На правах рукописи
НИКУЛИНА ОЛЬГА ФЕДОРОВНА
ЛЕЧЕНИЕ ОСТРЫХ И РЕЗИСТЕНТНЫХ ФОРМ АУТОИММУННОЙ
ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АНЕМИИ И МОНИТОРИНГ АКТИВНОСТИ ГЕМОЛИЗА
Специальность 14.00.29 – гематология и переливание крови
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Москва 2008
Работа выполнена в государственном некоммерческом учереждении Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук
Научный руководитель:
Cтарший научный сотрудник, кандидат медицинских наук Н.В. Цветаева
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор А.К. Голенков доктор медицинских наук, профессор С.А. Луговская Ведущее научное учреждение:
Федеральный Научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ
Защита состоится «......»
на заседании диссертационного совета Д 001.042. в Гематологическом научном центре РАМН по адресу: Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4а
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Гематологического научного центра Российской Академии медицинских наук Автореферат разослан «......»
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук Е.Е. Зыбунова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования Аутоиммунные гемолитические анемии (АИГА) – группа заболеваний, обусловленных выработкой аутоантител против антигенов эритроцитов. В результате происходит ускоренное разрушение эритроцитов, аутосенсибилизированных иммуноглобулинами различных классов и комплементом.
Стандарты диагностики и терапии аутоиммунной гемолитической анемии (АИГА) остаются неизменными уже много лет. Однако при проведении первой линии терапии преднизолоном ремиссии составляют всего 7,3-22% (А.И. Воробьев, 2005, Dacie J. 1962, Packman C., Leddy J.1995). Актуальность поиска новых возможностей лечения АИГА определяется необходимостью длительного приема кортикостероидных препаратов, приводящих к тяжелым осложнениям, возвратом гемолитических кризов при попытке их отмены, укорочением продолжительности ответа при повторном применении и противоречивыми результатами использования других видов иммуносупрессивной терапии. Первостепенной задачей лечения острых АИГА является выбор пути наиболее быстрого прерывания гемолиза. В этих случаях пульс-терапия метилпреднизолоном может стать альтернативой «стандартным»
дозам преднизолона, поскольку она давно и успешно используется при тяжелых формах других аутоагрессивных заболеваний (Liebling M.R, 1981, Caldwell D. 1991, Hari P, 1998, Pasricha J.S, 2003). В литературе нет достаточных сведений об эффективности пульс-терапии при АИГА, (Ozsoylu S. 1990, 2000, Meyer O. et al.
1997) как и нет ответа, может ли она уменьшить число инвалидизирующих последствий общепринятого длительного режима кортикостероидной терапии (Stanbury R., Grham E. 1998, Bialas M, Routledge P. 1998, Lester. R. еt al. 1998).
В 1998 году в клинической практике применен препарат Ритуксимаб моноклональное антитело к антигену CD20, экспрессируемому на поверхности зрелых В-лимфоцитов (Coiffer B.et al. 1998, Leget G., et al. 1998). В зарубежных исследованиях была показана высокая эффективность Ритуксимаба при разных аутоиммунных процессах, в том числе, у небольшого числа больных с резистентными АИГА (Stasi R. Et al. 2001, Lee E. Et al. 2000, Kakaiya R. 2003, Szodoray P., Alex P, 2004).
ремиссии в 50-80% случаев (Zecca M, 2003, Erdozain J.G., Irastorza R., 2004, Petz L., Garatty G. 2004). Однако, необходим дальнейший научно-практический анализ значимости Ритуксимаба, поскольку стабильность полученных результатов, оптимальная дозировка, спектр и частота побочных эффектов, а также возможность повторного введения при рецидиве заболевания и отдаленные последствия остаются мало изученными.
Основные симптомы и лабораторные признаки гемолиза (гемоглобин, ретикулоциты, билирубин, ЛДГ) позволяют констатировать уже состоявшийся гемолитический криз. Поэтому очень важен поиск других, доступных показателей гемолитической активности, мониторинг которых дает возможность подтвердить стабильность достигнутой ремиссии, выявить ранние проявления рецидива и обосновать либо прекращение поддерживающей терапии, либо проведение превентивного, противорецидивного курса. Было показано, что при АИГА в разные периоды течения болезни такие биофизические свойства эритроцитов, как плотность и деформируемость существенно изменяются, что создало перспективу их использования в контроле ответа на лечение (Шурхина Е.С, Лисовская И.Л, 2004).
