«БИОТЕХНОЛОГИЯ (Часть 1) Микробная биотехнология Химическая энзимология Учебное пособие Составители: Т.А. Ковалева, А.И. Сливкин, А.С. Беленова С.Н. Суслина Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного ...»

Применительно к производству антибиотиков (стадия ферментации) непосредственно относится указание на карантин, которому должно подвергаться сырье (т.е. компоненты, входящие в комплексные среды), на необходимость статистических критериев вариабельности компонентов сырья, на проверку определенных видов сырья на пирогенность.

Нормируется содержание микроорганизмов в воде для очистки и промывки получаемых лекарственных средств.

Контроль процесса производства лекарственных препаратов должен осуществляться в соответствии с технологической документацией. Следует отметить, что правила GMP разных стран не совпадают с предлагаемыми методами стерилизации готового продукта. В целом преимущество отдается термическим методам стерилизации. GMP некоторых стран допускают также радиационную стерилизацию и стерилизацию окисью этилена.

Большое внимание в GMP уделяется обеспечению четкого выполнения производственных инструкций.

Подробно регламентируется перечень документов, точек контроля, возможных отклонений от принятых норм. Регламентируются способы фиксации результатов.

Набор требований по регистрации и отчетности, содержащийся в GMP, позволяет проследить за ходом выполнения производственного процесса и точно установить в случае необходимости всю последовательность действий персонала, приведшую к отклонению качества продукта от требуемого параметра.

Само собой разумеется, что правила GMP предусматривают строгую регламентацию тех выбросов, которые могут поступать от фармацевтических и биотехнологических предприятий в окружающую среду. Правила рекомендуют практически полное предотвращение поступления штаммовпродуцентов рекомбинантных белков в стоки и газо - воздушные выбросы, исключение попадания аллергенноактивных продуктов микробиологического синтеза в атмосферу с помощью различных технических решений, предотвращение сброса со сточными водами биотехнологических полупродуктов, способных повлиять на активность и состав биоценозов, используемых на установках биологической очистки загрязненной воды.

Имеющие силу закона в ряде стран правила GMP позволяют предприятиям выпускать конкурентоспособную продукцию. Как показал международный опыт внедрения в медицинскую практику новых лекарственных препаратов, производимых биотехнологическими способами, организация их предварительных испытаний также должна подчиняться определенным правилам. Официальные инстанции, дающие разрешение на промышленный выпуск нового препарата, требуют соблюдения этих правил и соответствующего оформления документации. Всем этим повышается достоверность и объективность экспериментальных результатов и результатов испытаний в клинике.

Правила GLP расшифровываются как "Good Laboratory Practice", что означает правильную (надлежащую) организацию проведения лабораторной работы при исследовании препарата. Правила GLP охватывают всю систему предклинических испытаний. В качестве лишь одного из примеров отметим, что правилами предъявляются определенные требования к планировке помещений вивария, где содержатся подопытные животные, к условиям содержания животных, их подбору и т.п. Организация предклинических лабораторных испытаний должна обеспечивать объективность при сопоставлении данных в контроле и опыте.

Весьма существенное значение для разрешения на промышленный выпуск нового препарата имеют правила GCP "Good Clinical Practice", т.е.

надлежащая организация работы при проведении клинических испытаний.

Соблюдение правил GCP позволяет получать объективные результаты и дает определенные гарантии приближения к максимальной безопасности в случае впервые вводимых человеку препаратов.

1. Этапы подготовки культуральной жидкости к переработке.

2. Основные типы сепараторов, применяемые в биотехнологии.

3. Дезинтеграция. Основные способы дезинтеграции.

4. Методы разделения веществ, применяемые в биотехнологии.

5. Контроль качества продуктов биосинтеза.

6. Тесты, применяемые при стандартизации лекарственных средств.

7. GMP - как единая система требований по организации производства и контролю качества лекарственных средств.

5. АНТИБИОТИКИ. КЛАССИФИКАЦИЯ. ПОЛУЧЕНИЕ

АНТИБИОТИКОВ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА

АНТИБИОТИКОВ.

Химиотерапевтические средства – это лекарственные вещества, используемые для подавления жизнедеятельности и уничтожения микроорганизмов в тканях и средах больного, обладающие избирательным, этиотропным (действующим на причину) действием.

Чтобы выбрать антибиотик для лечения того или иного заболевания, необходимо иметь представление каким образом антибиотики могут воздействовать на микроорганизмы. Все антибиотики можно классифицировать:

- по механизму действия:

1. Нарушающие синтез биомакромолекул; циклосерин; гликопептиды;

ванкомицин; тейкоплакин).

2. Нарушающие функции цитоплазматической мембраны (циклические полипептиды, полиеновые антибиотики).

3.Нарушающие синтез белка в рибосомах (группа левомицетина, тетрациклина, макролиды, линкозамиды, аминогликозиды, фузидин, анзамицины).

4. Ингибиторы синтеза РНК и ингибиторы метаболизма фолиевой 5. Ингибиторы синтеза мРНК (актиномицин).

-по типу действия:

1. Антибиотики с бактерицидным действием приводят к гибели бактерий путем влияния на клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану и приводящие к гибели бактерии.

2. Антибиотики с бактериостатическим действием влияют на синтез макромолекул и останавливают размножение бактерий.

