На правах рукописи

Сакалла Мохамед Мохамед-Файез-Абдель-Халик

Клинико-биохимическое исследование взаимодействия наночастиц меди с

бактериальной флорой и ферментами ротовой жидкости у больных кариесом и

изучение биологического действия наночастиц

в экспериментальных исследованиях

14.03.10 – клиническая лабораторная диагностика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов – 2012 1

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Бородулин Владимир Борисович.

Официальные оппоненты:

Гладилин Геннадий Павлович – доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития России, кафедра клинической и лабораторной диагностики, заведующий;

Федотова Ольга Васильевна – доктор химических наук, профессор, ГБОУ ВПО Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского Минобрнауки РФ, кафедра органической химии, заведующая.

Ведущая организация – Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Ставропольский государственный университет Минобрнауки РФ.

Защита состоится «» 2012 года в _ часов на заседании диссертационного совета Д 208.094.04 при ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им.

В.И. Разумовского Минздравсоцразвития России по адресу: 410012, г. Саратов, ул.

Б. Казачья, 112.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан «» _ 2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Музурова Л.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования Стремительное развитие нанотехнологий в настоящее время приводит к внедрению в медицинскую практику новых материалов и методов. Наночастицы находят широкое применение в различных областях химии, биологии, экологии.

Использование микроэлементов в виде биологически активных добавок в ветеринарии и сельском хозяйстве способствует увеличению продукции растительной и животной биомассы. Металлы в виде наночастиц обладают пролонгированным действием и высокой биологической активностью (Глущенко Н.Н. и соавт., 2002).

Использование наночастиц несет потенциальную опасность вредного воздействия на здоровье человека и природные экосистемы (Колесниченко А.В. и соавт., 2008).

Взаимодействие наночастиц с нуклеиновыми кислотами, белками и клетками приводит к изменениям в метаболизме последних и возможному иммунному ответу со стороны целого организма (Zieziulewiez T.J., 2003;Fischer H.C., 2007;

Geze A., 2007; Hall J.B., 2007; Jain T.K., 2008;).

В медицинской практике и биологии наночастицы наиболее часто используют в форме биосовместимых магнитных жидкостей, которые представляют собой взвесь магнитных частиц в водных буферных растворах разного состава, иногда-в водно – масляных эмульсиях (Звездина Н.Д., 2007).

Изучение воздействия на организм нанопорошков биогенных металлов меди, цинка, железа, биологическая ценность которых определяется многогранностью функций в сложных биохимических процессах и активным участием в клеточном метаболизме, обеспечивающем нормальное функционирование организма,требует особо пристального внимания.

Лечение кариеса часто сопровождается введением в структуру зуба композитных материалов, которые могут содержать различные благородные металлы в сочетании с ионами биогенных элементов, меди или железа. Развитие нанотехнологий будет способствовать и развитию различных композитных материалов. Исследование влияния наночастиц на ферменты и бактериальную флору ротовой полости представляет собой отдельную важную задачу.

Необходимо отметить, что вырабатываемая слюнными железами и смешиваемая с другими компонентами ротовой полости слюна постоянно попадает в желудок и другие отделы желудочно-кишечного тракта. Вследствие этого наночастицы могут всасываться в различных отделах желудочно-кишечного тракта и попадать в печень и другие органы, что требует изучения подобных процессов на экспериментальных моделях.

Цель исследования – исследование взаимодействия наночастиц меди с бактериальной флорой и ферментами ротовой жидкости у больных кариесом и изучение биологического действия наночастиц меди в экспериментальных исследованиях.

1. Исследовать влияние наночастиц меди в различных концентрациях на активность, скорость и константу Михаэлиса ферментов ротовой жидкости (амилазы, лактатдегидрогеназы, щелочной фосфатазы) у лиц с кариесом in vitro.

2. Разработать прогностический коэффициент активности ЛДГ/амилаза и оценить его значение для диагностики кариеса на различных его стадиях.

