Государственное учреждение

Гематологический научный центр РАМН

На правах рукописи

АЛЬ-РАДИ ЛЮБОВЬ САТТАРОВНА

ВОЛОСАТОКЛЕТОЧНЫЙ ЛЕЙКОЗ:

ОСОБЕННОСТИ ТЕЧЕНИЯ,

СОВРЕМЕННАЯ ТАКТИКА ТЕРАПИИ

14.00.29 – гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва, 2007г

Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор А.В.Пивник

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Е.А.Лукина доктор медицинских наук, профессор Н.Е.Андреева Ведущее научное учреждение:

Московский Научно-Исследовательский Онкологический институт им.

П.А.Герцена Министерства Здравоохранения Российской федерации

Защита состоится «»_2008г в_час.

на заседании диссертационного совета Д 001.042.01 в Гематологическом научном центре РАМН по адресу: 125167, Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Гематологического научного центра РАМН

Автореферат разослан «_»_2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук старший научный сотрудник Е.Е.Зыбунова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Волосатоклеточный лейкоз (ВКЛ) - хроническое лимфопролиферативное заболевание, выделенное из хронического лимфолейкоза в 1958г в связи со своеобразием морфологии, клинического течения и тактики лечения. ВКЛ характеризуется специфической лимфоидной инфильтрацией костного мозга и селезенки, проявляется цитопенией и спленомегалией. Особенностью заболевания является присутствие характерных лимфоидных клеток с «ворсинчатой» морфологией и особым иммунофенотипом.

Несмотря на относительную редкость (1 случай на 150 000 населения в год), пациенты с ВКЛ регулярно встречаются в практике гематолога, причем в последние годы это заболевание все чаще диагностируется не только у лиц старшего возраста, но и у больных в возрасте моложе 40 лет. Довольно часто (по нашим наблюдениям примерно в 25% случаев) заболевание протекает без лейкопении – так называемая «вариантная форма ВКЛ», что диктует необходимость проведения тщательной дифференциальной диагностики со сходными лимфопролиферативными заболеваниями. Естественное течение болезни варьирует от доброкачественного, с медленным нарастанием проявлений заболевания в течение многих лет, до быстрого прогрессирования с появлением симптомной цитопении, приводящей к гибели больных, в первую очередь от инфекционных, а также от геморрагических и анемических осложнений. Средняя продолжительность жизни больных ВКЛ без адекватного лечения составляет примерно лет. Попытки моно- и полихимиотерапии ВКЛ различными цитостатиками были неэффективны, стероиды лишь усугубляли частоту и тяжесть инфекционных осложнений, и до 80х годов единственным методом лечения являлась спленэктомия, ликвидирующая цитопению у небольшого количества больных на длительный срок, но у основной массы больных - ненадолго, с неизбежной фатальной прогрессией заболевания. Прогресс в лечении ВКЛ с 1984г связан с применением -интерферона (-Иф), позволившего получать в 10 % случаев полные, а в 70 % случаев - частичные ремиссии, что существенно улучшило течение и прогноз ВКЛ. Однако лечение -Иф должно быть длительным - 12 мес и более, а прекращение лечения у большинства больных с полной ремиссией и у всех больных с частичной ремиссией ведет к рецидиву заболевания, требующего дальнейшей, зачастую пожизненной, терапии -Иф. Появление новой группы лекарственных средств - аналогов пурина 2-дезоксикоформицина (DCF, пентостатин) и 2-хлордезоксиаденозина (2-CdA, кладрибин) значительно улучшило результаты лечения ВКЛ и кардинально изменило течение заболевания, вернув к полноценной жизни ранее неизлечимых больных. DCF (пентостатин) начали применять в лечении больных ВКЛ с 1984г, что привело к достижению 60 % полных и 25 % частичных ремиссий, в том числе и у больных с неэффективностью иной терапии. Однако с учетом токсичности пентостатина (нейротоксичность, нефротоксичность, гепатотоксичность, развитие тяжелых инфекционных осложнений), а также в связи с меньшей эффективностью по сравнению с 2-СdA, с 90х годов именно кладрибин стал препаратом выбора при лечении ВКЛ. Это лечение стало наиболее эффективно: частота полных ремиссий составила 85 %, частичных ремиссий – 12 %. Тем не менее, даже в полной клинико-гематологической ремиссии можно выявить минимальный клон опухолевых клеток в костном мозге, и у 25-40 % больных при последующем наблюдении регистрируется рецидив заболевания. В то же время кладрибин, не обладая в терапевтических дозах нейро-, нефро- и гепатотоксичностью, имеет гематологическую токсичность, проявляющуюся в основном глубокой и длительной нейтропенией, чреватую риском развития тяжелых, подчас фатальных инфекционных осложнений.

