На правах рукописи

Луцай Владимир Иванович

НАУЧНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ

ТЕХНОЛОГИЙ И МЕТОДОВ ПРИ РЕПАРАТИВНОМ

ОСТЕОГЕНЕЗЕ В ТОРАКАЛЬНОЙ ХИРУРГИИ У

ЖИВОТНЫХ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ И

КЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

06.02.04 – ветеринарная хирургия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

ТРОИЦК - 2014 1

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении высщего профессионального образования «Московский государственный университет пищевых производств» на кафедре «Ветеринарная медицина»

Научные консультанты: доктор ветеринарных наук, профессор, Уша Борис Вениаминович доктор медицинских наук, профессор Вишневский Александр Александрович

Официальные оппоненты:

Стекольников Анатолий Александрович, доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины», ректор Ермолаев Валерий Аркадьевич, доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия ветеринарной медицины им. Столыпина П.А.», кафедра ветеринарной хирургии, заведующий Сахно Николай Владимирович, доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Орловский государственный аграрный университет», кафедра ветеринарной хирургии, заведующий

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина»

Защита диссертации состоится «_» 2014 в _ часов на заседании Диссертационного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.066.01 при ФГБОУ ВПО «Уральская государственная академия ветеринарной медицины» по адресу: 457100, г. Троицк, Челябинской области, ул. Гагарина,13.

С авторефератом и диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБОУ ВПО «Уральская государственная академия ветеринарной медицины» www.usavm.ac.ru.

Автореферат разослан «»_2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук, доцент Е.В. Борисенко

1.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы. Особенности технологического содержания животных в условиях специализированных комплексов в определенной степени увеличили уровень травматизма. По данным Ю.А. Ватникова (2004), количественный показатель травм в 2000-2003 г.г. составил от 18 до 26 % всей хирургической патологии. По данным И.И. Логинова (2011) частота травм, среди животных в ветеринарной хирургической патологии, составляет от 15% до 20%. Большая часть повреждений приходится на травмы конечностей и составляет 65-70%, травмы головы составляют 17и травмы груди 8-13%.

Закрытые травмы груди в ветеринарной медицине занимают 3-е место после повреждения конечностей и травм в области головы (В.И. Луцай, 2012). Статистические данные свидетельствуют, что от 60 до 70% при закрытых травмах груди составляют переломы ребер. Нужно отметить, что повреждение грудной клетки и органов груди принадлежат к категории особенно тяжелых травм, так как гибель часто наступает не от разрушения органа, а от вызванных травмой нарушений дыхания и кровообращения.

Поэтому, разработка новых способов оптимизации репаративной регенерации пластинчатой костной ткани с целью снижения нежелательных последствий остается актуальной проблемой, для ветеринарной хирургии.

Наибольший интерес для стимуляции репаративного остеогенеза, при различных костных патологиях представляют мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) костного мозга, для которых показана способность к направленной дифференцировке в остеогенном и хондрогенном направлении (А.С. Тепляшин, 2004, И.П. Савченкова, 2008, В.И. Луцай, 2009, D.C. Handa 2010).

Трансплантационный репаративный остеосинтез, по мнению многих исследователей, является наиболее перспективным и находится на стыке наук, так как введенные в область повреждения (мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки) под действием микроокружения вырабатывают все необходимые факторы регуляции остеогенеза, могут дифференцироваться в остеобласты и вырабатывать вещества внеклеточного костного матрикса (Т.Х. Файхундинов, Д.В. Голыштейн, А.А. Кулаков и др.

2005; Р.А. Мусина, Е.С. Бекчанова, Г.Т. Сухих 2005; С.П. Миронов, ДенисовНикольский и др. 2005; Р.В. Деев 2006; Н.И. Чупикова, А.С Тепляшин, С.З.

Шарифуллина и др. 2006; С.З. Шарифуллина 2006; С.В. Тимофеев 2006; В.И.

Селедцов, С.С. Рабинович, Э.А. Кыщенко 2006; А.С. Тепляшин 2007; Р.В.

Деев, А.А. Исаев, А.Ю. Кочиш, Р.М. Тихилов 2007; А.С. Григорян, Р.В. Деев, П.В. Кругляков и др. 2010; В.И. Луцай, 2009, 2012, И.П. Савченкова, Л.Н.

Эрнст, М.И. Гулюкин, 2010; Б.В. Уша и др., 2012).

Таким образом, исследования по выявлению наименее реактивного способа фиксации отломков ребер и воздействию мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток на репаративный остеогенез, представляются нам важным и перспективным направлением, а отсутствие доступной, как зарубежной, так и отечественной литературы по данной тематики в ветеринарной медицине, подтверждают их актуальность.

1.2. Степень разработанности изучаемой проблемы. В настоящее время для повышения качества и травматологических процессов разрабо таны различные способы стабильной фиксации костных фрагментов (В.В.

Анников, 2006; Ф.В. Шакирова, 2011). Однако, мало изучена проблема по вреждения ребер грудной стенки, процесс их репаративного остеогенеза и фиксации различными материалами.

Как показывает практика, жесткая фиксация не обеспечивает формиро вание костного регенерата, что связано, по мнению Ю.А. Ватникова (2003), Т.В. Кузьминой (2004), Н.В. Сахно (2009) и других авто ров, с развитием травматической болезни.

Проблема стимуляции остеогенеза, наряду с изысканием возможностей управления регенерацией костной ткани, является одной из актуальных. Это обусловлено бо льшим количеством нарушений травматологического про филя с повреждениями, протекающими с угнетением репаративного о стео генеза (С.Ю. Концевая, М.А. Дерхо, 2004).

В связи с этим, проведение исследований морфофункционального состо яния организма, клинико-биохимического, рентгенологического контроля со стояния животных с переломами ребер очень важен для научно обоснованно го подхода при использовании различных способов фиксации для о птимизации репаративного остеогенеза.

