На правах рукописи

РЕМЫГА Степан Геннадьевич

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ГРИППА СВИНЕЙ ТИПА А

И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ

ДИАГНОСТИКИ

03.02.02 «Вирусология»

Aвтореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владимир – 2013 2

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г. Владимир.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, Груздев Константин Николаевич

Официальные оппоненты: Ирза Виктор Николаевич доктор ветеринарных наук, ФГБУ «ВНИИЗЖ», заведующий лабораторией эпизоотологии и мониторинга.

Белоусов Василий Иванович доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБУ «ЦНМВЛ», заместитель директора.

Ведущая организация – Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.

Коваленко Россельхозакадемии (ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии).

Защита состоится «17» декабря 2013 г. в «14 » часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.015.01 при ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец, ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»).

Автореферат разослан «15» ноября 2013 г.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций ФГБУ «ВНИИЗЖ», кандидат биологических наук Жбанова Татьяна Валентиновна

1.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Грипп свиней (инфлюэнца свиней, энзоотическая бронхопневмония) - высоко контагиозная, остро протекающая болезнь, характеризующаяся резко выраженной лихорадкой, общей слабостью и поражением органов дыхания, сопровождающимся кашлем, чиханием, и выделением назальной слизи. Вирус гриппа свиней (ВГС) может вызывать заболевание у людей и, наоборот, установлена возможность заражения свиней вирусом гриппа человека [4].

ВГС является широко распространенным и значимым возбудителем респираторного заболевания у свиней [5]. Основные подтипы данного вируса – H1N1, H3N2 и H1N2. Клинические проявления заболевания могут присутствовать в стаде несколько недель, по мере распространения вируса от свиньи к свинье внутри популяции. На течение и тяжесть заболевания свиней гриппом могут влиять коинфекционные агенты, возраст животных, общее состояние здоровья и иммунного статуса и, потенциально, штамм ВГС [4, 5, 9].

Эпизоотическая ситуация по гриппу свиней имеет большое социальное значение в связи со способностью вируса к реассортации и возникновению штаммов, высоко патогенных для людей [13].

Пандемии гриппа, возникшие в различные временные интервалы XX века, разнились по своей тяжести, от легких до катастрофических. К ним можно отнести пандемию Испанского гриппа H1N1 («испанки») 1918 года, унесшего по разным данным от 20 до 50 миллионов жизней людей по всему миру. Пандемия 1957 года (Азиатский грипп) и 1968 года (Гонконгский грипп) унесли 1 и 0,5 миллиона жизней людей по всему миру, соответственно [1, 9, 8].

Эпизоотическая ситуация по гриппу обострилась после заболевания и гибели людей от "нового" вируса гриппа свиней типа А, начавшегося в апреле 2009 г. в Мексике [4, 11]. Генетический анализ этого вируса показал, что он произошел от комбинированных Североамериканского и Евроазиатского вирусов гриппа свиней [6, 7, 8].

Для выявления вируса гриппа в свиноводческих хозяйствах существует ряд методик, которые условно можно разделить на прямые и косвенные.

К прямым методам выявления ВГС можно отнести выделение вируса в куриных эмбрионах (КЭ), культуре клеток (КК), выявление генома вируса в полимеразной цепной реакции (ПЦР), проведения реакции иммунофлюоресценции, постановка иммуногистохимии (ИГХ).

С развитием заболевания (в организме животных) вирус быстро накапливается в легких и носовой слизи, что позволяет выделить его для культивирования и идентификации [14]. При использовании данных методов часто необходимо учитывать такие аспекты, как пробоподготовка, оптимизация параметров культивирования, выявление генома или антигена ВГС. Вирус можно «потерять» при несоблюдении правил отбора, упаковки или транспортировки патологического материала.

При проведении диагностических исследований на грипп свиней широко используют серологические реакции. Все их можно отнести к косвенным методам определения присутствия ВГС. В научных работах зарубежных исследователей описываются различные методы серологической диагностики гриппа свиней. К ним можно отнести: реакцию торможения гемагглютинации (РТГА), реакцию нейтрализации (РН), иммуноферментный анализ (ИФА) для выявления антител.

Степень разработанности проблемы. С появлением новых подтипов ВГС, а также из-за существования значительной антигенной неоднородности внутри подтипов вируса гриппа и вариационных линий в разных географических районах мира [12], диагностировать данное заболевание становится значительно труднее. Поэтому совершенствовать, разрабатывая наборы к новым актуальным штаммам ВГС.

