На правах рукописи

ЧУЛАНОВ Владимир Петрович

ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ И КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ

ГЕТЕРОГЕННОСТИ ВИРУСОВ ГЕПАТИТА А И В

14.02.02 – эпидемиология

14.01.09 – инфекционные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва – 2013

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Центральный научноисследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ:

доктор медицинских наук, академик РАМН, профессор Покровский Валентин Иванович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Акимкин Василий Геннадиевич – член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор, ФБУН «Научно-исследовательский институт дезинфектологии» Роспотребнадзора, заместитель директора по научной работе;

Семененко Татьяна Анатольевна – доктор медицинских наук, профессор ГУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.

Гамалеи» Минздрава РФ, отдел эпидемиологии, руководитель;

Токмалаев Анатолий Карпович – доктор медицинских наук, профессор ФГБОУ ВПО «Российский университет Дружбы народов» Минобразования РФ, кафедра инфекционных болезней с курсом эпидемиологии, профессор ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: ГБОУ ВПО «Московский государственный медикостоматологический университет» Минздрава РФ

Защита состоится г. в_10_час.30_мин. на заседании «_06_»_декабря_ диссертационного совета Д.208.114.01 в ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора по адресу: 111123, г. Москва, ул.

Новогиреевская, д. 3а

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, д. 3а)

Автореферат разослан «»2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Горелов Александр Васильевич

Общая характеристика работы

Актуальность темы Вирусные гепатиты (ВГ) до настоящего времени остаются весьма актуальной проблемой здравоохранения как в России, так и в мире. Несмотря на то что в течение последних 10 лет в России наблюдается неуклонное снижение заболеваемости гепатитом А (ГА), ее показатель в 2012 г. оставался достаточно высоким – 5,5 на 100 000 населения.

Следует отметить, что, по данным Роспотребнадзора, заболеваемость ГА в субъектах РФ имеет выраженные различия, и в ряде территорий превышает среднероссийский показатель (Астраханская область – 22,5, Республика Дагестан – 50,6, Республика Тыва – 96,8 на 100 000 населения). Особенностью ГА является его способность вызывать массовые заболевания населения с большим количеством пострадавших. За последние лет в России было зарегистрировано более 300 вспышек ГА, в том числе в относительно благополучных регионах, таких как г. Москва и Московская область (вспышка в 2010 г. с количеством пострадавших более 800 человек). Гепатит В (ГВ) сохраняет свою высокую актуальность в связи со значительной частотой развития хронических форм болезни.

Заболеваемость хроническим вирусным гепатитом В (ХГВ) в РФ в 2012 г. составила 12,6, а впервые выявленные носители вируса гепатита В (ВГВ) регистрировались с частотой 21,1 на 100 000 населения. В целом, заболеваемость хроническими формами инфекции, вызванной ВГВ, в 2012 г. в 23,7 раза превышала заболеваемость острым вирусным гепатитом В (1,42 на 100 000 населения). Особое внимание к себе ХГВ привлекает в связи с высокой частотой развития таких неблагоприятных исходов, как цирроз печении и гепатоцеллюлярная карцинома [Perz J.F. et al., 2006; Хазанов А.И. с соавт., 2007; Kew M.С.б 2010; Кучерявый Ю.А. соавт., 2012; Слепцова С.С. с соавт., 2012]. Согласно данным ВОЗ, ВГВ является причиной 60-80% случаев гепатоцеллюлярной карциномы в мире, от которой ежегодно погибает более 320 000 человек [WHO, Fact sheet No. 204, 2012].