Кроме того, исследование плотности и деформируемости эритроцитов, расширяет информацию о свойствах эритроцитов при различных патологиях и может быть использовано в дифференциальной диагностике некоторых анемии, а в дальнейшем для коррекции терапии. Биохимическое определение среднего содержания креатина в эритроцитах может стать еще одним рациональным методом измерения активности гемолиза на разных этапах АИГА. Колебания уровня креатина эритроцитов, как и количество ретикулоцитов в крови, являются интегральным показателем активности эритропоэза (Griffiths W., Fitzpztrick M., 1967). Однако, поскольку высокое содержание креатина свойственно только молодым эритроцитам и по мере их старения оно постепенно снижается, этот показатель более полно отражает изменение доли всех молодых эритроцитов, а не только ретикулоцитов (Griffiths W., Fitzpztrick M. 1967, Дмитриева М.Г. 1998). Иными словами креатин эритроцитов остается высоким даже тогда, когда уже нет ретикулоцитоза, так как молодые эритроциты продолжают циркулировать еще 2-3 недели.
Важно, что все три метода просты в исполнении, не требуют дорогостоящих реактивов и оборудования и могут найти применение в широкой клинической практике в качестве методов оценки активности гемолиза, а также диагностики некоторых форм анемий и контроля терапии.
Цель исследования - разработать оптимальные режимы лечения острых и резистентных форм АИГА и новый алгоритм мониторинга активности гемолиза с использованием оценки деформируемости, плотности и количества креатина эритроцитов.
Задачи исследования 1. Проанализировать эффективность пульс-терапии при острых формах АИГА и выработать оптимальную тактику ведения данной группы больных.
2. Оценить эффективность и проанализировать особенности лечения Ритуксимабом резистентных форм АИГА.
3. Выявить характерные различия деформируемости и плотности эритроцитов при некоторых формах анемий и АИГА. Оценить клиническое значение мониторинга изменений деформируемости, плотности и количества креатина эритроцитов на разных этапах течения АИГА для контроля активности гемолиза.
4. Создать оптимальный алгоритм лечения и контроля за его эффективностью при острых и резистентных форм АИГА с неполными тепловыми агглютининами.
Научная новизна. Выявлены преимущества пульс-терапии метилпреднизолоном острых форм АИГА перед «стандартным» режимом лечения преднизолоном: а) отсутствие серьезных побочных эффектов, свойственных длительному лечению преднизолоном; б) быстрота первичного ответа не только без потери в отдаленных результатах, но и с большей частотой ремиссии. Доказана высокая эффективность лечения Ритуксимабом резистентных форм АИГА. Выработан новый подход к контролю эффективности лечения АИГА с помощью мониторинга деформируемости, плотности и уровня креатина эритроцитов, определяющего степень стабильности ремиссии и ранние признаки рецидива гемолиза. Выявлены характерные различия деформируемости и плотности эритроцитов при некоторых формах анемий, улучшающие их дифференциальную диагностику и контроль ответа на терапию.
Практическая значимость.
резистентных форм АИГА с использованием пульс–терапии метилпреднизолоном и Ритуксимаба. Разработан новый алгоритм контроля активности гемолиза в процессе лечения АИГА, включающий измерение деформируемости, плотности и содержания креатина эритроцитов, который позволяет констатировать глубину ремиссии или раннее проявление рецидива. Показано, что измерение в динамике фильтрационноосмотических свойств и креатина эритроцитов - информативный и простой в исполнении комплекс тестов, повышающий достоверность дифференциальной диагностики анемий и улучшающий возможности контроля лечения не только АИГА, но и ряда других анемий.
Внедрение результатов в практику. Результаты внедрены в работу отделения химиотерапии лейкозов и патологии эритрона и других отделений Гематологического Научного Центра РАМН, а также Московского консультативного гематологического центра и кафедры гематологии РМАПО.
Настоящая работа является фрагментом темы, выполняемой по плану НИР ГНЦ РАМН «Создание программ скрининговой диагностики и мониторинга лечения больных гемолитическими анемиями» (2003-2007 гг.), N Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ в отечественной и зарубежной литературе.
Апробация работы. Тема настоящей работы утверждена на Ученом Совете ГУ ГНЦ РАМН 30.03.2004 г. (протокол N2). Работа апробирована 28.05.07 на заседании проблемной комиссии ГНЦ РАМН «Опухоли лимфатической системы, патология красной крови. Порфирии». Основные положения диссертации доложены на научной конференции: «Новое в гематологии и трансфузиологии» (апрель 2004, Москва), на Всероссийских декадниках по гематологии (ГНЦ РАМН апрель 2005, 2006, 2007, Москва), терапевтическом обществе г. Москвы (октябрь 2006).