';

Учитывая тот факт, что на территории РФ вакцинация против гриппа свиней не входит в перечень обязательной специфической профилактики заболевания, данные методы диагностики являются первостепенными при проведении скрининговых или мониторинговых исследований на ГС. Выявление в сыворотках крови свиней антител к ГС указывает на возможное присутствие заболевания. Отсутствие в доступной литературе сведений о наличии отечественных тест-систем для выявления антител к ВГС, свидетельствует о необходимости и своевременности их разработки.

Цель и задачи исследований. Целью нашей работы явилось изучение биологических свойств ВГС типа А и усовершенствование методов серологической диагностики гриппа свиней типа А подтипа H1N1 и H3N2 в реакциях торможения гемагглютинации (РТГА) и микронейтрализации (РМН).

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

определить условия культивирования ВГС типа А подтипов H1N1 и H3N2 в куриных эмбрионах (КЭ), в первичной и перевиваемых культурах клеток с целью выделения, адаптации ВГС и получения вируссодержащего материала; изучить гемагглютинирующие свойства ВГС, подобрав необходимые эритроциты от разных видов животных и параметры постановки РГА и РТГА;

изучить чувствительность лабораторных животных к ВГС типа А подтипа H3N2;

подобрать инактивант и режим инактивации ВГС типа А подтипов H1N1 и H3N2, с целью получения антигенов, обладающих выраженной антигенной и гемагглютинирующей активностью;

получить вирусоспецифические сыворотки крови свиней к ВГС типа А подтипов H1N1 и H3N2; оптимизировать условия очистки нативных сывороток крови свиней от термостабильных и термолабильных ингибиторов;

установить условия лиофильного высушивания иммуноспецифических компонентов набора РТГА для выявления антител к ВГС типа А подтипа H1N (антиген, положительные и нормальные сыворотки крови свиней);

разработать нормативную документацию на набор РТГА для выявления антител к ВГС типа А подтипа H1N1, а также методические рекомендации для выявления антител к ВГС типа А подтип H3N2 в РТГА и H1N1 в РМН.

Научная новизна результатов исследований.

Впервые в России разработана технология изготовления компонентов РТГА для выявления антител к ВГС типа А подтипа H1N1. Подобраны оптимальные параметры культивирования ВГС типа А подтипов H1N1 в КЭ и перевиваемой культуре клеток.

Изучены биологические свойства изолята ВГС А/свинья/Владимирское/2010/ H3N2, при культивировании его в КЭ, перевиваемой и первичной культурах клеток.

Определена его гемагглютинирующая, инфекционная и антигенная активности.

Установлены основные параметры инактивации ВГС типа А подтипов H1N1 и H3N при сохранении их основных антигенных и гемагглютинирующих свойств.

Теоретическая и практическая значимость работы. На основании проведенных исследований изучены биологические свойства полученного изолята и штаммов ВГС культивирования на культурах клеток и куриных эмбрионов. Установлены параметры инактивации ВГС, а также приготовления и хранения иммуноспецифических компонентов ВГС типа А. Определена корреляционная зависимость полученных результатов исследований в разработанных тест-системах с коммерческими наборами ИФА. По результатам проведенных исследований разработан и утвержден пакет научно-технической документации:

- Набор и инструкция для выявления антител к вирусу гриппа свиней типа А подтипа H1N1 в реакции торможения гемагглютинации (СТО 00495527-0189 -2012), утвержденные Россельхознадзором в 2012 году;

серодиагностики гриппа свиней типа А подтипа H1N1 в реакции торможения гемагглютинации», утвержденный директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2011 году;

Предложены, комиссионно проверены, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» следующие методические указания:

- «Методические указания по выявлению антител к вирусу гриппа свиней типа А в реакции торможения гемагглютинации» в 2010 году;

- «Методические указания по выявлению антител к вирусу гриппа свиней типа А подтипа H3N2 в реакции торможения гемагглютинации» в 2013 году;

- «Методические указания по выявлению антител к вирусу гриппа свиней типа А подтипа H1N1 в реакции микронейтрализации» в 2011 году;

Методология и методы исследования. Для достижения поставленной цели диссертационной работы были использованы экспериментальные методы исследования, которые включали в себя прямые и косвенные методы лабораторной диагностики. Прямые методы были задействованы при вирусологических исследованиях, а именно выделение и наработка ВГС типа А в куриных эмбрионах и культуре клеток. Косвенные методы лабораторной диагностики применяли при серологических исследованиях (РТГА, РМН, ИФА) для выявления антител к вирусу гриппа свиней.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. биологические свойства ВГС типа А;

2. подбор оптимальных условий культивирования ВГС типа А в КЭ и КК;

3. гемагглютинирующая, инфекционная и антигенная активность ВГС типа А;

4. технология получения иммуноспецифических компонентов РТГА для выявления ВГС типа А.