- по спектру действия:

1. Антибиотики с преимущественным действием на грамположительные микроорганизмы (линкозамиды, биосинтетические пенициллины, фузидин, ванкомицин).

2. Антибиотики с преимущественным действием на грамотрицательные микроорганизмы (монобактамы, циклические полипептиды).

3. Антибиотики широкого спектра действия (аминогликозиды, левомицетин, тетрациклины, пинемы, анзамицины, цефалоспорины).

- по химической структуре Широкое применение антибиотиков в медицине, сельском хозяйстве и других отраслях народного хозяйства поставило задачу получения этих биологически активных веществ в больших количествах. Решение этой задачи стало возможным благодаря созданию мощной фармацевтической промышленности.

В основе промышленного производства антибиотиков лежит ряд последовательных этапов: получение высокопродуктивных штаммовпродуцентов, разработка наиболее благоприятных условий культивирования продуцента антибиотика с максимальным биосинтезом этого вещества, подбор и внедрение в практику соответствующих методов выделения и очистки антибиотика, создание готовых препаратов и контроль их качества.

Каждый из этих этапов должен обеспечиваться соответствующими специалистами (генетиками, микробиологами, технологами и др.).

Производство антибиотиков представляет ныне мощную, хорошо развитую отрасль, входящую в фармацевтическую промышленность. Она занимает одно из ведущих мест в производстве лекарственных препаратов. Особенно широко она развита в США, Англии, Японии, Франции, Италии и других странах. Например, в США ежегодно выпускается антибиотиков и их производных на сотни миллионов долларов.

Среди антибиотиков выделяют -лактамы Пенициллины. Пенициллин впервые получен из культуральной жидкости в аморфном, а затем – в кристаллическом виде А.

Флемингом, X. Флори и Е. Чейном в 1940 г. До сих пор антибиотики химиотерапевтических препаратов. Ядром пенициллинов является 6аминопенициллиновая кислота (6-АПК), которую используют для получения полусинтетических пенициллинов.

Один водород в аминогруппе 6-АПК может быть заменен на какой-либо радикал (R), усиливающий и (ИЛИ) расширяющий (изменяющий) антимикробный спектр полусинтетического производного. Обычно 6-АПК получают из бензилпенициллина (пенициллина G).

В настоящее время в различных странах многие антибиотики и их полусинтетические производные на их основе производят биосинтетически с помощью Penizillum notatum или Penizillum chrysogenum.

экстрацеллюлярных -лактамных антибиотиков, в которых шестичленное дигидротиазиновое кольцо соединено с -лактамным кольцом. Благодаря этому ядром цефалоспоринов является 7аминоцефалоспорановая кислота – 7-АЦК (цефемовое ядро), впервые выделенная в ходе очистки цефалоспорина С – продуцент Cephalosporium acremonium.

Известно около 20 цефалоспоринов, созданных методом полусинтеза из АЦК: цефалоридин (цепорин), цефуроксим, цефалотин, цефацетрил, цефалексин, цефокситин, цефазолин, цефаридин, цецефотаксим, цефтриаксон, цефтазидим и др.

Боковые цепочки, содержащие 2-аминотиазолил как R1 в цефотаксиме, цефтриаксоне, цефтазидиме и некоторых других, усиливают активность цефалоспоринов против стрептококков и грамотрицательных бактерий.

Иминометоксигруппа в той же позиции, например, в цефуроксиме, обеспечивает активность антибиотика против стафилококков и грамотрицательных бактерий.

В таблице приведены радикалы R1 и R2.

1 – Оксацефемы – сходны с цефалоспоринами, у которых атом серы в дигидротиазиновом (цефеконовом) кольце замещен на кислород. Представителем такой группы антибиотиков является широкоспектральный препарат латамоксеф (мексалактам), в котором 7--метоксигруппа стабилизирует молекулу и придает устойчивость большинству -лактамаз.

Клавамы – -лактамные антибиотики, отличающиеся от пенициллинов тем, что в тиазолидиновом кольце последних сера заменена на кислород (клавемовое оксазолидиновое кольцо) и в позиции 6 нет боковой цели.

Такой антибиотик – клавулановая кислота выделена из Streptomyces clavuligerus. Она слабо активна в отношении бактерий, но является потенциальным ингибитором стафилакокковой -лактамазы и -лактамазы, образуемой грамотрицательными бактериями.

Радикалы, входящие в состав цефалоспоринового ряда 2-аминотиазол-4-илметоксиимино)ацетил 6-гидрокси-2-метил-5оксо-2,5-дегидро-1,2,4аминотиазол-4-илметоксиимино)ацетил триазин-3-илтио…натриевая соль 1 – Карбапенемы – это новое семейство -лактамных антибиотиков, представляющих собой аналоги пенициллинов или клавамов, в которых сера у первых, и кислород у вторых замещены на углерод:

К этому семейству относятся оливановые кислоты и тиенамицин Их продуцентами являются стрептомицеты. Эти антибиотики обладают широким антимикробным спектром и являются выраженными ингибиторами -лактамаз.

Нокардицины – новая группа -лактамных антибиотиков, продуцируемых бактериями из рода Nocardia. Выделены нокардицины А, В, D, E, F, G.

Монобактамы – это моноциклические монобактамные антибиотики, продуцируемые штаммами бактерий, например, Pseudomonas acidophila или Geuconobacter species.

