На правах рукописи

Беланова Наталья Анатольевна

СОРБЦИОННО-ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ И

КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ ФЛАВОНОИДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

НАНОСТРУКТУРИРОВАННЫХ МАТЕРИАЛОВ

02.00.02 – аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Воронеж – 2013

Работа выполнена в Воронежском государственном университете

Научный руководитель доктор химических наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ Селеменев Владимир Федорович

Научный консультант кандидат химических наук, доцент Карпов Сергей Иванович

Официальные оппоненты Сумина Елена Германовна, доктор химических наук, профессор ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет», профессор Шапошник Алексей Владимирович, доктор химических наук, доцент ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный аграрный университет им. К.Д. Глинки», заведующий кафедрой химии

Ведущая организация: Учреждение Российской Академии Наук Институт геохимии и аналитической химии им. В.И. Вернадского, ГЕОХИ РАН

Защита состоится «13» марта 2013 года в 14-00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.19 при Воронежском государственном университете, расположенном по адресу: 394006, г. Воронеж, Университетская пл., 1, ауд. 439.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Воронежского государственного университета.

Автореферат разослан 11 февраля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, Крысин М.Ю.

доктор химических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

Определение флавоноидов в растительном материале является непростой задачей в связи с их многообразием, а также присутствием большого количества сопутствующих компонентов. Интерес к данной группе веществ обусловлен в первую очередь их высокой антиоксидантной активностью. При извлечении из растительного сырья и биологических жидкостей человека выбор способов определения и концентрирования флавоноидов является весьма актуальным. На этапе пробоподготовки для данной цели наиболее перспективно использование сорбционно-хроматографических методов, что позволяет сократить число стадий, а также расход токсичных растворителей. При выделении и определении флавоноидов часто используют силикагель и композиты на его основе (например, силикагель с привитыми октадецильными группами С18), целлюлозу и полиамид, которые имеют хаотичное расположение пор с широким распределением их по размеру. Такая структура материалов часто обуславливает значительные диффузионные затруднения и размывание сорбционных зон хроматографируемых веществ.

В конце прошлого века впервые был синтезирован высокоупорядоченный наноструктурированный мезопористый материал МСМ-41. По своей химической природе он идентичен силикагелю, но имеет большие значения удельной площади поверхности (более 1000 м2/г), узкое распределение пор по размерам (2-10 нм) гексагональной структуры, что позволяет использовать его в качестве сорбента. МСМ-41, а также модифицированные органосиланами композиты на его основе могут быть использованы в качестве альтернативы силикагелю и другим сорбентам в хроматографических процессах и для сорбционного концентрирования и выделения полифенольных веществ.

Повышение селективности мезопористых сорбентов, увеличение эффективности разделения флавоноидов может быть достигнуто путем создания высокоселективных материалов на основе систем, «структурно ориентируемых», на целевой сорбат. Сведения о применении мезопористых материалов МСМ-41, модифицированных органосиланами и синтезированных в присутствии полифенольных веществ, для определения и концентрирования кверцетина и (+)-катехина в литературе отсутствуют. Поэтому разработка новых способов концентрирования и разделения флавоноидов с использованием выше описанных сорбентов является перспективной в области аналитической химии.

Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» на 2009 - 2013 годы GrantСоглашение № 14.B37.21. Целью данной диссертационной работы является установление физикохимических закономерностей разделения и концентрирования флавоноидов с использованием силикагеля и высокоупорядоченных мезопористых материалов, а также разработка способов их практической реализации.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- разработать способ модификации органосиланами высокоупорядоченного материала МСМ-41, позволяющий регулировать структуру, гидрофобность, сорбционные свойства композитов по отношению к флавоноидам;

- установить влияние добавки флавоноидов при синтезе мезопористых материалов на их поверхностные свойства, структуру, гидрофобность и сорбционную способность по отношению к полифенольным веществам;

- установить зависимость эффективности разделения близких по физикохимическим свойствам полифенольных веществ от структуры, упорядоченности, гидрофобности мезопористых сорбентов;

- разработать способы количественного определения кверцетина и (+)-катехина при их совместном присутствии с использованием тонкослойной (ТСХ) и жидкостной хроматографии, твердофазной экстракции (ТФЭ), УФ-спектрофотометрии.

Научная новизна.

Показано влияние состава подвижной фазы (с учетом полярности системы), структуры и физико-химических свойств неподвижной фазы на разделение полифенольных веществ, относящихся к различным подгруппам флавоноидов, методом ТСХ.

