На правах рукописи

Филипьев Михаил Михайлович

ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ И ГИСТОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПОЧЕК

КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, ПОЛОЖИТЕЛЬНО РЕАГИРУЮЩЕГО

В СЕРОДИАГНОСТИКЕ НА ЛЕЙКОЗ

06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология

и морфология животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Благовещенск–2013

Работа выполнена на кафедре анатомии, патологической анатомии и хирургии ФГБОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет»

Научный руководитель: Донкова Наталья Владимировна – доктор ветеринарных наук, профессор, заведующая кафедрой анатомии, патологической анатомии и хирургии ФГБОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет» (г.

Красноярск)

Официальные оппоненты: Кухаренко Наталья Степановна – доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный аграрный университет»; кафедра патологии, морфологии и физиологии факультета ветеринарной медицины и зоотехнии, профессор (г. Благовещенск) Огородникова Татьяна Леонидовна – кандидат биологических наук, ГБОУ ВПО «Амурская государственная медицинская академия»; кафедра гистологии, эмбриологии, цитологии, ассистент (г. Благовещенск)

Ведущая организация: Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования ФГБОУ ВПО «Иркутская государственная сельскохозяйственная академия»

Министерства сельского хозяйства Российской Федерации

Защита диссертации состоится 20 декабря 2013 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 220.027.02 при ФГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный аграрный университет», 675005 г. Благовещенск, ул.

Политехническая, 86. тел.: (416-2) 52-32-06, тел./факс: (416-2) 52-62-80.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный аграрный университет»

Автореферат разослан « » 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Самусенко Ольга Леонидовна

I.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Известно, что в процессе жизнедеятельности образуются продукты распада, возникающие в результате диссимиляции белков, которые являются вредными для организма. Они выделяются за пределы организма системой мочевыделения, основным элементом которой являются почки.

Наиболее важная функция почек заключается в обеспечении постоянства основных физико-химических свойств организма, почки регулируют водный обмен, осмотическое давление, ионный состав и кислотнощелочное равновесие плазмы (Витворт Дж.А., 2000; Линева А., 2003; Авылов Ч.К., Кунаков А.А., 2006). В структуре заболеваний внутренних органов крупного рогатого скота поражение почек составляет 5-7%.

Нарушение функции почек особенно при системных заболеваниях, таких как лейкоз, приводит к изменению гомеостаза организма, поражение не возникает до распространения опухолевых клеток по сосудистой системе и развитии органных сдвигов, связанных с опухолевыми разрастаниями, при этом клиническое проявление заболевания отсутствует. Поражение почек при лейкозе проявляеться в виде, как отдельных очагов, так и диффузной пролиферации, которая приводит к почечной недостаточности с развитием анурии (Кудряшов A.A., Петров Н.И., 1999; Смирнов П.Н., Храмцов В.В., Смирнова В.В., Разумовская В.В., 2000; Ермаков С.П., 2001; Lin J., Markowitz G.S., Valeri A.M. et al. 2001; D’Agati V.D., Jennette J.C., Silva F.G., 2005).

Гистологические, гистохимические и морфометрические особенности почек крупного рогатого скота при лейкозе изучены недостаточно, что и послужило предметом нашего исследования.

Цель исследования – изучить гистологические, гистохимические и морфометрические особенности почек крупного рогатого скота, положительно реагирующего в серодиагностике на лейкоз.

Задачи исследования:

1. установить гистологические и гистохимические особенности почек крупного рогатого скота, больных лейкозом;

2. изучить гистологические и гистохимические особенности почек крупного рогатого скота, инфицированных ВЛКРС;

3. установить гистологические и гистохимические особенности почек коров, отрицательно реагирующих в серодиагностике на лейкоз;

4. провести сравнительный морфометрический анализ почечных структур здоровых (РИД-), положительно реагирующих в серодиагностике (РИД+) и гематологически больных лейкозом коров.

Научная новизна. В работе впервые проведено комплексное гистологическое, гистохимическое и морфометрическое исследование почек крупного рогатого скота, положительно реагирующего в серодиагностике на лейкоз в условиях Красноярского края. Проведен сравнительный анализ микроструктуры почек у здоровых, инфицированных ВЛКРС и больных лейкозом коров, включающий исследование клубочкового и канальцевого аппарата нефронов. Установлена частота возникновения и характер морфологических изменений в почках у коров с серопозитивной реакцией на лейкоз.

Теоретическая и практическая значимость. Данная работа является фрагментом темы: «Микроструктурные изменения паренхиматозных органов у животных в норме и при патологии» направления научно-исследовательской работы кафедры «Анатомия, патологическая анатомия и хирургия» Института прикладной биотехнологии и ветеринарной медицины Красноярского государственного аграрного университета. Результаты исследований дополняют и углубляют существующие данные по микроструктуре почек у крупного рогатого скота в норме, инфицированных ВЛКРС и гематологически больных лейкозом животных, что может служить основой для оценки уровня морфофункциональных изменений и дифференциальной диагностики патологии почек.