1.3. Цель исследования. Изучить морфофункциональные изменения в организме животных при остеосинтезе ребер с помощью различных хирургических методов. Выявить закономерности структурной и функцио нальной организации репаративного остеогенеза при трансплантации ало генных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и пунктата аутогенного костного мозга в области дефекта ребер грудной клетки в эксперименте и провести сравнительную оценку их репаративного по тенциала.

1.4. Задачи исследования:

Обосновать морфофункциональные изменения в организме животных при остеосинтезе ребер с помощью различных хирургических методов и про вести сравнительный анализ по выявлению наименее реактивного способа фиксации.

Изучить морфофункциональные и структурные изменения в организме животных при репаративном остеогенезе ребер в различные сроки после введения аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клето Изучить морфофункциональные и структурные изменения в организме животных при репаративном остеогенезе ребер в различные сроки после введения пунктата аутогенного костного мозга.

Выявить закономерности структурной и функциональной организации репаративного остеогенеза, при трансплантации аллогенных мультипо тентных мезенхимальных стромальных клеток и пунктата аутогенного костно го мозга.

1.4. Предмет и объект исследований. Предметом исследований явилось изучение морфо-функционального, клинико -биохимического, рентгеноло-гического состояния организма животных с переломами ребер при различных методах фиксации с применением аллогенных мультипо тентных мезенхимальных стромальных клеток.

Объектом экспериментальной части были клинически здоровые живо тные двух видов - козы русской породы – самки в возрасте 1,5 лет, массой кг, в количестве 60 голов и кролики породы шиншилла, в возрасте 1, лет, массой 2,5-3,5 кг, в количестве 120 голов.

1.5. Научная новизна результатов исследований. Проведен сравнительный анализ процесса остеогенеза и остеосинтеза ребер с помо щью различных хирургических методов и дано научное обоснование для выбора наименее реактивного способа фиксации. Показано, что остеосинтез обуславливает необходимость постоянного лабораторного контроля над по слеоперационным течением процесса у животных. Впервые разработаны алгоритмы лабораторного контроля над остеогенезом и доказано, что оценка посттравматических сдвигов, активности и стадий остеогенеза может быть о существлена при помощи лабораторных тестов.

Проанализирован и научно установлен репаративный потенциал алло генных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток при остео синтезе ребер, а также репаративный потенциал пунктата аутогенного костно го мозга при остеогенезе ребер у экспериментальных животных. Изучен регенерационный остеогистогенез при внесении аллогенных мультипо тентных мезенхимальных стромальных клеток.

На основании системного исследования научно подтверждены изменения гематологических и биохимических показателей крови при испо льзовании аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и пунктата аутогенного костного мозга при репаративной регенерации в области дефекта ребер. Показано, что трансплантация аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток не вызывает осло жнений и местных реакций отторжения трансплантанта.

Выявлены закономерности изменения основных костных маркеров при репаративной регенерации в области дефекта ребер с использованием алло генных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и пунктата аутогенного костного мозга.

1.6. Теоретическая и практическая значимость работы.

Теоретическая значимость работы заключается в том, что на основе разрабо танных теоретических положений и экспериментальных исследований, по дтвержденных морфологическими материалами, разработан метод трансплантации аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в области дефекта ребер грудной стенки, которые способствуют уско рению репаративного остеогенеза и более полному восстановлению ее о рганотопической архитектоники. Материалы диссертации испо Практическое значение работы отражено в полученных результатах, свидетельствующих об ускорении репаративной регенерации костной ткани после введения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, что актуально при замедлении стадийности репаративного процесса, когда пролифиративная активность пула остогенных клеточных элементов в зоне ко нсолидации недостаточна и подтверждающих целесообразность применения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток для ускорения репаративных процессов в костных тканях.

1.7. Соответствие диссертации паспорту научной специальности.

Область диссертационных исследований соответствует формуле специальность 06.02.04 – ветеринарная хирургия в плане изучения состояния организма животных с переломами ребер при различных методах фиксации с применением аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, а именно следующим пунктам шифра специальности: п. 2 – изучение общих и специфических признаков хирургических заболеваний (семиотика);

п. 3 – исследование принципов и методов диагностики хирургических заболеваний; п. 4 – исследование процессов воспаления, регенерации, трансплантации и выздоровления; п. 5 – выяснение внутренних условий, тормозящих и стимулирующих выздоровление; п. 10 – изучение экономических, гематологических, морфологических, биохимических и физиологических показателей, объективно характеризующих общее состояние организма и обмена веществ при разных видах патологии.

1.8. Связь исследований с научной программой. Диссертационная работа является частью комплексных исследований по использованию клето чных технологий (стволовых клеток) в ветеринарной медицине, проводимых на кафедре «Незаразные болезни» ФГБО ВПО МГУПП под руководством заслуженного деятеля науки РФ академика РАСХН до ора ветеринарных наук профессора Б.В. Уша, договор № 124 от. 20.10. 2010г. совместно с докто ром медицинских наук профессором А.А. Вишневским (ФГУ «Институт хирургии им. А.В. Вишневского Росмедтехнологий»).

1.9. Апробация и реализация результатов исследований. Апробация:

результаты научных и клинических исследований представлены на Международной научно-практической конференции по во просам ветеринарной хирургии «Внедрение новых технологий в профилактику и лечение хирургической патологии у животных», г. Санкт-Петербург, 2009г.; I Всероссийской межвузовской конференции по ветеринарно й хирургии, МГАВМиБ, 2010г.; в Анестезиологическом ветеринарном обществе «Институт развития ветеринарной терапии, анестезиологии и реаниматоло гии», ВИТАР; в клинике экспериментальной терапии НИИ КО РО НУ им. И.И. Блохина РАМН, 2010 г.; II Всероссийской межвузовской конференции по ветеринарной хирургии МГАВМиБ, 2011 г.; Международной научной ко нференции «Актуальные проблемы ветеринарной хирургии», г. Ульяновск, 2011г.; на международном конгрессе «Биотехнология и перспективы развития», г. Москва, 2013г.; Междуна-родной научно-практической конференции «Теоретические и практические вопросы науки XXI века», г.

Уфа, 2014.

