗ объявила об окончательной ликвидации этого заболевания в Европе (Mendis et al, 2009).

Однако во многих странах европейского региона ВОЗ плотность популяций переносчиков малярии, комаров рода Anopheles, оставалась высокой. Это создавало условия для возобновления местной передачи на основе завозных случаев или вследствие активизации местных остаточных очагов, и привело к развитию полномасштабных эпидемий малярии в Азербайджане и Таджикистане с середины 90-х годов, а потом и по всей территории европейского региона ВОЗ (Касумов, Гусейнов, 2001; Сабатинелли, 2002). В связи со сложившейся ситуацией ВОЗ была разработана программа «Обратим малярию вспять», которая вступила в действие в 1998 г. Одной из центральных задач программы стала ревизия фауны малярийных комаров с целью уточнения основных переносчиков заболевания и контроля их численности (Региональная стратегия, 2006).

Ареал малярии ограничивается в основном областью распространения переносчиков этого заболевания - комарами рода Anopheles. В мировой фауне насчитывается 484 вида этого рода (Sallum et al., 2000; Harbach, 2004; Harbach et al., 2005), но далеко не все они представляют опасность для человека. Эпидемиологическое значение имеют лишь те, которые удовлетворяют критерию ”основной переносчик”, т.е.

обладают биологическими особенностями, повышающими вероятность контакта комаров с человеком. К таким биологическим особенностям комаров относятся высокая численность, способность развиваться вблизи жилья человека в антропогенных биотопах, высокий уровень антропофилии, эндофагии и эндофильности (Беклемишев, 1944). В настоящее время к числу основных переносчиков относят около 60 видов комаров рода Anopheles (Service, 2004; Fontenille et al.,2005).

Исследования особенностей пищевого и репродуктивного поведения, суточного ритма активности, сезонного хода численности и других биологических характеристик у ряда видов малярийных комаров показали, что они представляют собой комплексы близкородственных видов, морфологические различия между которыми выражены крайне слабо, а часто и вовсе отсутствуют, тогда как эпидемическая роль может существенно отличаться. Описание комплексов в роде Anopheles началось с европейского вида An.maculipennis в 1920-годах и в дальнейшем затронуло значительное число видов (Norris, 2002). Уже в 30-40-е годы в Индии были найдены внутривидовые формы комара An.

stephensi (Sweet, Rao, 1937), в Южной Америке - подвиды An.albitarsis, An. darlingi, An.crusians, An.quadrimaculatus, в Северной Америке – An.maculipennis, An.pseudopunctipennis (Aitken, 1945). Начавшееся в 40-е годы изучение An.gambiae, основного переносчика малярии в Африке (Coluzzi, 1964), привело к описанию по меньшей мере семи новых видов, образовавших комплекс An.gambiae (Coluzzi et al., 2002).

Среди них пять видов являются переносчиками малярии. К настоящему времени показано, что около 77% видов - переносчиков малярии представляют собой комплексы видов.

Разработка методов их идентификации является важной, но сложной задачей, которая в настоящее время далека от завершения.

На территории России и в других странах СНГ наиболее распространены представители комплекса An.maculipennis, к числу которых относятся основные переносчики малярии (Gordeev et al., 2008). Кроме того, большое эпидемиологическое значение в некоторых регионах имеют комары An. claviger (Бубликова, 2001), а в Средней Азии - An.superpictus (Gordeev et al., 2008). По современных представлениям, оба эти вида также представляют собой комплексы.

Цель и задачи исследования. Целью работы была ревизия видового статуса комаров комплексов An.maculipennis, An.claviger и An.superpictus, их распространения на территории России и ближнего зарубежья и оценка области второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов (ITS2) как универсального маркера для идентификации видов указанных комплексов.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) уточнение видового состава комаров комплекса An.maculipennis на территории России и некоторых стран СНГ методами морфологического, цитогенетического и молекулярно-генетического анализа;

2) оценка внутривидовой изменчивости первичной структуры области второго внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS2) кластера рибосомных генов комаров комплекса An.maculipennis;

3) разработка молекулярно-генетического ключа для идентификации видов комплекса An.maculipennis;

4) оценка внутривидовой изменчивости первичной структуры области второго внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS2) кластера рибосомных генов комаров комплекса An.claviger;

5) изучение комаров комплекса An.superpictus методами морфологического и молекулярно-генетического анализа.