Внедрение результатов исследований. Результаты исследований используются в учебном процессе и научно-исследовательской работе на кафедрах: «Анатомия, патологическая анатомия и хирургия» Института прикладной биотехнологии и ветеринарной медицины Красноярского государственного аграрного университета; «Анатомия и физиология животных» Сельскохозяйственного института Хакасского государственного университета им. Н.Ф. Катанова; «Анатомия, физиология и патологическая физиология животных» Иркутской государственной сельскохозяйственной академии, а также в Красноярском научно-исследовательском институте животноводства Россельхозакадемии.

Апробация работы. Основные материалы исследований доложены на:

Всероссийской очно-заочной научно-практической и научно-методической конференции с международным участием «Инновации в научно-практической деятельности» (Красноярск, 2010, 2011); третьей Красноярской региональной научно-практической конференции «Животные как часть экосистемы»

(Красноярск, 2010); научной интернет-конференции «Актуальные проблемы ветеринарии» (Новосибирск, Омск, Красноярск, Барнаул, 2012);

Международной научно-практической конференции «Наука: опыт, проблемы, перспективы развития» (Красноярск, 2012, 2013).

Личный вклад автора. Представленные в диссертационной работе экспериментальные исследования, теоретический и практический анализ полученных результатов проведены автором самостоятельно.

Публикации. По результатам научных исследований опубликовано восемь печатных работ, в том числе две – в ведущих научных изданиях, рецензируемых ВАК РФ.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Почки коров имеют гистологические и гистохимические особенности у здоровых, инфицированных ВЛКРС и больных лейкозом коров.

2. Микроструктура почек, гематологически больных лейкозом коров, характеризуется лимфоидной инфильтрацией всех почечных структур.

3. Почки коров, положительно реагирующих в серодиагностике на ВЛКРС, но без изменений в лейкограмме, имеют микроструктурные признаки, свойственные для дегенеративно-дистрофических, воспалительных и некротических процессов.

4. Почечные структуры, больных лейкозом, инфицированных ВЛКРС и здоровых коров имеются достоверные морфометрические различия.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах печатного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических рекомендаций. Список использованной литературы включает в себя источника, в том числе 60 иностранных. Работа содержит 5 таблиц, рисунков, из них 3 диаграммы, 33 микрофотографий и 8 макрофотографий, схему.

II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1.1 Объект и материалы исследований Исследования и обработка экспериментального материала проведены в течение 2009-2013 гг. на кафедре «Анатомия патанатомия и хирургия» Красноярского государственного аграрного университета, в ЗАО «Агрофирма Маяк» Сухобузимского района, хозяйстве «Захаровская заимка» Енисейского района Красноярского края и убойном пункте Уярского мясокомбината и отделе «Ветеринарная медицина»

Красноярского НИИ животноводства Россельхозакадемии.

Объектом исследования явился крупный рогатый скот черно-пестрой голштинизированной породы, в возрасте от четырех до девяти лет, возраст животных определяли по журналам учета поголовья.

Материалом для исследования послужили правая и левая почки (nephros dexstra et sinistra), цельная кровь, сыворотка крови, а так же информационные материалы службы по ветеринарному надзору Красноярского края и отдела экономического анализа и прогнозирования министерства сельского хозяйства и продовольствия Красноярского края.

Для решения поставленных задач было сформировано три группы животных: первая группа – больные лейкозом коровы (положительно реагирующие в серодиагностике на лейкоз и гематологически положительные);

вторая группа – инфицированные ВЛКРС коровы (положительно реагирующие в серодиагностике на лейкоз, но гематологически отрицательные); третья группа – здоровые коровы (отрицательно реагирующие в серодиагностике на лейкоз). Схема формирования опытных групп животных представлена в таблице 1.

Таблица 1 – Схема формирования опытных групп животных 2.1.2 Методы исследований. Основными методами исследования являлись: цитологические, гистологические, гистохимические, гематологические, морфометрические и биостатистические методы. Уровень инфицированности ВЛКРС и заболеваемости лейкозом животных проводили по данным информационных материалов службы по ветеринарному надзору Красноярского края и отдела экономического анализа и прогнозирования министерства сельского хозяйства и продовольствия Красноярского края, а так же журналам ветеринарной отчетности ЗАО «Агрофирма Маяк».

Общая структура исследований представлена на рисунке 1.

Морфологические методы. Морфологические методы включали гистологические, гистохимические и цитологические методы исследования.

Для гистологического исследования отбирали левую и правую почку, кусочки вырезали на границе коркового и мозгового вещества, размеры иссекаемых кусочков не превышали 0,5 см х 0,5 см, фиксировали не менее 12ти часов в 10%-ном растворе нейтрального формалина и жидкости Буэна, промывали под проточной водой, обезвоживали путем проведения через батарею спиртов возрастающей крепости и уплотняли в парафине. Срезы толщиной 5-7 мкм изготавливали на санных микротомах «МС-2» и «Техном».