Реализация: по материалам собственных исследований разработан и внедрен патент РФ на полезную модель № 122575 от 10.12.2012 г. при лечении осло жненных ран; научные разработки, положения и выводы вошли в мето дические рекомендации: «Экспериментальные применения клеточных техно логий для стимуляции репаративного остеогенеза при дефекте ребер грудной клетки», одобренные Отделением ветеринарной медицины Россельхо закадемии 19.11.2012 г.; «Экспериментальные применения аутогенного ко стного мозга для стимуляции репаративного остеогенеза при дефекте ребер грудной клетки», одобренные Отделением ветеринарной медицины Ро ссельхозакадемии 03.02.2013 г.; исследования по структурно-функционально му остеогенезу представлены в учебном пособии «Алгоритмы лабораторного контроля остеогенеза» (М.: ООО «Франтера», 2011, 100 с.).

1.10. Публикации результатов исследований. Основные результаты работы максимально отражены в 26 печатных работах, в том числе - в 11 рабо тах, опубликованных в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК для публикации основных результатов диссертаций, представляемых на со искание ученой степени доктора наук.

1.11. Основные положения, и выносимые на защиту.

изменений в организме животных периферической крови при остеосинтезе ребер грудной клетки различными материалами.

репаративный потенциал в поврежденном участке ребра грудной клетки при введении клеточного трансплантата аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток.

репаративный потенциал в поврежденном участке ребра грудной клетки при введении пунктата аутогенного костного мозга.

Морфологические и биохимические изменения в периферической крови экспериментальных животных при использовании аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и аутогенного ко стного мозга.

1.12. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изло жена на 297 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора научной литературы, материалов и методов исследования, собственных исследований (экспериментальная часть включает 4 раздела), обсуждения по лученных результатов, выводов и практических предложений, библио графического списка литературы и приложений. Работа включает таблиц и 93 рисунка. Список литературы включает в себя 286 источников, в том числе 45 – зарубежных авторов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ РЕЗУЛЬТАТЫ

2.1. Материалы и методы исслеований. Работа выполнялась на базе кафедры «Незаразные болезни» ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств».

Данная работа, является частью комплексных исследований по испо льзованию клеточных технологий в ветеринарной медицине, проводимых кафедрой «Незаразные болезни», под руководством заслуженного деятеля РФ, академика РАН, доктора ветеринарных наук, профессора Уша Б.В., со вместно с доктором медицинских наук профессором А.А. Вишневским (ФГУ «Институт хирургии им. А.В. Вишневского Росмедтехнологий», дого вор № 124 от. 20.10. 2010г).

Объектом исследования, были следующие клинически здоровые живо тные, козы (n=60) и кролики (n=120). Все животные содержались в стандартных условиях вивария (12-ти часовой световой день, свободный доступ к воде и корму, температура в помещении 23-25 0С).

Экспериментальные группы формировались по принципу аналогов (по породе, возрасту, полу и массе). В опыте использовались козы русской породы – в возрасте 1,5 года самки, масса - 35-40 кг, кролики породы шиншилла, в возрасте 1,5 года, массой 2,5-3,5 кг.

Выделение и культивирование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и анализ костного мозга производились в «Центре биологических методов лечения» (научным консультантом которого является профессор Туманов В.П., член научно-координационного Совета при президиуме РАМН по клеточным технологиям). Фрагменты лабораторных и клинических исследований выполнялись в клинике при кафедре «Незаразные болезни» МГУПП и Академии Медицинских наук (Российский научный центр хирургии им академика Б.В. Петровского).

В ходе работы выполнены три серии экспериментальных исследо ваний, каждое из которых направлено на решение определенных задач, по ставленных в работе. Схема проведения исследований представлена на рис. 1.

Первая серия. Изучали влияние различных способов фиксации, на репаративный процесс в области грудной клетки после остеотомии ребер.

Изучение динамики показателей белой и красной крови, при различных способах фиксации ребер грудной клетки и выявление наиболее физиологичного метода, при котором происходят наименьшие реактивные сдвиги в системе крови и деструктивные процессы в живом организме.

Исследования проводили на козах (n=60), которым делали одно типную операцию - резекцию пятого ребра, а затем проводили остеосинтез с помощью лигатуры, серкляжа и металлических скоб.

Вторая серия. Изучали влияние аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток на репаративный остеогенез в зоне дефекта ребра.

Исследования проводились на кроликах (n=60), всем кроликам (о пытной и контрольной группы) делали однотипные операции - дефект в о бласти пятого ребра длиной 8 мм и шириной 1,5 мм.

В область дефекта с помощью инсулинового шприца, кроликам опытно й группы, вводили клеточный трансплантат, представляющий собой взвесь – 1 х аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в 0,1 мл физиологического раствора, затем дефект закрывали деминерализо ванным костным аллотрансплантатом.

Аллотрансплантат представляет собой брефкость (кость, изгото вленная из плодов кролика, по методике Г.Н. Котельникова, Л.Т. Воловой, 2006). Контрольной группе область дефекта ребра закрывали только брефко стью без введения ММСК.

Для изучения влияния мультипотентных мезенхимальных стро мальных клеток на структурные изменения в процессе репаративного остео генеза, а также для стандартизации эксперимента и правильной интерпретации получаемых результатов, животных выводили из эксперимента в строго определенные сроки: на 15, 30, 60, 90 сутки.

Третья серия. Изучали влияние пунктата аутогенного костного мозга на репаративный остеогенез в зоне дефекта ребра. Исследования прово дились на кроликах (n=60). Всем кроликам (опытной и контрольной группы) делали однотипные операции (дефект в области пятого ребра, длиной 8 мм и шириной 1,5 мм). В область дефекта с помощью инсулинового шприца кро ликам опытной группы вводили 0,3 - 0,5 мл взвеси пунктата костного мозга.

Далее эксперимент проводили как с ММСК.

Животные, у которых возникали осложнения ран, после хирургического вмешательства после резекции ребер грудной клетки нами успешно применялась мембранная диализирующая повязка для животных, при гнойных и длительно незаживающих ран получен патент РФ №122575.

