На правах рукописи

ОВЧИННИКОВ Александр Александрович

РОЛЬ ФАКТОРОВ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ РЕЗУЛЬТАТИВНОСТЬ

ПОЛУЧЕНИЯ КЛОНИРОВАННЫХ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО

РОГАТОГО СКОТА IN VITRO

03.01.06 – Биотехнология

03.03.01 – Физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Дубровицы – 2012 2

Работа выполнена в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии.

доктор биологических наук, профессор Научные руководители:

член – корреспондент РАСХН Зиновьева Наталия Анатольевна;

кандидат биологических наук Сингина Галина Николаевна.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Шихов Игорь Яковлевич доктор биологических наук Лебедев Виктор Иванович.

ФГБОУ ВПО «Московская государственная

Ведущая организация:

академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина»

Защита диссертации состоится « » 2012 г. в «10» часов, на заседании диссертационного совета Д 006.013.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии.

Адрес института: 142132 Московская обл. Подольский р-н п. Дубровицы, ГНУ ВИЖ РАСХН, Тел./факс: 8(4967) 65-11-01.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института и на сайте института www. vij.ru

Автореферат разослан « » января 2012 года.

Ученый секретарь совета Д 006.013. доктор биологических наук C.В. Воробьева

1.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Технология клонирования в большинстве развитых стран мира открывает существенные возможности животноводству, биотехнологии, фармацевтической промышленности, производству трансгенных животных, сохранению исчезающих видов животных, медицине человека (Niemann et al. 2005, Campbell et al. 2007, Robl et al. 2007, Duszewska et al. 2010).

В животноводстве технология клонирования может быть направлена на размножение уникальных, высокоценных и выдающихся животных в целях улучшения селекционного процесса, быстрого получения оптимизированных генотипов, а также для сохранения исчезающих пород домашних и диких животных. Не менее важно создание трансгенных животных с измененным обменом веществ в направлении повышения качества и эффективности продукции, животных-продуцентов биологически активных веществ лекарственного назначения, а также животных, генетически устойчивых к ряду инфекционных заболеваний.

Метод межвидового клонирования, в частности пересадка ядер соматических клеток человека в энуклеированные яйцеклетки крупного рогатого скота открывает возможности получения культуры стволовых плюрипотентных эмбриональных клеток и является наиболее перспективным направлением в репаративной медицине.

Несмотря на то, что в последние годы в области клонирования животных достигнуты определенные успехи, эффективность технологии получения клонированных зародышей крупного рогатого скота, равно как и других домашних животных остается крайне низкой, часты случаи аномального эмбрионального развития, а рожденное потомство менее жизнеспособно.

Причиной такого положения является то, что от момента получения клеток источников цитопластов и клеток-доноров кариопластов до получения зародышей и живого потомства стоит целый ряд экспериментальных манипуляций и большое количество непонятых механизмов, которые влияют на развитие реконструированных зародышей.

Кроме того техника переноса ядер соматических клеток с использованием в качестве цитопластов ооцитов крупного рогатого скота с самого начала базировалась на методических приемах оплодотворения in vitro. Однако в связи с тем, что отдельные принципиальные положения клонирования не прошли испытания временем, ученые занятые данной проблемой, вынуждены возвращаться к изучению каждого этапа клонирования вновь.

Более того, в мировой литературе есть сведения о получении клонированных зародышей и потомства крупного рогатого скота (Cibelli et al., 1998; Kato et al., 1998), однако, механизмы позволяющие воспроизвести подобные технологии, полностью не раскрываются. Особенно это касается условий подготовки цитопластов, способов их реконструирования, параметров слияния цитопласта и кариопласта, режимов и условий активации, а также приемов синхронизации клеточного цикла соматических клеток.

Цель исследований. На основе изучения факторов, влияющих на результативность отдельных этапов клонирования, моделировать технологию получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro методом переноса ядер соматических клеток в энуклеированные ооциты.

