На правах

рукописи

Неборак Екатерина Владиславовна

Синтез, строение и биологические свойства комплексных соединений меди с

азотсодержащими органическими лигандами.

03.01.04 – биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2012 Работа выполнена на кафедре биохимии медицинского факультета Российского университета дружбы народов.

доктор биологических наук, профессор Научные руководители:

Сяткин Сергей Павлович доктор медицинских наук, профессор Трещалина Елена Михайловна Член-корреспондент РАМН, Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой биохимии лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Министерства здравоохранения России Терентьев Александр Александрович доктор биологических наук, профессор Институт детской онкологии Онкологического научного центра РАМН, г. Москва, Министерства здравоохранения, руководитель отделения Байкова Валентина Николаевна Ведущая организация: Институт Биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Защита состоится «21» декабря 2012 г. в «_» ч. на заседании диссертационного совета Д 212.203.13 при Российском университете дружбы народов по адресу:

117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.8, медицинский факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.

6.

Автореферат разослан « » ноября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Доктор биологических наук, профессор Е.В.Лукашева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Проблема изучения и выработки подходов к направленному влиянию на механизмы регуляции клеточной пролиферации и дифференцировки остается актуальной для фундаментальных и прикладных исследований в биологии и медицине, несмотря на ряд важных открытий и внедрений. В соответствии с гипотезой о способности аналогов полиаминов (ПА) замещать эндогенные ПА в клетке в участках связывания был предложен механизм нарушения их внутриклеточных функций [Porter С. W., Bergeron R. J., 1988]. Поскольку метаболизм ПА является одним из эссенциальных процессов клеточного роста и дифференцировки [Seiler N., 2003], этот путь считается удобной и надежной мишенью для поиска и конструирования биологически активных агентов – регуляторов активности ключевых ферментов обмена ПА. В этой связи наиболее перспективен ряд азотсодержащих гетероциклических соединений, в частности, бис-уридильных [Syatkin S.P., Fedorontchuk T.V., Lidack M.Yu., et al., 1994], пуриновых алкалоидов [Beninati S., Lentini A., 1998], азафлуореновых и бензимидазольных производных [Сяткин С.П., Березов Т.Т., Фролов В.А., и соавт., 2007]. Эти вещества объединены тем, что в их структуре содержатся полиаминовые фрагменты.

В последние годы большое внимание уделяется также поиску биологически активных структур среди комплексных соединений d-металлов с органическими лигандами и, особенно, азотсодержащими. Обнаружены комплексы металлов с лигандами (структурные аналоги ПА), проявляющие антипролиферативные свойства [Casero R. A., Woster P. M., 2009; Tisato F., 2010;

Wallace H. M. 2009].

Все вышесказанное подтверждает актуальность получения и биохимической оценки свойств комплексных соединений металлов с азотсодержащими органическими лигандами в плане создания нового класса биологически активных соединений с оригинальным механизмом действия.

Цель работы – синтез и исследование химических, биохимических и биологических свойств комплексных соединений меди с азотсодержащими органическими лигандами, модулирующими метаболизм полиаминов в экспериментальных, биологических системах с усиленной клеточной и опухолевой пролиферацией.

диоксаборининопиридина в стандартной бесклеточной тест-системе для количественной оценки влияния этих соединений на обмен полиаминов.

2. Модифицировать структуры, проявившие наибольшую биохимическую активность, путем координирования с металлом-комплексообразователем - медью (II) и охарактеризовать химические свойства полученных комплексов.

3. Провести количественную оценку способности полученных комплексов влиять на показатели обмена полиаминов в стандартной бесклеточной тест-системе из 4. Оценить цитотоксические свойства исследуемых соединений на сигнальных 5. Определить возможность влияния на экспрессию маркеров готовности к запуску апоптоза клетки для соединений, проявивших наибольшую цитотоксическую 1. Соединения 1-фенил-3-(4-толуидино)-пропанон-1, 3-(4-хлоранилино)-1-фенилпропанонброманилино)-1-фенилпропанон-1, 3-(4-йоданилино)-1-фенилпропанон-1, 3-(2фторанилино)-1-фенилпропа-нон-1, повышают активность аминоксидаз.

орнитиндекарбоксилазы.