Установлено влияние модификации мезопористых сорбентов МСМ-41, поверхностной плотности силанольных групп на сродство материала к разделяемым флавоноидам с учетом полярности подвижной фазы.

Методами низкотемпературной адсорбции/десорбции азота, просвечивающей электронной микроскопии, рентгеноструктурного анализа изучена возможность образования высокоупорядоченной гексагональной структуры, ее изменения при силилировании и синтезе материалов с молекулярными отпечатками флавоноидов. На основе данных термогравиметрии, ИК-спектроскопии, конкурентной адсорбции воды и толуола показано влияние условий синтеза и модификации на поверхностную плотность силанольных групп и гидрофобность материалов. Синтезированные сорбенты обладают большим сродством по отношению к флавоноидам по сравнению с немодифицированным силикагелем и мезопористым материалом МСМ-41.

Показано, что снижение поверхностной плотности силанольных групп и гидрофобности мезопористого материала увеличивают степень извлечения и концентрирования флавоноидов. При синтезе высокоупорядоченных материалов с молекулярными отпечатками флавоноидов удается добиться подавления каталитической активности сорбента по отношению к кверцетину и (+)-катехину по сравнению с силикагелем и исходным МСМ-41.

Предложен способ разделения и концентрирования кверцетина и (+)-катехина хроматографирования с использованием силилированных материалов и мезопористых сорбентов с молекулярными отпечатками флавоноидов.

Практическая значимость. Представленные в работе результаты позволяют расширить перечень материалов для селективного сорбционного концентрирования флавоноидов. Разработаны способы силилирования МСМ- и получения мезопористых материалов, «структурно настраиваемых», на целевой сорбат. Представлен способ хроматографического разделения и определения кверцетина и (+)-катехина, включающий в себя сорбционное концентрирование в колонке, заполненной мезопористыми материалами, с последующим спектральным или хроматографическим определением веществ.

Разработан способ спектрофотометрического определения флавоноидов в многокомпонентных растворах по методу Фирордта. Разработан способ хроматографического определения в тонком слое сорбента полифенолов, относящихся к различным подгруппам органических веществ: гликозидов (рутина и нарингина) и агликонов флавоноидов (кверцетина, (+)-катехина) – в их многокомпонентной смеси.

Новизна способа получения материалов с молекулярными отпечатками кверцетина и (+)-катехина и способа разделения флавоноидов подтверждена заявкой на патент № 2012118008 от 5.05.2012.

На защиту выносятся следующие положения:

- дифференцирующее влияние органического модификатора подвижной фазы на степень протонирования фенольных групп в условиях тонкослойной хроматографии на силикагеле и полиамиде приводит к увеличению хроматографического разрешения и селективности разделения гликозидов и агликонов флавоноидов;

- способы синтеза и модификации мезопористых высокоупорядоченных материалов, основанные на формировании и сохранении гексагональной наноструктуры силикатной матрицы в присутствии поверхностно активного вещества с добавками кверцетина и (+)-катехина;

- сорбционная емкость высокоупорядоченного материала МСМ-41 и композитов на его основе, а также рост коэффициентов распределения кверцетина и (+)-катехина в системе раствор-сорбент по сравнению с силикагелем позволяют достигать увеличения степени извлечения и концентрирования флавоноидов;

- способы определения флавоноидов методами ТСХ и спектрофотометрии, позволяющие детектировать вещества при совместном присутствии в их многокомпонентных смесях с предварительным концентрированием аналитов на мезопористых материалах.

Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, из них 5 статей в рецензируемых научных журналах, входящих в перечень ВАК. Основные результаты работы представлены и доложены на Международном конгрессе «International Congress on Analytical «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия» (г. Клязьма, 2008), XIII и XIV Всероссийском симпозиуме с участием иностранных ученых «Актуальные проблемы теории адсорбции, пористости и адсорбционной селективности»

(г. Клязьма, 2009 и 2010), III Всеросcийском симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (г. Краснодар, 2011), XIII Международной конференции «Физико-химические основы ионообменных и хроматографических процессов» (г. Воронеж, 2011), Всероссийской конференции по аналитической спектроскопии с международным участием (г. Краснодар, 2012), IV Международной конференции «Сорбенты как фактор качества жизни и здоровья» (г. Белгород, 2012), VI Всероссийской конференции «Физико-химические процессы в конденсированных средах и на межфазных границах – ФАГРАН-2012» (г. Воронеж, 2012).