Успехи молекулярной биологии привели к появлению новых данных о биологических особенностях возбудителей ГА и ГВ. В течение последних 20 лет был выделен целый ряд генетических вариантов (генотипов и субтипов) данных вирусов. Так, было описано 6 генотипов вируса ГА (ВГА) и 10 – ВГВ, каждый из которых подразделяется на целый ряд субтипов и имеет характерные особенности географического распространения [Okamoto H. et al., 1988; Norder H. et al., 1993, 2004; Olinger.M. et al, 2008;

Tatematsu K. et al. 2009]. Для некоторых возбудителей инфекций, например, вируса гриппа, изучение циркуляции генетических вариантов и использование этой информации при осуществлении эпидемиологического надзора уже вошло в рутинную практику. О распространенности генетических вариантов вирусов ГА и ГВ в России имеются лишь отрывочные сведения в отдельных публикациях [Flotgren E. et al., 2000; Мукомолов С.Л. с соавт., 2001; Tallo T. et al., 2004]. Клиническое значение генотипов некоторых вирусов, например, вируса гепатита С, уже достаточно хорошо изучено. Известно, что течение и эффективность лечения хронического гепатита С зависит от генотипа и даже от субтипа вируса. О клиническом значении генотипов ВГА и ВГВ сведений в литературе мало и они часто носят противоречивый характер [Chu C-J. et al. 2002; Fung S. et al., 2004; Hussain Z.

et al., 2005; Lin C-L. et al., 2011; Yoon Y.K. et al., 2011; Yun H., 2011]. Систематических исследований, касающихся генетической гетерогенности данных вирусов на территории РФ, значения их генетических вариантов для целей эпидемиологического надзора и клинической практики, не проводилось.

Цель работы: разработать научные основы молекулярно-генетического компонента системы эпидемиологического надзора за ГА и ГВ; оценить клиническое значение генетической гетерогенности ВГА и ВГВ.

Задачи исследования:

1. Провести анализ проявлений эпидемического процесса ГА и ГВ в РФ за период с 2001 по 2011 гг. и современного состояния системы эпидемиологического надзора за данными инфекциями;

2. Определить распространенность генотипов и субтипов ВГА, циркулирующего на территории РФ и ряда стран СНГ с различной интенсивностью эпидемического 3. Определить распространенность генотипов и субгенотипов ВГВ, циркулирующего на территории РФ и ряда стран СНГ с различной интенсивностью эпидемического 4. Установить связь между филогенетическими характеристиками ВГА и ВГВ, относящихся к различным генотипам, с особенностями их географической распространенности;

5. Разработать подходы к анализу эпидемиологической связи случаев заболевания ГА и ГВ на основе изучения генетической гетерогенности вирусной популяции;

6. Усовершенствовать систему эпидемиологического надзора за ГА и ГВ на основе внедрения системы молекулярно-генетического мониторинга за возбудителями данных инфекций;

7. Оценить взаимосвязь между генетическими характеристиками ВГА и ВГВ и клинико-лабораторными особенностями течения ГА и ХГВ.

Научная новизна:

Проведен анализ проявлений эпидемического процесса ГА и ГВ на территории РФ, свидетельствующий о выраженном снижении его интенсивности, изменении возрастной структуры заболевших с увеличением доли взрослого населения, выраженной территориальной неравномерности показателя заболеваемости ГА, значительном преобладании хронических форм инфекции в структуре заболеваемости ГВ.

Впервые дана характеристика территориальной распространенности генотипов и субтипов ВГА во всех федеральных округах (ФО) РФ и ряде стран СНГ. Установлена циркуляция двух субтипов, IA и IIIA, и их неравномерное распространение на территории страны. Показано доминирование субтипа IA в большинстве субъектов РФ. Установлено, что распространенность генотипов ВГА в Украине сходна с таковой в Европейской части РФ, тогда как в странах Средней Азии (Таджикистан, Кыргызстан) наблюдается характерные ее особенности. Изучена генетическая гетерогенность каждого из субтипов вируса и выделены географические кластеры ВГА в пределах субтипов IA и IIIA, характерные для территории РФ и некоторых стран СНГ.

