[
на правах рукописи
МЕЛЕШИНА АЛЕКСАНДРА ВИКТОРОВНА
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ
МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК С ОПУХОЛЯМИ
МЕТОДАМИ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ИМИДЖИНГА
04.01.12.-онкология (биологические наук
и)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург, 2014 1
Работа выполнена на кафедре биомедицины Нижегородского государственного университета имени Н.И. Лобачевского
Научный руководитель: доктор медицинских наук, Загайнова Елена Вадимовна Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Нижегородский государственный университет им.
Н.И.Лобачевского» Министерства образования и науки Российской федерации, заведующая кафедрой биомедицины биологического факультета.
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Орлова Рашида Вахидовна ФГБОУВПО «Санкт-Петербургский государственный университет»
Правительства Российской Федерации, заведующая кафедрой онкологии.
доктор биологических наук, профессор Комов Вадим Петрович Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия, профессор кафедры биохимии
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина" Российской академии медицинских наук, г. Москва
Защита состоится «_21» октября 2014г. в 14.00час. на заседании диссертационного совета Д 208.052.01 при ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н.
Петрова» Минздрава России (197758, Санкт-Петербург, Песочный, ул.
Ленинградская, 68, тел.:(812)4399554, Эл.почта:[email protected]).
С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России (197758, СанктПетербург, Песочный, ул. Ленинградская, 68, и на сайте: www.niioncologii.ru
Автореферат разослан « » 2014 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук Бахидзе Елена Вилльевна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы В настоящее время изучение роли стволовых клеток в развитии онкологических заболеваний идет по двум направлениям: фундаментальная наука исследует клеточную пластичность и генетические механизмы процесса, прикладная – возможности использования стволовых клеток при лечении и профилактике онкозаболеваний. Стволовые и прогениторные клетки различного происхождения играют важную роль в развитии опухоли. Особенно интересны в этом отношении мультипотентные мезенхимные стромальные клетки, которые могут быть получены из костного мозга, жировой ткани, скелетной мускулатуры, периферической и пуповинной крови, синовиальной оболочки суставов. Считается, что мультипотентные мезенхимные стромальные клетки способны мигрировать в опухоль подобно тому, как они мигрируют в поврежденные ткани. Привлечение мультипотентных мезенхимных стромальных клеток в опухоль было продемонстрировано в ряде исследований (Niess et al., 2011, Kramidas et al., 2013, Yang et al., 2013;).
Наиболее вероятным механизмом привлечения и участия мультипотентных мезенхимных стромальных клеток в канцерогенезе считается мобилизация их из ниш и возвращение в опухоль в ответ на действие хемотаксических агентов, продуцируемых опухолевыми клетками. На различных экспериментальных моделях показано, что, с одной стороны, привлеченные стволовые клетки способствуют развитию опухоли, участвуют в создании ниши для поддержания роста и жизнедеятельности опухолевых клеток, в образовании метастазов (Galderisi et al., 2010). С другой стороны, данные исследований других авторов свидетельствуют о том, что стволовые клетки способны замедлять рост опухолей. Механизмы, лежащие в основе противоопухолевых свойств стволовых клеток, по-видимому, связаны с подавлением регуляции Аkt, NFB и Wnt сигнальных путей (Loebinger, Janes, 2010). Таким образом, роль стволовых клеток в онкогенезе остается предметом активных исследований. Новые знания важны как для понимания механизмов поддержания неопластического роста, так и поиска новых подходов к терапии опухолей.
Для изучения участия стволовых клеток в опухолевом росте и наблюдения распределения их в организме реципиента традиционно используют методы ex vivo иммуногистохимический анализ, in situ гибридизация. Однако в последнее время все шире используют методы высокоразрешающей визуализации (имиджинга) in vivo. Высокоразрешающий имиджинг позволяет проводить исследования на уровне одной клетки с возможностью визуализации в живом организме (Weissleder, Mahmood, 2001). В современных биомедицинских исследованиях все чаще как метод высокоразрешающей визуализации используют флуоресцентный имиджинг. Этот метод становится особенно важным при изучении миграции стволовых клеток и их последующей дифференцировки/пролиферации как на уровне целого организма, так и на субклеточном уровне. Для данного метода применяют особые контрастирующие агенты: флуоресцентные краски, флуоресцентные белки, биолюминесцентные конструкты. На уровне целого организма, используют установки для молекулярного флуоресцентного биоимиджинга, позволяющие получить информацию о распределении клеточных популяций в животном in vivo, в режиме реального времени и отследить изменения в динамике при развитии патологического процесса (Gao et al., 2013). При исследовании субклеточного распределения флуоресцирующих веществ эндогенного и экзогенного происхождения in vitro наиболее информативным является метод конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (Saton et al., 2008; Hogan et al., 2009). Пространственное разрешение лазерной сканирующей микроскопии позволяет строить полноценные трехмерные изображения оптически прозрачных флуоресцирующих объектов (культур клеток), а также наблюдать структуру образцов биотканей на глубину до 500 мкм. Методика лазерной сканирующей микроскопии демонстрирует высокую чувствительность при визуализации структур, меченных цветными флуоресцирующими белками.
В связи с этим изучение участия стволовых клеток в патогенезе опухолевого роста методами флуоресцентного биомиджинга представляет собой актуальную проблему на сегодняшний день.
Цель и задачи исследования Цель настоящей работы – исследовать взаимодействие мультипотентных мезенхимных стромальных клеток и опухоли методами флуоресцентного биоимиджинга на уровне целого организма in vivo и субклеточной организации ex vivo.
Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:
Выделить, охарактеризовать и получить стабильные линии стромальных клеток жировой ткани человека (СКЖТ), трансфицированных красным флуоресцентным белком Turbo FP635 (СКЖТ-Turbo FP635) и мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) костного мозга человека, трансфицированных геном люциферазы luc2 (ММСК-luc2); выделить и охарактеризовать мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК) из костного мозга GFP(+) трансгенных мышей (ММСК- GFP(+)).
Исследовать взаимодействие СКЖТ-Turbo FP635 с первичной опухолью в ксеногенной модели, а также ниши миграции СКЖТ-Turbo FP методами флуоресцентного имиджинга in vivo и лазерной сканирующей микроскопии.
Изучить взаимодействие ММСК из костного мозга GFP(+) трансгенных мышей с первичной опухолью в аллогенной модели и ниши миграции ММСК- GFP(+) методами проточной цитометрии и лазерной сканирующей микроскопии.