Исследования по диссертационной работе выполнены в 2010-2013гг. в Федеральном государственном бюджетном учреждении «ФГБУ ВНИИЗЖ».

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. В соответствии с формулой специальности 03.02.02 Вирусология, охватывает проблемы инфекционности вирусов, разработки мер и средств диагностики вызываемых вирусами заболеваний, включая области исследований – взаимодействие между вирусами, эпидемиологии и путей распространения вирусных инфекций, изучение путей передачи вирусов, выявление естественных хозяев, разработку мер диагностики вирусных заболеваний, совершенствование лабораторных диагностических систем. В диссертационной работе проведены исследования по разработке методов культивирования вируса гриппа свиней типа А подтипа H1N1 и H3N2 в КЭ и перевиваемой, и первичной культурах клеток, инактивации и хранения полученного вирусного материала, получение иммуноспецифических компонентов, подбору эритроцитов, очистки нативных сывороток от термостабильных и термолабильных ингибиторов.

Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности 2, 3, 6, 7, 10.

Степень достоверности и апробация результатов. Результаты проведенных исследований получены с использованием большого объема экспериментального материала, данные опытов обработаны статистическими методами, что подтверждает их достоверность. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях учного совета «ФГБУ ВНИИЗЖ» в 2010-2012 годах, на международной научной конференции «Достижение молодых ученых в ветеринарную практику»

(Владимир, 2010 г.), на всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы биологии», (г. Чебоксары 2011 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 научных работы, две из которых опубликованы в изданиях по перечню ВАК Министерства образования и науки РФ для докторских и кандидатских диссертаций.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 140 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения, приложения; иллюстрирована 32 таблицами и рисунками. Список использованной литературы включает 166 источников, из них иностранных. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную новизну и практическую значимость.

Личный вклад автора в выполнении работы. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам ФГБУ «ВНИИЗЖ»: к.в.н. Долгановой Е.К., к.б.н. Баборенко Е.П., к.в.н.

Пузанковой О.С., к.в.н. Шевцову А.А., к.в.н. Чвале И.А., а также Горюшеву О.Ю. за помощь в проведении отдельных этапов работы.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1.1 Вирусы. В работе были использованы вирусы гриппа свиней музейных штаммов А/свинья/Калифорния/07/2009 H1N1 (ГНУ «ВНИИВВиМ Россельхозакадемии»); штамм ВГС «А/свинья/Айова/15/30» (ФГБУ «ВГНКИ»), а также изолят ВГС «А/свинья/Владимирское/2010/ H3N2». Изолят был выявлен в назальной слизи свиньи, принадлежащей ЗАО по свиноводству «Владимирское» в 2010 г.

В настоящее время материалы по данному изоляту направлены для депонирования в коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ».

2.1.2 Куриные эмбрионы. Использовали эмбрионы кур 9-12 суточного срока инкубации, категории SPF фирмы Loman Tiehrzucht (Германия) (СПФ).

2.1.3 Культуры клеток. В опыт использовали перевиваемую культуру клеток почки собаки MDCK; перевиваемую культуру клеток почки поросенка ППК;

перевиваемую культуру клеток фетальной почки макаки резус Marc-145 и первичную культуру клеток почки свиньи СП. Культуры клеток в виде готового монослоя получали из отдела культивирования клеток (ФГБУ «ВНИИЗЖ»).

2.1.4 Инактиванты. В качестве инактивантов использовали димер этиленимина (АЭЭИ) производства НПП «Биохимресурс» (г.Владимир), -пропилактон (-ПЛ) (Польша), формальдегид (Россия).