Отсутствие, в связи с относительной редкостью заболевания, длительных наблюдений за достаточно большой группой больных ВКЛ, оставляет до настоящего времени нерешенным вопрос об оптимальной тактике терапии и последовательности ее отдельных этапов для получения стойкого длительного эффекта с минимизацией побочных действий. Опыт большинства центров в стране ограничен немногочисленными случаями наблюдений без единого протокола обследования и лечения. Решение данной проблемы требует многолетнего отбора больных ВКЛ и наблюдения за ними.

Все это послужило причиной начать собственную работу по отбору больных ВКЛ в нашем центре с проведением полноценного диагностического исследования, оценкой эффективности лечения и наблюдением в динамике в течение длительного периода.

Цель исследования. Охарактеризовать представительную группу больных ВКЛ и разработать оптимальный протокол лечения.

Задачи исследования.

1. Сравнить клинические и лабораторно-диагностические особенности типичной и вариантной форм ВКЛ 2. Сопоставить клинико-диагностические параметры ВКЛ в зависимости от возраста дебюта заболевания.

3. Сравнить эффективность спленэктомии, терапии -Иф, кладрибином и их сочетаний при разных формах ВКЛ и выделить группу повышенного риска развития рецидива заболевания.

4. Оценить осложнения лечения и разработать возможную профилактику 5. Предложить оптимальный протокол лечения ВКЛ.

Научная новизна.

В работе собран большой клинический материал редкого лимфопролиферативного заболевания – ВКЛ. Дана сравнительная оценка клинических и иммунофенотипических особенностей типичной и вариантной форм заболевания в старшей и молодой возрастных группах. Оценена эффективность разных методов лечения (спленэктомия, -Иф, кладрибин). На основании полученных данных показано, что оптимальной тактикой лечения ВКЛ является последовательное применение -Иф и кладрибина. Показано, что дебют заболевания в молодом возрасте является фактором риска развития рецидива, в том числе раннего, при применении стандартного протокола лечения.

Практическая ценность.

В работе на большом материале проведено сравнение клинических и лабораторнодиагностических особенностей типичной и вариантной форм ВКЛ. Дан алгоритм диагностики и лечения ВКЛ. Продемонстрированы преимущества тактики лечения ВКЛ с последовательным применением -Иф и 2-CdA. Выявлена группа риска рецидива ВКЛ.

Положения, выносимые на защиту.

1. Типичная и вариантная формы ВКЛ отличаются друг от друга по соотношению пола и возраста заболевших, степени выраженности спленомегалии, наличию лимфоаденопатии, обнаружению дополнительных иммунофенотипических маркеров и частоте сопутствующей моноклональной секреции.

2. ВКЛ выявляется в молодом возрасте (моложе 40 лет) в четверти случаев заболевания, отличается большей частотой встречаемости вариантной формы, лимфоаденопатии и выраженной спленомегалии, особенностями иммунофенотипа, а также частотой и тяжестью инфекционных осложнений течения болезни.

3. Эффективность спленэктомии, терапии -Иф и кладрибином при разных формах волосатоклеточного лейкоза сопоставима. Дебют ВКЛ в молодом возрасте является фактором повышенного риска рецидива заболевания.

4. Основное осложнение применения кладрибина– длительная миелотоксическая супрессия. Предварительное назначение -Иф позволяет избежать этого осложнения.

5. Максимально безопасной и эффективной терапией всех форм ВКЛ является последовательное применение -Иф и кладрибина. У больных ВКЛ молодого возраста необходимо присоединение терапии поддержания ремиссии.