3.Производные диоксаборининопиридина ингибируют активность аминоксидаз.

4. Производные диоксаборининопиридина, в основном, повышают активность орнитиндекарбоксилазы.

5.Комплексные соединения меди (II) c 3-(2-фторанилино)-1-фенилпропаноном-1, 3-(3хлоранилино)-1-фенилпропаноном-1, 3-(3-нитроанилино)-1-фенил-пропаноном-1, 3-(2хлоранилино)-1-фенилпропанон-1-гидразоном и 3-(4-этиланилино)-1-фенилпропаноном- повышают активность аминоксидаз.

6. Комплексные соединения меди (II) с 3-анилино-1-фенил-пропаноном-1, 1-фенил-3-(4толуидино)-пропаноном-1, 3-(4-хлоранилино)-1-фенилпропаноном-1, 3-(4-броманилино)-1фенилпропаноном-1, 3-(4-йоданилино)-1-фенил-пропаноном-1, 3-(2-фторанилино)-1фенилпропанон-1, 3-(3-три-фторметиланилино)-1-фенилпропаноном-1, 3-(3-хлоранилино)-1фенилпропаноном-1, 3-(3-нитроанилино)-1-фенилпропаноном-1, 3-(2-хлоранилино)-1фенилпропанон-1-гидразоном ингибируют активность орнитиндекарбоксилазы.

7. Комплексные соединения меди (II) с 1-фенил-3-(4-толуидино)-пропаноном-1, 3-(2фторанилино)-1-фенилпропаноном-1, 3-(3-хлоранилино)-1-фенил-пропаноном-1, 3-(2хлоранилино)-1-фенилпропанон-1-гидразоном обладают значимой цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток.

8. Комплексные соединения меди (II) с 1-фенил-3-(4-толуидино)-пропаноном-1, 3-(2фторанилино)-1-фенилпропаноном-1 и 3-(2-хлоранилино)-1-фенилпропанон-1-гидразоном вызывают повышение уровня экспрессии маркера готовности клетки к апоптозу CD95 у мононуклеарных лейкцитов здорового человека.

Модифицирована и адаптирована методика количественного определения дансильных производных полиаминов методом ВЭЖХ для прибора высокоэффективного жидкостного хроматографа с флуоресцентной детекцией на базе платформы Agilent 1200.

Результаты исследований формируют базу данных для разработки программного обеспечения расчетов количественных корреляций связи «структура-активность» (ККСА, или QSAR) при компьютерном моделировании химических структур с заданными биологическими свойствами, в частности с антиопухолевой и антипролиферативной активностью. Данные о новых синтетических соединениях, содержащих полиаминовые фрагменты, могут быть использованы для синтеза веществ с улучшенными терапевтическими свойствами.

Апробирован алгоритм первичного тестирования новых синтетических соединений на наличие, биохимической и биологической активности.

Адаптированная методика количественного определения полиаминов в биологических тканях методом ВЭЖХ с флуоресцентной детекцией внедрена в работу ЦКП НОЦ РУДН.

Результаты работы используются в лекции «Обмен полиаминов как терапевтическая мишень» в курсе «Медицинской энзимологии» для студентов по специальности «Лечебное дело».

Впервые выявлены активирующие распад и/или ингибирующие синтез ПА производные 3фениламино-1-фенил-пропанона-1.

Впервые синтезированы и охарактеризованы по химическим и физико-химическим свойствам 11 комплексных соединений двухвалентной меди с производными 3-фениламино-1-фенил-пропанона-1.

Впервые in vitro провели определение и количественно оценили влияние производных диоксаборининопиридина и 3-фениламино-1-фенил-пропанона-1, а также медных комплексов с последними на 3-х сигнальных культурах клеток опухолей человека (беспигментной меланоме MEL7, эстрогензависимого рака молочной железы МСF7 и гормонозависимого рака предстательной железы РС3). Установлено отсутствие цитотоксичности у лигандов и появление цитотоксичности комплексов.

Впервые in vitro на клетках мононуклеарных лейкоцитов человека выявлено повышение экспрессии маркеров готовности к апоптозу на фоне действия 3 медных комплексов с производными 3-фениламино-1-фенил-пропанона-1.