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 159 страницах. Состоит из введения, 4 глав, включая обзор литературы, материалы и методы, результатов собственных исследований, заключения и выводов. Библиографический указатель содержит 143 источника, в том числе 36 работ отечественных авторов. В работе рисунка и 14 таблиц.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Общая характеристика больных. Обследовано 50 больных АИГА, выявленных среди 578 пациентов, направленных в ГНЦ РАМН с подозрением на гемолитическую анемию в 2001-2007 гг., 46 из них были с первичной формой заболевания. Среди наблюдавшихся было 33 женщины и 17 мужчин в возрасте от 17 до 68 лет.Продолжительность наблюдения (Ме) составила 52 (9-120) мес. Диагноз АИГА устанавливали до начала лечения на основании общепринятых критериев - анемии, повышения уровня ретикулоцитов, непрямого билирубина, ЛДГ и положительной прямой пробы Кумбса. По типу антител диагностировали АИГА с неполными тепловыми агглютининами (n=38), c полными холодовыми агглютининами (n=6), кортикостероидной терапии 22 больным была удалена селезенка (ремиссии в 54% случаев). Специальный подбор больных не проводили. Поскольку в ГНЦ РАМН направляли наиболее тяжелых пациентов, это создавало определенный характер выборки, что следует учитывать в будущем при экстраполяции результатов.
Ошибочный первичный диагноз АИГА при обследовании в ГНЦ РАМН был изменен у 38% больных (наиболее часто это были пароксизмальная ночная гемоглобинурия и В12 дефицитная анемия, а также болезнь Мошковица, септический эндокардит, наследственный сфероцитоз).
Длительный анализ динамики изменений гемограммы, биофизических свойств эритроцитов и количества в них креатина проводили в основной (n=38) группе больных -АИГА с неполными тепловыми агглютининами.
При хроническом течении АИГА снижение гемоглобина и развитие симптомов анемии было постепенным, в течение 1-2 месяцев. Данной категории больных (n=28) была проведена общепринятая терапия преднизолоном - 1 мг/кг/день (далее называемая «стандартной»). Острое течение АИГА наблюдали у 17 пациентов.
Быстрое падение гемоглобина, повышение ретикулоцитов и непрямого билирубина, нарастание слабости, головокружения, бледности, адинамии, одышки без физической нагрузки происходили в течение 2 -14 дней. Такой темп анемизации опасен развитием комы и требовал неотложной терапии, что способствовало разработке нового алгоритма ведения больных острой АИГА.
Критерии оценки эффективности терапии. Эффективность терапии оценивалась по достижению клинико-гематологической ремиссии. Вариант ответа констатировали, если показатели крови больного соответствовали одной из трех нижеуказанных совокупностей критериев на фоне проводимой терапии.
Клинической ремиссией заболевания считали полное восстановление показателей гемограммы (Hb > 120 г/л, Rt менее 10%0, непрямой билирубин менее 20 мкмоль/л), на период не менее двух месяцев. Частичная ремиссия определена, как подъем гемоглобина более 100 г/л, снижение ретикулоцитов и непрямого билирубина в два раза по сравнению с началом гемолитического криза. Отсутствие ответа на терапию или резистентность констатировали при незначительной положительной динамике или улучшении, продолжительностью менее одного месяца.
Из ряда дополнительных тестов оценки активности гемолиза для мониторинга были выбраны следующие: определение распределения эритроцитов по плотности (РЭПП), измерение деформируемости эритроцитов с помощью фильтрационноосмотического метода (ФИОМ) и среднюю концентрацию креатина в них, которые сравнивали с основными параметрами, характеризующими активность гемолиза.
Методы исследования. Динамическое наблюдение и лечение пациентов осуществлялось в отделении химиотерапии лейкозов и патологии эритрона (научный руководитель – д.м.н, профессор Н.Д. Хорошко) Гематологического Научного Центра РАМН (директор – академик РАН и РАМН, профессор А.И.Воробьев). В процессе обследования больных помимо рутинных лабораторных и инструментальных методов гематологической практики использовали специализированные методы выявления и дифференциации гемолитических и других форм анемий, перечисленные ниже.
• Скрининговые гемолитические тесты - в.н.с. ГНЦ к.м.н. С.В. Колодей в отд.
химиотерапии лейкозов и патологии эритрона (научный руководитель – д.м.н., профессор Н.Д.Хорошко).