В соответствии с вышеуказанной целью были поставлены следующие задачи:

- определить параметры синхронизации бычьих эмбриональных фибробластов в фазе G0/G1, с целью их последующего использования в качестве кариопластов;

- определить эффективность «слепой энуклеации» ооцитов, в зависимости от расположения первого направительного тельца относительно хромосом на стадии метафазы второго деления мейоза и времени созревания ооцит-кумулюсных комплексов;

- исследовать влияние времени культивирования in vitro и гормона пролактина на созревание ооцит-кумулюсных комплексов и положение первого полярного тельца относительно метафазной пластины в ооцитах коров;

- изучить влияние цитохалазина Б на реконструирование ооцитов методом переноса ядер соматических клеток крупного рогатого скота;

- установить оптимальные параметры электрослияния цитопласта и кариопласта с использованием мультипоратора фирмы Eppendorf (Германия);

- изучить влияние пролактина на развитие партеногенетических и клонированных эмбрионов крупного рогатого скота.

Научная новизна. Впервые исследовано влияние бычьего пролактина на выделение и миграцию первого полярного тельца относительно метафазы II, на эффективность «слепой энуклеации», а также на развитие клонированных эмбрионов в зависимости от продолжительности созревания ооцитов крупного рогатого скота in vitro. Впервые показано отрицательное действие цитохалазина Б на устойчивость к микроманипуляциям ооцитов, созревших в среде, содержащей пролактин и определены параметры электрослияния эмбриональных фибробластов и энуклеированных ооцитов с использованием мультипоратора фирмы Eppendorff.

Практическая значимость. Вследствие усовершенствования способа синхронизации клеточного цикла эмбриональных фибробластов на стадии G0/G1 и созревания ооцит-кумулюсных комплексов, а также методов «слепой энуклеации» и электрослияния цитопластов и кариопластов повышена эффективность технологии получения клонированных эмбрионов крупного рогатого скота.

Апробация результатов диссертации.

диссертации доложены на научных конференциях Цента биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ ВИЖ в период с 2009 по 2011 гг., а также на научных конференциях: 8-я Международная научная конференция-школа ВИЖ "Современные достижения и проблемы генетики и биотехнологии сельскохозяйственных животных" (Дубровицы, 2009), региональная конференция молодых ученых Курганской ГСХА:

"Молодежный научный потенциал в инновационном развитии уральского региона" (Курган, 2009), Международная научно-практическая конференция Уральской государственной академии ветеринарной медицины:

«Инновационные подходы в ветеринарии, биологии и экологии» (Троицк, 2011), I Всероссийская конференция "Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет" (Санкт-Петербург, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных статей, из них 3 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 130 страницах компьютерного набора и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений и списка использованной литературы, который включает в себя 276 источников, в том числе 267 иностранных авторов. Работа содержит 7 таблиц, 18 рисунков.

Положения, выносимые на защиту:

- эффективность «слепой энуклеации» ооцитов зависит от расположения первого полярного тельца относительно метафазы II. Отклонение более чем на 5 градусов снижает эффективность удаления хромосом;

- на выделение и расположение первого полярного тельца влияет время культивирования и присутствие в среде пролактина. Наибольшая доля ооцитов с ППТ наблюдается в период с 20 до 26 часов. Миграция первого полярного тельца начинается после 20 часов созревания. Пролактин не изменяет динамику выделения, но замедляет процесс миграции первого полярного тельца на 2 часа;

- слияние цитоплазм эмбрионального фибробласта и энуклеированного ооцита крупного рогатого скота с целью образования цитогибрида и его последующее эмбриональное развитие зависит от силы, продолжительности и кратности электроимпульса. Наиболее эффективным является режим: два последовательных импульса силой 30 Вт продолжительностью 15 мкс;

- цитохалазин Б не влияет на эффективность реконструирования ооцитов, созревающих в среде без пролактина и снижает долю комплексов цитопласт/кариопласт в случае использования яйцеклеток, созревающих в его присутствии;

- культивирование эмбриональных фибробластов в течение двух дней в среде содержащей 5% сыворотки является высокоэффективным способом синхронизации клеточного цикла в фазе G0/G1;

- пролактин улучшает развитие клонированных и партеногенетических эмбрионов крупного рогатого скота. Наибольший процент развития клонированных бластоцист получается при «слепой энуклеации» ооцитов, созревающих в течение 18-22 часов. Положительный эффект пролактина в исследуемой системе культивирования на развитие искусственно активированных ооцитов выше, чем реконструированных.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа была выполнена в период с 2008 по 2011 год.