3. Исследовать антибактериальное действие наночастиц меди на бактериальную флору у больных кариесом.

4. Изучить влияние наночастиц меди в различных концентрациях на биохимические показатели у белых беспородных мышей in vivo.

Исследовано взаимодействие наночастиц меди с ферментами, содержащимися в ротовой жидкости у лиц с кариесом in vitro. Обнаружено изменение активности ферментов, принимающих участие в углеводном обмене. Исследовано изменение скорости ферментативной реакции ферментов ротовой жидкости при их взаимодействии с наночастицами меди.

Исследовано влияние наночастиц меди на активность ферментов и содержание ключевых метаболитов белкового, липидного, углеводного обменов в сыворотке крови белых мышей.

Изучено антибактериальное действие наночастиц меди на бактериальную флору у больных кариесом.

Теоретическая и практическая значимость работы Выявлена биологическая активность нанопорошка меди. Установленные аспекты токсического действия наночастиц металла свидетельствуют о необходимости проведения тщательной оценки возможных рисков для применения наноразмерных материалов в стоматологии.

Внедрение результатов диссертационного исследования Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе кафедр биохимии, гигиены медико-профилактического факультета, общей гигиены и экологии ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития России и в стоматологической поликлинике «Жемчужина»

г. Саратова.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на научных конференциях кафедры биохимии ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И.

Разумовского Минздравсоцразвития РФ (Саратов, 2010, 2011, 2012);на Х межвузовской конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении» (Ростов-н\Д, 2011).

Положения, выносимые на защиту:

1. Выявлено увеличение индекса ЛДГ/амилаза ротовой жидкости у больных кариесомв зависимости от тяжести кариозного процесса.Наночастицы меди взаимодействуют с ферментами ротовой жидкости.

Ферменты ротовой жидкости обнаруживают различную чувствительность к наночастицам меди.

2. Выявлена антибактериальная активность наночастиц меди в отношении флоры ротовой жидкости у больных кариесом.

3. Наночастицы в концентрациях 2 – 200 мкг/20г при пероральном введении проявляют выраженную биологическую активность на организм лабораторных животных, что подтверждается анализом биохимических показателей сыворотки крови. Исследуемые металлические наночастицы оказывают схожее действие, выражающееся в нарушении процессов утилизации глюкозы, активации процессов глюконеогенеза, катаболизма белков.

Личный вклад автора. Диссертантом определены основные идеи и дизайн исследования. Проведены обследование пациентов, забор и исследование ротовой жидкости, исследовано взаимодействие наночастиц меди с ферментами, содержащимися в ротовой жидкости. Автору принадлежат результаты исследования влияния наночастиц меди на активность ферментов и содержание ключевых метаболитов белкового, липидного, углеводного обменов в сыворотке крови белых мышей. Статистическая обработка и анализ полученных данных проведены автором самостоятельно. На основе полученных результатов сделаны достоверно обоснованные выводы и представлены практические рекомендации.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы, отражающей результаты собственных исследований, выводов и списка использованной литературы, включающего 107 отечественных и 45 иностранных источников. Работа иллюстрирована 20 рисунками и 15 таблицами.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 3 в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В работе представлены результаты обследования 74 пациентов, находившихся на лечении в стоматологической поликлинике. Возраст лиц варьировал от 28 до 46 лет (48 мужчин и 26 женщин) с диагнозом кариес различной степени тяжести.

Материалом для исследования служила ротовая жидкость, полученная без стимуляции методом сплевывания в стеклянные пробирки утром натощак, которая сразу после забора подвергалась биохимическому исследованию.

Собранную ротовую жидкость в количестве 2-3 мл использовали для исследования параметров углеводного обмена (-амилазы, лактатдегидрогеназы, щелочной фосфатазы). Данную часть исследования проводили с помощью готовых наборов химических реагентов и биохимического анализатора Hospitex (Швейцария). Для получения разведений образцов ротовой жидкости использовали бидистиллированную воду.