• Исследование прямой пробы Кумбса, холодовых антител проводили в лаборатории иммуногематологии (зав. лабораторией к.м.н. Головкина Л.Л.);
• Место секвестрации эритроцитов с Cr51исследовала с.н.с., к.м.н. Н.Ш Сагдиева в радиоизотопной лаборатории (руководитель – д.м.н. профессор Я.Д. Сахибов) • Тесты, используемые для мониторинга показателей активности гемолиза (далее обозначаемые как «дополнительные»), которые в процессе наблюдения за больными сопоставляли с основными параметрами активности гемолиза (Нb, ретикулоциты, билирубин):
1. исследование среднего содержания креатина в эритроцитах (методом Griggiths, на спектрофотометре «Specord») проведено с.н.с., к.б.н. М.Г. Дмитриевой (отд.
химиотерапии гематологических заболеваний и интенсивной терапии, научн.
руководитель - доц., к.м.н. С.К. Кравченко);
2. исследование деформируемости эритроцитов фильтрационно-осмотическим методом (ФИОМ) и распределения эритроцитов по плотности (РЭПП) выполнено автором диссертации совместно со с.н.с., к.б.н. Шурхиной Е.С. (лаб. физической биохимии системы крови (руководитель лаборатории - проф. Ф.И.Атауллаханов).
Определение деформируемости эритроцитов фильтрационно-осмотическим методом (ФИОМ) проводили в период диагностики заболевания, в процессе проведения лечения и достижения клинико-гематологической ремиссии. У большинства больных исследования повторяли через 1-2 месяца, в острый период болезни – каждые 2 недели. Тщательный мониторинг позволил более полно охарактеризовать биофизические свойства эритроцитов в разные периоды течения способностью к обратимому изменению формы - деформируемостью. Для исследования фильтруемости венозной крови использовали гемореометр Ида-1, разработанный и изготовленный в лаборатории физической биохимии ГНЦ РАМН (патент РФ N 2052194). В основе метода лежит измерение фильтруемости эритроцитов при различных осмолярностях среды через фильтры с диаметром пор мкм. Оценивали значение осмолярности, при котором эритроциты из-за гипоосмотического набухания перестают фильтроваться критическую осмолярность (Ucr). Продолжительность исследования занимает15 минут.
Распределение эритроцитов по плотности (РЭПП) исследовали с помощью фталатного метода Данон-Мариковского (Danon D., Marikovsky Y.J,1964).
Определяли процентное содержание легкой (dлег - клетки с плотностью менее 1,086г/мл) и тяжелой (dтяж - клетки с плотностью более 1,112 г/мл) фракций эритроцитов, первая из которых представлена ретикулоцитами и гипохромными эритроцитами, а другая дегидратированными, «поврежденными» эритроцитами.
Метод заключается в разделении суспензий эритроцитов по плотности с помощью набора смесей диметил- и дибутил-фталатов известной плотности. Гематокритные капилляры последовательно заполняли смесями фталатов известных плотностей (d) от 1,068 г/мл до 1,138 г/мл, добавляли исследуемый образец крови (высота столбика 50 мм). После центрифугирования (10' при 12000 g) эритроциты, имеющие плотность выше фталатов попадали в нижнюю часть капилляров и отделялись от более легких клеток и плазмы смесью фталатов. Высоту столбиков эритроцитов измеряли (мм) и рассчитывали их процентное содержание.
В процессе терапии Ритуксимабом также проводили мониторинг:
a) показателей трех классов иммуноглобулинов крови путем иммунохимического исследования (лаб. гуморального иммунитета, зав. - к.м.н. Варламова Е.Ю.);
b) количества В- и Т-лимфоцитов периферической крови, до и после курса использованием ограниченной панели (CD19-FITC, CD20-PE, CD22-PE, CD45PECy5, CD3- PECy5) проведено Е.М. Грецовым в лаборатории функциональной морфологии гемобластозов (зав. лаборатории профессор Воробьев И.А.);
Статистический анализ результатов исследования проводился совместно с руководителем отдела компьютеризации ГНЦ РАМН Б.В. Зингерманом и лабораторией медицинской статистики ГНЦ РАМН (руководитель к.т.н. С.М.
Куликов).
За коллегиальную помощь и содействие в проведении работы автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам этих отделений и лабораторий: д.м.н. проф.
Н.Д. Хорошко, д.б.н. проф. Ф.И.Атауллаханову, проф. Г.И. Козинцу, к.м.н. В.С.
Журавлеву, к.б.н. Е.С. Шурхиной, к.м.н. С.В. Колодей, к.б.н. М.Г. Дмитриевой, к.б.н.