Экспериментальные исследования проводились в центре биотехнологии и молекулярной диагностики ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии по схеме, представленной на рисунке 1.

Объектом исследования служили ооцит-кумулюсные комплексы, выделенные из яичников убитых на мясокомбинате коров, созревшие ооциты на стадии метафазы II, цитопласт, эмбрионы, эмбриональные фибробласты, комплексы цитопласт/кариопласт.

Все манипуляции с ооцитами, цитопластами и комплексами цитопласт/кариопласт проходили в среде ТС-199, содержащей 10мМ HEPES, 10% к объему фетальной сыворотки плода коров и 50 мкг/мл гентамицина (ТС-199М).

Яичники крупного рогатого скота доставляли с мясокомбината в термосе с физиологическим раствором при температуре 30-35о С в течение 3часов. Выделенные путем рассечения видимых фолликулов яичников, ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК) культивировали в 4-луночных чашках Nunc группами по 30-40 штук в 500 мкл среды, покрытой минеральным маслом, при температуре 38,5С в атмосфере с 5% СО2 и 90%-ной влажности.

Время инкубации составляло 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 часов. В качестве контроля использовали среду ТС-199, содержащую 10% ФБС, 1 мМ Naпирувата, 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС), 0,5 мкг/мл ФСГ и 0, мкг/мл ЛГ, 50 мкг/мл гентамицин-сульфата. В опытных группах в среду вносили бычий пролактин (50 нг/мл). Перед процедурой энуклеации созревшие ооциты освобождали от окружающих кумулюсных клеток в среде ТС-199М, содержащей 0,1% гиалуронидазы. Для манипуляций отбирали только ооциты с первым полярным тельцем.

Источником кариопластов служили эмбриональные фибробласты крупного рогатого скота, выделенные из 50 дневного плода животного. Для работы с соматическими клетками использовалась среда ДМЕМ, с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л), дополненной 2 мМ глутамина,1 мМ пирувата натрия, 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% несущественных аминокислот, 0,1 мМ 2-меркаптоэтанола и 50 мкг/мл гентамицина.

Проведение процедуры энуклеации ооцитов и переноса соматических клеток в цитопласт осуществляли методом прямого прокола зоны пеллюцида при помощи манипулятора TransferMan NK2 и масляно-гидравлического микроинъектора Cell Tram Oil.

Комплекс цитопласт и кариопласт объединяли методом электрослияния в микрокамере с использованием мультипоратора фирмы Eppendorf при температуре 37°C. Непосредственно перед переносом комплексов пространство между электродами заполнялось модифицированным буфером для электрослияния.

Культивирование ОКК 16, 18, 20, 22,24 26 часов + пролактин Освобождение ооцитов от клеток кумулюса ооцитов с Активацию полученных цитогибридов проводили химическим методом путем инкубации при 38,5°C в среде ТС-199М, содержащей 5 мкм иономицина в течение 5 минут и культивировали в среде CR1aa, содержащей 2 мМ 6-DMAP. Через 3 часа их вновь переносили в среду CR1aa и культивировали в течение 7 дней до стадии бластоцисты. На пятый день культивирования к среде добавляли 10% ФБС.

Для цитогенетического исследования ядерного материала эмбрионов готовили суховоздушные препараты по методу Тарковского и подсчитывали число ядер для подтверждения стадии их развития.

Для определения стадии клеточного цикла проводили окраску клеток на ДНК с использованием двух методов: гистохимического (по Фельгену) и с применением красителя Hoechst 33342. Относительное количество ДНК ядер клеток определяли с использованием камеры и компьютерной программы Image Scope по методике Шихова (Москва, ООО «Системы для микроскопии и анализа»).