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературы, включающего 191 наименование и приложения. Работа изложена на страницах, содержит 56 рисунков и 25 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Во введении обоснованы актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, изложена новизна, практическая значимость результатов и основные положения, выносимые на защиту.

В первой главе представлена классификация флавоноидов, обобщены и систематизированы литературные данные по основным методам разделения и концентрирования флавоноидов на сорбентах различного типа. Описаны способы синтеза и модифицирования мезопористых материалов.

Во второй главе «Экспериментальная часть» представлены свойства реактивов и характеристика оборудования, используемых в работе. В качестве объектов исследования были выбраны кверцетин, (+)-катехин, рутин и нарингин (рис. 1), относящиеся к разным подгруппам флавоноидов.

Разделение веществ проводили методом восходящей ТСХ в стандартных камерах для хроматографирования на пластинах «Sorbfil ПТСХ-П-А» и «Fluka Polyamid 6». Количественную обработку осуществляли с использованием программы «Sorbfil Videodensitometer» (ЗАО «Сорбполимер»). В качестве подвижной фазы использовались элюенты, включающие растворители различной полярности: бензол, ацетон, амиловый и этиловый спирты, этилацетат с добавками уксусной кислоты и воды.

Рис. 1. Структурные формулы некоторых флавоноидов Представлены способы модификации мезопористого сорбента МСМ- триметилхлорсиланом (Sigma, США). Приведены условия получения высокоупорядоченного аналога МСМ-41 с молекулярными отпечатками кверцетина и (+)-катехина. Описаны методики изучения структурных характеристик мезопористого сорбента МСМ-41 и композитов на его основе по данным адсорбции/десорбции азота при 77 К, рентгеноструктурного анализа, ИК-спектроскопии. Расчет удельной поверхности мезопористых материалов проведен с использованием уравнений Брунауэра-Эммета-Теллера (БЭТ), оценка распределения пор по размерам осуществлена методом БарретаBarrett-Joyner-Halenda – BJH).

термостабильности образцов проводили на термоанализаторе TGA/SDTA 851e (Mettler-Toledo GmbH, Германия) в диапазоне температур 25-1000 °С. Описаны методики изучения сорбционных свойств, гидрофобности МСМ-41 и его модифицированных аналогов на основе данных конкурентной адсорбции воды и толуола. Представлены особенности оценки индексов гидрофобности мезопористых материалов при использовании установки, включающей в себя систему термостатирования анализируемых материалов в реакторе при непрерывном пропускании адсорбатов и on-line определении толуола и воды на газовом хроматографе HP-5890 с капиллярной колонкой и детектором по теплопроводности.

Представлены способы изучения сорбционного разделения, концентрирования кверцетина и (+)-катехина мезопористыми сорбентами в статических и динамических условиях.

В третьей главе «Получение модифицированных материалов на основе МСМ-41» обсуждается влияние условий модификации МСМ- триметилхлорсиланом и синтез мезопористых материалов с молекулярными отпечатками флавоноидов. Структура МСМ-41 с достаточно высокими значениями удельной плотности силанольных групп (2,5-3,0 ммоль/г), с одной стороны, обуславливает значительное сродство к молекулам воды, хотя и меньшее по сравнению с силикагелями. С другой стороны, это способствует проявлению каталитической активности и ограничивает использование данного материала в качестве эффективного сорбента для ТФЭ и хроматографии.

Снижение удельной плотности поверхностных силанольных групп, а также возможность регулировать гидрофобно-гидрофильный баланс в настоящей работе достигается двумя путями. Первый состоит в прививке к МСМ- силилирующего агента – триметилхлорсилана. Второй – в получении мезопористого материала со структурой, аналогичной МСМ-41 с молекулярными отпечатками полифенольных веществ.

Рис. 2. Схема модификации МСМ-41 триметилхлорсиланом Силилирование мезопористого сорбента МСМ-41 осуществляли триметилхлорсиланом по приведенной выше схеме (рис. 2). В качестве растворителя при модификации использовали трихлорметан. Предварительно были выбраны условия активации материала для удаления адсорбированных молекул воды и изменения реакционной способности поверхностных силанольных групп, участвующих в образовании водородных связей с соседними ОН-группами. Для оценки возможности применения материала в качестве высокоэффективных сорбента необходимо контролировать их структурные характеристики.