Исследование ферментов ротовой жидкости Принципом определения активности лактатдегидрогеназы является спектрофотометрический метод, оптимизированный в соответствии с требованиями Немецкого Общества Клинической Химии. Активность фермента выражалась в Е/л (Weisshaar D., 1975).

Активность -амилазы определяли колориметрическим ферментативным методом. Результаты выражались в Е/л (Ткачук В.А. и соавт., 2002).

Щелочную фосфатазу определялаи кинетическим ультрафиолетовым методом, который разработан в соответствии с рекомендациями Немецкого Общества Клинической Химии. Активность фермента выражалась в Е/л (Kubler W., 1973; Thomas L., Labor U., 1978).

Клинические данные регистрировали в разработанных нами формализованных историях болезни. При клиническом осмотре отмечали зубную формулу, состояние слизистой оболочки полости рта, наличие некариозных поражений, мягкий зубной налет, над- и поддесневые зубные отложения, наличие или отсутствие аномалий зубов и прикуса.

Оценку гигиенического состояния полости рта и тканей пародонта проводили с помощью следующих тестов: определение упрощенного индекса гигиены (Greene J.C., Vermillon R.L., 1964); папиллярно-маргинально-альвеолярного индекса (Parma C., 1960) – PMA; пародонтального индекса (Russel A.L., 1956) – ПИ; индекса интенсивности поражения зубов кариозным процессом (Комитет экспертов ВОЗ по стоматологии, 1962) – КПУ.

Объектами исследования в работе являлись высокодисперсные нанопорошки меди, синтезированные на плазмохимическом комплексе филиала Федерального государственного управления РФ «Государственный научно-исследовательский институт химии и технологии элементоорганических соединений» (ФГУП РФ ГНЦ ГНИИХТЭОС, г. Москва), лаборатория №33, г.Саратов. Средний размер наночастиц колебался в пределах 50-80 нм.

Исследования были выполнены на белых беспородных мышах. Контрольные и экспериментальные группы формировали из 2-3-месячных самцов массой 20г.

Мышей распределяли в одну контрольную группу (15 мышей), которая не подвергалась воздействиям нанопорошков, и экспериментальную группу ( мышей). Экспериментальная группа состояла из четырех подгрупп по 15 мышей в каждой подгруппе в зависимости от концентрации вводимого исследуемого нанопорошка. Первой подгруппе вводили 2 мкг/20г ; второй – 20 мкг/20г,третьей – 150 мкг /20г,четвертой – 200 мкг/20г. Выбранные концентрации наночастиц не превышают максимальных переносимых доз для данных металлов (Venugopal B., 1978). Все нанопорошки вводили в течение 6 дней в виде масляных суспензий в количестве 10 мкл однократно в сутки перорально с использованием зонда. По окончании эксперимента производили забор крови в количестве 2 мл от каждой мыши. Образцы крови от 3 мышей объединяли. Проводили 5 повторов для каждой группы мышей. Экспериментальная часть работы выполнена в соответствии с протоколами Женевской конвенции и принципами надлежащей лабораторной практики (Национальный стандарт Российский Федерации,ГОСТ Р 53434-2009;

Практическое руководство по биологической безопасности в лабораторных условиях, 2007; Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских исследованиях( Грачев С. В., 2010).

Определение биохимических показателей крови проводили с помощью полуавтоматического биохимического анализатора «Hospitex» (Швейцария), оборудованного термостатом, фотометром и микропроцессором. Для работы на анализаторе использовали стандартные наборы реактивов производства ЗАО «Диакон-ДС» и 10 – 20 мкл сыворотки мышей для определения одного фермента или одного метаболита. В сыворотке крови определяли активность АсАТ, АлАТ, -амилазы, концентрацию глюкозы, лактата, ПВК, общего холестерина, общего белка, альбумина, мочевины, билирубина. Методы являются унифицированными (Карпищенко А.И., 1999).

