На правах рукописи

Кравцова Татьяна Робертовна

ОКСИГЕННЫЕ ФОТОТРОФНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ,

АССОЦИИРОВАННЫЕ С ГИДРОИДОМ DYNAMENA PUMILA

Специальность 03. 02. 10. – гидробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва-2013

Работа выполнена на кафедрах биоинженерии и гидробиологии биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Ильяш Людмила Васильевна (Биологический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова) доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Кокшарова Ольга Алексеевна (Научно-исследовательский институт физикохимической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова)

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Симаков Юрий Георгиевич (Московский государственный университет технологий и управления) доктор биологических наук, старший научный сотрудник Куликов Алексей Михайлович (Институт биологии развития имени Н.К. Кольцова РАН)

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение науки Институт фундаментальных проблем биологии Российской академии наук (ИФПБ РАН)

Защита диссертации состоится «28» ноября 2013 г. в 11часов 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.55 при Московском государственном совете имени М.В.Ломоносова, по адресу: 119234 Москва, Ленинские горы, 1, 12, МГУ имени М.В.Ломоносова, биологический факультет, аудитория 389.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «» октября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Карташева Н.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Эпибиоз – это ассоциация, состоящая из организмахозяина (базибионта) и живущих на нем организмов (эпибионтов). Эпибиоз широко распространен в водных экосистемах, при этом в качестве базибионта выступают водная растительность, простейшие и многоклеточные животные, в том числе гидроидные полипы (Di Camillo et al., 2005, 2008; Romagnoli et al., 2007; MartnezGarca et al., 2011; Burke et al., 2011). Обязательным компонентом всех эпибионтных сообществ, обитающих в фотической зоне, являются оксигенные фототрофные микроорганизмы (ОФМ): цианобактерии и одноклеточные водоросли. Исследования эпибионтных ОФМ актуальны с точки зрения оценки видового разнообразия, биотических взаимоотношений между компонентами и продуктивности водных экосистем.

Проведенные ранее исследования эпибионтных ОФМ, ассоциированных с гидроидным полипом Dynamena pumila, обитающим в Белом море, выявили присутствие разнообразных цианобактерий и эукариотных водорослей, которые, за исключением диатомовых водорослей, не были идентифицированы (Лобакова и др., 2008; Gorelova et al., 2013). Идентификация многих ОФМ представляет значительную трудность, и для уточнения их систематического положения с успехом используются молекулярно-генетические методы (Ernst et al., 2003; Taylor et al., 2007; Perkerson et al., 2011 и др.). Именно на основе их применения выявлено, что значительная часть видов ОФМ в природных водных экосистемах еще не идентифицирована, отсутствуют сведения об их ареалах и функциональной роли в экосистемах (Follows et al., 2007).

В предыдущих исследованиях показано, что среди ОФМ, ассоциированных с D. pumila, по численности преобладают цианобактерии и диатомовые водоросли (Горелова и др., 2009; Gorelova et al., 2013), тогда как оценки их биомассы, а также сведения о динамике биомассы в течение летнего периода до настоящего времени отсутствовали.

Цель работы - оценка численности и биомассы оксигенных фототрофных микроорганизмов, ассоциированных с гидроидным полипом Dynamena pumila и определение таксономического положения ОФМ, выделенных из ассоциации с гидроидом.

Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:

- Оценить численность и биомассу диатомовых водорослей и цианобактерий основных компонентов эпибионтного сообщества беломорского гидроида Dynamena pumila в июне и августе.

- Получить изоляты ОФМ, из ассоциаций с гидроидом D. pumila.

- Охарактеризовать морфологию, ультраструктуру и состав пигментов ОФМ, изолированных из ассоциаций с гидроидом D. pumila микроорганизмов.

- Провести молекулярно-генетическое типирование и филогенетический анализ ОФМ, изолированных из ассоциации с гидроидом D. pumila.

Научная новизна. Выявлена выраженная сезонная и пространственная изменчивость биомассы эпибионтных диатомей и цианобактерий на молодых междоузлиях беломорского гидроида Dynamena pumila. Показано достоверное различие в трендах величины биомассы диатомовых водорослей и цианобактерий в идентифицированы цианобактерии Synechococcus sp., Leptolyngbya sp., Nostoc sp.