Для получения обзорных препаратов гистологические срезы окрашивали гематоксилином Эрлиха и эозином, коллагенновые волокна соединительной ткани выявляли по методу Ван-Гизон и по методу Маллори. При применении метода Ван-Гизон коллагенновые волокна окрашивались в красный цвет, клеточные ядра – в темно-коричневый или фиолетово-черный, цитоплазма и мышечная ткань – в темно-желтый цвет. При использовании смеси Маллори коллагенновые волокна окрашивались в темно-синий цвет (Меркулов Г.А.

1969).

ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ И ГИСТОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПОЧЕК КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, ПОЛОЖИТЕЛЬНО

РЕАГИРУЮЩЕГО В СЕРОДИАГНОСТИКЕ НА ЛЕЙКОЗ

Материал для исследования: цельная кровь, сыворотка крови, левая и правая почка, статистическая отчетность по уровню инфицированности ВЛКРС и заболеваемости лейкозом в Красноярском крае.

Гематоксилин углеводсодержащие биополимеры и нуклеиновые кислоты. Углеводсодержащие биополимеры выявляли реактивом Шиффа при предварительном окислении препаратов периодатом натрия по методу А.Л. Шабадаша, в сочетании с энзиматическим контролем – срезы выдерживали в растворе амилазы слюны при t +370C в течении одного часа (Кононский, А.И., 1976). За гликоген принимали ШИК-позитивные вещества, ферментирующиеся амилазой слюны. ШИКпозитивный материал, устойчивый к ферментированию амилазой, относили к нейтральным гликопротеидам. Гликоген окрашивался в интенсивный фиолетововишневый цвет, мукоиды и гликопротеиды – в красноватый.

ДНК содержащие структуры выявляли окраской метиловым зеленым с пиронином по Браше (Кононский, А.И, 1976). При этом структуры, содержащие ДНК окрашиваются в красный цвет, ядерный хроматин в зеленый, сине-зеленый или пурпурно-зеленый. Контрольные препараты, обработанные рибонуклеазой не окрашиваются пиронином, ДНК хроматина выявляют в виде частиц зеленого цвета или зелено-синих образований.

Для получения обзорных цитологических препаратов мазки крови изготавливали на обезжиренных предметных стеклах, окрашивали по Паппенгейму, комбинированному методу сочетающему в себе предварительное окрашивание-фиксацию метиленовым синим по Май-Грюнвальду, с окончательным докрашиванием в азур II-эозине по Романовскому. Подсчет различных форм лейкоцитов и выведение лейкограммы проводили методом Филлипченко. При окраске по Паппенгейму хорошо дифференцируется как ядро, так и зернистость лейкоцитов (Карпуть, И.М., 1986).

Гематологические методы включали качественный и количественный анализ лейкоцитов. У животных отбирали пробы крови из яремной вены.

Цельную кровь, полученную при добавлении антикоагулянта, подвергли морфологическому анализу на кафедре анатомии, патологической анатомии и хирургии Красноярского государственного аграрного университета. Для подсчета количества лейкоцитов пробы цельной крови разводили в жидкости Тюрка и далее исследовали в камере Горяева, производя подсчет лейкоцитов в больших квадратах. Серологические исследования сыворотки крови на ВЛКРС в реакции иммунодиффузии (РИД) проведены в КГБУ “Краевая ветеринарная лаборатория” г. Красноярск, ул. Дудинская, 5г. Результаты исследований оценивали согласно «Методических рекомендаций по диагностике лейкоза крупного рогатого скота» от 23.08. 2000 г. № 13-7-2/2130.

Морфометрические методы. Морфометрические исследования почечных структур проводили на продольных и поперечных срезах, окрашенных гематоксилином Эрлиха и эозином, под световыми микроскопами марок МикМед-5, MS 100 (Austria), при увеличении в 100, 400, 1000 раз.

Микрофотосъемку производили Digital Camera Cam V 200, совмещенной с компьютером посредством кабеля USB. Полученные изображения обрабатывали с использованием программного обеспечения Bio Vision 2005; коррекцию микрофотографий проводили с помощью программного комплекса Biographica Cito 2.0.

Толщину почечных структур измеряли с помощью окуляр-микрометра МОВ-1-15х (ГОСТ 15150-69). Измерения проводили не менее чем в 8- произвольно отобранных срезах с различных стекол. Данные морфометрии протоколировались.

Площадь почечных телец, сосудистых клубочков и извитых канальцев вычисляли по формуле вычисления площади эллипса:

где – длина эллипса; - ширина эллипса.

Биостатистические методы. Полученные в ходе проведенных экспериментальных исследований данные обработаны с учетом учебных рекомендаций по биометрии (Глотов Н.В с соавт., 1982; Лакин Г.Ф., 1990;

Автандилов Г.Г., 1990; Математические методы в биологии, 2004).

Оценку достоверности различий проводили методом вариационной статистки с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считали значимыми