Микроорганизмы,использованные в работе Лабораторные эксперименты проводили в бактериологической лаборатории САРНИИТО в период с 2009 по 2011г.

Объектом исследования служили бактерии E. Coli (музейный штамм), Streptococcus salivarius, 7 * 103 КОЕ\мл, Stafilococcus epidermidis, 5 * 103 КОЕ\мл, выделенные от больных кариесом в различных стадиях.

Штаммы Streptococcus salivarius и Stafilococcus epidermidis были выделены от больных с диагнозом кариес зубов в стадиях компенсации, субкомпенсации и декомпенсации. Штамм E. coli 113-13 предоставлен музейной коллекцией Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН.

Методы исследования влияния наночастиц на микроорганизмы Для получения исходного разведения вещества на аналитических весах взвешивали навески наночастиц меди 1мг и растворяли их в 1 мл стерильной дистиллированной воды. Затем готовили последовательные разведения препарата до 10-2 мг/мл. Таким образом, получали следующие концентрации наночастиц: 1.0;

0.1; 0.01 мг/мл Микроорганизмы выращивали на МПА в чашках Петри. Твердую питательную среду готовили из дистиллированной воды и агара “Bacto Mac Concey Agar Base” (фирма “Difco”) в пропорции 20 г агара на 1 л дистиллированной воды и автоклавировали в течение 30 мин при 2 атм, разливали в чашки Петри диаметром 90 мм (по 20 мл). Посеянные культуры инкубировали в термостате при температуре 37 оС 1 сутки.

Суспензию бактерий приготавливали из выращенной культуры с содержанием на 1 мл дистиллированной воды миллиарда бактериальных клеток, что определяли по оптическому стандарту мутности на 10 единиц. Рядом последовательных разведений суспензии получали конечную концентрацию бактерий в 500 клеток на 1 мл.

В пробирки с разведениями смеси нанопорошков добавляли по 100 мкл конечной суспензии микроорганизмов, встряхивали и оставляли на полчаса. После этого с каждого из разведений производили посев по 20 мкл на каждую чашку Петри с агаром. Для контроля на такой же среде сеяли исходную суспензию культуры бактерий. Все чашки помещали в термостат (37 °С) на 24 часа. Результат учитывали на второй день. Тогда же ставили пробу на биохимические показатели жизнедеятельности микроорганизмов до и после воздействия исследуемой смеси веществ. Для биохимических тестов использовали специальную дифференциальнодиагностическую систему ENTEROtest 16 (La Chema).

Статистическая обработка результатов исследования Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с использованием методов вариационной статистики с выявлением достоверности различий по критерию Фишера - Стьюдента. Оценку точности и надежности числовых характеристик определяли по 95%-ному доверительному интервалу истинного среднего значения. Графики и диаграммы в работе построены с использованием стандартных приложений «Microsoft Excel». Вычисление показателей проводили с помощью программ статистического анализа на PC «Pentium 4».

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследование активности ферментов ротовой жидкости при кариесе.

Изменение активности ферментов ротовой жидкости у пациентов с В результате проведенного исследования изменения активности ферментов (амилаза, ЩФ, ЛДГ) ротовой жидкости у пациентов с интактным пародонтом in vitro установлено незначительное снижение активности всех вышеназванных ферментов (табл. 1). В присутствии наночастиц отмечается более выраженный эффект снижения активности ЛДГ и ЩФ, потому что являясь гидрофобными соединениями, наночастицы, по всей видимости, разрушают гидрофобные связи между субъединицами ЛДГ (тетрамер) и ЩФ (димер), что приводит к снижению активности ферментов. Фермент амилаза представляет собой полипептид с молекулярной массой примерно 55 килодальтон, хорошо растворим в воде.