Исследовать взаимодействие ММСК-luc2 с первичной опухолью и метастазами в ксеногенной модели методами двойного флуоресцентного и биолюминесцентного имиджинга in vivo и иммуногистохимического анализа.
Проанализировать ниши ММСК-luc2.
Научная новизна Впервые выполнено исследование взаимодействия СКЖТ-TurboFP635 с первичной опухолью на иммунодефицитных мышах в ксеногенной модели методом флуоресцентного имиджинга и лазерной сканирующей микроскопии.
In vivo (методом флуоресцентного имиджинга) удалось идентифицировать миграцию СКЖТ-TurboFP635 в селезенку при системном введении, а исследование на субклеточном уровне (методом лазерной сканирующей микроскопии) выявило миграцию СКЖТ-TurboFP635 в костный мозг, легкие и ткани опухоли реципиента при системном и местном введении (в опухоль).
Впервые исследовано взаимодействие ММСК-GFP(+) с первичной опухолью на линейных мышах С57BL6 в аллогенной модели методами лазерной сканирующей микроскопии и проточной цитометрии. Установлено, что при системном введении исследуемые ММСК-GFP(+) отсутствуют в тканях индуцированной опухоли и костном мозге, но вместе с тем способны мигрировать в организме реципиента, накапливаясь и активно пролиферируя в потенциальных нишах (селезенка, печень).
Впервые получены данные о взаимодействии ММСК-luc2 с первичной опухолью и метастазами, мечеными красным флуоресцентным белком, на иммунодефицитных мышах в ксеногенной модели с использованием двойного (флуоресцентного и биолюминесцентного) имиджинга in vivo. Определено, что при системном и местном введениях ММСК-luc2 мигрируют в легкие, органы брюшной полости и ткани опухоли. Кроме того, при системном введении ММСК-luc2 оказывают подавляющее действие на формирование метастазов, при введении в область первичной опухоли не влияют на ее рост.
Научно-практическая значимость Работа обосновывает возможность прижизненного и динамического исследования взаимодействия СК различного происхождения, несущих в качестве генетических меток различные контрастирующие агенты, с опухолями в различных моделях методами флуоресцентного имиджинга. Полученные результаты имеют важное значение, как для понимания механизмов взаимодействия стволовых клеток и опухолей в условиях in vivo, так и поиска новых подходов к терапии опухолей.
Апробация работы Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на XIX Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых:
Секция «Биология» (Москва, 2012), где отмечена грамотой за лучший доклад;
16-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2012), где отмечена грамотой за лучший доклад; XI всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты (экспериментальная онкология)» (Нижний Новгород, 2012); V Троицкой конференции «Медицинская физика и инновации в медицине» (Троицк, 2012);
17-й Сессии молодых ученых (Нижний Новгород, 2012); IV Съезде биофизиков России. Симпозиум III «Физика – медицине и экологии» (Нижний Новгород, 2012); SPIE Photonics West 2013 (США, 2013); 38th FEBS congress «Mechanisms in Biology» (Санкт-Петербург, 2013); IV International Symposium «Topical problems of Biophotonics-2013» (Нижний Новгород, 2013); V Всероссийской научно-практической конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2013); Форуме молодых ученых (Нижний Новгород, 2013).
Публикации По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК РФ - 4, тезисов докладов и материалов конференций - 10.
Личное участие автора Анализ литературы, планирование работы, сбор материала, отработка методик, постановка и выполнение экспериментов, обработка и интерпретация результатов выполнены непосредственно автором. Автор лично участвовал в апробации результатов исследования, подготовке и написании основных публикаций по выполненной работе Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 113 страницах, включает таблицы и 22 рисунка. Список литературы содержит 176 источников, из них 167 зарубежных.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Лабораторные животные. Эксперименты выполнены на самках мышей линии nude в возрасте 6 месяцев массой 20 г, самцах GFP(+)трансгенных мышей линии С57Вl6 и самцах мышей линии C57Bl6 в возрасте 3 месяца массой 23 г.Клеточные культуры. В работе были использованы культуры стволовых клеток: линия мезенхимных стромальных клеток жировой ткани человека (СКЖТ), стабильно экспрессирующих ген красного флуоресцентного белка Turbo FP635 и линия мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга (ММСК) человека любезно предоставленны лабораторией проблем клеточной пролиферации (ИБР РАН им. Н.К. Кольцова, г. Москва);
первичные культуры мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга (ММСК) GFP(+)трансгенных мышей линии C57Bl6; Культуры опухолевых клеток были любезно предоставлены: клеточная культура карциномы груди MDA-MB-231, меченая красным флуоресцентным белком Turbo FP650 - лабораторией K.E. Luker (Мичиганский университет, США);
клеточная культура рака шейки матки Hela kyoto - лабораторией С.А.
Лукьянова (ИБХ РАН им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, г. Москва);
опухолевый штамм карциномы легких Льюис LLC получен из РОНЦ им. Н.Н.
Блохина РАМН (г. Москва).
Опухолевые модели. Были созданы 3 опухолевые модели: 1. первичная опухоль (рак шейки матки, карцинома легкого Льюис) 2. метастазирующая опухоль (карцинома груди) 3. ортотопическая опухоль с метастазами в легкие (карцинома груди). Подробное описание моделей приведено в тексте диссертации.
ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Культивирование стволовых клеток. СКЖТ и ММСК человека, ММСКGFP(+) мыши были выделены и культивированы по стандартным методикам (Zuk et al., 2001; Soleimani, Nadri, 2009). Для определения маркеров мезенхимных стволовых клеток (СК) проводили иммуноцитохимический анализ. СКЖТ 2-го пассажа трансфицировали геном красного флуоресцентного белка Turbo FP635, ММСК - геном люциферазы luc2.Трансфекция и получение стабильной клеточной линии ММСК-luc2.
Для получения стабильной линии меченых мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга ММСК-luc2 использовали технологию лентивирусной трансфекции. Плазмида рluc2-N и лентивирусный вектор pLVTбыли любезно предоставлены лабораторией молекулярных технологий (ИБХ РАН им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, г. Москва).
Проточную цитометрию осуществляли с помощью проточного цитометра FACS Calibur (BD, США), с возбуждением флуоресценции (для идентификации флуоресценции GFP 488/506) лазером с длиной волны 488 нм и регистрацией сигнала в диапазоне длин волн 515-545 нм.