Данные обрабатывали методом 2 или двухфакторным дисперсионным анализом при помощи компьютерной программы Sigma Stat. Достоверность различия сравниваемых значений оценивали с использованием критерия или Тьюки, при этом был принят уровень значимости P < 0,05.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Моделирование условий культивирования бычьих эмбриональных фибробластов с целью синхронизации клеточного цикла на стадии G0/G1.

Одним из показателей характеризующих стадию клеточного цикла является количество ДНК в ядре. Нами была исследована степень синхронизации клеточного цикла на стадии G0/G1 в зависимости от продолжительности культивирования бычьих эмбриональных фибробластов и содержания в среде ФБС. Для этого бычьи эмбриональные фибробласты с момента формирования ими 100% монослоя культивировали в среде, содержащей 5 или 10% ФБС в течение 1, 2, 3, 4, 5 и 6 дней.

При применении обоих методов наблюдалась одинаковая тенденция в характере изменения содержания ДНК в ядрах при использовании сред с различным содержанием ФБС. С точки зрения эффективности синхронизации клеток в фазе G0/G1, характеризующейся снижением количества ДНК в ядрах, наиболее результативным оказалось использование ростовой среды, содержащей 5% ФБС. Максимальное число клеток на данной стадии клеточного цикла (с низким содержанием ДНК) было установлено на второй день культивирования – 95–96%. Начиная с четверного дня культивирования наблюдалась деградация клеток. При использовании ростовой среды, содержащей 10% ФБС, данные изменения в морфологии клеток были менее выраженными. Число клеток в фазе G0/G было значительно ниже, чем при применении 5% сыворотки.

Влияние пролактина на эффективность «слепой энуклеации»

ооцитов коров в зависимости от расположения первого направительного тельца относительно хромосом на метафазе II.

Одним из элементов технологии клонирования является получение цитопласта. Чаще всего для этого проводят полную энуклеацию хромосом ооцита на стадии метафазы второго деления мейоза. С точки зрения сохранения полноценности и способности к последующему эмбриональному развитию «слепой» метод энуклеации рассматривается как наиболее эффективный (Hua et al., 2007). Однако по мере старения яйцеклетки связь между хромосомами и направительным тельцем разрушается и последний начинает мигрировать в перевителлиновом пространстве.

Нами было исследовано влияние места локализации ППТ относительно хромосом ооцита, на эффективность энуклеации ооцитов коров, созревающих in vitro в присутствии пролактина. Контролем служили ооциты, разделенные на аналогичные группы, созревающие в среде без пролактина.

Для этого оголенные ооциты с ППТ окрашивали в среде ТС 199М, содержащей 10 мкг/мл красителя Hoechst 33342 в течение 5 минут и разделяли на группы: 1 группа – ориентированные – ооциты, у которых хромосомы расположены рядом с ППТ; 2 группа – ооциты, в которых наблюдается отклонение ППТ не более чем на 50 ; и 3, 4, 5 группы - ооциты, с отклонением ППТ в диапазоне от 6 до 100, от 11 до 300 и от 31 до соответственно. Локализацию ППТ определяли на флуоресцентном микроскопе путем измерения угла между линиями, соединяющими центр ооцита с первым полярным тельцем и с метафазной пластинкой. После процедуры слепой энуклеации ооциты повторно окрашивали Hoechst 33342, с последующей оценкой эффективности удаления их собственного генетического материала.

Влияние пролактина на эффективность «слепой энуклеации» в зависимости от расположения ППТ в ооцитах коров 6- 11- 31- В результате экспериментов установлено, что эффективность слепой энуклеации снижалась с увеличением угла отклонения ППТ от места расположения хромосом. Наибольший процент цитопластов был получен из ооцитов 1 группы, у которых хромосомы были расположены рядом с ППТ.

Отклонение ППТ до 50 практически не снижало данный показатель. В случае, когда ППТ откланялось от места локализации метафазы II на 6 и более градусов, эффективность энуклеации достоверно снижалась. Так в контроле в 3, 4 и 5 группах доля энуклеации была меньше, чем в 1 группе на