Клиническое исследование животных производили по общепринятым методикам.

Методы клинического исследования крови. Проводили определение скорости оседания эритроцитов методом Панченкова. Экспозиция в течение часа. Нормальные величины 2,0 – 3,5 мм/ч.

Определение уровня содержания гематокрита проводили унифици-ро ванным методом с помощью микроцентрифуги.

Определение уровня содержания гемоглобина - колориметрическим методом с применением реактивов серии "Ольвекс-FL", скомпонованным в соответствии с международными требованиями.

Принцип метода: под действием феррицианида калия и цианида гемоглобин трансформируется в цианометгемоглобин, определяемый фо тометрически.

Подсчет количества эритроцитов проводили с использованием унифицированного метода подсчета в счетной камере Горяева.

Подсчет количества лейкоцитов проводили унифицированным методом в счетной камере Горяева.

Определение лейкоцитарной формулы – проводили с помощью морфо логических исследований форменных элементов крови и дифференциальным подсчетом лейкоцитарной формулы. Микроскопию нативных преператов периферической крови проводили на фазово-контрастном световом микроско пе производства австрийской фирмы «Лейц» с увеличением 1000 и Leica DM 1000 с увеличением 1000.

Подсчет числа лейкоцитов, эритроцитов, уровня гемоглобина, среднего содержания гемоглобина в эритроците (МСН), средней концентрации гемо глобина в эритроцитах (МСКС), определение анизоцитоза эритроцитов (RDW), а также лейкограммы и эритрограммы производили на гематоло гическом анализаторе РСЕ-90 (ERMAINC Япония), наряду с общепринятыми методами. Собранный объем крови переливали во флакон, содержащий антикоагулянт TDTA-2K (двукалиевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты) в 1 мл крови. Фагоцитарную активность нейтрофилов – по Клеченковой Л.З. (1967), рассчитывали фагоцитарный индекс (ФИ) и фаго цитарное число (ФЧ) (Плященко С.И., Сидоров В.Т.1979).

Для морфологического исследования крови использовали окраску препаратов по Романовскому-Гимза.

Определение активности аланинаминотрансферазы (АлАТ) в сыворо тке крови проводили унифицированным методом Райтмана-Френкеля. Испо льзовали реактивы "Ольвекс-FL-E" ALT-11 (Кат. №001.011) для определений при конечном объеме пробы 6,1 мл.

Определение активности аспартатаминотрансферазы (АсАТ) в сыво ротке крови проводили унифицированным методом Райтмана-Френкеля. С использованием реактивов AST-11 (Кат. №002.011) определений при конечно м объеме пробы 6,1 мл.

Определение активности гамма-глутамилтрасферазы (гаммаглутамилтранспептидазы) (ГГТ) в сыворотке крови проводили кинетическим фотометрическим методом Зейца-Персиджина (1974). Тест стандартизирован по методу в соо ствии с IFCC. Использовали реактивы Gamma-GTFS (Szaszmod/IFCCstand) Диакон диагностик. Определение общей активности кретининкиназы (КФК) в сыворотке крови проводили кинетическим фотометрическим методом с использованием реактивов Gamma-GTFS (Szaszmod/IFCCstand) Диакон диагностик. Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови кинетическим методо м с использованием набора реактивов «Витал-Европа», скомпанованными в соответствии с международными требованиями. Определение концентрации общего холестерина в сыворотке крови проводили энзиматическим коло риметрическим методом с помошью реактивов «Ольвекс-В», скомпоно ванными в соответствии с международными требованиями CHOLESTEROL (Kaт. №013.012). Определение концентрации триглицеридов в сыворотке кро ви проводили унифицированным энзиматическим колориметрическим мето дом с использованием набора реактивов «Витал-Европа», скомпонованным в соответствии с международными требованиями Триглицериды-22-ВИТАЛ (Kaт. №В 17.22). Определение концентрации креатина в сыворотке крови проводили унифицированным псевдокинетическим двухточечным методом с использованием реактивов CREATININE-7 (Кат. №004.007). Набор реактиво в относится к серии "Ольвекс-FL-E", скомпонованными в соо тветствии с международными требованиями. Определение концентрации мочевины в сыворотке крови проводили унифицированным ферментативным кинетическим методом с использованием реактивов фирмы «Lachema» производства Чехии, скомпонованными в соо ствии с международными требованиями. Определение активности -амилазы в сыворотке крови проводили унифицированным оптимизированным энзимо тическим кинетическим методом с использованием реактивов- АмилазаВитал, скомпонованными в соответствии с международными требованиями.

Определение концентрации общего и прямого билирубина в сыворотке крови проводили унифицированным методом Ендрассика-Грофа с использованием реактивов BILIRUBIN-TD Кат.№ 003.012. Метод, использованный в наборе реактивов, относится к серии «Ольвекс-FL-E», отличается от методов, используемых в ряде зарубежных стран, но является унифицированным в Ро ссии. Определение концентрации глюкозы в сыворотке крови проводили унифицированным энзиматическим колориметрическим методом с использо ванием реактивов GLUCOSE-2 (Кат. №005.002), GLUCOSE-12 (Кат.

№005.012) "Ольвекс-Европа", скомпонованных в соответствии с международными требованиями. Определение концентрации кальция в сыво ротке крови проводили унифицированным колориметрическим методом, с использованием реактивов CALCIUM (Кат.№ 018.001). Набор реактивов о тносится к серии "Ольвекс-FL-E", скомпонованных в соответствии с международными требованиями. Определение концентрации неорганическо го фосфора в сыворотке крови проводили спектрофотометрическим методо м, с использованием наборов реактивов (Кат. №016.001). Реактивы относятся к серии "Ольвекс-FL-E", скомпонованной в соответствии с междунаро дными требованиями. Определение концентрации общего белка в сыворотке крови проводили биуретовым методом. Реактивы относятся к серии "О львекс-FL-E", скомпонованных в соответствии с международными требо ваниями. Определение концентрации альбумина в сыворотке крови прово дили колориметрическим методом с бромкрезоловым зеленым при испо льзовании реактивов ДИАКОН-ДС, скомпонованными в соответствии с международными требованиями.