Их ядром является 3-аминомонобактамовая кислота (3-АМК). Ее можно получить из природных монобактамов или из 6-АПК.

Антибиотики – тетрациклины – это антибиотики с широким спектром антибактериального действия. Их продуцентами являются стрептомицеты.

Некоторые тетрациклины относятся к ряду полусинтетических препаратов.

Антибиотики - гликозиды. Среди этой группы антибиотиков выделяют группы, содержащие О-, S- и N- гликозидные связи. К числу первых относят аминогликозидные антибиотики и новобиоцин, ко вторым – клиндамицин и линкомицин, к третьим – некоторые нуклеозидные антибиотики.

Антибиотики – О-гликозиды. Аминогликозиды – содержат аминосахара в своей структуре. Большинство из них (канамицин, гентамицин и др.) продуцируются актиномицетами. Все антибиотики-аминогликозиды обладают широким спектром действия на различные патогенные бактерии.

Продуцентами гентамицинов является Mieromonospora. purpurea.

Антибиотики – макролиды имеют О-гликозидные связи (эритромицин, олеандомицин, триацетилолеандомицин, спирамицин и др.). Они продуцируются стрептомицетами и проявляют активность против большинства грамположительных и некоторых грамотрицательных бактерий и содержат в своей структуре макроциклическое лактонное кольцо, связанное с углеводными остатками, из которых аминосахар, если он имеется, всегда располагается ближе к макролактону, чем нейтральный углевод.

Олеандомиццн, его эфир - триацетилолеандомицин и спирамицин сходны по спектру антибактериального действия с эритромицином, но несколько слабее его активности.

Новобиоцин продуцируется культурой Streptomyces spheroides, активен против возбудителей пневмонии, некоторых кишечных и раневых инфекций, ангин и флегмон. По химической структуре – это О-гликозид (амидогликозид), агликон которого существенно массивнее углеводной части.

Оливомицин – О-гликозидный антибиотик, в котором углеводная часть представлена триозой и биозой, между которыми как бы «вставлен» агликоноливин (хромомицинон).

Оливомицин является представителем большой группы антибиотиков – аналогов ауреоловой кислоты (митрамицина), активных против грамположительных бактерий и отдельных опухолей. Оливомицин продуцируется Streptomyces olivoreticuli.

Дауномицин (рубомицин) – О-гликозидный антибиотик из группы антрациклинов, образуемый Streptomyces species. Антибиотик обладает противомикробным и противоопухолевым действием.

иммуносупрессивным и противоопухолевым действием, синтезируемый стрептомицетами.

Ристомицин А (ристоцетин) – О-гликозидный антибиотик, в составе которого имеется циклизованная агликоновая часть (циклопентит) и углеводный компонент, включающий ристозамин, маннозу, арабинозу, глюкозу и рамнозу, активен против грамположительных бактерий.

Антибиотики - S-гликозиды Из этой группы антибиотиков наиболее известны линкомицин и клиндамицин, гликоном которых является метил. Из них клиндамицин является производным линкомицина, у которого гидроксил в позиции заменен на хлор.

Клиндамицин лучше всасывается в кровь из кишечника. Оба антибиотика активны преимущественно против грамположительных кокков.

Антибиотики - N-гликозиды Гужеротин – антибиотик широкого спектра антимикробного действия, продуцируется культурой Streptomycis gougerotii.

Пуромицин – N-гликозидный антибиотик, применявшийся при изучении и расшифровке процесов элонгации, подобен 3'-концу аминоацил-тРНК, связывающейся с определенным участком рибосомы. Продуцентом пуромицина является Streptomyces alboniger. Антибиотик ингибирует, биосинтез белка многих микроорганизмов, включая трипаносомы, однако терапевтическое значение его невелико.

Антибиотики -депсипептиды Они продуцируются бациллами и проявляют активнсть против грамположительных и/или грамотрицательных патогенных бактерий (бацитрацины, грамицидины, полимиксины и др).

В таблице представлены продуценты данных антибиотиков.

lichenitormis Bacillus brevis var.G.-B.

polymixa Bacillus.circula Полимиксин B1, циркулин А и колистин различаются по единичным аминокислотным остаткам.

К циклопептидным антибиотикам относится также циклоспорин А, продуцируемый мицелиальными грибами Cephalosporium lucidum и Tolypoeladium inflatum-Bauveria nives. Отличительным свойством данного антибиотика является его иммуносупрессивное действие, его преимущественно используют трансплантологии. Также он проявляет антифунгицидную активность.

Антибиотики – актиномицины составляют большую группу сходных веществ, синтезируемых стрептомицетами. По химическому строению их относят к хромопептидам, содержащим феноксазиновую хромофорную группу и два пентапептида в форме циклических лактонов. Некоторые из них обладают противоопухолевым и иммуносупрессивным действием. На практике хорошо известен актиношцин (дактиномицин), ингибирующий синтез мРНК.

Антибиотики – полиены-это группа лекарственных препаратов, продуцентами которых являются стрептомицеты и некоторые мицелиальные грибы, образующие структуры с четырьмя-семью сопряженными двойными связями. В медицинской практике наибольшее распространение получили нистатин, фумагиллин, амфотерицин В и полусинтетический амфоглюкамин, обладающие противогрибковым действием (преимущественно – в отношении патогенных дрожжевых организмов и некоторых других видов грибов).