Научная новизна. Впервые проведен сравнительный анализ методов идентификации видов-двойников, распространенных на территории России и ближнего зарубежья.

Показано, что применение морфологических признаков для идентификации всех видов комплекса An.maculipennis затруднено из-за наличия промежуточных вариантов окраски экзохориона яйца и схожести морфологии яиц у некоторых видов (например, An.maculipennis, An.atroparvus). Применение анализа структуры политенных хромосом для идентификации видов ограничено существованием гомосеквентных видов (An.labranhiae и An.atroparvus; An.maculipennis, An.melanoon и An. artemievi). Показано, что наиболее перспективным является молекулярно-генетический подход, основанный на использовании первичной структуры области второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов (ITS2) как универсального маркера для идентификации видов комплекса An.maculipennis. С использованием этого маркера впервые разработан молекулярный ключ для идентификации видов комплекса An.maculipennis, обитающих на территории России и ближнего зарубежья.

У An.messeae, представителя комплекса An.maculipennis, впервые обнаружен внутригеномный полиморфизм ITS2. Изучение степени внутригеномного полиморфизма указанного вида на территории России показало, что недавно описанный в Европе вид An.daciae представляет собой одну из внутригеномных форм An.messeae и не может считаться самостоятельным видом. Другие исследованные виды комплекса An.maculipennis оказались мономорфными по маркеру ITS2. Использование молекулярогенетических методов позволило выявить новый для фауны СНГ вид – An.persiensis, а также уточнить границы ареалов An.messeae, An.maculipennis, An.atroparvus, An.artemievi, An.melanoon и An.sacharovi.

В ходе цитогенетических исследований впервые получены данные по кариотипической структуре популяций An.messeae юго-восточной части Русской равнин.

Выявлены три четко дифференцированные зоны, различающиеся по частоте встречаемости разных кариотипов.

Впервые выявлена и исследована внутригеномная изменчивость первичной структуры области второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов (ITS2) у An.claviger. Различия по этому маркеру между популяциями из Абхазии, с одной стороны, и Беларуси и Германии с другой, значительно превосходили различия на популяционном уровне. Эти результаты дают основу для дальнейшей исследовательской работы на уровне комплекса видов.

Впервые проведен молекулярно-генетический анализ An.superpictus в Туркменистане и Кыргызстане Показано, что морфологические формы An.superpictus не соответствуют молекулярным формам по ITS2 и COI-II; выявлены два новых митотипа Х (в Кыргызстане и Туркменистане) и Х2 (в Кыргызстане).

Теоретическое и практическое значение работы. Данные о внутривидовом и межвидовом полиморфизме в комплексах видов-двойников An.maculipennis, An.claviger и An.superpictus по изученным маркерам являются важными для дальнейших систематических и эволюционных исследований, а также мониторинга биоразнообразия.

Разработанный молекулярно-генетический ключ для идентификации видов комаров комплекса An.maculipennis успешно применяют для изучения переносчиков по программе «Обратим малярию вспять» ВОЗ и в центрах эпидемиологии (Акт о внедрении от 21.04.2004 г.) Полученные результаты внесли изменения в видовой состав и распространение переносчиков малярии на территории РФ и некоторых стран ближнего зарубежья.

Апробация работы и публикации. Основные результаты исследований были представлены в виде докладов на 3 международных и 1 российской конференциях:

Международном семинаре «Генетика репродукции насекомых и ее практическое применение» (Москва, 2006), XII Международной орнитологической конференции (Ставрополь, 2006), I Всероссийском Совещании по проблемам изучения кровососущих насекомых (Санкт-Петербург, 2006), III международном совещании "Молекулярная и популяционная биология комаров и других переносчиков заболеваний" (Колимбари, Крит, Греция, 13-20 июля 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатные работы, в том числе 10 статей, из которых 9 – в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из разделов: «Введение», четырех глав, «Заключение», «Выводы», «Список литературы» (включающий 240 источник, из них 144 на иностранных языках). Текст изложен на 120 страницах (без учета приложений), содержащий 13 таблиц и проиллюстрированный 20 рисунками. Приложения содержат таблиц.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я выражаю глубочайшую благодарность научным руководителям кандидату биол.