Гистологическое исследование костной ткани проводили по о бщепринятой методике, фиксировали в 10% -ном водном растворе нейтрального формалина, обезвоживали в серии спиртов возрастающей ко нцентрации, заливали в парафин. Срезы после депарафинации окрашивали гематоксилином Майера и эозином по Романовскому-Гимза, Ван-Гизону по о бщепринятым методам.

Изучение морфометрических показателей и анализ полученных данных производили, оценивая величины площадей: всего регенерата, ко стного компонента регенерата, костного матрикса, соединительной и кро ветворной тканей. Эти исследования проводили с помощью микроскопаанализатора «АхioimagerA-2» фирмы Карл Цейсе.

Методика получения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток. Материалом для получения мультипотентных мезенхимальных стро мальных клеток служили клинически здоровые животные (крольчихи), у ко торых при помощи кесарева сечения извлекались плоды на середине срока сукрольности и вместе с рогами матки помещались в стерильный термос для транспортировки в «Центр биологических методов лечения». Время транспортировки не более 3-х часов. Там плоды измельчались и суспензия переносилась в стерильный контейнер с раствором Хенкса и добавлением гентамицина. Дальнейшую работу проводили в стерильных условиях ламинарного бокса (режим GMR). Мультипотентные мезенхимальные стро мальные клетки получали строго в соо ствии с паспортом клеточного трансплантата (А.А. Ржаникова; С.И. Горностаева; Д.В. Гольдштейн, 2005).

Готовили суспензионный клеточный трансплантат в физиологическом раство ре, подсчитывали количество клеток и их жизнеспособность при окраске трипановым синим. Количество клеток в трансплантате доводили до ко нцентрации 1х клеток в 1/мл с содержанием жизнеспособных клеток не менее 96%.

Методика получения пунктата аутогенного костного мозга. Для по лучения пунктата костного мозга использовалась большеберцовая кость кро лика. Для взятия пунктата костного мозга использовались инъекционные иглы с плотно подогнанным мандреном и одноразовые десятиграммовые шприцы. Операцию выполняли под местной анестезией, и строго в асептических условиях. После того как игла оказывалась в костномозговом канале, из аспирационной иглы извлекали стилет и присоединяли к игле шприц на 10 мл и создавали отрицательное давление, после этого внутри цилиндра шприца появлялся пунктат, в количестве 0,3-0,5 мл из костномозго вого канала. Пунктат костного мозга у кролика брали за 20-30 минут перед экспериментальной операцией по изучению влияния его на репаративный о стеогенез в области дефекта ребра грудной клетки. Определение клеток предшественников в костном мозге по А.Я. Фридштейну (1988) выполняли в «Центре биологических методов лечения». Исследование производили по стандартной схеме протокола. Полученные данные обработаны методом вариационной статистики по Стьюденту (Урбах В.Ю., 1975).

2.2. Экспериментальный остеосинтез поврежденных ребер грудной клетки у коз с помощью различных материалов Нами была поставлена задача по выявлению наиболее щадящего или физиологического метода при остеосинтезе ребер поврежденной грудной клетки. Для выполнения поставленной задачи было сформировано три о пытные группы (n=20) и подобраны, по принципу аналогов (порода, возраст, пол и масса), клинических здоровых коз, содержащихся в стандартных усло виях вивария. Перед началом операции, каждое животное проходило клинический осмотр по общепринятой схеме. Полученные результаты сравнивались с физиологической нормой животных. Кровь брали на исследо вания до оперативного вмешательства, за трое суток (исходные показатели) и после наложения швов; через одни, трое, семь, десять, четырнадцать, двадцать пять, тридцать, сорок, шестьдесят суток наблюдения.

В современной гематологии накоплен значительный материал о реакциях системы крови на оперативное вмешательство. Выявлена зависимо сть количественных изменений состава периферической крови в послео перационном периоде (М.А. Дерхо 2000, 2004).

Нашими исследованиями установлены общие закономерности изменений красной крови при оперативном вмешательстве на ребрах грудной клетки у коз, во всех трех группах.

Анализ изменений, возникающих в организме после оперативного вмешательства, дает возможность выделить в послеоперационном периоде три фазы: 1- срочную - продолжительностью 3-7 суток после окончания о перации; 2- катаболическую - долгосрочную (обратного развития), длящуюся от 7 до 20-и суток после операции. Длительность этой фазы зависит от объема выполненного оперативного вмешательства; 3-анаболическую отдаленную, длящуюся от момента операции до восстановления функции о ргана (таб.2).

Таблица 2. - Общие закономерности изменений красной крови при о перативном вмешательстве на ребрах грудной клетки у коз Среднее содержание Hb в (МСН) Средняя концентрация Hb (МСНС) Примечание: -сильно увеличено; -умеренно увеличено; -сильно снижено; - умеренно снижено; - слабо снижено.

Сравнительный анализ динамики показателей красной крови коз при различных соединениях ребер через сутки после операции выявил следующие закономерности. У животных при лигатурном соединении ребер отмечали уменьшение количества гемоглобина – в 1,15 раза, гематокрита – в 1,03, эритроцитов в 1,23 раза, (ИД 12,5±0,29х10 12 /л) среднего содержания гемоглобина – в 1,18 и средней концентрации гемоглобина в эритроците – в 1,11 раза.

У коз при серкляжном соединении ребер отмечали уменьшение ко личества эритроцитов в 1,23 раза (ИД 12,6±0,28х1012 /л), гемоглобина в 1,15, гематокрита 1,03 раза, среднего содержания гемоглобина в эритроцитах - в 1,18 (МСН), средней концентрации гемоглобина в эритроците (МСНС) – в 1,11 раза.

При остеосинтезе ребер металлическими скобами произошло уменьшение количества гемоглобина в 1,08, гематокрита 1,03 раза, эритро цитов в 1,06 раза (ИД 12,2±0,26х1012 /л), среднее содержание гемоглобина в эритроцитах в 1,03 (МСН), средняя концентрация гемоглобина в эритроците (МСНС) – 1,06 раза (рис. 1).