Впервые предложены оптимальные маркерные области генома ВГА для использования при расследовании вспышек ГА. Доказано, что ВГА субтипа IIIА является причиной возникновения многих очагов групповых заболеваний в РФ. Впервые выявлены особенности генетического разнообразия ВГВ на территории всех ФО РФ и ряда стран СНГ. Определены эндемичные для РФ генотипы и субгенотипы вируса, их географическая распространенность. Доказано отсутствие филогеографических кластеров в пределах генотипов А и D, позволяющих различать штаммы ВГВ из различных регионов РФ.

Выявлен новый, ранее не описанный, рекомбинантный вариант ВГВ.

Разработаны научные основы использования молекулярно-генетических методов и филогенетической реконструкции эволюционных взаимоотношений между изолятами вируса в качестве дополнительных объективных инструментов в эпидемиологической диагностике при обследовании эпидемических очагов ГА и ГВ.

Впервые изучены особенности клинико-лабораторных характеристик ГА, вызванного вирусами субтипов IA и IIIA, и ХГВ, вызванного вирусами генотипов А и D, в РФ.

Практическая значимость:

Разработанные положения позволят создать систему молекулярно-генетического мониторинга за ГА и ГВ в РФ.

Для оптимизации информационной подсистемы эпидемиологического надзора предложено внедрить молекулярно-генетический мониторинг с целью слежения за циркулирующими генетическими вариантами ВГА и ВГВ и динамикой изменения генетических характеристик вирусной популяции.

Для повышения качества эпидемиологической диагностики в рамках диагностической подсистемы эпидемиологического надзора рекомендовано использовать данные молекулярно-генетического мониторинга, а также проводить анализ маркерных последовательностей генома вирусов при работе в очагах вирусных гепатитов для установления источника возбудителя инфекции, путей и факторов передачи, а также временных и пространственных границ очагов.

Разработана методика и алгоритм анализа эпидемиологической связи случаев ГА и ГВ на основе филогенетической реконструкции эволюционных взаимоотношений между изолятами вируса. Рекомендованы оптимальные маркерные области генома ВГА и для использования с целью идентификации штаммов. Предложена классификация штаммов ВГА для практического использования при расследовании вспышек.

Выявлены клинико-лабораторные особенности ГА и ХГВ, вызванных различными генотипами вирусов, позволяющие рекомендовать их определение при обследовании больных с целю уточнения прогноза течения заболевания.

Апробация результатов исследования Результаты диссертационной работы представлены на 13 международных и российских съездах, конгрессах, конференциях, симпозиумах и семинарах: Российская научно-практическая конференция «Генодиагностика инфекционных болезней»

(Новосибирск, 2005), Всероссийская научная конференция «Эпидемиология, лабораторная диагностика и профилактика вирусных инфекций» (Санкт-Петербург, 2005), научнопрактическая конференция «Проблемы клиники, диагностики и лечения гепатитов»

(Украина, Харьков, 2005), научно-практическая конференция «Дни иммунологии в Сибири» (Красноярск, 2005), X Республиканская научно-практическая конференция «Актуальные вопросы гепатологии: новое в диагностике и терапии» (Махачкала, 2005), VII Российский съезд врачей-инфекционистов «Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней» (Нижний Новгород, 2006), Российская научно-практическая конференция «Эпидемиология, диагностика и профилактика вирусных гепатитов.

Современное состояние» (Санкт-Петербург, 2006), 13th,14th International Congress on Circumpolar Health (Russia, Novosibirsk, 2006; Canada, Yellowknife, 2009), международная научно-практическая конференция «Геномные технологии в медицине и медицинское образование на рубеже веков» (Казахстан, Алматы, 2006), IX съезд Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения РФ» (Москва, 2007), заседание научно-практического общества врачей-инфекционистов г. Москвы (Москва, 2007), международная научно-практическая конференция «Молекулярная диагностика инфекционных болезней» (Республика Беларусь, Минск, 2007), VII Российская научно-практическая конференция с международным участием «Вирусные гепатиты – эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика» (Москва, 2007), научнопрактический семинар «Современные достижения в диагностике и лечении инфекционных болезней» (Азербайджан, Баку, 2007), VI Всероссийская научно-практическая конференция «Молекулярная диагностика-2007» (Москва, 2007), Circumpolar Viral Hepatitis Working Group Meeting (Denmark, Copenhagen, 2007, 2008, 2010, 2011; USA, Anchorage, 2012), XXIV Российская гастроэнтерологическая неделя (Москва, 2008), Российская научно-практическая конференция «Гепатит В – новое в этиологии, диагностике, профилактике и лечении» (Москва, 2008), VIII Российская научнопрактическая конференция с международным участием «Вирусные гепатиты – эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика» (Москва, 2009), I-V Ежегодный Всероссийский конгресс по инфекционным болезням (Москва, 2009-2013), научнопрактическая конференция «Молекулярная диагностика инфекционных болезней»