Фумагиллин ингибирует стафилококки, дизентерийную амебу, бактериофаги.

Нистатин – аналог амфотерицина В, но в его цепочке (в позиции 20-27) содержится 4 конъюгированных двойных связи.

Антибиотики – анзамицины образуются актиномицетами и некоторыми растениями. В молекулах антибиотиков данной группы к ароматическому ядру присоединяется алифатическая анза-цепь. Наиболее известными из них являются рифоцин (рифампицин SV), рифампицин и рифамид. Анзамицины – широкоспектральные антибиотики, ингибирующие бактерии, отдельные вирусы и некоторые эукариотические клетки.

Рифампицин – продуцент Streptomyces mediterranei, является одним из лучших химиотерапевтических средств при туберкулезе, проявляющим бактерицидное действие против Mycobacterium tuberculosis. Он проникает в спинномозговую жидкость и поэтому эффективен при туберкулезном менингите.

Антибиотики-стероиды продуцируются мицелиальным грибом Fusarium coccineum, активны в отношении многих типов грамположительных бактерий (особенно – стафилококков). К ним относят фузидиевую кислоту, выпускаемую в виде натриевой соли.

Прочие антибиотики Гризеофульвин – продуцируется нитчатым грибом Penicillium griseofulvum и другими, активен в отношении болезнетворных грибов – дерматофитов.

Трихотецин – антифунгицидный антибиотик, используемый прежде всего в ветеринарии и растениеводстве, продуцируется нитчатым грибом Trichothecium roseum и некоторыми другими несовершенными грибами.

Более половины известных антибиотиков продуцируются актиномицетами.

К этой группе антибиотиков относятся стрептомицин и другие антибиотикигликозиды (неомицины, канамицины), тетрациклины, антибиотики-макролиды (эритромицин, олеандомицин) и анзамицины (римфампицин.

Другим важным продуцентом являются плесневые грибы – различные Penicillium,Cephalosporium, противоопухолевых, антибактериальных и противовирусных лекарственных препаратов.

Бактерии рода Bacillus продуцируют большинство антибиотиковполипептидов. Они, как правило, высокотоксичны, но некоторые из них (грамицидин, полимиксин и другие) применяются в медицине. Небольшая группа антибиотиков продуцируется лишайниками, водорослями и другими низшими растениями.

По способу получения антибиотики можно подразделить на три основные группы.

1. К первой группе относят антибиотики, получаемые путем микробиологического синтеза на основе плесневых грибов или актиномицетов. Этим способом получают антибиотики тетрациклинового ряда, природные пенициллины, антибиотики-гликозиды, макролиды и некоторые другие.

2. Ко второй группе относят антибиотики, получаемые за счет химического синтеза из простых органических веществ. Его используют для получения антибиотиков, имеющих несложную химическую структуру – левомицетин и его производные.

3. К третьей группе относят антибиотики, получаемые путем сочетания микробиологического и химического синтеза – полусинтетические антибиотики. На основе трансформации молекул природных антибиотиков получают полусинтетические пенициллины, цефалоспорины, тетрациклины и другие.

Получение природных антибиотиков основано на их биосинтезе в клетках микроорганизмов-продуцентов и включает следующие основные этапы: поиск и селекция высокопроизводительных штаммов продуцентов; подбор оптимального состава питательных сред; разработка и аппаратурное оформление процесса ферментации; выделение и очистка целевого продукта.

Особую значимость в производстве антибиотиков приобретает поиск и селекция высокопроизводительных штаммов-продуцентов. Отобранные наиболее перспективные образцы далее подвергаются индуцированному мутагенезу. Чаще всего для этого используют искусственную мутацию, воздействуя на природный продуцент различными физическими и химическими факторами – ультрафиолетовым, ионизирующей радиацией и химическими веществами. В результате таких воздействий получают штаммы, которые по своей продуктивности целевого продукта – антибиотика в десятки и даже сотни раз превосходят по своей продуктивности исходные (природные) формы.

Широкое применение антибиотиков в медицине, сельском хозяйстве и других отраслях народного хозяйства поставило задачу получения этих биологически активных веществ в массовых масштабах. Решение этой задачи стало возможным благодаря созданию мощной фармацевтической промышленности.

В основе промышленного производства антибиотиков лежит ряд последовательных этапов: получение высокопродуктивных штаммовпродуцентов, разработка наиболее благоприятных условий культивирования продуцента антибиотика с максимальным биосинтезом этого вещества, подбор и внедрение в практику соответствующих методов выделения и очистки антибиотика, создание готовых препаратов и контроль их качества.

Каждый из этих этапов должен обеспечиваться соответствующими специалистами (генетиками, микробиологами, технологами и др.).

Производство антибиотиков представляет ныне мощную, хорошо развитую отрасль, входящую в фармацевтическую промышленность. Она занимает одно из ведущих мест в производстве лекарственных препаратов. Особенно широко она развита в США, Англии, Японии, Франции, Италии и других странах. Например, в США ежегодно выпускается антибиотиков и их производных на сотни миллионов долларов.

По общему производству антибиотиков наша страна занимает ведущее место в мире.