наук М В. Федоровой и кандидату биол. наук И. И. Горячевой. Особую благодарность выражаю члену-корресполнденту РАН, доктору биол.наук И.А. Захарову-Гезехусу за всестороннюю помощь и поддержку при выполнении работы в руководимой им лаборатории. Я благодарю профессора, доктора биол. наук М.И. Гордеева и кандидата биол. наук Е.В. Шайкевич за совместную работу. Я искренне признательна за предоставление материала А.Б. Званцову, доктору биол. наук М.Ю.Щелканову, А.Бабуадзе, кандидатам биол. наук А. Кешишьян, Т.В.Волковой, Н.К. Потаповой. Я очень благодарна за всестороннюю помощь и профессиональные советы доктору биол. наук Н.

А. Тамариной, кандидатам биол. наук Н.Я. Маркович и Р.М. Горностаевой.

Работа финансировалась Глобальным фондом по борьбе со СПИДом, туберкулезом и малярией, Европейским региональным бюро Всемирной Организации Здравоохранения, а также по грантам РФФИ 05-04-49047, 05-04-49035, 06-04-08347, 08-04-01674-а; по грантам Президента РФ НШ-827.2003.4; НШ-15.2003.4; НШ-10122.2006.04, по программе РАН «Динамика генофондов растений, животных и человека».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ВВЕДЕНИЕ

I.I. КОМПЛЕКС ВИДОВ-ДВОЙНИКОВ AN.MACULIPENNIS

Комплекс видов Anopheles maculipennis – основной переносчик малярии в Палеарктике. Комплекс An. maculipennis включает в себя 11 Палеарктических видов (An.

artemievi Gordeev, Zvantzov, Goryacheva, Shaikevich and Ejov, An. atroparvus van Thiel, An.

beklemishevi Stegnii & Kabanova, An. daciae Linton, Nicolescu & Harbach, An. labranchiae Falleroni, An. maculipennis Meigen, An. martinius Shingarev, An. melanoon Hackett, An.

messeae Falleroni, An. persiensis Linton, Sedaghat & Harbach and An. sacharovi Favre) и Неоарктических видов (An. occidentalis Dyar and Knab, An.aztecus, Hoffman, An.freeborni Aitken, An.earlei Vargas, An.hermsi Barr and Guptavanij) (Nicolescu et al., 2004; Kampen, 2005b).

В странах СНГ найдены 8 видов: An. artemievi, An. atroparvus van Thiel, An.

beklemishevi Stegnii & Kabanova, An. maculipennis Meigen, An. martinius Shingarev, An.

melanoon Hackett, An. messeae Falleroni и An. sacharovi Favre (Горностаева, 2000, 2003, 2009; Горностаева, Данилов, 2002; Мамедниязов, Ерохин, 2005; Мамедниязов, 1995; Ejov, 2005; Gordeev et al., 2008).

Изучение систематики видов комплекса не прекращалось на протяжении всего ХХ столетия. Первые работы были посвящены поиску морфологических особенностей и доказательствам существования репродуктивной изоляции между членами комплекса. Во второй половине столетия с успехом были использованы цитогенетические и биохимические подходы, а в последнее десятилетие широкое распространение получили методы молекулярной генетики. Итогом этих работ явилось открытие новых видов, часть из которых описана на основании молекулярно-генетических различий, а часть - с использованием методов цитогенетики.

I.2. КОМПЛЕКС ВИДОВ-ДВОЙНИКОВ AN.CLAVIGER

В 40-х годах Del Vecchio на основании морфологических отличий яиц, личинок и куколок выделил два вариетета An.claviger: An.cl.petragnani и An.cl.missiroli (Del Vecchio, 1939; Lupascu, 1941; Senevet, Andranelli, 1955; Coluzzi, 1963). Видовая самостоятельность An.petragnani и An.claviger s.s.обсуждалась до 60-х г.г. XX в., когда Колуцци показал репродуктивную изоляцию этих форм (Coluzzi, 1963).