Апробация работы. Диссертация апробирована на заседании проблемной комиссии ГНЦ РАМН «Опухоли лимфатической системы, патология красной крови и порфирии»

(ноябрь 2007г). Основные положения работы доложены на Международном симпозиуме «Человек и лекарство» (Москва, 2004г.), XII международной специализированной выставке «Аптека-2005» (Москва), Гематологическом декаднике (Москва, 2005, 2007гг), Съезде гематологов (Москва, 2006г).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 183 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, двух глав результатов собственного исследования, заключения, выводов, списка литературы, включающего 303 источника, и приложения. Работа иллюстрирована 34 таблицами, 14 рисунками, 14 диаграммами и 1 схемой.

Диссертация выполнена в отделении химиотерапии гематологических заболеваний и интенсивной терапии (оХГЗиИТ) (руководитель в 1990-2002гг – д.м.н., проф.

А.В.Пивник, руководитель с 2002г - к.м.н. С.К.Кравченко, заведующая – заслуженный врач РФ А.М.Кременецкая). Все исследования проводились в лабораторнодиагностических подразделениях ГНЦ РАМН (директор – академик РАМН и РАН А.И.Воробьев). Морфологическое исследование крови и костного мозга проводилось в клинической лаборатории (руководитель – Л.Ю.Тихонова) и патолого-анатомической лаборатории (руководитель – член-корр. РАМН Г.А.Франк), цитохимическое исследование лимфоцитов на содержание тартрат-устойчивой кислой фосфатазы проводилось в лаборатории гемоцитологии (руководитель – проф. Г.И.Козинец), иммунофенотипическое исследование лимфоцитов проводилось в лаборатории клинической иммунологии (руководитель – профессор, д.м.н. Т.И.Булычева) и в лаборатории функциональной морфологии гемобластозов (руководитель – д.б.н.

И.А.Воробьев), иммунохимическое исследование сыворотки крови и мочи проводилось в цитогенетическое исследование лимфоцитов крови и костного мозга проводилось в лаборатории цитогенетических исследований (руководитель – д.м.н. Е.В. Домрачева). В ведении отдельных больных участвовали сотрудники других подразделений ГНЦ РАМН – поликлинического отделения (руководитель д.м.н., проф. Л.Г.Ковалева), стационара дневного пребывания больных (руководитель – к.м.н. Н.Н.Цыба), отделения химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга (руководитель – членкорр. РАМН проф. В.Г.Савченко), отделения химиотерапии лейкозов и патологии эритрона (руководитель – д.м.н., проф. Н.Д.Хорошко), отделения хирургии (руководитель – д.м.н. С.Р.Карагюлян). Статистическая обработка проведена руководителем отдела компьютеризации ГНЦ РАМН Б.В.Зингераманом. Всем сотрудникам этих отделений и лабораторий автор искренне признательна.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика больных.

В исследование включено 160 больных ВКЛ, наблюдавшихся нами в период с по 2007гг. Среди больных было 103 мужчин и 57 женщин. Медиана возраста составила лет (27 – 81). Возраст 41 больного на момент установления диагноза ВКЛ был меньше лет. Длительность заболевания у больных в нашем исследовании составила от 1 года до лет (медиана – 5,5 лет).

Диагноз ВКЛ устанавливали на основании следующих критериев:

лимфоцитоз в периферической крови и костном мозге с наличием «ворсинчатых»

лимфоидных клеток (ВК), положительный тест ВК на тартрат-устойчивую кислую фосфатазу (TRAP), характерный фенотип ВК при иммунофенотипировании крови/костного мозга (CD20+, CD22+, CD11c+, CD25+, CD103+, FMC7+, анти-ВКЛ+) или при иммуногистохимическом исследовании трепанобиоптата (CD20+, DBA.44+, CD5-, CD10-), характерная гистологическая картина костного мозга (и, в случае спленэктомии, селезенки).

Согласно общепризнанным критериям, при выявлении лейкопении (лейкоциты 10х109/л) количества лейкоцитов форма ВКЛ считалась вариантной.

Минимальный срок наблюдения составил 1 год, максимальный – 12 лет, медиана наблюдения – 6 лет.

Больные были разделены на две группы в зависимости от формы ВКЛ: пациентов были с типичной формой ВКЛ, 42 пациента - с вариантной формой ВКЛ.