2.1. восприимчивых к гриппу животных – серонегативных свиней пород ландрас, крупная белая, дюрок: поросята 2 - 4 месячного возраста живой массой 20 - 25 кг – 10 голов;

также в исследованиях использовали: кроликов породы шиншилла, живой массой 2 кг - 25 голов; морских свинок, живой массой 250-300 г - 30 голов; мышей линии Balb/c 5-6-недельного возраста - 20 голов; петухов живой массой 1.5-2 кг – 4 головы;

лошадь (для получения взвеси эритроцитов).

2.1.6 Сыворотки. Для исследований использовали сыворотки крови свиней, присланные из свиноводческих хозяйств РФ; специфические сыворотки к ВГС типа А подтипа H1N1; специфические сыворотки к ВГС типа А подтипа H3N2;

специфические сыворотки к парвовирусной инфекции свиней; нормальные (отрицательные) сыворотки к ВГС типа А.

2.1.7 Эритроциты. В работе использовали взвесь эритроцитов петуха, морской свинки и лошади.

2.2.1 Культивирование ВГС типа А в СПФ КЭ. Для наработки ВГС типа А подтипа H1N1 (штамм «А/свинья/Калифорния/07/2009» и «А/свинья/Айова/15/30») и H3N2 использовали 9-12 суточные СПФ КЭ (Lohman Tiehrzucht, Германия).

Зараженные эмбрионы инкубировали при температуре (37±2) С и относительной влажности 60-70% в течение 70-72 ч. Биологический контроль проводили путем овоскопирования эмбрионов каждые 24 ч. Эмбрионы, погибшие в более поздний срок, а также живые инфицированные эмбрионы снимали через 70-72 ч, охлаждали и использовали для сбора вируссодержащей экстраэмбриональной жидкости (ЭЭЖ).

2.2.2 Культивирование ВГС типа А на культуре клеток. При культивировании ВГС типа А подтипов H1N1 (штамм «А/свинья/Калифорния/07/2009» H1N1, штамм «А/свинья/Айова/15/30» H1N1) и H3N2 (изолят А/свинья/Владимирское/2010/H3N2) использовали 2-3 дневные перевиваемые и первичную культуры клеток. Матрасы с зараженным монослоем инкубировали в CO2-инкубаторе при температуре 37±2°С.

Ежедневно, в течение 3-7 суток, проводили микроскопию при проявления цитопатического действия (ЦПД) ВГС. Процент ЦПД выражали в крестах: + 25%; ++ 50%; +++ 75%; ++++100%.

2.2.3 Определение инфекционной активности ВГС типа А. Инфекционную активность ВГС, полученного в КЭ, определяли в 9-12-суточных эмбрионах СПФкур. Инфекционную активность выражали в эмбрион-инфицирующих дозах – ЭИД50.

Инфекционную активность ВГС, полученного на культурах клеток, определяли путем титрования на используемых перевиваемых культурах клеток. Титром вируса считали наивысшее его разведение, вызывающее четкое цитопатическое действие (ЦПД) в 50% монослоя культуры клеток. Расчет величины инфекционного титра вируса проводили по методу Кербера в модификации Ашмарина.

2.2. Гемагглютинирующую активность ВГС типа А определяли в реакции гемагглютинации (РГА) постановкой общепринятым методом в планшетах с использованием суспензии эритроцитов.

2.2.5 Определение стерильности. Стерильность матровой расплодки определяли по ГОСТ 28085.

2.2.6. Очистка и концентрирование вируса гриппа свиней типа А. Проводили методом центрифугирования через 20% слой сахарозы. В качестве вируссодержащего материала использовали экстраэмбриональную жидкость (ЭЭЖ).

2.2.7 Инактивация вирусного материала. Инактивацию ВГС типа А подтипов H1N1 и H3N2 в вируссодержащих суспензиях проводили -ПЛ, АЭЭИ и формальдегидом, при этом использовали различные концентрации и рН инактивантов, температуру и длительность инактивации.

2.2.8 Серологические методы исследований. Уровень специфических антител к ВГС типа А подтипов H1N1 и H3N2 определяли в РТГА, РМН и ИФА с использованием коммерческого набора (IDEXX, США).

2.2.9 Интерпретация результатов РТГА. За отрицательный порог реакции принимали уровень антител к ВГС типа А подтипа H1N1 со значением 5,0 log2.

Положительное значение было 6,0 log2. При диагностике ВГС типа А подтипа H3N