Технологический процесс производства антибиотиков состоит из пяти стадий. На первой стади осуществляется подготовка питательной среды и посевного материала (инокулята).

Для каждого продуцента антибиотика и вновь полученного штамма разрабатывается своя оптимальная среда, которая должна отвечать следующим основным требованиям: а) обеспечивать хороший рост продуцента и максимально возможное образование антибиотика; б) содержать доступные и дешевые компоненты; в) обладать хорошей фильтрующей способностью; г) обеспечивать применение наиболее экономичных и эффективных приемов выделения и очистки антибиотика.

Стерилизация питательных сред в промышленных условиях осуществляется двумя основными методами: периодическим и непрерывным.

Периодический метод стерилизации применяется при использовании небольших объемов среды и состоит в том, что среда нагревается до определенной температуры (120—130°С) непосредственно в ферментерах или в специальных котлах-стерилизаторах, выдерживается при этой температуре в течение 30 – 60 мин (в зависимости от объема среды и ее состава), после чего среда охлаждается до 27—30°С.

Непрерывный метод стерилизации целесообразно применять при использовании больших объемов среды. Приготовленная среда из специального сосуда с помощью насоса подается в стерилизационную колонку, через которую сверху по внутренней трубе, имеющей щелевидные прорези, пропускается острый пар (давление пара около 5 атм.). Питательная среда в колонку поступает снизу и движется по спирали вокруг внутренней трубы.

Далее нагретая в колонке среда поступает в специальный аппарат – выдерживатель, где она при температуре 125-130°С находится определенное время (5-10 мин). Затем она поступает в змеевиковый холодильник, охлаждается до 30 – 35°С (на выходе) и поступает в ферментер.

Непрерывный метод стерилизации имеет ряд преимуществ перед периодическим методом: возможность автоматического регулирования процесса, быстрый и равномерный нагрев среды, обеспечение более полной стерильности среды и другие факторы. При применении в качестве отдельных компонентов субстрата термолабильных веществ их, как правило, следует стерилизовать отдельно в условиях более мягкого режима.

Стадия биосинтеза – основная биологическая стадия в процессе получения антибиотика, обеспечивающая для продуцента такие условия развития, которые бы способствовали максимальному уровню образования БАВ.

Эффективность стадии биосинтеза определяется генетическими особенностями организма, составом питательной среды, режимом развития продуцента и зависит от времени максимального образования антибиотика, стоимости компонентов среды, пеногасителей, энергетических затрат, связанных с процессом развития организма-продуцента. В энергетические затраты включаются расходы энергии при стерилизации среды, ферментера и коммуникаций, а также систем перемешивания культуральной жидкости и продувания воздуха через нее.

В производстве антибиотиков используют методы периодического, непрерывного культивирования, а также методы, занимающие промежуточное положение между периодическим и непрерывным культивированием – полунепрерывный отъемно-доливной метод.

При непрерывном культивировании клетки продуцента размножаются со скоростью, зависящей от притока питательных веществ и некоторых других условий, при этом часть объема культуральной жидкости постоянно вытекает с той же скоростью, с какой подается питательная среда в аппарат.

Метод непрерывного проточного культивирования может быть организован как процесс полного вытеснения и как процесс полного смешения.

культивировании анаэробных микроорганизмов в ферментере, представляющем собой трубу, в которую с одной стороны непрерывно подается питательная среда и посевной материал, а с другой стороны производится отбор культуральной жидкости. Процесс происходит без перемешивания и аэрации. Когда среда и посевной с материал попадают в ферментер, популяция продуцента находится в лаг-фазе, а на выходе из ферментера культура может находиться в любой фазе в зависимости от скорости подачи среды. При этом воспроизводится кинетика роста продуцента, но не во времени, а в пространстве.

В процессе полного смешения размножение культуры происходит в ферментере при интенсивном перемешивании и аэрации. Во всем объеме культуральной жидкости условия должны быть одинаковыми. Процесс полного смешения по типу системы «турбидостат» и «хемостат».

В системе «турбидостат» в ферментере плотность популяции поддерживают постоянной. При быстром потоке среды в данной системе создаются условия, близкие к тем, которые соответствуют экспоненциальной фазе, а при медленном – приближаются к условиям, соответствующим стационарной фазе. В установившемся режиме удельная скорость потока среды равна удельной скорости размножения культуры. Повышение скорости протока или воздействие, замедляющее рост, приводит к тому, что скорость размножения оказывается меньше скорости протока, и клетки культуры будут «вымываться» из ферментера.

В системе «хемостат» величину клеточной популяции контролируют с помощью отдельных компонентов питательной среды. Среду составляют так, чтобы один из компонентов, необходимый для роста биомассы клеток, был в недостаточном количестве или лимитировал рост, поддерживая тем самым культуру в нужном состоянии. Используя батарею ферментеров, можно в каждом аппарате постоянно поддерживать продуцент в определенной фазе размножения.

Применение отъемно-доливного метода удается в 2 – 3 раза увеличить время пребывания продуцента в активной форме. Недостаток этого метода заключается в том, что доливы осуществляются питательной средой плотного состава. Сущность этого метода заключается в том, что в определенное время, начиная с экспоненциальной фазы, по специально отработанной программе, в культуральную жидкость добавляют отдельные компоненты питательной среды – раствор сахара, сульфат аммония, жир и т.д., поддерживая их концентрацию на постоянном оптимальном уровне – в начале для роста биомассы клеток, а затем – для синтеза целевого продукта.