Работа выполнялась в рамках Государственных контрактов № 2.1.1./ 5939 и № 2.1.1./ «Исследование технологий по созданию новых классов противоопухолевых средств на базе обмена полиаминов как системы опосредованной регуляции химическими веществами процессов клеточной и опухолевой пролиферации и дифференцировки» аналитической ведомственной целевой программы “Развитие научного потенциала высшей школы (2009- годы)” Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на итоговой конференции студенческого научного общества медицинского факультета РУДН «Клинические и теоретические аспекты современной медицины», 24 – 27 апреля 2007 г. Москва; XV международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии. и экологии», 31 мая-10 июня, 2007 г., Гурзуф; 10th International Congress On Amino Acids And Proteins (ICAAP). 21 - 26 August 2007. - Kallithea, Chalkidiki, Greece;

Сателлитный симпозиум «Экология и здоровье» Съезда физиологического общества им.

И.П.Павлова, 9 – 10 июня 2007 г.; International Polyamine Conference. Gotemba, Shizuoka, Japan, June 14 – June 18, 2010; Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, с 31 мая по июня 2010 г.; Международной научно-практической конференции. «Экология и медицина»:

современное состояние, проблемы и перспективы. Москва, 2 – 3 ноября, 2010 г.; 2a International Conference on the Role of Polyamines and their Analogs in Cancer and other Diseases, Rome, Italy, December 1-6, 2010; VII Международная научно-практической конференция Актуальные научные достижения, 17-25 июня 2011 г. София, Болгария; 12th International Congress on Amino Acids, Peptides and Proteins. Beijing, China, August 1–5, 2011; XX Юбилейная международная конференция и дискуссионный научный клуб. Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии. Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 5 – 15 июня 2012 г.; IV Международная научная конференция Science4Health 2012. Клинические и теоретические аспекты современной медицины. 18–21 апреля 2012г., РУДН, Москва; 2012Congress on polyamines. Polyamines: biological and clinical perspectives. Istanbul, 2 – 7 September, 2012; XIV Всемирный конгресс «Здоровье и образование в XXI веке» 14-17 Ноября 2012 года, РУДН, г.

Москва.

По материалам диссертации опубликовано 24 печатные работы, в том числе 3 научныe статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Диссертация изложена на 167 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов, глав с описанием результатов собственных исследований, обсуждения результатов и выводов. Список литературы включает 271 источника, из них 242 зарубежных и 29 отечественных. Работа иллюстрирована рисунком и 22 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В ходе эксперимента были проведены исследования, химических, биохимических и биологических свойств соединений оригинального синтеза: А – производные анилина (таблица 1), Б – производные диоксаборининопиридина (таблица 2), В – комплексные соединения меди с производными 3-анилино-1-фенил-пропанона-1.

Исследуемые вещества группы А были синтезированы по стандартной методике [Волков С.В., Кутяков С.В, 2007], группы Б – получены в лаборатории синтеза гетероциклических соединений кафедры органической химии РУДН (зав. кафедрой - профессор Варламов А.В.), а группы В – синтезированы из соединений группы А.

Таблица 1. Производные 3-анилино-1-фенил-пропанона-1 (группа А).

3-анилино-1-фенил-пропанон- 1-Фенил-3-(4-толуидино)-пропанон-1 3-(3-хлоранилино)-1-фенилпропанон- 3-(4-хлоранилино)-1-фенилпропанон-1 3-(3-нитроанилино)-1-фенилпропанон- 3-(4-йоданилино)-1-фенилпропанон-1 3-(4-этиланилино)-1-фенилпропанон- А6 3-(2-фторанилино)-1-фенилпропанон- Шифр вещества Б1 6-Метил-2-(2-молил)-4,8а-дифенилпергидро[1,3,2]-диоксаборинино[5,4-с]пиридин Б5 6-Метил-2-(2-тиенил)-4,8а-дифенилпергидро[1,3,2]-диоксаборинино[5,4-с]пиридин Б6 6-Метил-2,4,8а-трифенилпергидро[1,3,2]-диоксаборинино[5,4-с]пиридин 6-Метил-2-(3-фтор-4-хлорфенил)-4,8а-дифенилпергидро[1,3,2]-диоксаборинино[5,4Б Б8 6-Метил-2-(3-толил)-4,8а-дифенилпергидро[1,3,2]-диоксаборинино[5,4-с]пиридин Б9 6-Метил-2-(4-толил)-4,8а-дифенилпергидро[1,3,2]-диоксаборинино[5,4-с]пиридин 1. Синтез и химические свойства тестируемых соединений.