(Москва, 2010), The 8th Japanese Society of Hepatology Single Topic Conference “HBV Now (Japan, Tokyo, 2009), научно-практическая конференция «Молекулярная in Asia” диагностика 2010» (Москва, 2010), The 20th Conference of the APASL (China, Beijing, 2010).

Диссертация апробирована на заседании апробационной комиссии ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора 16 мая 2013 года.

Внедрение результатов работы Результаты внедрены в практическую работу Референс-центра по мониторингу за вирусными гепатитами Роспотребнадзора, Научно-консультативного клиникодиагностического центра ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора, вошли в лекционные материалы курсов повышения квалификации «ПЦР-диагностика инфекционных болезней» ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора, а также были использованы при создании информационно-методических документов:

методические указания МУ 3.1.2837-11 «Эпидемиологический надзор и профилактика вирусного гепатита А», методические указания МУ 3.1.2792-10 «Эпидемиологический надзор за гепатитом В».

Публикации Основные научные результаты по теме диссертации опубликованы в 57 научных работах, из них 14 – в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Личный вклад автора Все представленные в диссертационной работе научные результаты получены автором как лично, так и под его руководством коллективами лаборатории вирусных гепатитов и Научно-консультативного клинико-диагностического центра ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. Автору принадлежит идея работы, им определены цели, задачи и методология, разработана часть лабораторных методик и проведены исследования. Автор лично принимал участие в расследовании наиболее крупных вспышек ГА, описанных в работе. Самостоятельно проведено обобщение эпидемиологических данных и клинических наблюдений, статистическая обработка материалов, анализ и интерпретация полученных результатов.

Объем и структура диссертации Диссертационная работа изложена на 380 страницах машинописного текса и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», глав собственных исследований и списка литературы. Диссертация иллюстрирована рисунками и 32 таблицами, список литературы включает 415 источников, в том числе – зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования Исследование выполнялось с 1999 по 2012 гг. на базе Федерального бюджетного учреждения науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии»

Роспотребнадзора.

Анализ проявлений эпидемического процесса ГА и ГВ в РФ за период с 2001 по 2011 гг. проводился по данным форм федерального и отраслевого статистического наблюдения № 2 "Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях", № "Сведения о профилактических прививках", № 6 "Сведения о контингентах детей и взрослых, привитых против инфекционных заболеваний", № 23-09 "Сведения о вспышках инфекционных заболеваний Современное состояние системы эпидемиологического надзора за ГА и ГВ в РФ оценивалось на основании изучения положений действующих нормативно-правовых и информационно-методических документов по эпидемиологическому надзору и профилактике данных инфекций.

С целью изучения распространенности генотипов и субтипов ВГА в РФ было исследовано 2422 образца сыворотки крови от больных ГА и контактных лиц, в 1637 из которых была выявлена РНК ВГА. Проведено субтипирование 527 изолятов ВГА, выделенных от пациентов из различных регионов РФ (таблица 1). Для оценки структуры генотипов ВГА в отдельных странах СНГ было исследовано 899 образцов сыворотки крови от больных ГА и больных острым вирусным гепатитом неуточненной этиологии из следующих стран СНГ: Кыргызстан – 138 образцов, Таджикистан – 511 образцов, Украина – 250 образцов. В 544 (22, 354 и 168 – Кыргызстан, Таджикистан и Украина, соответственно) из них выявлена РНК ВГА, и данные образцы были субтипированы.