Периодически из ферментера отбирают определенные объемы культуральной жидкости, все возрастающей концентрацией целевого продукта. Ферментацию прекращают после того как активность продуцента достигнет максимума. Этим способом удается не только продлить активную фазу, в которой находится продуцент, но и повысить степень использования им субстрата, а в конечном итоге – продуктивность всего процесса, то есть увеличить выход конечного продукта в расчете на потребленный субстрат.

Из всего разнообразия используемых в биотехнологии способов наиболее сложными являются регулируемые ферментации с соблюдением условий асептики. Асептические условия предполагают введение дополнительных стадий, обеспечивающих стерилизацию питательных сред и подаваемого в ферментер воздуха.

Стерильную питательную среду в инокуляторе первой ступени засевают с соблюдением правил асептики через специальное устройство посевным материалом, который предварительно был выращен в колбах в лабораторных условиях. В аппарате поддерживаются необходимые режимы для размножения клеток продуцента – температуру, аэрацию, скорость перемешивания, а также контролируют и оценивают развитие культуры.

При достижении требуемых стадий развития и количества биомассы посевной материал передавливают стерильным сжатым воздухом по посевному колектору перемещают в посевной аппарат большей вместимостью. На этой второй ступени выращивания посевного материала стремятся получить больше биомассы клеток, чтобы в ферментере можно было создать необходимую для данного штамма продуцента исходную плотность популяции. Если это требование может быть выполнено без второй ступени, то ферментационную среду засевают непосредственно из инокулятора.

При получении пенициллина с помощью микробиологического синтеза используют питательную среду (она же пригодна для приготовления инокулята), включающую глюкозу – 1,5%, лактозу – 5%, сульфат аммония и фосфаты – 0,5 -1%, кукурузный экстракт – 2-3%, «предшественники антибиотика – фенокси- или фенилуксусная кислота – 0,3-0,6%, мел – 0,5-1%, пеногаситель – 0,5-1%. Температуру ферментации поддерживают на уровне 22 – 26°С при рН от 5,0 до 7,5 и постоянной аэрации (1 м3 воздуха на 1 м среды в 1 минуту), продолжительность процесса – 4 суток.

В современных условиях развития фармацевтической промышленности наиболее перспективным методом выращивания микроорганизмовпродуцентов антибиотиков и других биологически активных соединений является метод глубинного культивирования, хотя используют и периодическое культивирование продуцентов.

Для получения антибиотиков в промышленных масштабах применяются специальные герметически закрытые емкости или ферментеры, обеспечивающие глубинное выращивание продуцентов.

Аэрирование культуры в ферментере происходит в результате подачи подогретого до необходимой температуры стерильного воздуха через специальные приспособления — барботеры, а также благодаря перемешиванию культуральной жидкости различного типа мешалками (пропеллерными, турбинными и др.).

В последнее время при производстве антибиотиков применяют низкочастотное вибрационное перемешивание культуральной жидкости как наиболее экономичный способ.

Поддержание температуры, оптимальной для хорошего роста продуцента антибиотика и проявления им повышенной физиологобиохимической активности, обеспечивается рубашкой ферментера или системой змеевиков, которые необходимы также для подачи пара в процессе стерилизации и для охлаждения.

Наблюдение за основными процессами жизнедеятельности организма осуществляется контрольно-измерительной аппаратурой (КИП), позволяющей регулировать скорость перемешивания культуральной среды, поддерживать на заданном уровне температуру внутри ферментера, рН среды, количество пропускаемого воздуха, давление внутри ферментера и другие параметры. Применяются установки, позволяющие автоматически определять содержание азота в среде по ходу развития организма.

Ферментеры снабжены приспособлениями для переноса инокулята, внесения дополнительных питательных веществ, необходимых для лучшего развития культуры, пеногасителя и устройством для взятия проб.

В промышленных условиях получения антибиотиков применяют ферментеры различной емкости – от 500 л до 50, 100 м3 и более.

Стерилизацию производственных ферментеров, а также всех обслуживающих их коммуникаций проводят перегретым паром. Воздух, необходимый для аэрации, стерилизуется через специальные фильтры, заполненные стеклянной ватой или активированным древесным углем.

Использование волокнистых фильтров (типа стеклянной ваты) – широко распространенный и экономически наиболее выгодный механический способ стерилизации воздуха (чем меньше диаметр волокна, тем лучше их фильтрующая способность).

Проникновение в фильтр бактериальных клеток или спор, перемещающихся с воздушным потоком, зависит от скорости движения воздуха. Проникновение увеличивается с увеличением скорости воздуха. В зависимости от плотности упаковки фильтра скорость движения воздуха не должна превышать 1,5 м/с.

Процесс развития микроорганизма в ферментерах проходит при строгом контроле всех стадий, очень точном выполнении разработанного регламента условий развития организма-продуцента антибиотика. Большое внимание уделяется поддержанию заданной температуры культивирования, кислотности среды, степени аэрации и скорости работы мешалки. Учитывается потребление организмом основных питательных компонентов субстрата (источников углерода, азота, фосфора), внимательно контролируется образование антибиотика.