Флуоресцентный имиджинг in vivo проводили на установке для поверхностного флуоресцентного имиджинга (ИПФ РАН, г. Н. Новгород) и установке IVIS-Spectrum (Caliper Life Sciences, США).
Перед проведением измерений на установке для поверхностного флуоресцентного имиджинга животных наркотизировали внутрибрюшинной инъекцией Золетила в концентрации 20 мг/мл и горизонтально фиксировали на подставке. В ходе измерений животное помещали в «черную» камеру и освещали широким световым пучком в узком спектральном диапазоне (для возбуждения флуоресценции белка Turbo FP635 использовали излучение на длине волны 585 нм с полосой 20 нм). Флуоресценцию, возбужденную на поверхности животного, регистрировали охлаждаемой CDD-камерой.
Разделение флуоресценции и зондирующего излучения осуществляли интерференционным фильтром с полосой пропускания 628-672 нм. Время экспозиции CDD-камеры составляло 2 с. Для флуоресцентного имиджинга in vivo на установке IVIS-Spectrum животных предварительно наркотизировали 2,5% изофлураном. Флуоресценцию белка Turbo FP650 возбуждали на длине волны 605 нм, принимали на 660 нм при экспозиции 5 с.
Сразу после умерщвления выполняли анализ флуоресценции ex vivo во всех органах. При количественном анализе сигнала флуоресценции в программе Living Image 4.2. определяли суммарную интенсивность флуоресценции и усредненную по ее площади.
Биолюминесцентные изображения in vivo и in vitro получали на установке IVIS-Spectrum. Для измерения биолюминесцентного сигнала in vitro клетки ММСК-luc2 вносили в 96-луночный планшет в количестве 20 000 клеток на лунку с серией разведений 1:2. D-люциферин добавляли в концентрации мкг/мл. Измерения проводили в динамике до тех пор, пока сигнал не выходил на плато. Для in vivo биолюминесцентного имиджинга животных предварительно наркотизировали 2.5% изофлураном. D-люциферин вводили внутрибрюшинно в дозе 150 мг/кг. Изображения получали спустя 3 мин после введения субстрата серийно, каждые 2 мин, в течение 20 мин. Сразу после умерщвления выполняли анализ биолюминесценции во всех органах ex vivo.
Сигнал биолюминесценции количественно обрабатывали в программе Living Image 4.2.
Конфокальную лазерную сканирующую микроскопию проводили на установке ЛСМ (LSM 510 META 23, Carl Zeiss, Германия) на основе моторизованного инвертированного микроскопа (Axiovert 200М), оснащенной спектральным модулем для детектирования спектров эпифлуоресценции в видимом диапазоне с разрешением 10 нм. Регистрацию флуоресцентных изображений осуществляли при однофотонном возбуждении аргоновым лазером на длине волны 488 нм (для возбуждения флуоресценции GFP) мощностью 1-2 мВт на образце и на длине волны 543 нм (для возбуждения флуоресценции Turbo FP635) мощностью 12 мкВт на образце. Для идентификации флуоресценции GFP (488/506) регистрировали спектры флуоресценции в интервале 490-600 нм, для Turbo FP635 (588/635) в интервале 597-694 нм. Изображения, полученные на конфокальном микроскопе, обрабатывали в компьютерной программе Zeiss LSM Image browser (version 4.0.0.91).
Содержание и использование лабораторных животных соответствовало правилам, установленным комиссией по биоэтике Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского. При работе с животными руководствовались приказом Минздрава РФ №267 от 19.06.2003 г.
Гистологические препараты исследуемых органов готовили по стандартной методике с окраской гематоксилином и эозином (Саркисов, Перов, 1996). Иммуногистохимический анализ исследуемых тканей проводили с использованием первичных антител Firefly Luciferase Antibody (ffLuc) (LSBio, Германия). Для детектирования первичных антител использовали ImmPress Reagent Anti-Rabbit Ig Peroxidase (Vector Laboratories, Burlingame, CA).
Визуализацию осуществляли с помощью микроскопа X71 Olympus (Япония).
Статистическую обработку результатов проводили с использованием стандартных пакетов Microsoft Excel 2010 и Statistica 6.0. При оценке достоверности различий показателей использовали t-критерий Стьюдента.
Оценку результатов проводили также с применением методов непараметрической статистики с использованием U-критерия Манна-Уитни.
Различия считали статистически достоверными, если уровень значимости был р0,05.
Схемы экспериментов.
1.Изучение взаимодействия СКЖТ-Turbo FP635 с первичной опухолью в ксеногенной модели. Введение СКЖТ-Turbo FP635 на ранних стадиях канцерогенеза осуществляли для проверки участия СКЖТ-Turbo FP в создании неопластической сосудистой сети и стромы опухоли (локальное введение – для моделирования взаимодействия тканеспецифичных СК с опухолевыми тканями в области формирования узла, системное – для моделирования взаимодействия опухоли с СК, мигрирующих из других ниш).
На стадии сформированной опухоли (зрелая система кровообращения и строма) СКЖТ-Turbo FP635 вводили для проверки влияния их на дальнейшее развитие опухоли: усиление роста, инвазия и образование метастазов. Помимо этого изучали дополнительные ниши пролиферации, органы перераспределения и органы выведения продуктов распада СКЖТ-Turbo FP635.
СКЖТ-Turbo FP635 (1,5106) вводили мышам линии nude на разных стадиях канцерогенеза - 0 дней и 8 дней после прививки опухолевой культуры рака шейки матки различными способами: локально и внутривенно (рис. 1).
Контролем служили животные с привитой опухолью без введения СКЖТ-Turbo FP635 (n=3).
2.Изучение взаимодействия ММСК-GFP(+) с первичной опухолью в аллогенной модели.
GFP(+)трансгенных мышей замещать собственные ММСК линейных мышей, не несущих ген GFP, что позволило наблюдать участие меченых ММСК в росте и развитии опухолей. Кроме того изучали дополнительные ниши пролиферации, органы возможного перераспределения и органы выведения продуктов распада ММСК-GFP(+).
ММСК-GFP(+) были трансплантированы мышам линии С57/Bl6. Для эффективного замещения собственных ММСК на меченые ММСК-GFP(+) проводили предварительную миелоабляцию облучением. Облучение лабораторных животных мышей линии С57/Bl6 проводили с помощью излучателя РУМ17 с фильтром Cu05+1Al (ИБР РАН им. Н.К. Кольцова, г.