Известно, что гидрофобные соединения хорошо взаимодействуют друг с другом;

по всей вероятности, происходят менее выраженное взаимодействие гидрофобных частиц с амилазой и меньшее подавление ее активности по сравнению с другими ферментами, хотя нельзя исключить возможности проникновения наночастиц в гидрофобные домены полипептидной цепочки амилазы.

При разработке прогностического коэффициента активности ЛДГ/амилаза и оценке его значения для диагностики кариеса на различных его стадиях следует обратить внимание на то, что концентрация ионов водорода будет зависеть от активности ЛДГ прямо пропорционально, в то время как активность амилазы слюны будет снижаться при уменьшении значений рН меньше 6,8.

Изменение активности ферментов ротовой жидкости у пациентов с интактным пародонтом и кариесом различной степени (ЕД/л) Субкомпенсированный кариес 425±15** 34±1.9** 28±1.7** Декомпенсированный кариес 453±17** 41±1.2** 25±1.2** Примечание: * – достоверность при сравнении активности ферментов ротовой жидкости у пациентов с интактным пародонтом и кариесом р > 0,05; * – р < 0,05;

** – p < 0,01.

Анализ проведенных исследований показал, что в контроле ( при интактном пародонте) данный показатель составляет 9,6 безразмерных единиц, на стадии компенсации индекс составил 11,8 безразмерных единиц, на стадии субкомпенсации – 15.2 и на стадии декомпенсации 18.1 безразмерных единиц активности. Таким образом, для диагностики степени кариозного процесса можно использовать соотношение активности ферментов ЛДГ и амилазы.

Изменение активности ферментов ротовой жидкости у больных с В результате проведенных исследований ротовой жидкости лиц с кариесом в стадии обострения установлено, что при поражении пародонта отмечается увеличение активности ЛДГ и щелочной фосфатазы ротовой жидкости на фоне резкого снижения активности амилазы. Вероятно, это происходит, с одной стороны, в результате активизации бактериальной микрофлоры, содержащей большое количество ЛДГ и ЩФ, а с другой стороны, это обусловлено разрушением тканей пародонта и выходом в ротовую жидкость вышеназванных ферментов из клеток соединительной ткани и клеток, участвующих в поддержании структуры зуба, – остеокластов и остеобластов.

Снижение активности амилазы обусловлено, по всей видимости, поражением секреторных клеток слюнных желез продуктами жизнедеятельности микроорганизмов. Анаэробные процессы, инициируемые бактериальными клетками, приводят к увеличению концентрации молочной кислоты в ротовой жидкости. В свою очередь, лактат является слабой кислотой и, следовательно, поставляет в раствор ионы водорода, которые закисляют ротовую жидкость, сдвигают рН в кислую сторону, что приводит к снижению активности амилазы, поскольку известно, что активность амилазы проявляется или при нейтральных значениях рН, или при слабощелочных.

Изменение активности ЛДГ ротовой жидкости у пациентов с кариесом в сочетании с наночастицами меди (in vitro) (ЕД/л) Концентрация Компенсирован Субкомпенсирован Декомпенсированнаночастиц Норма Примечание: * – достоверность при сравнении активности ЛДГ ротовой жидкости у пациентов с интактным пародонтом и кариесом в сравнении с активностью ЛДГ при воздействии наночастиц р > 0,05; * – р < 0,05; ** – p < 0,01.

Наночастицы влияли на активность всех ферментов ротовой жидкости.

Снижение активности ферментов можно объяснить подавлением роста бактерий в присутствии препаратов из-за их липофильности, то есть способности растворяться в мембранах бактериальных клеток, а, следовательно, и лучше проникать в клетки микроорганизмов (табл. 2-4).

В процессе метаболизма бактерий выделяется лактат (слабая органическая кислота), который сдвигает значение рН в кислую сторону; подобный эффект приводит к закислению среды и снижению активности амилазы, так как известно, что активность амилазы максимальна в диапазоне рН = 6,8-7,2.