Таблица 1. Поверхностные и объемные свойства исходного и силилированного адсорбции/десорбции азота и (Та=130С) Мод. композит (Tа=500С) сохраняется упорядоченная структура сорбента, практически не меняется удельная площадь поверхности материала (1100-1200 м2/г), сохраняется узкое распределение пор по размерам. Уменьшается лишь объем (до 0,9 м3/г) и диаметр (до 3 нм) пор (табл. 1).

Синтез мезопористых материалов с молекулярными отпечатками кверцетина и (+)-катехина проводили методом жидкокристаллического темплатирования в присутствии структурообразующего поверхностно активного вещества. В настоящей работе для этого использовали цетилтриметиламмония бромид (СТАВr). В качестве модификатора использовали кверцетин и (+)-катехин. Одновременно синтезировали образец сравнения без добавки флавоноидов. В результате получали реакционную 1,0 SiO2:1,0 Na2O:1,0 СTABr:100 H2O:1·10 (1·10 ) Querсetin – MQ1 (МQ2) или 1,0 SiO2:1,0 Na2O:1,0 СTABr:100 H2O:1·10-5(1·10-4) (+)-Catechin – МК1 (МК2).

Рис. 3. Изотермы низкотемпературной адсорбции/десорбции азота MCM-41 (1), синтеза приводит к получению высокоупорядоченных материалов. Композиты с молекулярными отпечатками кверцетина и (+)-катехина (MQ и МК) имеют гексагональную структуру, площадь поверхности 900-1200 м2/г, распределение пор по размерам в интервале 2,0-4,5 нм (табл. 2). Можно полагать, что MQ и МК характеризуются наноструктурированностью, аналогичной МСМ-41.

Таблица 2. Поверхностные и объемные свойства МСМ-41 и мезопористых (рис. 4) показано, что при материалов с молекулярными отпечатками увеличении содержания Параметр образец MK1 MQ1 снижается удельная плотность Объем пор, cм3/г 0,69 1,36 0, Диаметр пор, нм 2,74 4,35 2, зависит не только от природы добавленного флавоноида, но и от его концентрации. Очевидно, падение поверхностной плотности силанольных групп сопровождается снижением сродства к молекулам воды, что и было подтверждено данными ИК-спектроскопии (рис. 5).

Рис. 4. Дифференциальные Рис. 5. ИК-спектры диффузного термогравиметрические кривые отражения мезопористых материалов МСМ-41 (1), MK1 (2), MK2 (3), МСМ-41 (1), MK1 (2), MK2 (3), MQ1 (4), В четвертой главе «Сорбционно-хроматографическое разделение флавоноидов на сорбентах различной природы» обсуждается влияние природы и структуры сорбента на хроматографические параметры удерживания флавоноидов.

Многокомпонентность растворов флавоноидов при их извлечении из растительного сырья и при определении в физиологических жидкостях человека требует выбора условий хроматографирования. Метод тонкослойной хроматографии является наиболее простым и доступным. Для увеличения эффективности в ТСХ проводят варьирование состава элюента и типа неподвижной фазы (НФ). Изменение состава подвижной фазы (ПФ) – наиболее экономичный способ повышения качества хроматографической методики.

Изменение полярности растворителя приводит к необходимости учета влияния природы взаимодействий в системе сорбат-сорбент-растворитель на гликозидированные формы флавоноидов (рутин и нарингин) и агликоны (кверцетин и (+)-катехин). Для большинства используемых систем рутин и нарингин (Rf=0,2-0,7) лучше удерживаются силикагелем, чем кверцетин и (+)-катехин (Rf=0,8-0,9) (рис. 6). При этом параметры хроматографирования рутина и нарингина зависят от состава и свойств растворителей, используемых для элюирования.

Рис 6. Изменение относительной Рис 7. Зависимость относительной скорости перемещения (+)-катехина (1), скорости перемещения от Р' кверцетина (2), нарингина (3), в системах элюирования на основе рутина (4) при варьировании доли этилацетата: (+)-катехин (1), При выборе наиболее подходящего соотношения компонентов ПФ оценивали полярность системы растворителей с использованием таких параметров как диэлектрическая проницаемость (r), параметр полярности по Снайдеру (Р') (рис. 7), параметр растворимости Гильдербранда (т). Для характеристики полярности среды использовали аддитивное уравнение (1):