А.А. Левиной, д.м.н. проф Л.Г. Ковалевой, Е.М. Грецову, к.м.н. О.А. Дягилевой, к.б.н. О.В. Поповой, к.м.н. Н.Ш.Сагдиевой, Л.Ю. Тихоновой.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Изменение деформируемости и плотности эритроцитов при различных видах анемий.Чтобы оценить возможности метода при АИГА, его клиническую значимость и объективность получаемых результатов, плотность и деформируемость эритроцитов исследовали у доноров (n=21), а также в контрольных группах больных другими пароксизмальной ночной гемоглобинурией (ПНГ) (n=8), железодефицитной анемией (ЖДА) (n=20).
У здоровых доноров распределение эритроцитов по плотности (РЭПП) находились в пределах 1,086 – 1,114 г/мл (рис.1). Средняя плотность эритроцитов доноров (dср) составила 1,099±0,001 г/мл. В норме доли легкой (dлег 0,3±0,3%) и тяжелой (dтяж 0,5±0,3%) фракций эритроцитов были минимальными.
Было показано, что при некоторых патологиях РЭПП существенно меняется. Так у больных с ЖДА, за счет снижения содержания гемоглобина в эритроцитах, выявлено увеличение легкой фракции эритроцитов (dлег 8,5±3,9%) и уменьшение эритроцитов средней плотности. При МСЦ преобладают эритроциты тяжелой фракции (dтяж - 24,5±13%), состоящей из дегидратированных эритроцитов с высокой концентрацией гемоглобина, превышаюших норму в 10-20 раз.
% эритроцитов Рис. 1 Распределение эритроцитов по плотности (РЭПП) у здоровых доноров (n=21).
При ПНГ присутствуют эритроциты как легкой фракции (dлег 21,5±5,7%), так и нормальной плотности, создающих два пика на кривой РЭПП, что помогает в дифференциальной диагностике с ЖДА. При определении РЭПП у больных АИГА в период активного гемолиза отмечено увеличение эритроцитов как легкой, так и тяжелой фракции. Их уровень значительно, в 10-50 раз, превышал норму и отличался от изменений в эритроцитах при всех других видах анемии (dлег - 12,0±8% и dтяж В ремиссии АИГА форма кривой распределения эритроцитов по плотности поэтапно возвращалась к параметрам плотности эритроцитов здоровых лиц. Для наглядности характерные отличия РЭПП отдельных больных с различными формами Рис. 2 Различия распределения эритроцитов по плотности у отдельных больных с разными анемиями Деформируемость эритроцитов также различается в зависимости от патологии.
Среднее значение параметра Ucr было значительно увеличено при МСЦ - 231± мОсм (n=30), в отличие от ПНГ - Ucr = 197±2 мОсм (n=8). При ЖДА (n=20) и соответственно 184±7 и 166±8 мОсм и достоверно отличаются друг от друга (р< 0, 001).
Таким образом, учет биофизических свойств эритроцитов, во-первых, упрощает диагностических ошибок, а во-вторых, динамика их изменений может использоваться для подтверждения верного выбора тактики лечения.
преднизолона.
«Стандартное» лечение преднизолоном в дозе 1 мг/кг провели 28 больным АИГА (9 мужчин и 19 женщин) с неполными тепловыми агглютининами. Возраст больных находился в диапозоне 17 – 68 (Ме=43) лет. При первичном обследовании уровень Нb, в среднем, составил 68,2±13,8 г/л, ретикулоцитоз 91,3±70,6%0, непрямой билирубин – 56,1±27,2 мкмоль/л, ЛДГ превышала норму в 2 – 4 раза. Прямая проба гемолитического криза, дополнительные тесты, контролирующие активность гемолиза, выявили расширение РЭПП за счет обеих патологических фракций эритроцитов (dлег – 12,0±8,0% и dтяж – 25,6±9%), их ухудшенную фильтруемость Ucr 229±42 мОсм (N 190-200 мОсм) и увеличение содержания креатина в эритроцитах (28,6±13,0 мг/дл при норме 5,7±1,5 мг/дл). Корреляция (r=0,69, p20%), венозные тромбозы (>20%). При повторных курсах частота и тяжесть осложнений возрастали (у больных остеопороз с деструкцией позвоночника). В итоге подтверждается вывод, к которому давно пришли многие клиницисты: «стандартная» терапия преднизолоном подавляет активность гемолиза однако, эффект редко удается сохранить без длительной индукционной и поддерживающей терапии (Ю.И. Лорие 1964).
«