Изменение активности щелочной фосфатазы ротовой жидкости у пациентов с кариесом в сочетании с наночастицами меди (in vitro) (ЕД/л) Концентрация Компенсирован Субкомпенсирован Декомпенсированнаночастиц Норма Примечание: * – достоверность при сравнении активности ЩФ ротовой жидкости у пациентов с интактным пародонтом и кариесом в сравнении с активностью ЩФ при воздействии наночастиц р > 0,05; * – р < 0,05; ** – p < 0,01.

Изменение активности амилазы ротовой жидкости у пациентов с кариесом в сочетании с наночастицами меди (in vitro) (ЕД/л) Концентрация Компенсирован Субкомпенсирован Декомпенсированнаночастиц Норма Примечание: * – достоверность при сравнении активности амилазы ротовой жидкости у пациентов с интактным пародонтом и кариесом в сравнении с активностью амилазы при воздействии наночастиц р > 0,05; * – р < 0,05; ** – p < 0,01.

Изменение скорости биохимической реакции ферментов ротовой Скорость реакции определяется как количество вещества, превращенного (образовавшегося или распавшегося) в единицу времени. Она является функцией концентраций,участвующих в реакции веществ, которые непрерывно меняются по мере протекания реакции в присутствии фермента, поэтому однозначное определение скорости реакции может быть дано только в случае, если конечное изменение количества вещества в единицу времени заменить на дифференциальную разность, относящуюся к бесконечно малому времени dt.

Количество превращенных веществ обычно выражают в виде изменения объемной концентрации с одного или нескольких реагентов.

Скорость реакции не может быть измерена непосредственно, возможно только определение концентрации с, относящейся к разным моментам времени t. Зная пары значений с-t, определенные с достаточной частотой, можно построить функциональную зависимость. Диагностическое значение определения скорости биохимической реакции заключается в выяснении основных факторов, влияющих на активность ферментов: концентрации фермента в среде или изменение его удельной активности вследствие появления в среде активаторов или ингибиторов ферментативной реакции.

Наблюдается изменение скорости реакции при различных стадиях кариозного процесса (табл. 5).

При действии наночастиц меди отмечается наиболее выраженное по сравнению с контролем снижение скорости реакции ферментов ЛДГ (табл. 6) и ЩФ (табл. 7). В то же время отмечается уменьшение скорости реакции амилазы (табл. 8). Также обнаруживаются изменения константы Михаэлиса – она увеличивается для ферментов ЛДГ, ЩФ и амилазы при применении наночастиц (табл. 9 - 11).

На общую активность фермента влияют две величины: концентрация фермента и его удельная активность. При лизисе бактериальных клеток и распаде тканей пародонта концентрация ферментов ЛДГ и ЩФ в ротовой жидкости резко увеличивается, соответственно возрастает и скорость биохимических реакций, катализируемых ЛДГ и ЩФ, так как величина скорости биохимической реакции прямо пропорциональна концентрации фермента.

При действии наночастиц уменьшается число бактериальных клеток в растворе, что приводит к снижению концентрации ЛДГ и ЩФ, и соответственно – к снижению скорости биохимической реакции, катализируемой ЛДГ и ЩФ.

Обнаружено уменьшение скорости биохимической реакции, катализируемой ферментом амилазой при увеличении концентрации наночастиц, что указывает на снижение активности данного фермента в ротовой жидкости.

Изменение скорости биохимической реакции ферментов ротовой жидкости с интактным пародонтом (М/л*с) Компенсированный кариес 31±2.1* 69±3.1* 25±1.8* Субкомпенсированный Декомпенсированный кариес 54±3.2** 115±4.7** 14,3±2.0** Примечание: * – достоверность при сравнении скорости реакции ферментов ротовой жидкости у больных с кариесом: р > 0,05; * – р < 0,05; ** – p < 0,01.