Кроме этого, была выделена для отдельного анализа группа больных ВКЛ с возрастом дебюта заболевания 40 лет. В каждой из выделенных групп больных оценивали клинические особенности течения заболевания, данные лабораторных исследований, эпидемиологические данные по полу и возрасту, по частоте выявления типичного и абберантного иммунофенотипа. Проведен сравнительный анализ эффективности различных вариантов хирургического (спленэктомия) и консервативного (-Иф, кладрибин) лечения во всех группах. Охарактеризован спектр и тяжесть осложнений проводимого лечения. Проанализированы редкие случаи заболевания: ВКЛ с секрецией парапротеина, с выраженной лимфоаденопатией, с хроническим лимфолейкозом, с Тклеточной клональностью. Приведены данные о встречаемости вторых опухолей у включенных в исследование больных ВКЛ. Проведен анализ рецидивов заболевания за 12-летний период и результаты их лечения.

Методы исследования.

Больным было проведено обследование согласно предложенному протоколу:

1. опрос и осмотр больного (оценка размеров и консистенции периферических лимфоузлов, печени и селезенки, наличия геморрагий и воспалительных инфильтратов на коже и слизистых, функции дыхания и кровообращения).

2. рутинные лабораторные исследования:

- клинический анализ крови с оценкой морфологии лимфоцитов - клинический анализ мочи;

- исследование на гепатиты, ВИЧ, сифилис;

- группа крови, резус-фактор;

- электрокардиография;

- рентгенография грудной клетки;

- ультразвуковое исследование органов брюшной полости и забрюшинного пространства;

3. специальные диагностические исследования:

- иммунохимический анализ сыворотки крови и мочи;

- трепанобиопсия и миелограмма (с оценкой морфологии лимфоцитов, характера лимфоидной инфильтрации, наличия фиброза, иммуногистохимическим исследованием на общие Т- и В-клеточные маркеры, DBA.44, CD25, CD11c );

- определение тартрат-устойчивой кислой фосфатазы в лимфоцитах крови (лейкоконцентрат) или костного мозга;

- иммунофенотипирование лимфоцитов крови (или костного мозга, селезенки) с определением общих Т- и В-клеточных маркеров, дифференциальнодиагностических CD5, CD10, CD23 и специфических для ВКЛ анти-ВКЛ, FMC7, CD 11c, CD25, CD103;

- кариологическое исследование костного мозга с анализом кариотипа и исследованием 5, 12 хромосом (FISH);

- при наличии экстранодальных очагов поражения (инфильтрация кожи, легкого, поражение костей и т.п.) – биопсия с морфологическим и фенотипическим анализом.

У 75 больных (45 с типичной и 30 с вариантной формами ВКЛ, в том числе 24 молодого возраста) проанализированы результаты иммунофенофенотипирования лимфоцитов крови/костного мозга. Во всех включенных в анализ случаях определялись общие В-клеточные маркеры CD19, CD20, CD22, клональность В-лимфоцитов по легким цепям Ig каппа (k) и лямбда (), специфические для ВКЛ антигены CD103, анти-ВКЛ, CD85, НС2, активационные антигены CD11c, CD25, CD38 и прочие дифференциальнодиагностические антигены - FMC7, CD10, CD23, CD5 при помощи методики непрямого иммунофлюорисцентного маркирования мембранных антигенов: концентрацию опухолевых клеток в суспензии доводили до 4-5 млн./мл. По 100 мкл суспензии опухолевых клеток в данной концентрации вносили в 96-луночные круглодонные плашки.

Клетки осаждали путем центрифугирования 300g – 5 мин. После удаления надосадочной жидкости, согласно выбранной панели антител, в каждую лунку вносили по 20 мкл немеченых мышиных моноклональных антител в заранее отработанном рабочем разведении в PBS с 1 % добавкой бычьего сывороточного альбумина (БСА) для блокирования неспецифического связывания антител. В контрольные лунки вместо вместо моноклональных антител вносили 20 мкл среды : 0,01М PBS pH 7,4 – 100мл, БСА – 1г (1 %), прогретая эмбриональная телячья сыворотка – 2% (v/v), NaN3 до 0,1 %.