Особенность второй стадии производства антиботиков является двухфазный характер стадии ферментации. В первой фазе развития культуры (тропофазы) идет интенсивное накопление биомассы, сопровождающееся усилением процессов биосинтеза белков, нуклеиновых кислот, углеводов, ферментов. Причем на этом этапе антибиотик, как правило, не синтезируется.

Во второй фазе (идиофаза) накопление биомассы замедляется, так как питательная среда уже обеднена рядом компонентов и обогащена продуктами жизнедеятельности продуцента. Максимум биосинтеза антибиотика наступает в стадии отмирания культуры.

Особое внимание при развитии продуцента в ферментерах обращают на процесс пеногашения. При продувании воздуха через культуру микроорганизма часто происходит обильное образование пены, которая существенно нарушает протекание всего процесса развития продуцента в ферментере. Основная причина появления большого количества пены наличие белковых веществ в среде и ее высокая вязкость, обусловленная обильным накоплением биомассы.

Для борьбы с пеной в ферментерах при антибиотикообразовании используют различные поверхностно-активные вещества: растительные масла (соевое, подсолнечное), животный жир, а иногда минеральные масла (вазелиновое, парафиновое), спирты и высшие жирные кислоты. Нередко в качестве пеногасителей используют специально синтезированные вещества (силиконы, диазобуталкарбомил и другие соединения).

Многие вещества (масла, жиры, спирты и др.) – пеногасители, потребляются продуцентами антибиотиков как дополнительные источники углеродного питания. При этом часто наблюдается повышение выхода антибиотика. Однако внесение пеногасителя снижает скорость растворения кислорода, что в свою очередь может отрицательно сказаться на развитии микроорганизма и его биосинтетической активности.

Иногда используются механические способы пеногашения (отсасывание пены через специальные трубы, разрушение пузырьков пены сильными струями жидкости, пара или газа) и аэродинамические методы.

В процессе развития микроорганизмов-продуцентов антибиотики в большинстве случаев почти полностью выделяются из клеток в окружающую среду. Однако в некоторых случаях лишь часть антибиотика выделяется в культуральную жидкость, а другая часть сохраняется внутри клеток. У ряда продуцентов антибиотик почти полностью содержится в клетках организма.

В процессе образования антибиотика в культуральную жидкость, наряду с присутствием в ней различных неиспользованных компонентов среды, выделяются и разнообразные продукты обмена, она обогащается продуктами автолиза клеток. Удаление примесей – первая и весьма важная стадия химической очистки антибиотика.

Стадия выделения и химической очистки включает ряд процессов: от обработки нативного раствора до сушки готового очищенного препарата. На этой стадии в зависимости от свойств антибиотика, его химического строения и места основного накопления применяют различные методы выделения и очистки. В качестве основных методов используют экстракцию, осаждение, сорбцию на ионообменных материалах, упаривание, сушку.

В зависимости от того, где антибиотическое вещество сосредоточено, применяют соответствующие методы его извлечения. Так, если антибиотик находится в культуральной жидкости, его выделяют методами экстракции растворителями, не смешивающимися с жидкой фазой, или осаждают в виде нерастворимого соединения, а также путем сорбции на ионообменных смолах.

Выделение антибиотика из клеток микроорганизмов осуществляют с помощью экстракции органическими растворителями. Если антибиотик содержится в культуральной жидкости и в клетках продуцента, первичной операцией его выделения является перевод антибиотика в фазу, из которой наиболее целесообразно его изолировать. Для этого антибиотик, содержащийся в культуральной жидкости, и клетки с антибиотическим веществом переводят в осадок, а затем антибиотик экстрагируют.

Отделение нативного раствора от биомассы и взвешенных частиц проводят методами фильтрации или центрифугирования. При этом применяют меры для обеспечения лучшей фильтруемости культуральной жидкости (кислотную или тепловую коагуляцию, обработку электролитами, внесение различных добавок и т. П.). Для процесса фильтрации применяют различные фильтрующие аппараты: фильтр-пресс, нутч-фильтр, друкфильтр, центрифуги, сепараторы.

Фильтр-прессы применяются для обработки больших объемов культуральной жидкости. Эти аппараты состоят из ряда чередующихся плит и рам и фильтрующих перегородок между ними. Процесс фильтрации осуществляется под давлением.

Для фильтрации небольших объемов культуральной жидкости обычно используют нутч-фильтры или друк-фильтры. Первый аппарат работает под вакуумом, второй – в условиях повышенного давления над фильтрующейся жидкостью.

Для получения жидкости, освобожденной от взвешенных частиц, широкое распространение нашел способ центрифугирования. Хорошие результаты достигаются при правильном выборе скорости подачи жидкости (лучший вариант – 15000 об/мин). Отделение мицелия или других взвешенных частиц может также происходить в сепараторах. При скорости вращения барабана сепаратора, равной 7000—7500 об/мин, благодаря центробежной силе твердые частицы устремляются к стенкам барабана и осаждаются там, а отсепарированная жидкость стремится к центру барабана и переходит в специальную камеру.

Одной из особенностей стадии выделения и химической очистки является то, что при выделении антибиотиков приходится иметь дело с весьма невысокими концентрациями выделяемого вещества (не превышающими одного процента). В конце стадии химической очистки концентрация антибиотика увеличивается и достигает 20-30%.