На территории бывшего СССР Устиновым (1946) и Маркович (1951) были выявлены две физиологические расы вида An.claviger, отличающиеся по признаку автогенности (способности самок откладывать первую кладку яиц без кровососания).

Неавтогенные популяции были обнаружены в окрестностях Сочи (Шленова, 1938), в Адлере (Шипицина, 1941) и Абхазии (Устинов, 1945, 1946), тогда как популяции из европейской части Российской Федерации, Украины, Молдавии, Прибалтики, Казахстана и республик Средней Азии были способны к автогенному развитию яиц. Полученные данные поставили вопрос о видовом статусе комаров из автогенных и неавтогенных популяций на территории СНГ.

I.3. КОМПЛЕКС ВИДОВ-ДВОЙНИКОВ AN.SUPERPICTUS

An.superpictus в последнее время рассматривается как комплекс видов. Известны две морфологические формы имаго (A и В), различающиеся по наличию или отсутствию темного пятна (кольца) на апикальном сегменте максиллярных щупиков (Amani, 1999).Молекулярно-генетический анализ области гена малой субъединицы цитохромоксидазы I (COI) и участка COI-II методом ПЦР-ПДРФ позволил выделить три молекулярные формы этого локуса, которые были обозначены как Х, Y и Z (Oshagi et al, 2007a). Параллельно для выявления внутри- и межвидовых различий велись исследования другой маркерной области генома переносчика – первичной структуры области второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов (ITS2).

Исследования показали отсутствие корреляции между молекулярными маркерами и морфологическими формами личинок и имаго (Oshaghi et al., 2007a, 2007b, 2008), но выявили соответствие между митохондриальными и ядерными молекулярными формами.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

II.1. Места сбора. Материалом для работы послужили личинки и имаго малярийных комаров, собранные с 2004 по 2009 г.г. в Волгоградской, Астраханской, Ростовской, Пензенской областях, Краснодарском крае, Абхазии, республиках Адыгея и Калмыкия. Имаго собирали энтомологическим сачком, световыми ловушками, в местах дневок cамок – заплечным пылесосом (BioQuip, USA), а также ловили на себе с помощью ловушки Кришталя. Среди самок отбирали особей, напитавшихся кровью, которых помещали в индивидуальные пробирки для получения кладок. Сбор личинок проводили с помощью ковша. Кроме собственных сборов были проанализированы также личинки, имаго и яйца комаров из Воронежской области, республики Карачаево-Черкесия, Якутии, а также из Беларуси, Грузии, Армении и Азербайджана, любезно предоставленные местными энтомологами. Материал из Московской и Томской областей, Алтайского края, республики Калмыкия, из Казахстана, Кыргызстана, Узбекистана, Туркменистана и Таджикистана предоставлен М.И. Гордеевым и А.Б. Званцовым. Для определения имаго и личинок использовали стандартные ключи (Гуцевич и др., 1970).

II.2. Цитогенетический анализ. Для цитогенетических исследований личинок IV возраста фиксировали в смеси 96% спирта и ледяной уксусной кислоты (в соотношении 3:1). Слюнные железы комаров выделяли в капле фиксатора под микроскопом МБС–10.

Хитиновый покров личинки приподнимали с помощью препаровальных игл. Затем из грудного отдела извлекали парные слюнные железы. Железы окрашивали 2%-ным лактоацеторсином в течение 30 минут. Затем излишки краски убирали фильтровальной бумагой. Железы дифференцировали в 45% уксусной кислоте. Далее железы накрывали покровным стеклом и раздавливали легкими постукиваниями тупым концом препаровальной иглы. Цитогенетический анализ политенных хромосом проводили под микроскопом Micros (Австрия). Видовой и половой состав личинок малярийных комаров определяли путем сравнения препаратов политенных хромосом с фотокартами политенных хромосом видов-двойников рода Anopheles (Стегний, 1991). Для оценки достоверности различий в частоте встречаемости инверсий в разных популяциях An.

messeae европейской части ареала использовали метод 2 (Гершкович, 1968).

II.3. Молекулярно-генетические методы.