Для проведения филогенетического анализа штаммов ВГА и изучения особенностей их географической кластеризации, было секвенировано 375 изолятов ВГА из РФ и изолятов из Украины, Таджикистана и Кыргызстана.

Для изучения молекулярно-генетических особенностей вспышек ГА были проанализированы материалы расследования 20 вспышек, имевших место на территории ФО РФ (охватывающих 15 субъектов РФ) с 2005 по 2010 гг. Исследовано 783 образца сыворотки крови больных ГА, 1279 образцов сыворотки крови контактных лиц, образцов фекалий больных и контактных лиц, 369 образцов концентратов водных проб и 82 образца пищевых продуктов, собранных в рамках расследования вышеуказанных вспышек.

Образцы сыворотки крови больных ГА и контактных лиц исследовались на наличие антител к ВГА (anti-HAV IgG и/или anti-HAV IgМ) с использованием ИФА-тест-систем «Вектор-Бест» (Россия). Все пациенты с anti-HAV IgM и контактные лица без маркеров ВГА обследовались на наличие РНК ВГА в сыворотке крови.

Географическое распределение изолятов ВГА, отобранных для изучения распространенности генотипов и субтипов вируса в РФ Федеральный Южный и Кавказский Архангельская, Новгородская, Калининградская, Образцы проб воды из объема 20 л концентрировались на фильтровальном модуле Millipore с мембранами с усиленным положительным зарядом (до 40 мв/см). Образцы концентратов водных проб и смывов с продуктов питания исследовались на наличие РНК ВГА, энтеровирусов, ротавирусов, астровирусов и норовирусов.

Выделения вирусной РНК проводили из 100 мкл сыворотки крови и 1000 мкл образцов концентратов водных проб и смывов с продуктов питания с помощью автоматической станции «NucliSENS easyMAG» («BioMrieux», Франция) или комплекта реагентов «МАГНО-сорб» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Выявление РНК вирусов проводили с помощью комплектов реагентов «АмплиСенс» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Субтипирование наиболее распространенных субтипов вируса (IA, IB, IIIA и IIIB) проводилось с помощью методики собственной разработки на основе сайтспецифичной мультиплексной ПЦР. Для последующего филогенетического анализа проводилось секвенирование двух вариабельных фрагментов генома ВГА VP1/2A длиной 410 нт и 2С длиной 648 нт.

С целью оценки особенностей течения ГА, вызванного различными генотипами вируса, были проведены клинические наблюдения и проанализированы истории болезни 195 больных, госпитализированных в специализированные стационары инфекционного профиля, среди которых у 124 (63,6%) был выявлен ВГА генотипа IA и у 71 (36,4%) – ВГА генотипа IIIA. Всем больным в динамике наблюдения от 2 до 9 раз проводились общеклинические лабораторные исследования (клинический анализ крови и мочи, биохимический анализ крови). По клиническим показаниям проводилось ультразвуковое исследование органов брюшной полости.

Для оценки распространенности генотипов и субгенотипов ВГВ в РФ было исследовано 3609 образцов сыворотки крови больных острым гепатитом В (ОГВ), ХГВ и носителей ВГВ, содержащих ДНК ВГВ, из различных регионов РФ (таблица 2).

Изучение распространенности генотипов ВГВ на территории ряда сопредельных государств было исследовано 719 образцов плазмы крови от больных острой и хроническими формами инфекции, вызванной ВГВ, из следующих стран СНГ: Республика Армения – 75 образцов, Кыргызстан – 27 образцов, Таджикистан – 80 образцов, Украина – 537 образцов. С целью проведения филогенетического анализа штаммов ВГВ, был секвенирован 291 изолят ВГВ из 26 субъектов РФ и 24 изолята из стран СНГ. Для анализа использовался фрагмент генома длиной 887 нт, покрывающий область S-гена ВГВ (позиция в геноме ВГВ 83-969 по референс-последовательности AF280817).