Москва). На следующие сутки после миелоабляции животным прививали опухоль карциному легкого Льюис и системно трансплантировали аллогенные клетки костного мозга. При этом «клеточный препарат», подготовленный для введения, включал смесь клеток ММСК-GFP(+) (1106) и GFP(-) костномозговые гемопоэтические клетки (1106), необходимые для репопуляции костного мозга реципиента и поддержки кроветворения (рис. 2).
3.Изучение взаимодействия ММСК-luc2 с первичной опухолью и метастазами в ксеногенных моделях.
Возможность ММСК-luc2 выступать в роли противовоспалительных агентов и тем самым способствовать росту опухоли и развитию метастазов, а также их включение в стромальные структуры опухоли изучали при локальном введении ММСК-luc2 в область формирующейся первичной (ортотопической) опухоли.
При внутривенном введении ММСК-luc2 животным с метастазирующей опухолью изучали влияние ММСК-luc2 на метастатический потенциал опухолевых клеток рака груди. Помимо этого внимание уделяли местам локализации (в области формирующихся опухолей и метастатических очагов), нишам пролиферации и органам премиграции ММСК-luc2.
ММСК-luc2 в количестве 1106 вводили мышам линии nude с метастазирующей опухолью на 10 день после инъекции опухолевых клеток рака груди внутривенно. ММСК-luc2 в количестве 0,5106 вводили животным с ортотопической опухолью на 13-й и 15-й дни после инъекции опухолевых клеток в область формирующегося опухолевого узла (рис. 3). Контролем служили животные без введения каких-либо клеток (n=3).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Изучение взаимодействия СКЖТ-Turbo FP635 с первичной опухолью в ксеногенной модели.Клеточная культура. СКЖТ были выделены и охарактеризованы.
Показано, что СКЖТ имеют фенотип мезенхимных СК (экспрессируют CD105, CD90, СD73, CD 44, CD 54, не экспрессируют - CD 34, CD45, HLA-DR) и способны дифференцироваться в условиях in vitro в адипогенном, остеогенном и хондрогенном направлениях. Для трансфекции использовали СКЖТ 2-го пассажа. Эффективность трансфекции СКЖТ геном красного флуоресцентного белка Turbo FP635 составила 75%.
Динамика изменений опухолей. Экспериментальным животным разными способами и на разный срок вводили СКЖТ-Turbo FP635. После измерения линейного размера опухолей и полученных данных флуоресцентного имиджинга стало ясно, что экзогенное введение СКЖТ-Turbo FP существенно не влияет на рост опухолей.
Мониторинг миграции СКЖТ-Turbo FP635 методом поверхностного флуоресцентного in vivo имиджинга. В контрольной группе животных (с привитой опухолью без введения СКЖТ-Turbo FP635) в процессе всего наблюдения роста опухолей не наблюдали локальной флуоресценции ни в области опухолевого узла, ни в органах-нишах. Динамику накопления СКЖТTurbo FP635 в опухоли и органах премиграции in vivo отслеживали по наличию красной флуоресценции.
В первой группе (ранняя стадия онкогенеза и внутривенное введение СКЖТ-Turbo FP635) скопление СКЖТ-Turbo FP635 отмечено у всех животных в области селезенки. Флуоресценция в области селезенки была детектирована на 9 сутки и сохранялась до 14 суток (рис. 4А). В опухолевых тканях этой группы животных данным методом скопления СКЖТ-Turbo FP635 не обнаружено.
Во второй группе животных (ранняя стадия онкогенеза и локальное введение СКЖТ-Turbo FP635) была видна флуоресценция в месте инъекции клеток, которая постепенно затухала и к 3 суткам не визуализировалась совсем.
Локального скопления СКЖТ-Turbo FP635 не выявлено, время наблюдения составило 14 суток (рис. 4Б).
В третьей группе животных (сформированная опухоль и внутривенное введение СКЖТ-Turbo FP635) на 5 сутки было детектировано скопление СКЖТ-Turbo FP635 в области селезенки. Отмечали нарастание флуоресценции в последующие дни (вплоть до 10 суток) аналогично первой группе. Локальных скоплений СКЖТ-Turbo FP635 в опухолевом узле и других нишах выявлено не было.
Рис. 4. Мониторинг миграции СКЖТ-Turbo FP635 методом поверхностного флуоресцентного имиджинга: А - первая группа (ранняя стадия канцерогенеза, системное введение СКЖТ-Turbo FP635). Сплошной линией указано место инъекции опухолевых клеток, пунктирной – место инъекции СКЖТ-Turbo FP635, стрелками – локализация СКЖТTurbo FP635; Б - вторая группа (ранняя стадия канцерогенеза, локальное введение СКЖТTurbo FP635). Квадратом указано место инъекции опухолевых клеток, пунктирной линией – место инъекции СКЖТ-Turbo FP635, пунктирной стрелкой - флуоресценция места инъекции СКЖТ-Turbo FP635.
Мониторинг миграции СКЖТ-Turbo FP635 методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (ЛСМ). Для верификации результатов, полученных методом поверхностного флуоресцентного имиджинга in vivo, был использован метод ЛСМ.
Для получения контрольного спектра белка Turbo FP635 на установке ЛСМ анализировали спектральные характеристики культуры СКЖТ, экспрессирующей этот белок, для дальнейшего сравнения со спектрами тканей исследуемых органов (рис. 5А). Спектр очищенного плазмидного белка имел максимум флуоресценции при 635 нм (Shcherbo et al., 2007), однако спектр клеток, трансфицированных генным вектором этого белка при возбуждении на длине волны 543 нм имел два выраженных пика: на 613 нм и 635 нм (рис. 5Б).
Появление дополнительного пика, вероятно, могло быть связано либо с мутацией белка при культивировании СКЖТ-Turbo FP635, либо с наложением спектров клеточных автофлуорофоров.
В контрольной группе была оценена интенсивность собственной флуоресценции органов и тканей опухоли при возбуждении лазерным излучением с длиной волны 543 нм. Выявлено, что в коже, мышцах, сердце, мозге, легких и кишечнике автофлуоресценция в данной области спектра крайне низкая. В опухолевой ткани также не было обнаружено фоновой флуоресценции.
Вместе с тем, в тканях селезенки, почек и печени автофлуоресценция выражена (рис. 6), но спектральные характеристики тканей отличаются от спектра СКЖТ-Turbo FP635 и не имеют 2-х заметных пиков на 613 нм и 635 нм (рис. 7). Вероятно, это связано с присутствием большого количества эндогенных порфириновых структур, максимум возбуждения которых лежит в районе 400 – 500 нм, а спектр эмиссии имеет два пика – 635 нм и 690 нм.