Установлено, что ближайшие родственники этих ОФМ обитают как в морских, так и пресных водоемах разных широт. Цианобактерии Leptolyngbya sp. 2Dp86E и Nostoc sp. 10Dp66E являются новыми видами для биоты Белого моря. В ассоциации с Nostoc sp. впервые выявлена гетеротрофная бактерия рода Gemmatimonas.

Практическая значимость работы. Полученные данные расширяют представления о видовом разнообразии и обилии ОФМ, ассоциированных с беспозвоночными животными, обитающими в Белом море. Результаты могут быть использованы при оценке продукционного потенциала Белого моря, а также при решении таких фундаментальных задач гидробиологии и экологии, как выявление механизмов формирования видовой структуры и поддержания видового разнообразия эпибионтных сообществ. Synechococcus sp., Leptolyngbya sp., Nostoc sp., Desmodesmus sp. ведутся как лабораторные культуры, которые могут быть использованы в биотехнологических проектах в качестве продуцентов биологически активных соединений. Результаты могут быть использованы в курсах лекций и практикумах по гидробиологии.

Апробация работы и публикации. Диссертационная работа апробирована и рекомендована к защите на совместном заседании кафедр гидробиологии и биоинженерии, на заседании международного биотехнологического центра МГУ международной научной конференции «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях Крайнего Севера» (Апатиты, 2009), на международной научно-практической конференции «Водоросли и цианобактерии в природных и сельскохозяйственных экосистемах» (Киров, 2010), на 2-ой и 3-ей Московских международных конференциях «Молекулярная филогения» (Москва, 2010, 2012), на 4-ой международной Европейской конференции микробиологов FEMS (Женева, 2011), на Всероссийском симпозиуме «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2010), на 4-ой международной конференции «Актуальные проблемы современной альгологии» (Киев, 2012), на международной конференции «Физиология и биотехнология микроводорослей»

(Москва, 2012).

По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 3 статьи опубликованы в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

машинописного текста, содержит 13 таблиц и 26 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, приложения и списка литературных источников, включающего 361 наименований.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

пространственно-временная изменчивость на разных группах организмовбазибионтах. Дана общая характеристика колониального гидроида Dynamena pumila и состава ассоциированных с ним ОФМ. В Белом море D.pumila распространен в сублиторали, обитает в основном на фукусах, встречается также на камнях, аскофиллумах и ламинариях. Высота колоний редко превышает 7 см. Тело гидроида представляет собой разветвленную двухслойную трубу, часть которой - столоны гидроризы прикреплены к субстрату. Вдоль столон гидроризы примерно через каждые 2,5 мм образуются вертикально поднимающиеся побеги, которые также ветвятся. Ствол побега состоит из междоузлий длиной 2-3 мм, отделенных друг от друга сужением ствола. Гидранты располагаются на стволе побега друг против друга, лишены ножки и приплюснуты к стволу, имеют внешний скелет – гидротеку (Марфенин, 1993). Удлинение колонии происходит моноподиальным способом с терминально расположенными зонами роста. При средней температуре воды 12-18С новое терминальное междоузлие может развиваться за 24-72 ч (Косевич, Федосов, 2008; Gorelova et al., 2013).

Также обсуждены современные молекулярно-генетические методы и их применение для исследований ОФМ, обитающих в водных экосистемах.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Образцы колоний гидроида D. pumila отбирали в верхнем горизонте сублиторали Ругозерской губы Кандалакшского залива Белого моря в районе Беломорской биологической станции МГУ имени Н.А. Перцова в июне и августе 2006 г. и 2007 г. С апикальной части колоний 3-5 гидроидов срезали первые 4– междоузлий. В лаборатории с помощью светового микроскопа Leica DM2500 делали фотографии поверхности гидроида, включая фронтальную сторону междоузлия, зону слияния ствола и гидротеки. В июне было сделано 30 фотографий, в августе – 16. По фотографиям на участках определенной площади, выбранных случайным образом, подсчитывали количество эпибионтных ОФМ. Количество клеток (N) пересчитывали на 1 мм2 поверхности гидроида. Объемы клеток определяли методом геометрического подобия (Hillebrand et al., 1999). Величину биомассы в единицах углерода (B) рассчитывали по аллометрическим уравнениям (Menden-Deuer, Lessard, 2000). Площадь поверхности колонии гидроида рассчитывали по средним линейным размерам междоузлия (Марфенин, 1993) методом геометрического подобия, принимая, что высота побега составляет 20-25 междоузлий с учетом бокового ветвления 30-300% в зависимости от возраста колонии (Марфенин, 1993).