Методом спектрофотометрического титрования были определены константы ионизации соединений группы А.

Веществ группы В синтезировали по стандартной методике смешиванием этанольных растворов органического лиганда и хлорида дигидрата меди (II) (CuCl2·2H2O) в эквимолярных соотношениях (Me:L=1:1) при перемешивании и нагревании. После кристаллизации осадка полученную смесь центрифугировали, надосадочную жидкость декантировали, а осадок высушивали над гидроксидом калия. Полученные комплексы были охарактеризованы с помощью методов элементного, рентгенофазового, термогравиметрического, титриметрического и ИК-спектроскопического анализа.

2. Биологическое тестирование проводилось на двух уровнях: бесклеточном (полиаминовый тест) и клеточном (культуры клеток опухолей человека и мононуклеарные лейкоциты (МЛ) здорового человека). В качестве растворителя во всех экспериментах использовался ДМСО.

Количественный анализ основных показателей обмена ПА в бесклеточных тестсистемах. В экспериментах использовали белых беспородных крыс - самцов массой 100 – г, содержащихся на стандартном рационе вивария РУДН со свободным доступом к воде. В качестве моделей для исследований использовалась регенерирующая печень крыс, полученная путем частичной гепатэктомии [Higgins, Anderson, 1931] – быстро пролиферирующая ткань с усиленным синтезом ПА за счет повышения активности ОДК и с нормальной активностью аминоксидаз (ДАО и ПАО). Бесклеточные тест-системы представляли собой цитозольную фракцию (20 000 g x 20 мин при 4оС) 33%-ного гомогената ткани печени с добавлением необходимых компонентов. Полученный супернатант использовался для экспериментов по определению активности аминоксидаз [С. П. Сяткин, 1981], ОДК и уровня ПА методом ВЭЖХ с флуоресцентной детекцией с предварительным дансилированием.

Оценка цитотоксичности тестируемых веществ in vitro. Клетки меланомы человека MEL-7, рака молочной железы MCF-7 и рака простаты PC-3 размещались в специальных инкубаторах и культивировались в стандартных условиях. Через 24 ч после посадки клеток в питательную среду к клеткам добавлялись растворы исследуемых веществ с заданной конечной концентрацией и инкубировались в течение 24, 48 и 72 часов. В контрольные лунки добавляли ДМСО до концентрации 0,5%. Уменьшение флуоресценции в присутствии тестируемого вещества пропорционально количеству живых клеток и используется для измерения цитотоксичности. Для оценки цитотоксичности веществ подсчитывалось количество клеток в присутствии красителя Аламар Блю, после превращения его во флуоресцирующий продукт в метаболически активных клетках, и вычислялось по формуле:

Уровень пролиферации (%) = 100 x (ТЕСТ-МИН)/ (МАКС-МИН), где ТЕСТ – средний сигнал (n=2) для изучаемого вещества, МИН – средний сигнал (n=6) для лунок без клеток, МАКС – средний сигнал (n=6) для лунок с клетками, но без обработки веществами.

Оценка возможности проапоптотического действия наиболее цитотоксически активных соединений. Тестирование проводилось путем исследования влияния соединений на экспрессию маркеров готовности клетки к апоптозу CD95 на МЛ человека. После инкубации с тестируемыми веществами проводилось окрашивание клеток флуорохромами, мечеными FITCантителами к CD95, а затем с помощью метода проточной цитометрии и статистической обработки полученных данных определялся уровень повышения экспрессии CD95 на МЛ.

Количественный анализ белка. Количество белка в пробах из исследуемых тканей для расчета удельной активности ПАО, ДАО и ОДК определялось фармакопейным методом [Государственная Фармакопея СССР, XI, 1998] по Лоури (1951) в модификации С.П. Сяткина (1981).

Статистический анализ данных. Статистический анализ полученных результатов проводился с помощью t-критерия Стьюдента [Афифи, Эйзен, 1982] с использованием пакета