Наличие СКЖТ-Turbo FP635 в тканях анализировали по визуализации клеточных скоплений с флуоресценцией и спектром, соответствующим флуоресценции Turbo FP635.
В опытных группах, где животным вводили СКЖТ-Turbo FP635, также отмечена выраженная автофлуоресценция тканей селезенки, почек и печени при возбуждении лазерным излучением с длиной волны 543 нм. Учитывая данные in vivo флуоресцентного имиджинга о наличии нарастающей флуоресценции в селезенке у животных с системным введением СКЖТ-Turbo FP635, была предпринята попытка выделить пики на 613 или 635 нм, но автофлуоресцентный сигнал перекрывал флуоресценцию в данной области спектра.
В опытных группах скопления СКЖТ-Turbo FP635 были обнаружены в тканях с низким уровнем автофлуоресценции: опухоль, костный мозг и легкие (рис. 6). Это свидетельствовало о миграции и возможно пролиферации СКЖТTurbo FP635 в этих нишах.
В опухолевых тканях обнаружены небольшие скопления СКЖТ-Turbo FP635 у животных второй группы. У животных других опытных групп таких скоплений не выявлено.
В костном мозге были детектированны яркие скопления СКЖТ-Turbo FP635 у животных второй группы (рис. 6). В костном мозге животных первой и третьей групп наблюдалась только слабая фоновая флуоресценция. В ткани легких животных третьей группы были найдены скопления СКЖТ-Turbo FP635, в остальных случаях отмечалась лишь фоновая флуоресценция (рис. 7).
Таким образом, при исследовании взаимодействия СКЖТ-TurboFP635 с первичной опухолью на иммунодефицитных мышах в ксеногенной модели, in vivo (методом флуоресцентного имиджинга) удалось идентифицировать миграцию СКЖТ-TurboFP635 в селезенку при системном введении, а исследование на субклеточном уровне (методом ЛСМ) выявило миграцию СКЖТ-TurboFP635 в костный мозг, легкие и ткани опухоли реципиента при системном и местном введении (в опухоль).
2. Изучение взаимодействия ММСК-GFP(+) с первичной опухолью в аллогенной модели.
Клеточная культура. ММСК-GFP(+) были выделены и культивированы.
Установлено, что при длительном культивировании происходит «угасание»
первоначально ярко флуоресцирующих клеток, при этом ММСК-GFP(+) к пассажу теряют до 70% первоначальной флуоресценции (рис. 8).
Проточная цитометрия. Костномозговые клетки опытных животных были выделены через 7, 12 и 15 суток после трансплантации. В ходе анализа распределения клеток костного мозга опытных облученных и контрольных необлученных животных по уровню сигнала не было выявлено достоверных различий. Флуоресценция, характерная для ММСК-GFP(+), не была обнаружена ни в одном из случаев (рис. 9). Таким образом, присутствие ММСК-GFP(+) в костном мозге опытных облученных животных не выявлено.
Рис. 8. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. А - флуоресцентное изображение первичной культуры ММСК-GFP(+); Б - флуоресцентное изображение ММСК-GFP(+) 3-го пассажа. Красным выделены ММСК-GFP(+). Возбуждение флуоресценции 488 нм, регистрация 490-600 нм, размер кадра 320х320 мкм. В – спектры флуоресценции первичной культуры ММСК-GFP(+) (фиолетовая кривая) и ММСК-GFP(+) 3-го пассажа (синяя кривая).
Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. Для получения контрольного спектра белка GFP на установке ЛСМ анализировали спектральные характеристики культуры ММСК-GFP(+). Данный спектр использовали для дальнейшего сравнения со спектрами тканей исследуемых органов. Полученный спектр клеток имел ярко выраженный пик на длине волны 506 нм и полностью соответствовал спектру белка GFP(Shagin et al., 2004).
Наличие ММСК-GFP(+) в тканях анализировали по визуализации клеточных скоплений с флуоресценцией и спектром, соответствующим флуоресценции GFP.
У опытных облученных животных после введения ММСК-GFP(+) в тканях легких были обнаружены отдельные ММСК-GFP(+): достаточно часто встречающиеся в поле зрения на 7-й день после инъекции и разрозненные к 12му и 15-му дням эксперимента (рис. 10А). Спектральные характеристики выделенных на рис. 10А областей флуоресценции представлены на рис. 10Б, где присутствие белка GFP характеризуется пиком на длине волны 506 нм.
ММСК-GFP (+) располагались диффузно (по 1-3 в поле зрения), клеточных скоплений обнаружено не было.
В селезенке опытных животных на 7-й день после трансплантации обнаружены небольшие скопления ММСК-GFP (+). К 12-му дню их количество увеличилось. На 15-й день удалось зафиксировать лишь диффузно распределенные остатки экстраклеточного белка GFP (рис. 10А).
В тканях печени на 7-й день после трансплантации скоплений ММСКGFP(+) не выявлено. Локальные скопления ММСК-GFP(+) обнаружены на 12-й день и часто встречались в поле зрения. К 15-му дню отмечено уменьшение их количества (рис. 10А).
В опухолевых тканях скоплений ММСК-GFP(+) на 7-й день после трансплантации обнаружено не было (рис. 10А). Небольшие скопления остатков экстраклеточного белка GFP найдены на 12-й и 15-й дни после трансплантации (рис. 10А).
Интенсивность собственной флуоресценции в тканях контрольных необлученных животных оценивали при тех же условиях и настройках, что и у опытной облученной группы. В тканях легких, селезенки, печени и опухоли была отмечена слабая флуоресценция (рис. 10А), однако ее спектр кардинально отличался от спектра ММСК-GFP(+) (рис. 10Б).
Таким образом, при исследовании взаимодействия ММСК-GFP(+) с первичной опухолью на линейных мышах С57BL6 в аллогенной модели методами ЛСМ и проточной цитометрии установлено, что на сроке до 15-ти дней роста опухоли при системном введении исследуемые ММСК-GFP(+) отсутствуют в тканях индуцированной опухоли и костном мозге, но вместе с тем способны мигрировать в организме реципиента, накапливаясь и активно пролиферируя в потенциальных нишах (селезенка, печень).