Изменение скорости биохимической реакции ЛДГ ротовой жидкости с кариесом в сочетании с наночастицами меди (in vitro) (М/л*с) Концентрация наночастиц Норма 20 мкг/мл 19,2±1.6* 24,8±2.1* 34,4±3.1** 43,2±2.6** 150 мкг/мл 200 мкг/мл Примечание: * – достоверность при сравнении скорости реакции ЛДГ ротовой жидкости у больных с кариесом:р > 0,05; * – р < 0,05; ** – p < 0,01.

Изменение скорости биохимической реакции ЩФ ротовой жидкости с кариесом в сочетании с наночастицами меди (in vitro) (М/л*с) Концентрация наночастиц Норма Примечание: * – достоверность при сравнении скорости реакции ЩФ ротовой жидкости у больных с кариесом:р > 0,05; * – р < 0,05; ** – p < 0,01.

Изменение скорости биохимической реакции амилазы ротовой жидкости с кариесом в сочетании с наночастицами меди (in vitro) (М/л*с) Концентрация Компенсирован Субкомпенсирован Декомпенсированнаночастиц Норма Примечание: * – достоверность при сравнении скорости реакции амилазы ротовой жидкости у больных с кариесом:р > 0,05; * – р < 0,05; ** – p < 0,01.

Изменение константы Михаэлиса (K m) ферментов ротовой жидкости у В ходе проведенных исследований обнаружено изменение константы Михаэлиса биохимических реакций, катализируемых ЛДГ, ЩФ и амилазой (табл. - 11). Установлено, что Km увеличивается для ЛДГ и ЩФ при использовании наночастиц, что указывает на снижение удельной активности фермента; этот факт можно расценивать как прямое ингибирующее действие наночастиц на ЛДГ и ЩФ.

Km для амилазы также увеличивается в процессе проводимого воздействия наночастицами, что указывает на прямое действие наночастиц на фермент (эти эффекты были обнаружены in vitro).

Изменение константы Михаэлиса (Km) ферментов ротовой жидкости с кариесом в стадии компенсации (* 10-3 М) 20 мкг/мл наночастиц меди 1.36±0.04* 3.47±0.21* 5.67±0.18* 150 мкг/мл наночастиц меди 1.47±0.06* 3.68±0.14* 5.87±0.17* 200 мкг/мл наночастиц меди 1.67±0.08** 3.89±0.23** 6.02±0.15** Примечание: * – достоверность при сравнении Km ферментов ротовой жидкости у больных с кариесом в стадии компенсации:р > 0,05; * – р < 0,05; ** – p < 0,01.

Изменение константы Михаэлиса (Km) ферментов ротовой жидкости больных с кариесом в стадии субкомпенсации (* 10-3 М) 20 мкг/мл наночастиц меди 1.48±0.06 * 3.87±0.24* 5.76±0.19* 150 мкг/мл наночастиц меди 1.68±0.07* 4.02±0.18* 5.89±0.15* 200 мкг/мл наночастиц меди 1.95±0.09** 4.23±0.27** 6.12±0.13** Примечание: * – достоверность при сравнении Km ферментов ротовой жидкости у больных с кариесом в стадии субкомпенсации р > 0,05; * – р < 0,05; ** – p < 0,01.

Изменение константы Михаэлиса (Km) ферментов ротовой жидкости с кариесом в стадии декомпенсации (* 10-3 М) 20 мкг/мл наночастиц меди 1.78±0.08* 3.97±0.13* 5.76±0.20* 150 мкг/мл наночастиц меди 2.13±0.12** 4.22±0.16** 5.96±0.13** 200 мкг/мл наночастиц меди 2.35±0.09** 4.35±0.21** 6.22±0.24** Примечание: * – достоверность при сравнении Km ферментов ротовой жидкости у больных с кариесом в стадии декомпенсации: р > 0,05; * – р < 0,05; ** – p < 0,01.