Сопоставляя полученные результаты у животных опытных групп, следует отметить, что через трое суток наблюдения, отмечалось еще большое снижение количества эритроцитов.

Рис.1. - Динамика изменения показателей сыворотки крови через сутки после операции у коз При лигатурном соединении количественный показатель эритроцитов уменьшился в 1,32 раза и составил (9,5±0,23х1012 /л), гемоглобина в 1, раза, гематокрита – в 1,23 раза. Среднее содержание гемоглобина в эритро цитах (МСН) уменьшилось в 1,18 раза, средняя концентрация гемоглобина в эритроците (МСНС) – в 1,11 раза.

При серкляжном соединении количественный показатель эритроцитов уменьшился в 1,32 раза и составил (9,4±0,22х1012 /л), гемоглобина в – в 1,21, гематокрита – в 1,23 раза. Среднее содержание гемоглобина в эритроцитах (МСН) снизилось в 1,18 раза, средняя концентрация гемоглобина в эритро ците (МСНС) – в 1,11 раза.

При соединении металлическими скобами количественный показатель эритроцитов уменьшился в 1,06 раза и составил (11,2±0,28х1012/л), гемогло бина – в 1,08, гематокрита – в 1,03 раза. Среднее содержание гемоглобина в эритроцитах (МСН) снизилось в 1,06 раза, средняя концентрация гемогло бина в эритроците (МСНС) – в 1,03 раза.

На 7-е сутки эксперимента гематологические показатели опериро ванных животных продолжали снижаться. При лигатурном соединении ко личественный показатель эритроцитов снизился в 1,4 раза и составил (9, ±0,25х1012 /л), гемоглобина в 1,48 раза, уровень гематокрита снизился в 1, раза, среднее содержание гемоглобина в эритроцитах (МСН) – в 1,03 раза, средняя концентрация гемоглобина в эритроците (МСНС) – 1,28 раза. При серкляжном соединении количественный показатель эритроцитов уменьшился в 1,37 и составил (9,3 ±0,24х1012 /л), гемоглобина в 1,35, гемато крита снизился в 1,12 раза, среднее содержание гемоглобина в эритроцитах в 1,02 (МСН), средняя концентрация гемоглобина в эритроците (МСНС) – 1, раза. При соединении металлическими скобами количественный показатель эритроцитов снизился в 1,11 раза и составил (10,9±0,27х1012/л), гемоглобина в 1,17, гематокрита в 1,08 раза, среднее содержание гемоглобина в эритро цитах в 1,04 (МСН), средняя концентрация гемоглобина в эритроците (МСНС) – 1,10 раза Изменения кроветворных органов в организме коз связаны с по ступлением в кровяное русло незрелых эритроцитов с меньшим содержанием гемоглобина, что обусловлено различным травматическим воздействием при остеосинтезе ребер грудной клетки и реактивностью используемого материала.

Таким образом, можно отметить, что в первые семь суток после остео синтеза различными способами фиксации ребер наблюдается незначительная анемия, которая наиболее отчетливо проявляется у животных при со единении ребер лигатурным и серкляжным способом.

В период с 15-х по 40-е сутки, во всех трех экспериментальных группах происходило постепенное восстановление показателей красной кро ви до уровня физиологических значений. Это связано, по нашему мнению, с усилением потребления регенерирующей тканью кислорода и биологически активных веществ, так как в этот период осуществляется активный процесс васкуляции зоны перелома и начинает формироваться костный регенерат.

При лигатурном соединении на 30-е сутки отмечали постепенное увеличение количества эритроцитов до 11,1±0,14х1012/л, хотя по отношению к исходным данным их уровень был достоверно ниже в 1,9 раза. Отмечали во сстановление и других гематологических показателей: гемоглобина, гемато крита, среднего содержания гемоглобина в эритроците, средней ко нцентрации гемоглобина в эритроците.

Количественные изменения со стороны красной крови при репозиции ребер с помощью лигатуры, мы расцениваем, как совокупность изменений происходящих в организме повреждающих факторов (травмы), а так же, как компенсацию ацидотического сдвига, возникшего после повреждения.

На 40–60-е сутки эксперимента показатели периферической крови до стигают физиологических значений. Посттравматический период, сопрово ждаемый развитием воспалительной реакции, документирован характерными изменениями скорости оседания эритроцитов. На 15-е сутки после травмы скорость оседания эритроцитов по сравнению с исходными данными выросла в 5,6 раза. Далее мы отмечали постепенное уменьшение этого показателя, характеризующее ослабление воспалительной реакции.

При серкляжном соединении на 30-е сутки отмечали увеличение ко личества эритроцитов до 11,4±0,33х1012/л, хотя по отношению к исходным данным их уровень был достоверно ниже в 1,8 раза. Отмечали восстано вление таких показателей крови, как уровень гемоглобина, гематокрита, среднее содержание гемоглобина в эритроците, средняя концентрация гемо глобина в эритроците.

На 40-е – 60-е сутки эксперимента показатели эритроцитарного звена периферической крови постепенно достигали физиологических значений. По сттравматический период, характеризуется развитием воспалительной реакции, документирован характерными изменениями скорости оседания эритроцитов. На 15-е сутки после травмы по сравнению с исходными данными скорость оседания эритроцитов была выше в 4,34 раз. Далее мы о тмечали уменьшение этого показателя, что характерно для ослабления во спалительной реакции.

При соединении ребер металлическими скобами на 30-е сутки о тмечали увеличение количества эритроцитов до 11,9±0,31х1012 /л, хотя по о тношению к исходным данным их уровень был достоверно ниже в 1,03 раза.

Восстанавливались и другие показатели крови: гемоглобин, гематокрит, среднее содержание гемоглобина в эритроците, средняя концентрация гемо глобина в эритроците.

На 40-е – 60-е сутки эксперимента показатели эритроцитарного звена периферической крови достигали исходных значений. На 15-е сутки после о перативного вмешательства, отмечали достоверное увеличение скорости о седания эритроцитов в 2,0 раза по сравнению с исходными данными Далее мы отмечали постепенное уменьшение этого показателя, характеризующее ослабление воспалительной реакции.