Достоверность различий средних значений N и B оценивали по критерию МаннаУитни с использованием программы PAST (PAleontological STatistics) Version 2. (http://folk.uio.no/ohammer/past/).

В работе использованы накопительные культуры ОФМ, выделенные из ассоциаций с D. pumila сотрудниками каф. биоинженерии биологического факультета МГУ. Выделение моновидовых изолятов цианобактерий и эукариотных водорослей из накопительных культур проведено с участием автора. Изоляты культивировали на жидкой и твёрдой (1.5% агара) минеральной среде BG-11 и её безазотном аналоге BG-110 (Stanier et al., 1971).

Спектры поглощения клеточных суспензий в видимом и ближнем ИКдиапазоне снимали на спектрофотометре снабженном интегрирующей сферой. Компенсацию на вклад светорассеяния осуществляли, как описано в работе (Merzlyak, Razi Naqvi, 2000).

Выделение хромосомной ДНК из цианобактерий проводили согласно методике (Koksharova et al., 1998). Амплификацию фрагментов нуклеотидных последовательностей генов 16S pPHK-23S pPHK проводили по методике (Papaefthimiou et al., 2008). В качестве праймеров применяли опубликованные нуклеотидные последовательности (Nbel et all., 1997; Taton et all., 2003) и праймеры, дизайн которых был осуществлен в настоящей работе. Нуклеотидные последовательности nifH гена амплифицировали с помощью праймеров (Ben-Porath, Zehr, 1994). Для амплификации фрагментов нуклеотидных последовательностей 18S pPHK в качестве праймеров применяли нуклеотидные последовательности (Katana et al, 2001). Все праймеры синтезировали в компании «Синтол» (Россия).

Амплификацию проводили в амплификаторе ТЕРЦИК (НПФ «ДНК-Технология», Россия).

Ампликоны клонировали в векторе pJET 1.2/blunt с помощью набора для клонирования ПЦР фрагментов CloneJetTM PCR Cloning Kit # K1231 фирмы Fermentas (EU). Секвенирование ДНК проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer в ЦКП «Геном».

Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программ BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer) с использованием нуклеотидных баз последовательности изучаемых ОФМ сравнивали с последовательностями, представленными в генном банке (GenBank) с помощью программы BLAST с отбором их по степени сходства, обеспечивающей достаточное разнообразие видов.

Последовательности отобранных видов выравнивали посредством программы MEGA 5.1 (http://www.megasoftware.net/) с использованием алгоритма ClustalW v.1.6. Для филогенетических построений использовали метод кластеризации - метод ближайшего соседа (Neighbor-Joining) с предварительным выбором оптимальной эволюционной модели нуклеотидных замен (MEGA 5.1). Статистическую надежность топологий получаемых деревьев оценивали с помощью бутстрепанализа в 1000 повторностях (MEGA 5.1).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Пространственно-временная динамика ОФМ, ассоциированных с колониальным гидроидом Dynamena pumila. В летний период на первых пяти междоузлиях беломорских гидроидов D. pumila присутствуют одноклеточные и трихомные цианобактерии, диатомовые и зеленые водоросли.

Диатомовые водоросли. В июне встречались только «прикрепленные» формы Cocconeis scutellum, C. costata и Licmophora sp. В августе видовое богатство диатомей увеличилось до 20 таксонов. В июне средние значения численности (N) и биомассы (В) диатомей составили 2,09±1,85 тыс. кл./мм2 и 0,130 ±0,115 мкг С/мм2),