Географическое распределение изолятов ВГВ, включенных в исследования по изучению распространенности генотипов вируса в РФ Федеральный Дальневосточный Сахалинская обл., Республика Саха (Якутия), Северо- Осетия-Алания, Карачаево-Черкесия, КабардиноКавказский Балкарская, Чеченская Республики, С целью углубленного изучения молекулярно-эпидемиологических особенностей циркулирующих генотипов и субгенотипов ВГВ на территории Чукотского АО было дополнительно исследован 769 образец плазмы крови, из которых 306 принадлежало больным ХГВ и 463 – условно здоровым лицам, ранее не обследовавшимся на наличие маркеров вирусных гепатитов.

Для разработки молекулярно-генетических подходов к анализу эпидемиологической связи случаев гепатита В был исследован 41 случай ХГВ из 18 семейных очагов (13 очагов по 2 случая и 5 очагов по 3 случая). Контрольную группу составили 47 больных ХГВ, проживающих в тех же населенных пунктах, заболевание которых не имело эпидемиологической связи с семейными очагами.

Выделение ДНК из плазмы крови и выявление ДНК ВГВ проводили с использованием комплектов реагентов «АмплиСенс» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора).

Генотипирование ВГВ осуществлялось с помощью методик собственной разработки на основе рестрикционного анализа амплифицированного фрагмента S-гена длиной 470 нт с использованием эндонуклеаз Bst4CI и Sse9I и ПЦР в реальном времени, а также прямого секвенирования. Для рекомбинантного штамма ВГВ было выполнено секвенирование полного генома вируса по Gunter S. et al. (1995). Для части изолятов ВГВ перед секвенированием было проведено клонирование фрагмента С-гена в вектор pGЕM-T (Promega).

Секвенирование изолятов ВГА и ВГВ проводилось на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems). Филогенетический анализ проводили с использованием программ MEGA 5.0 и Geneious 6.0 методами минимальной эволюции (ME), максимального правдоподобия (ML) и Монте-Карло Марковских цепей (MCMC), достоверность кластеризации определяли методом bootstrap (1000 повторов). Положение точки рекомбинации определялось с помощью программы SimPlot, bootscan анализом.

С целью изучения клинико-лабораторных особенностей хронических форм инфекции, вызванных различными генотипами ВГВ, были проведены клинические наблюдения и проанализированы амбулаторные карты 231 больных, наблюдавшихся с диагнозами «Хронический гепатит В» или «Неактивное носительство ВГВ», среди которых у 98 (42,4%) был выявлен ВГВ генотипа A и у 133 (57,6%) – ВГВ генотипа D. В исследование не включались больные, у которых имела место коинфекция другими гепатотропными вирусами и ВИЧ, а также те, у которых основным этиологическим фактором поражения печени было злоупотребление алкоголем. Использовались общепринятые методы клинико-лабораторного обследования, включая биохимический анализ крови в динамике заболевания. Концентрация ДНК ВГВ в плазме крови определялась методом ПЦР в реальном времени с помощью наборов реагентов «АмлиСенс» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Оценка стадии фиброза печени по шкале METAVIR была проведена методом ультразвуковой эластометрии на аппарате Фиброскан (Эхосенс, Франция) в 203 наблюдениях.

Статистическая обработка данных проводилась с помощью пакета программ SPSS 19.0 Достоверность различий оценивалась с помощью U-критерия Манна-Уитни или критерия Краскела-Уоллиса для независимых выборок. Для количественных признаков, имеющих распределение, близкое к нормальному, данные представлены в виде среднего (М) ± стандартное отклонение (s). Для признаков, имеющих ненормальное распределение, данные представлены в виде медианы (интерквартильного интервала). Статистическая значимость различий качественных признаков в сравниваемых группах оценивалась при помощи критерия 2 и точного критерия Фишера. Уровень значимости был принят как