Результаты наших исследований показали, что отмеченная динамика гематологических показателей носит благоприятный характер и свидетельствует об отсутствии послеоперационных осложнений инфекцио нного характера.

фиксации ребер различными материалами. Установлена общая законо мерность изменений белой крови после оперативного вмешательства на ребрах грудной клетки. Выделяют в послеоперационном периоде три фазы:

1- срочную продолжительностью 3-7 суток после окончания операции;

2- катаболическую долгосрочную (обратного развития), продолжительно стью от 7 до 20 суток после операции. Длительность этой фазы зависит от о бъема выполненного оперативного вмешательства. 3-анаболическую о тдаленную, продолжительностью от момента операции до восстановления функции органа (таб. 3).

Таблица 3. - Общие закономерности изменений белой крови при оперативном Ю+П нейтрофилы нейтрофилы Примечание:

-сильно увеличено; -умеренно увеличено; -сильно снижено; - умеренно снижено; - слабо снижено Лейкограмма периферической крови у коз при репозиции ребер различными материалами, выявила выраженную лейкоцитарную реакцию, проявившуюся увеличением количества лейкоцитов в первый день после о стеосинтеза ребер: при лигатурном соединении в 1,79 раза, при серкляжном соединении в 1,49 раза, при соединении металлическими скобами в 1,26 раза по отношению к исходным показателям.

Высокий уровень лейкоцитов в крови свидетельствует о развитии защитных реакций, связанных с развитием воспалительного процесса, направленного на компенсацию дефицита клеточных и гуморальных факторо в защиты организма (И.Ф. Калимуллин, 2010).

К третьим суткам количество лейкоцитов в крови коз снижалось, но до стоверно превосходило исходные значения. Снижение лейкоцитов отмечали до 30-ых суток, после чего во всех трех экспериментальных группах при со единении ребер с помощью различных материалов показатели лейкоцитов периферической крови достоверно повышались и были близки к физиоло гическим нормам на 40- 60-е сутки (рис.2).

Нами так же задокументировано достоверное снижение уровня лимфо цитов в 1 и 3-е сутки при оперативном вмешательстве на ребрах грудной клетки у коз:

при лигатурном соединении в 1,21 и 1,23 раза соответственно по отно шению к ИД (46,6±0,56 %).

при серкляжном соединении в 1,21 и 1,23 раза соответственно по отно шению к ИД (48,3±1,26 %).

при соединении металлическими скобами в 1,10 и 1,14 раза соо тветственно по отношению к ИД (47,8±1,39 %).

Нами так же задокументировано достоверное снижение уровня лимфо цитов в 1 и 3-е сутки при оперативном вмешательстве на ребрах грудной клетки у коз:

при лигатурном соединении в 1,21 и 1,23 раза соответственно по отно шению к ИД (46,6±0,56 %);

при серкляжном соединении в 1,21 и 1,23 раза соответственно по отно шению к ИД (48,3±1,26 %);

при соединении металлическими скобами в 1,10 и 1,14 раза соо тветственно по отношению к ИД (47,8±1,39 %).

Начиная с 10-х суток послеоперационного периода, у животных при всех способах фиксации ребер отмечали тенденцию к увеличению данного по казателя. Нами достоверно установлено у животных при фиксации ребер с по мощью лигатурного и серкляжного соединения уровень лимфоцитов достиг исходного уровня к 60-м суткам наблюдения, а при соединении металлическими скобами к 40-м суткам наблюдения.

Рис. 2. - Динамика изменения лейкоцитов при соединении ребер различными материалами у коз Полученные нами данные позволяют предположить активное участие лимфоцитов в процессе репаративного остеогенеза, они способны вступать в межклеточную кооперацию с остеогенными, макрофагальными и фибробластическими клетками. Подтверждением служит пик лимфо цитарной активности во второй половине посттравматического периода, со впадающего с формированием зрелых костных балок, что согласуется с данными Ю.А. Ватникова (2004), С.Ю. Концевой (2004).

Со стороны лейкограммы в постоперационный период отмечали увеличение палочкоядерных нейтрофилов у животных всех опытных групп, начиная с первых суток после операции до 14-х суток наблюдения. В дальнейшем мы наблюдали снижение уровня палочкоядерных нейтрофилов до исходного уровня.

У животных, при фиксации ребер с помощью лигатуры, количество палочкоядерных нейтрофилов на 10-е сутки постоперационного периода было выше исходных данных в 2,01 раза. При серкляжном соединении ребер количество палочкоядерных нейтрофилов превышало исходные значения в 1,81 раза, при соединении скобами – в 1,61 раза.

Увеличение палочкоядерных форм нейтрофилов и уменьшение числа моноцитов свидетельствует об интоксикации организма продуктами распада тканей, в ответ на травмирующий фактор после оперативного вмешательства.

При изучении динамики моноцитов, при репозиции ребер различными материалам, были выявлены следующие закономерности. Так при лигатурном соединении количество моноцитов у коз на 1-е сутки увеличило сь в 1,83 раза по сравнению с исходными данными (2,8±0,10х109).

К 7-м суткам содержание моноцитов снизилось и приближалось к исхо дным данным до начала эксперимента, но было достоверно ниже в 1.5 раза.

К 14-м суткам отмечали достоверное увеличение их в 1,15 раза по сравнению с исходными данными, а к 60-и суткам уровень их достиг физиологического значения. При серкляжном соединении количество моноцитов у коз на 1-е сутки увеличилось в 2,31 раза по сравнению с исходными данными (3,2±0,05х10 /л). К 7-м суткам содержание моноцитов снизилось и приближалось к исходным данным до начала эксперимента, но достоверно ниже в 1.4 раза.