Инкубировали 30 мин при t+4о. Далее, после 2-кратной отмывки холодным PBS, наносили F(ab)2-фрагменты поликлональных козьих антител против мышиных иммуноглобулинов, коньюгированных с флюоресцин-изотиоцианатом (FITC), в в подобранном рабочем разведении. Инкубировали 30 мин при t+4о с последующей 3-кратной отмывкой. 8луночные предметные стекла (Flow, Великобритания) покрывали 15-20мкл раствора Lполилизина 25 мкг/мл на физ. растворе (Sigma, США), для чего их инкубировали во влажной камере в течение 30 мин., перед нанесением клеточной суспензии стекла промывали PBS. После последней отмывки клетки ресуспендировали в 50 мкл PBS, 25 мкл полученной суспензии наносили на предметные стекла. Клетки осаждались на стекле в результате 30-минутной инкубации во влажной камере. Излишки раствора удаляли, клетки заключали в забуференный фосфатным буфером 1:1 глицерин, предметное стекло герметично закрывали покровным. Результаты анализировали путем флюоресцентной и фазово-контрастной микроскопии (микроскоп «Axiophot» фирмы «Opton», Германия).

Кроме количественного определения числа позитивных клеток (%) оценивалась степень экспрессии антигенов по интенсивности флюоресценции. Интенсивность свечения нормальных В-лимфоцитов из крови донора принималась за умеренную (+).

Соответственно этой точке отсчета отмечалось отсутствие свечения (-), слабое (±) или сильное свечение (++).

У 72 больных (54 с типичной и 18 с вариантной формами ВКЛ, в том числе 17 – молодого возраста) были проанализированы результаты иммунохимического исследования сыворотки крови и суточной мочи.

Содержание в сыворотке IgA, IgG, IgM, легких цепей каппа и лямбда определяли методом радиальной иммунодиффузии в геле агарозы. Для выявления секреции моноклонального иммуноглобулина исследовали образцы сыворотки и концентрированной мочи методом электрофореза в геле агарозы и иммунофиксации.

Уровень ЦИК определяли методом осаждения в ПЭГ-6000.

Методы лечения.

Показаниями к началу терапии считали:

- выраженную или нарастающую цитопению (гематокрит < 25 %, тромбоциты < 50х109/л, нейтрофилы < 0,5х109/л);

- симптомную или массивную спленомегалию (> 20х6см);

- присоединение инфекционных осложнений.

При наличии тяжелой симптомной тромбоцитопении выполняли спленэктомию с последующим наблюдением и, при отсутствии ремиссии, проведением консервативного лечения.

У 30 больных была выполнена спленэктомия, у 148 больных была проведена терапия -Иф, у 120 больных был применен курс химиотерапии кладрибином. Результаты лечения оценивали у всех больных после спленэктомии, у 139 больных после терапии -Иф и у 114 больных после химиотерапии кладрибином.

На основании анализа осложнений терапии кладрибином нами был предложен следующий двухэтапный протокол лечения для больных с ВКЛ:

1 этап - -интерферон по 3 млн ед х 3 р/нед подкожно 3-4 мес.

2 этап - кладрибин 0,1мг/кг/сут 7 дней подряд в/в капельно двухчасовыми инфузиями на 500мл физиологического раствора.

Данную схему терапии применили у 98 больных ВКЛ.

Критерии эффективности лечения были общепринятые:

полная ремиссия - нормализация размеров селезенки и лимфоузлов, отсутствие в крови «волосатых клеток», < 5 % «ВК» в костном мозге, Нв 120г/л, нейтрофилы >1,5х109/л, тромбоциты >100х109/л;

частичная ремиссия - уменьшение размеров селезенки и лимфоузлов >50 %, в крови < 5 % «ВК», уменьшение «ВК» в костном мозге > 50%, Нв 120г/л, нейтрофилы >1,5х109/л, тромбоциты >100х109/л.

улучшение - нормализация одного из параметров без ухудшения других.

Статистический анализ.

Статистический анализ полученных результатов проводился с помощью программы Statistica и MS Excel при участии отдела компьютеризации ГНЦ РАМН (руководитель Б.В.Зингерман) методами описательной статистики и анализа выживаемости. В работе использовались кривые выживания типа «общая выживаемость»:

время от начала лечения до смерти или последнего сообщения о больном (цензурирование), и «безрецидивная выживаемость»: время от начала ремиссии до наступления рецидива или последнего сообщения о больном (цензурирование).

Использован метод построения кривых Каплан-Маера. Достоверность рассчитывали по тестам Wilcoxon-Gehan, Mantel-Haenszel (обобщенный Хи-квадрат), Logrank, показатели