параметры эффективности где Si – сила растворителя i-го компонента, и селективности разделения флавоноидов i – объемная доля i-го компонента в ПФ на основе этилацетата на пластинах «Sorbfil ПТСХ-П-А» (n=3, Р=0,95) (+)-Катехин 0,88±0,02 8800 2,5 1, (+)-Катехин 0,89±0,03 8900 27,5 15, * - рассчитаны между двумя соседними зонами столько изменением полярности по Снайдеру, сколько увеличением объемной доли органического модификатора (уменьшение Rf) и ростом Rf с увеличением объемной доли уксусной кислоты, что способствует изменению степени протонирования полифенольных групп и позволяет регулировать разделение близких по природе и физико-химическим свойствам веществ, таких как гликозиды и агликоны флавоноидов. При этом наибольшее различие удерживания гликозидов и агликонов флавоноидов наблюдается в системах элюирования этилацетат–уксусная кислота–вода (ЭУВ) (80:10:10; 90:5:5) и амиловый спирт–уксусная кислота–вода (АУВ) (60:20:20; 50:26:24; 50:25:25).

Результаты хроматографирования смеси флавоноидов в тонком слое сорбента показывают, что удовлетворительного разделения не всегда можно добиться варьированием только ПФ.

Таблица 4. Параметры хроматографирования флавоноидов на пластинах оказывает значительного влияния «Polygram Polyamid 6» (n=3, Р=0,95) амиловый спирт–уксусная кислота–вода (50:25:25) этилацетат–уксусная кислота–вода (55:20:20) * - рассчитаны между двумя соседними зонами форм флавоноидов, наоборот, увеличивается (табл. 4).

Для эффективного разделения полифенолов и их концентрирования удобно использовать варианты ТФЭ и колоночной хроматографии при варьировании природы сорбента. В настоящей работе изучали процесс сорбции кверцетина и (+)-катехина методом колоночной хроматографии в режиме фронтального элюирования на силикагеле, силикагеле с привитыми октадецильными группами (С18), высокоупорядоченном материале МСМ-41 (рис. 8), силилированном композите, а также материале с молекулярными отпечатками флавоноидов из водно-органических растворителей.

Рис. 8. Выходные кривые сорбции (+)-катехина (1) и кверцетина (2) из ацетонитрильного раствора При пропускании до 15 относительных объемов смеси кверцетина и (+)-катехина через колонку, заполненную МСМ-41, на выходе получается фракция, обогащенная (+)-катехином (рис. 8). Данный флавоноид практически не удерживается МСМ-41. Кверцетин, напротив, характеризуется большим объемом удерживания (V/V0=15). Каталитическая активность поверхностных Si-OH групп сорбента сказывается при хроматографировании кверцетина и (+)-катехина на силикагеле и исходном мезопористом материале МСМ-41. При этом изменения в структуре веществ сопровождаются смещением полос в спектрах кверцетина и (+)-катехина в УФ-, видимой (рис. 9) и ИК-областях электромагнитного излучения. Снижение поверхностной активности силанольных групп может быть достигнуто путем применения силикагеля с привитыми октадецильными группами (С18), силилирования мезопористых сорбентов и получения материалов с молекулярными отпечатками флавоноидов.

Рис. 10. Выходные кривые сорбции (+)-катехина на С18 из растворов в 70%- (1), 96%-ом этаноле (2), ацетонитриле (3), воде (4) Рис. 11. Выходные кривые сорбции хроматографической колонки (+)-катехина (1) и кверцетина (2) получается фракция, обогащенная из ацетонитрильного раствора их смеси (+)-катехином.

на силилированном композите (МС1) Изменение удерживания веществ достигается также при использовании материалов с молекулярными отпечатками флавоноидов. В данном случае появляется возможность регулирования доступности силанольных групп и их способности участвовать в процессах необратимой сорбции полифенольных веществ. При этом необходимо отметить большую роль ПФ – растворителя, который влияет на процессы, протекающие в фазе сорбента. При применении ацетонитрила сорбционная способность материалов с молекулярными отпечатками практически не позволяет разделять кверцетин и (+)-катехин.

Добавление к ацетонитрилу аммиака позволяет регулировать возможность образования водородных связей между силанольными группами сорбента и фенольными группами сорбата. При пропускании 14 относительных объемов смеси на выходе получается фракция, обогащенная (+)-катехином.

Таблица 5. Степень (R, %) и коэффициенты распределения флавоноидов из ацетонитрильных (D) кверцетина на различных сорбентах *- аммиачный (0,5%) раствор в ацетонитриле