К 14-м суткам отмечали достоверное увеличение их в 1,20 раза по сравнению с исходными данными, а к 60-и суткам уровень их достиг физиоло гического значения. При соединении металлическими скобами количество мо ноцитов у коз на 1-е сутки увеличилось, в 1,58 раза по сравнению с исхо дными данными (3,5±0,08х109 /л). К 7-м суткам содержание моноцитов снизилось и приближалось к исходным данным начала эксперимента, но до стоверно было ниже в 1,2 раза. К 14-м суткам произошло их увеличение в 1,12 раза по сравнению с исходными данными, а к 60-м суткам их уровень до стиг физиологического значения.

2.4. Фагоцитарная активность нейтрофилов при остеосинтезе ребер с помощью различных материалов. При анализе фагоцитарной активности нейтрофилов in vitro при различных способах фиксации ребер грудной клетки нами были выявлены следующие закономерности.

Так фагоцитарная активность нейтрофилов у коз на 7-е сутки при остео синтезе ребер с помощью лигатуры характеризовалась следующими по казателями. Фагоцитарный индекс после оперативного вмешательства был ниже в 1,85 раза (ИД 75,00 ± 5,01%), фагоцитарное число было ниже в 3, раза. (ИД 8,08 ± 0.04 у.е), индекс фагоцитарной завершенности был ниже в 1,7 раза (ИД 1,62±0,31 у.е).

Фагоцитарная активность нейтрофилов у коз на 7-е сутки при остео синтезе с помощью серкляжа, характеризовалась следующими показателями.

Фагоцитарный индекс после оперативного вмешательства был ниже в 1, раза (ИД 74,09 ± 1,78%), фагоцитарное число было ниже в 1,09 раза. (ИД 7,68 ± 0.24 у.е), индекс фагоцитарной завершенности был ниже в 1,46 раза (ИД 1,64±0,05 у.е) Фагоцитарная активность нейтрофилов у коз на 7-е сутки при остео синтезе с помощью металлических скоб, имела следующие показатели. Фаго цитарный индекс после оперативного вмешательства был выше в 1,02 раза (ИД 74,01 ± 4,32%), фагоцитарное число было несколько выше в 1,14 раза.

(ИД 7,08 ± 0,54 у.е ), индекс фагоцитарной завершенности был выше в 1, раза (ИД1,57±0,04 у.е) (рис. 4).

Биохимическими исследованиями было достоверно установлено, что лучшие показатели фагоцитарной активности к 7-м суткам были в группе животных при остеосинтезе ребер металлическими скобами.

ФАГОЦИТАРНЫЙ ИНДЕКС ФАГОЦИТАРНОЕ ЧИСЛО ИНДЕКС ЗАВЕРШЕННОСТИ

ДО ОПЕРАЦИИ НА 7 ДЕНЬ до операции на 7 день до операции на 7 день Лигатурное лигатурное серкляжное серкляжное металлические соединение соединение соединение соединение скобы скобы Рис. 4. Фагоцитарная активность нейтрофилов с использованием различных материалов в % Определение активности щелочной фосфатазы является одним из маркеров в оценке активности репаративного остеогенеза (рис.4).

Рис. 4. Изменение ЩФ при различных способах фиксации ребер у коз Нами проведено исследование по одному из маркеров травматичности операции лактатдегидрогеназы (ЛДГ), которая обнаруживается во всех клетках организма: в сердечной и скелетной мускулатуре, в печени, в легких и в клетках крови. Особенно много ЛДГ в мышцах. В связи с тем, что ко нцентрация ЛДГ в тканях в 500 раз выше, чем в сыворотке, поэтому по вреждение даже небольшого объёма ткани может сопровождаться существенным повышением активности ЛДГ в сыворотке крови (рис. 5).

Изучение распределения КФК внутри мышечных и миокардиальных клеток показало, что фермент присутствует практически во всех клеточных структурах. Фермент локализован как в цитоплазме, где он частично связан с миофибриллярным аппаратом, так и в митохондриях.

Исследования показали, что креатинкиназные системы, кроме о беспечения энергетических запасов клетки, осуществляют внутриклеточный транспорт энергии по фосфокреатиновому пути от мест ее выработки к местам использования скелетной мышцы и миокарда. Так, изофермент КФК, который локализован на внутренней мембране митохондрий, осуществляет перенос фосфатной группы из митохондриальной АТФ, синтезированной в процессе окислительного фосфорилирования, на креатин, локализованный в цитоплазме, с образованием креатинфосфата.

Для диагностики и оценки тяжести поражения сердца и мышечной системы, а так же возможном развитии аутоинтоксикации после оперативно го вмешательства, мы сочли необходимым исследовать динамику активности креатининфосфокиназы КФК (рис.5).

Рис. 5. Изменение ЛДГ при различных способах фиксации ребер у коз Такое направление реакция принимает вследствие функционального со пряжения митохондриального изофермента с аденин-нуклеотид-транслоказо й. Цитоплазматический изофермент КФК участвует в дальнейшем превращении энергии и частично сопряжен с гликолитическими и другими процессами в цитоплазме.

Исходя из вышеизложенного, мы считаем, что фермент КФК, является одним из маркеров репаративных энергоемких процессов.

Рис. 6. Изменение КФК при различных способах фиксации ребер у коз 2.5. Морфофункциональные и структурные изменения в организме животных при репаративном остеогенезе ребер в различные сроки после введения аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток. Для изучения влияния мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток на структурные изменения в процессе репаративного остеогенеза, а также для стандартизации эксперимента и правильной интерпретации получаемых результатов, животных опытной и контрольной групп выводили из эксперимента на 15, 30, 60, 90 сутки.

Материал брали из области дефекта ребра.

Таблица 4. - Морфометрические показатели репаративного остеогенеза у n=30 контроль 82,2±3,19 63,9±4,91 24,4±2,16 16,4±1, n=30 опыт 89,5±2,41* 69,3±3,59* 15,9±1,91** 16,9±1,15* n=30контроль 85,8±0,32 75,9±1,52 15,1±0,50 13,7±0, n=30опыт 92,7±0,12* 88,5±1,03** 13,2±0,31** 9,1±0,49*** контроль n=30опыт 99,9±0,29** 99,3±3,57** 0,6±0,02*** 5,1±0,03*** контроль