Выделение ДНК. Для молекулярно-генетических исследований комаров фиксировали в 96 спирте. ДНК выделяли с помощью набора для выделения ДНК DIAtom DNA Prep (Изоген, Россия) в соответствии с инструкциями фирмы-производителя.

Принцип действия данного набора основан на использовании Лизирующего реагента с гуанидинтиоцианатом, последний предназначен для лизиса клеток, солюбилизации клеточного дебриса и денатурации клеточных нуклеаз. В присутствии Лизирующего реагента ДНК активно сорбируется на NucleoS™-сорбенте, а затем легко отмывается от других компонентов (белков, солей) спиртовым раствором. ДНК элюируется с сорбента ЭкстраГеном Е™ или деионизованной водой. Полученную ДНК использовали для проведения ПЦР. В реакцию амплификации брали по 0,01 мкг выделенной тотальной ДНК.

ПЦР. Амплификацию фрагментов ДНК проводили в объеме 25 мкл с использованием набора реактивов Encyclo PCR kit (Евроген, Россия).

Реакционную смесь готовили в соответствии с рекомендациями производителя: 2, мкл 10х Encyclo-буфера, 0,5 мкл смеси dNTP, содержащей по 0,2 мМ каждого нуклеотида, 0,5 мкл 50х- Encyclo-полимеразы (конечная концентрация 0,5 ед.), по 0,2 мкМ каждого праймера, 100 нг/25 мкл тотальной ДНК, бидистиллированная вода добавлялась до конечного объема 25 мкл.

Амплификацию фрагментов ДНК проводили в течение 35 циклов на термоциклере GeneAmpR RCR System 2700 (Applied Biosystems, США). Структура использованных праймеров представлена в таблице.

Таблица 1. Последовательность использованных в работе праймеров Полимеразную цепную реакцию с праймерами, комплементарными 3’-концу гена 5,8S рРНК и 5’-концу гена 28S рРНК и фланкирующими область второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов, проводили по условиям, описанным ранее (Proft et al., 1999; Oshaghi et al, 2007a, 2007b). Для амплификации данной области генома использовали праймеры 5,8S и 28S для комаров комплекса An.

maculipennis и комаров An. claviger, и праймеры 5,8S и 28S1 для комаров An. superpictus.

Полимеразную цепную реакцию проводили в следующем режиме: предварительная денатурация – 3 мин 980С, за которой следовали 35 циклов: денатурация – 20 сек 950С, отжиг - 20 сек, полимеризация – 720С – 40 сек; заключительная полимеризация 7 мин 720С. Отжиг праймеров проводили при t=500С для праймеров 5,8S и 28S, и при t=530C для праймеров 5,8S и 28S1. Полимеразную цепную реакцию с праймерами COIIR1 и COIIR2, комплементарными фрагменту между генами субъединиц I и II цитохромоксидазы проводили при следующих параметрах: предварительная денатурация – 3 мин 980С, циклов: денатурация – 20 сек 950С, отжиг - 20 сек 560С, полимеризация – 720С – 40 сек;

заключительная полимеризация - 7 мин 720С.

ПЦР-ПДРФ. Видовую идентификацию комаров комплекса An. maculipennis проводили методом ПЦР-ПДРФ на основании различий в паттернах рестрикции продуктов амплификации по ряду диагностических рестриктаз. Идентификацию видов осуществляли в несколько этапов. На первом этапе ПЦР-продукты, полученные в результате полимеразной цепной реакции с праймерами 5,8S и 28S, обрабатывали эндонуклеазой рестрикции CfoI (HhaI) (Promega Corporation, USA). Для этого 15 мкл ПЦР продукта смешивали с 2мкл 10х буферного раствора для рестриктазы CfoI и 5 ед рестриктазы. Смесь инкубировали при 370С в течение часа. Результаты ПЦР-ПДРФ визуализировали методом горизонтального электрофореза в 2,5% агарозном геле.