Рис. 10. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия тканей органов ex vivo: Афлуоресцентные изображения тканей легких, селезенки, печени, опухолей контрольных и опытных животных на 7, 12 и 15 дни после трансплантации ММСК-GFP(+). Красным выделены места локализации ММСК-GFP(+). Возбуждение флуоресценции 488 нм, регистрация 490-600 нм, размер кадра 320х320 мкм; Б- характеристики флуоресценции тканей органов контрольных и опытных животных на 7, 12 и 15 дни после трансплантации ММСК-GFP(+). Черные кривые соответствуют спектрам флуоресценции тканей органов животных контрольной группы; синие, красные и зеленые кривые – спектрам тканей органов животных после 7, 12 и 15 дней трансплантации ММСК-GFP(+) соответственно.
3. Изучение взаимодействия ММСК-luc2 с первичной опухолью и метастазами в ксеногенных моделях.
Клеточная культура. ММСК были выделены и охарактеризованы.
Показано, что ММСК имеют фенотип мезенхимных СК (экспрессируют CD105, CD90, СD73, CD 44, CD 54, не экспрессируют - CD 34, CD45, HLA-DR). В результате лентивирусной трансфекции создана линия ММСК-luc2, стабильно экспрессирующая данный биолюминесцентный маркер. При добавлении к клеткам субстрата D-люциферина отмечено, что культура сохраняет биолюминесцентные свойства в течение длительного периода времени (рис.
11).
Мониторинг образования метастазов в легких методом флуоресцентного имиджинга. Автофлуоресценцию тканей животных контрольной группы (без введения опухолевых и стволовых клеток) приняли за базовый уровень.
Формирование метастазов в грудной клетке отслеживали по появлению красной флуоресценции.
В группах животных с метастазирующей опухолью (с введением и без введения ММСК-luc2) на разных сроках наблюдали формирование метастазов в области грудной клетки. В группе с ортотопической опухолью красная флуоресценция не выявлена, следовательно, спонтанных метастазов в легких не было.
В группе с метастазирующей опухолью без введения ММСК-luc2 у 3-х животных отмечали появление метастазов по флуоресцентному сигналу на 6-й неделе после введения опухолевых клеток, который сохранялся вплоть до 8-й недели (рис. 12Б). Интенсивность флуоресцентного сигнала значительно превышала уровень базовой флуоресценции и к 8-й неделе наблюдалась у 4-х животных из 5-ти. Однако у одного животного метастазы регистрировались уже на 4-й неделе после введения опухолевых клеток и на 7-й неделе уровень флуоресценции в области грудной клетки был на порядок выше.
В группе с метастазирующей опухолью и введением ММСК-luc2 у трех животных на всем сроке наблюдали базовую флуоресценцию, сопоставимую с уровнем у контрольных животных (рис. 12А). При этом лишь у одного животного из группы отмечали образование метастазов по красной флуоресценции на 6-й неделе, которая сохранялась до 8-й недели после введения опухолевых клеток.
В группе с ортотопической опухолью и ММСК-luc2 у всех животных в течение первых двух недель наблюдали умеренную флуоресценцию в месте инъекции опухолевых клеток. На 13-й день формировались опухолевые узлы и интенсивность флуоресценции нарастала. В течение 8-ми недель объем опухолей и их флуоресценция увеличивались, но спонтанные метастазы в легких не образовались.
При осмотре изолированных органов ex vivo на 8й неделе метастазы по интенсивному флуоресцентному сигналу были обнаружены только в легких животных с метастазирующей опухолью (с введением и без введения ММСКluc2), что подтвердило данные имиджинга in vivo.
При макроскопическом осмотре показано, что у 1-го животного группы с метастазирующей опухолью и введением ММСК-luc2 метастазы не обнаруживались совсем, у 3-х животных наблюдали единичное количество. В группе с метастазирующей опухолью без введения ММСК-luc2 у всех животных наблюдали от 2-х и более метастазов. Метастатические очаги в группе животных с ортотопической опухолью и ММСК-luc2 не выявлены.
При гистологическом анализе срезов легочных тканей животных групп с метастазирующей опухолью (с введением и без введения ММСК-luc2) в зонах флюоресценции были найдены метастазы, что подтвердило данные ex vivo имиджинга. В легочной ткани животных группы с ортотопической опухолью и ММСК-luc2 метастазы выявлены не были.
Мониторинг распределения ММСК-luc2 методом биолюминесцентного имиджинга. В контрольных животных после внутрибрюшинного введения Dлюциферина в процессе всего наблюдения люминесценции обнаружено не было.
Люминесцентный сигнал в области легких и брюшной полости у животных групп с метастазирующей опухолью и введением ММСК-luc2 и с ортотопической опухолью и введением ММСК-luc2 на всем сроке наблюдения свидетельствовал о миграции, накоплении и активной пролиферации ММСКluc2 в соответствующих зонах.
У половины животных группы с метастазирующей опухолью и введением ММСК-luc2 через 5 часов после инъекции наблюдали скопления ММСК-luc2 в области легких. На сроке от 2-х до 4-х недель сигнал в легких увеличивался, при этом также отмечали перераспределение части популяции ММСК-luc2 в область брюшной полости. На сроке от 5-ти до 8-ми недель скопления ММСКluc2 как в области легких, так и в брюшной полости сохранялись лишь у половины животных группы (рис. 13). В группе с ортотопической опухолью и введением ММСК у всех животных сразу после введения наблюдали скопление ММСК-luc2 в области инъекции. На сроке до 4-х недель сигнал в этой области либо снижался, либо пропадал совсем. На 4-й неделе у 3-х животных из 4-х наблюдали перераспределение популяции ММСК-luc2 в область легких и брюшной полости. Однако к 8-й неделе скопления ММСК-luc2 в соответствующих областях либо практически не обнаруживались, либо пропадали.
Оценка биолюминесценции изолированных органов животных обеих групп ex vivo подтвердила наличие скоплений ММСК-luc2 в легких, а также органах брюшной полости: печени и почках.
Иммуногистохимический анализ. Иммуногистохимический анализ был выполнен на срезах легочной ткани с метастазами животных групп с метастазирующей опухолью (с введением и без введения ММСК-luc2). АнтиffLuc+ окрашивание было обнаружено только в тканях легких животных с метастазирующей опухолью и введением ММСК-luc2. ММСК-luc локализовались в области метастазов и легочной ткани, прилегающей к метастатическим очагам, однако это были лишь единичные клетки. Легочная ткань животных с метастазирующей опухолью и без введения ММСК-luc2 была негативна по окрашиванию на ffLuc (рис. 14).