Антибактериальное действие наночастиц меди на микрофлору ротовой После подсчета клеточных колоний на чашках производилась статистическая обработка полученных результатов. Формула для расчета:

из эксперимента величины общего числа бактериальных клеток, выросших на чашках в контроле и опыте соответственно.

С помощью критерия соответствия определяли величину Р – вероятность значения 2 (величина табличная). Сравнение между собой числа клеточных колоний в контроле и опыте с использованием критерия соответствия 2 указывает на достоверное различие между фактическими и теоретически ожидаемыми результатами (P < 0,001). Это свидетельствует о достоверности полученных результатов.

Проведенные исследования показали, что при увеличении концентрации наночастиц в суспензии число колоний микроорганизмов уменьшается вплоть до полного их отсутствия.

Влияние наночастиц меди на колониеобразующую способность культуры E.

Coli штамма 113- При воздействии наночастиц меди на культуры E. coli наблюдается значительное уменьшение количества КОЕ, при этом максимальный эффект достигается при концентрации 1.0 мг/мл (табл. 12). Так для культур E. coli штамма 113-13 отмечено уменьшение количества бактериальных клеток почти в 30 раз по сравнению с контролем.

Влияние наночастиц меди на колониеобразующую способность S. Epidermidis Концент наноный мг/мл Показана концентрационная зависимость количества КОЕ при исследовании действия суспензий наночастиц меди в отношении E. coli и в отношении S.

Epidermidis и S. Salivarius (табл. 13, табл. 14). Снижение концентрации наночастиц по сравнению с максимальной приводит к пропорциональному увеличению числа Наночастицы меди показали большую антибактериальную активность по отношению к клеткам S. Salivarius.

Влияние наночастиц меди на колониеобразующую способность S. salivarius.

Концент мг/мл В отношении всех исследованных культур E. coli наблюдали уменьшение числа КОЕ в среднем примерно в 30 раз при концентрации наночастиц меди 1мкг/мл по сравнению с контролем; уменьшение числа КОЕ в 20 раз при той же концентрации наночастиц для культуры S. Epidermidis, выделенной от больных кариесом в стадии компенсации и примерно в 10 раз для той же культуры, выделенной от больных в стадии субкомпенсации и компенсации. Для культуры S.

Salivarius при концентрации наночастиц 1 мкг/мл наблюдается картина подавления роста клеток, схожая с картиной для S. Epidermidis. Однако при уменьшении концентрации наночастиц меди в растворе большую чувствительность проявляют клетки штамма S. salivarius.

Изменение биохимических показателей сыворотки крови белых В процессе работы было выявлено, что медные частицы обладают биодоступностью и способны проникать из желудочно-кишечного тракта в кровь, переноситься с током крови к различным органам и оказывать биологический эффект, который проявляется также в изменении биохимических показателей сыворотки крови. Результаты экспериментов по изучению биохимических показателей при введении наночастиц меди представлены в таблице 15.

Исследовали состояние углеводного, белкового, липидного обменов организма животных, а также активность клеточных ферментов под влиянием наночастиц меди.

Исследование показателей углеводного обмена под воздействием частиц проводили по трем основным показателям-концентрации глюкозы, лактата, пирувата в крови.

Уровень глюкозы в крови интактных мышей составил 7,22±0,66 ммоль/л.

Введение медных наночастиц в концентрациях 2 – 200 мкг/20г достоверных изменений не вызвало; во всех исследуемых группах содержание глюкозы колебалось в пределах нормы.

Концентрация лактата в крови экспериментальных животных по сравнению с контролем (24,77±1,62 ммоль/л) во всех случаях оставалась в пределах нормы.

Концентрация ПВК в контрольной группе животных составила 0,21±0, ммоль/л. Все исследуемые концентрации медных частиц вызывают увеличение содержания ПВК в крови лабораторных животных (р0,05 8,81±0,90 >0,05 7,95±0,83 >0,