Использование данного подхода, предложенного Николеску с соавторами (Nikolescu et al., 2004), позволяет идентифицировать 3 вида из комплекса – An. atroparvus, An. maculipennis, An. sacharovi. Паттерны рестрикции видов An. messeae, An. daciae, An.

melanoon, An. artemievi оказываются сходными. Для идентификации этих четырех видов автором был разработан подход, основанный на использовании эндонуклеаз рестрикции, имеющих сайты рестрикции в нуклеотидной последовательности только одного из четырех вышеназванных видов (специфически расщепляющими ПЦР-продукт лишь одного из вышеназванных видов с образованием паттернов рестрикции специфического размера). Поиск специфических эндонуклеаз был проведен с использованием программы «Restriction of DNA sequences» (Bikandi et al., 2004).

Для выявления митохондриальных гаплотипов An. superpictus проводили рестрикцию продуктов амплификации области генов цитохромоксидазы субъединицы I и субъединицы II (COI-COII) с использованием эндонуклеазы рестрикции AluI (Fermentas, Литва) по ранее описанной методике (Oshaghi et al., 2008a). Для этого 15 мкл ПЦР продукта смешивали с 2мкл 10х буферного раствора для рестриктазы AluI и 5ед рестриктазы. Реакцию проводили в течение часа и останавливали реакцию добавлением EDTA до конечной концентрации 20mM.

Клонирование ПЦР фрагментов, их фракционирование в агарозном геле, элюция фрагментов ДНК и их секвенирование проводили согласно стандартным протоколам.

Методы биоинформационного анализа. Анализ хроматограмм проводили с помощью программы CromasPro 13.3 (Technelysium, Australia). Выравнивание последовательностей, полученных в результате секвенирования, с последовательностями, размещенными в базах данных, проводили с помощью ресурсов, расположенных на сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov, программ CLUSTAL W 1.83 (Thompson et al., 1994) и CLUSTAL X 2.1. (Larkin et al., 2007). Для статистической обработки последовательностей использовали программы BioEdit 7.0.5.3. (Hall, 1999). Для построения дендрограмм применяли программу MEGA 4.0. (Tamura et al., 2007) c использованием алгоритма neighbor joining (NJ). Для оценки статистической достоверности полученных дендрограмм была выбрана величина бутстрэп-поддержки не менее 70%.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

III.1. Морфологические признаки, цитогенетические и молекулярногенетические особенности комаров комплекса An. maculipennis С помощью морфологических, цитогенетических и молекулярно-генетических методов были исследованы 8 видов комаров комплекса An.maculipennis. Всего проанализировано 2151 особей комаров, собранных в 10 странах. В 300 кладках, полученных от напитавшихся самок, были изучены морфологические особенности яиц.

III.1.1. Морфология яиц у комаров комплекса An.maculipennis Морфология яиц была изучена у 8 представителей комплекса. На территории европейской части России An.maculipennis, An.messeae и An.atroparvus являются наиболее многочисленными видами, в южных и центральных регионах их ареалы симпатричны (Горностаева, Данилов, 2002). При анализе индивидуальных кладок An.maculipennis были обнаружены промежуточные варианты яиц. Количество пятен между черными перевязями на экзохорионе варьировало от практически полного их отсутствия до значительного количества. Изменчивость по признаку «количество пятен на экзохорионе яйца» была впервые отмечена в Македонии (Rice, Barber, 1937) и на Среднем Урале (Маркин, 1938), а впоследствии - в Армении, Одесской области и некоторых других регионах (Чубкова, 1948, Cеленс, 1953). При получении массовых кладок подобная картина изменчивости рисунка яиц существенно затрудняет видовую идентификацию.

В ряде исследованных регионов при получении индивидуальных кладок у An.messeae и An.atroparvus были обнаружены промежуточные варианты, у которых в разной степени были развиты темные поперечные перевязи у основания воздушных камер. Яйца еще одного представителя комплекса An.maculipennis – An.melanoon были либо полностью темные, либо с темными поперечными полосами и пятнами между полосами; в последнем случае яйца An.melanoon были практически неотличимы от яиц An.messeae. Сходство кладок An.melanoon и An.messeae в свое время создало трудности при идентификации переносчиков малярии в ряде стран, в том числе в Грузии (Гакетт, Барбер, 1935; Каландадзе, Сагателова, 1938) и Азербайджане (Ременникова, 1953, 1958;