Таким образом, при изучении взаимодействия ММСК-luc2 с первичной опухолью и метастазами, мечеными красным флуоресцентным белком, на иммунодефицитных мышах в ксеногенной модели с использованием двойного (флуоресцентного и биолюминесцентного) имиджинга in vivo определено, что при системном и местном введениях ММСК-luc2 мигрируют в легкие, органы брюшной полости и ткани опухоли. Кроме того, при системном введении ММСК-luc2 оказывают подавляющее действие на формирование метастазов, при введении в область первичной опухоли не влияют на ее рост.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В данной работе мы получили и охарактеризовали стабильные линии СКЖТ-Turbo FP635 ММСК-luc2; ММСК-GFP(+). Были созданы модельные системы, в которые входили реципиент (линейные мыши), прививаемая культура раковых клеток и инъецируемые СК. К моменту нашего исследования существовало большое количество работ, показывающих совершенно противоположные эффекты СК на развитие опухолей, изучение которых в основном проводили традиционными методами, поэтому исследование данного взаимодействия с помощью методов флуоресцентного биоимиджинга для нас оказалось актуальной задачей. Флуоресцентный биоимиджинг позволяет быстро и точно наблюдать миграцию и распределение трансплантированных СК, отслеживать хоминг к опухоли как на уровне целого организма, так и на субклеточном уровне. Мы исследовали взаимодействие СК различного происхождения, несущих в качестве генетических меток различные контрастирующие агенты, с опухолями и метастазами в 3-х различных моделях.В опухолевых тканях скопление СКЖТ-Turbo FP635 в ксеногенной модели было обнаружено только у животных с локальным введением. Мы предположили, что это, вероятно, связано с моделированием взаимодействия СКЖТ-Turbo FP635 с клетками окружающих опухолевых тканей (в частности, с участием в построении кровеносных сосудов опухоли). Однако данное введение СКЖТ-Turbo FP635 существенно на рост опухолей не повлияло. В опухолевых тканях животных в аллогенной модели были обнаружены лишь скопления остатков белка GFP, поэтому мы не могли уверенно говорить о присутствии ММСК-GFP(+) в тканях опухоли. В ксеногенной модели ММСКluc2 были обнаружены в метастатических тканях, однако это были лишь единичные клетки. Важно отметить, что в данной модели мы выявили подавляющее действие ММСК-luc2 на формирование метастазов. Возможно данное действие могло быть связано с подавлением регуляции АktA, NFB и Wnt сигнальных путей стволовыми клетками (Loebinger et al., 2010).
Полученные нами результаты в целом показали, что при исследовании взаимодействия стволовых клеток различного происхождения с опухолями во всех исследуемых нами моделях первичным органом локализации СК при внутривенном введении являлись легкие. Согласно литературным данным, в подобных экспериментальных моделях легкие животных действительно выступают в качестве пункта премиграции, где системно введенные СК накапливаются в первые дни после инъекции, а затем перераспределяются в организме реципиента (Kidd et al., 2009). При исследовании взаимодействия СКЖТ-Turbo FP635 с опухолью в ксеногенной модели мы обнаружили часть популяции СКЖТ-Turbo FP635 и их потомков, которые не покинули ткани легких и на 14-й день эксперимента. В сравнении с первым исследованием, при изучении взаимодействия ММСК-GFP(+) с опухолью в аллогенной модели мы показали, что максимальное количество ММСК-GFP(+) регистрировалось в тканях легких на 7-й день после трансплантации, а затем их количество уменьшалось. При исследовании взаимодействия ММСК-luc2 с метастазами в ксеногенной модели скопления ММСК-luc2 в области легких наблюдали уже через 5 часов после инъекции, а в течение 2-4-х недель скопления ММСК-luc увеличивались, что свидетельствовало об их накоплении и возможно - активной пролиферации. В дальнейшем мы наблюдали перераспределение ММСК-luc2 в организме. Важно отметить, что при локальном введении ММСК-luc2 также мигрировали в легкие и перераспределялись в органы брюшной полости, но позднее - лишь на 4-ой неделе.
Полученные нами результаты подтвердили известные ранее данные о селезенке как о нише для СК при системном введении. Во всех 3-х моделях мы наблюдали миграцию стволовых клеток различного происхождения в селезенку на разных сроках: от 7-ми дней до 2-х недель. Причем в аллогенной модели были выявлены особенности распределения ММСК-GFP(+) в тканях селезенки.
Донорские СК нами также были обнаружены в печени животных, что согласуется с результатами, полученными другими авторами (Wolf et al., 2005).
В аллогенной модели максимальное количество донорских ММСК-GFP(+) в печени было детектировано на 12 день, а в ксеногенной модели ММСК-luc обнаруживали и на 8-й неделе после введения СК. Присутствие СКЖТ-Turbo FP635 в печени в ксеногенной модели выявлено не было, что вероятно связано с выраженной автофлуоресценцией тканей.
В костном мозге при системном введении СК обнаружены нами не были.
Вероятно, в аллогенной модели отсутствие ММСК-GFP(+) в костном мозге опытных животных связано с достаточно ранними сроками наблюдения (до дней), на которых восстановление костного мозга уже началось, но активная пролиферация клеток еще не наступила. Неожиданным результатом работы оказалось то, что в костном мозге животных с локальным введением в аллогенной модели были обнаружены СКЖТ-Turbo FP635. Возможно, это произошло из-за перераспределения введенных СКЖТ-Turbo FP635 (в опухоль на мышце бедра) и миграции их через системный кровоток в костный мозг.
ВЫВОДЫ
1. Выделены, охарактеризованы и получены стабильные линии СКЖТTurbo FP635 и ММСК-luc2; выделены и охарактеризованы ММСК-GFP(+).Показано, что СКЖТ и ММСК экспрессируют спектр маркеров, характерных для мезенхимных СК (CD105, CD90, СD73, CD 44, CD 54) и не экспрессируют маркеры кроветворных клеток (CD 34, CD45, HLA-DR).
2. При исследовании взаимодействия СКЖТ-TurboFP635 с первичной опухолью в ксеногенной модели in vivo (методом флуоресцентного имиджинга) идентифицирована миграция СКЖТ-TurboFP635 в селезенку при системном введении, а исследование на субклеточном уровне (методом ЛСМ) выявило миграцию СКЖТ-TurboFP635 в костный мозг, легкие и ткани опухоли реципиента при системном и местном введении (в опухоль).