Киясов, 1970, 1973; Региональная стратегия, 2006), Турции (Postiglione et al., 1970), Греции (Linton et al., 2002) и на юге России (Маркович, 1936; Калита, 1939). Во всех указанных регионах отмечали оба вида (An.messeae и An.melanoon), основываясь на признаках морфологии и окраски экзохориона яиц. В дальнейшем было показано, что в странах Закавказья, Турции и, вероятно, на юге России (начиная от Адлера - 43°4`c.ш.) распространен только An.melanoon, тогда как в Греции эти виды являются симпатричными (Postiglione et al., 1970; Linton et al., 2002). Более того, темные яйца An.melanoon явно не отличались от хорошо пигментированных яиц в кладках An.messeae и An.atroparvus, что вызывало дополнительные сомнения в правильности идентификации этих видов. Проблема в изучении распространения An.melanoon усложнилась после описания нового вида, An.persiensis, обнаруженного на севере Ирана, яйца которого похожи на яйца An.melanoon (Sedaghat et al, 2003) Яйца An.sacharovi (Закавказье), An.martinius и An.artemievi (Средняя Азия) без воздушных камер и не различимы между собой. Идентификация этих видов проводилась нами с использованием цитогенетических и молекулярно-генетических методов анализа Таким образом, использование морфологических признаков для идентификации всех видов комплекса An.maculipennis затруднено из-за наличия промежуточных вариантов окраски экзохориона яйца и сходства морфологии яиц у некоторых видов.

III.1.2. Цитогенетический анализ комаров комплекса An.maculipennis Цитогенетическими методами было изучено 205 кариотипов An.maculipennis и An.melanoon, 48 An.atroparvus, 12 An.sacharovi и 425 An.messeae.

Кариотип An.atroparvus принят как «стандартный» (Frizzi, 1947,1953) При изучении полученных нами препаратов не удалось выявить каких-либо особенностей.

Кариотипы всех особей, собранных в южных регионах России (Краснодарский и Ставропольский край, Ростовская область, Калмыкия) по рисунку не отличались от фотокарт, сделанных в Западной Европе (Frizzi, 1947,1953) и на Украине, Молдавии, Ростовской области (Стегний, 1976, 1991; Шуваликов,1986).

При изучении рисунка политенных хромосом An.maculipennis, собранных в регионах, не выявлено отличий от кариотипов, полученных ранее в Молдавии, Абхазии, на Украине, европейской части России и других исследованных ранее регионов (Стегний, 1976, 1991; Шуваликов, 1986; Гордеев, 1997). Редкая инверсия на левом плече второй аутосомы, описанная в молдавской популяции An.maculipennis Стегнием и Кабановой (1978), нами не обнаружена. Полученные нами данные показывают, что на всем изученном нами ареале этот вид является мономорфным. Сравнение кариотипов An.maculipennis с An.melanoon, собранного в Грузии и идентифицированного молекулярно-генетическими методами, подтвердило, что эти виды являются гомосеквентыми, т.е. имеют идентичную структуру политенных хромосом, и поэтому не могут быть диагностированы цитогенетическими методами.

Кариотипы An.sacharovi были исследованы в популяциях Грузии. Этот вид отличается от рассмотренных выше фиксированной инверсией в правом плече хромосомы 3R. В изученном нами материале никаких отличий от полученных ранее кариотипов выявлено не было.

Характерной особенностью полиморфных видов является наличие флуктуирующих хромосомных инверсий. Среди исследованных нами видов это явление было обнаружено у An. messeae. В изученных популяциях An.messeae нами выявлены только известные ранее хромосомные инверсии: XL1, XL4, 2R1, 3R1, 3L1 (табл. 2). Все они, кроме XL4, широко распространены по ареалу вида. Инверсия XL4 является эндемичной и встречается с низкой частотой (2%) в Пензенской и Московской областях.

На основании сходства кариотипической структуры популяций на территории Русской равнины нами было выделено три зоны - юго-западная, юго-восточная и центральная, - которые отличались по набору хромосомных перестроек и частотам отдельных инверсий (табл.2).

По хромосоме XL: В юго-западной и юго-восточной зонах отмечена высокая частота инверсионной последовательности XL0. В центральной зоне встречается инверсия XL4 и наблюдается повышенная частота инверсии XL1 (X2=73,3; число степеней свободы