3. При исследовании взаимодействия ММСК-GFP(+) с первичной опухолью в аллогенной модели методами ЛСМ и проточной цитометрии установлено, что при системном введении исследуемые ММСК-GFP(+) отсутствуют в тканях индуцированной опухоли и костном мозге, но вместе с тем способны мигрировать в организме реципиента, накапливаясь в потенциальных нишах (селезенка, печень).
4. При исследовании взаимодействия ММСК-luc2 с первичной опухолью и метастазами, мечеными красным флуоресцентным белком, в ксеногенной модели с использованием двойного флуоресцентного и биолюминесцентного имиджинга in vivo определено, что при системном и местном введениях ММСК-luc2 мигрируют в легкие, органы брюшной полости и ткани опухоли.
Кроме того, при системном введении ММСК-luc2 оказывают подавляющее действие на формирование метастазов, при введении в область первичной опухоли не влияют на ее рост.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи:Мелешина А.В., Черкасова Е.И., Сергеева Е.А., Клешнин М.С., Турчин И.В., Киселева Е.В., Дашинимаев Э.Б., Ширманова М.В., Лукьянов С.А., Загайнова Е.В. (2012). Исследование взаимодействия мезенхимных стволовых клеток и опухоли методами флуоресцентного биоимиджинга. Современные технологии в медицине, 4, 7-16.
Мелешина А.В., Черкасова Е.И., Сергеева Е.А., Ширманова М.В., Балалаева И.В., Киселева Е.В., Загайнова Е.В. (2013). Исследование миграции трансплантированных мультипотентных мезенхимных стромальных клеток в организме опухоленосотеля. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, VIII(2), 56-63.
Клементьева Н.В., Ширманова М.В., Серебровская Е.О., Фрадков А.Ф., Мелешина А.В., Снопова Л.Б., Проданец Н.Н., Лукьянов С.А., Загайнова Е.В.
(2013). Биолюминесцентный имиджинг опухолевых клеток in vivo с применением оптимизированной люциферазы светляка LUC2. Современные технологии в медицине, 5(3), 6-15.
4. Meleshina A.V., Cherkasova E.I., Sergeeva E., Turchin I.V., Kiseleva E.V., Dashinimaev E.B., Shirmanova M.V., Zagaynova E.V. Tumor-stem cells interactions by fluorescence imaging. Proc. SPIE, Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues, 2013, Vol. 8587, 8587- 1S - (8P).
Тезисы конференций:
Мелешина А.В., Черкасова Е.И., Сергеева Е.А., Киселева Е.В., Дашинимаев Э.Б. Изучение взаимодействия мезенхимных стволовых клеток меченых Turbo FP635 и модели экспериментальной опухоли методами флуоресцентной микроскопии и in vivo имиджинга. XIX Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых: Секция «Биология»;
Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова, биологический факультет: Тезисы докладов, изд-во М.:МАКС Пресс, 2012, 303.
Мелешина А.В., Черкасова Е.И., Сергеева Е.А., Киселева Е.В., Дашинимаев Э.Б., Загайнова Е.В. Флуоресцентный биоимиджинг и конфокальная лазерная сканирующая микроскопия в изучении взаимодействия опухоли и меченых стволовых клеток. Биология — наука XXI века: 16-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых: Сборник тезисов, 2012, 428-429.
Мелешина А.В., Черкасова Е.И., Сергеева Е.А., Киселева Е.В., Дашинимаев Э.Б., Ширманова М.В., Загайнова Е.В. Исследование взаимодействия опухоли и стволовых клеток с использованием генетического маркирования и флуоресцентного биоимиджинга. Российский биотерапевтический журнал, 2012, 2(11), 34.
Мелешина А.В., Черкасова Е.И., Сергеева Е.А., Киселева Е.В., Дашинимаев Э.Б., Ширманова М.В., Загайнова Е.В. Исследование модели «опухоль-стволовая клетка» методами флуоресцентного биоимиджинга и лазерной сканирующей микроскопии. V Троицкая конференция «Медицинская физика и инновации в медицине», Сборник материалов, 2012, 2, 188-190.
Мелешина А.В., Черкасова Е.И., Сергеева Е.А., Клешнин М.С., Турчин И.В., Киселева Е.В., Дашинимаев Э.Б., Ширманова М.В., Загайнова Е.В.
Возможность использования оптических флуоресцентных методов для изучения модели «Опухоль-стволовая клетка». IV Съезд биофизиков России, Симпозиум III «Физика – медицине и экологии», Материалы докладов, 2012, 1597.
6. Cherkasova E., Meleshina A., Shirmanova M., Sergeeva E., Kiseleva E., Dashinimaev E., Zagaynova E. Tumor-mesenchimal stem cells interaction investigation by fluorescence bioimaging. 4th International Confress on Stem Cells and Tissue Formation, 2012, 1508.
7. Meleshina A., Cherkasova E., Sergeeva E., Turchin I., Kiseleva E., Dashinimaev E., Shirmanova M., Zagainova E. Fluorescent bioimaging in the study of the different models ‘stem cells-tumor’ interaction. 38th FEBS congress, The FEBS Journal, 2013, 280, 446.
8. Meleshina A.V., Cherkasova E.I., Sergeeva E.A., Kiseleva E.V., Dashinimaev E.B., Shirmanova M.V., Zagaynova E.V. Fluorescent imaging modalities for mesenchymal stem cell-tumor tropism. IV International Symposium «Topical problems of biophotonics -2013», 2013, 331-332.
Мелешина А.В., Черкасова Е.И., Ширманова М.В., Клементьева Н.В., Киселева Е.В., Загайнова Е.В. Исследование влияния мезенхимных стволовых клеток на формирование метастазов опухоли с использованием люминесцентного имиджинга. Стволовые клетки и регенеративная медицина: V Всероссийская научно-практическая конференция: Сборник тезисов, изд-во М.:МАКС Пресс, 2013, 48.
10. Мелешина А.В., Черкасова Е.И., Ширманова М.В., Сергеева Е.А., Турчин И.В., Киселева Е.В., Дашинимаев Э.Б., Загайнова Е.В. Изучение миграционной активности стволовых клеток в различных моделях патогенеза опухоли. Форум молодых учёных. Тезисы докладов. Том 1.–Нижний Новгород:
Изд–во ННГУ им. Н.И. Лобачевского, 2013, 28-30.
«