Цель химической очистки – извлечение антибиотика из культуральной жидкости или из клеток продуцента, концентрирование его и освобождение от сопутствующих примесей и в конечном счете получение высоко очищенного препарата, пригодного для соответствующего применения.

Антибиотики под влиянием повышенной температуры, высокой кислотности или щелочности среды инактивируются. Поэтому при их выделении и очистке необходимо соблюдать максимум осторожности.

Метод экстракции. Нередко в целях очистки антибиотика от различных примесей его многократно переводят из одного растворителя в другой с предварительным осаждением (кристаллизацией). Такой прием носит название перекристаллизации.

Ионообменная сорбция. Метод состоит в том, что при пропускании водных растворов антибиотиков, являющихся по химической природе кислотами, основаниями или амфотерными соединениями, через колонки с соответствующими ионообменными смолами они сорбируются на них, а раствор с частью примесей, имеющих противоположный антибиотику заряд, проходит через колонку. Смолы в зависимости от положительного или отрицательного заряда иона в них называют катионитами или анионитами.

Антибиотик в виде отрицательно заряженного иона будет сорбироваться на катионитной смоле, положительно заряженный – на анионите. Далее его элюируют (десорбируют) и получают значительно очищенный и сконцентрированный препарат. Затем раствор препарата можно вновь пропустить через ионообменную смолу, но имеющую противоположный заряд. При этом примеси осядут на смоле, а раствор более очищенного антибиотика пройдет через колонку.

Метод осаждения основан на том, что антибиотик связывают с органическими или неорганическими веществами с целью получения соединения, выпадающего в осадок. Полученный осадок с помощью фильтров или центрифугирования отделяют от нативного раствора, промывают и в ряде случаев высушивают, после чего образовавшееся соединение разлагают и антибиотик экстрагируют или вновь осаждают (кристаллизуют).

Одной из стадий химической очистки антибиотиков является концентрирование полученных растворов путем отгонки большей части растворителя, как правило, в вакууме.

Применяемые методы выделения и химической очистки, а также качество оборудования и используемых реактивов имеют большое значение прежде всего для улучшения качества получаемого антибиотика и для увеличения его выхода.

Известно, что к антибиотикам, используемым в медицинской практике, предъявляются очень высокие требования (высокая степень очистки, стерильность препарата и др.). Поэтому на указанной стадии работы, а также при химической очистке препарата необходимо соблюдать высокую степень чистоты на всех операциях. Для этого поддерживают в исключительной чистоте не только используемое оборудование, но и помещение, где производят работу.

Антибиотики, предназначенные для инъекций, должны быть стерильными. Поэтому получение таких препаратов, приготовление различных лекарственных форм, расфасовка и упаковка осуществляются в асептических условиях.

После выделения и химической очистки антибиотика его необходимо высушить – удалить из полученного препарата свободную и связанную воду.

Поскольку большинство антибиотиков в той или иной степени термолабильны, для их высушивания необходимо применять методы, не приводящие к потере биологической активности и не изменяющие цвета препарата.

На современном этапе промышленного получения антибиотиков используют различные методы обезвоживания препаратов.

Широкое распространение получила лиофильная сушка антибиотиков, которая проводится при сравнительно низких температурах (-8, -12°С).

Прогрессивным методом при работе с большими количествами антибиотика является высушивание с применением распылительной сушилки. Раствор антибиотика пневматически распыляется до мельчайших капель в камере потоком нагретого воздуха. Процесс высушивания антибиотиков протекает в течение нескольких секунд. При этом даже термолабильные препараты не меняют своих свойств.

Сушка зернистых и пастообразных антибиотических препаратов производится в вакуум-сушильных шкафах или методом взвешенного слоя.

Готовый антибиотик подвергается тщательному биологическому и фармакологическому контролю.

К антибиотическим веществам, используемым в медицинской практике, в соответствии с Государственной фармакопеей предъявляются очень строгие требования. Каждый новый лекарственный препарат, прежде чем он будет разрешен к практическому применению, должен пройти всесторонние испытания на токсичность, пирогенность и другие жизненно важные функции организма. Препарат изучают на разных видах животных в отношении его острой и хронической токсичности (влияние на состав крови, центральную нервную систему, дыхание и т. Д.). Показатели острой токсичности – один из критериев качества антибиотического вещества.

Устанавливают максимально переносимую дозу (МПД) антибиотика, дозу, вызывающую гибель 50% подопытных животных (LD50) и дозу, смертельную для всех животных (LD100). Только после всестороннего и тщательного изучения препарата он может быть рекомендован к практическому применению.

Количественное определение большинства антибиотиков проводят биологическими методами, основанными на сравнительной оценке угнетения роста тест-микроорганизма. Активность устанавливают диффузионным или турбидиметричесхим методами.

Государственная Фармакопея XI издания рекомендует для количественного определения метод диффузии в агар, сущность которого заключается в сравнении действия определенных концентраций испытуемого и стандартного образца антибиотика на тест-микроорганизм. Стандарты, отвечающие требованиям международных стандартов, готовят в Государственном контрольном институте медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича, они выпускаются в запаянных ампулах нейтрального стекла и хранятся при температуре не выше 0°С.

Так как состав агаровой среды и условия выполнения биологического испытания одинаковы, величина зоны диффузии, в которой развитие тест-микроорганизма подавляется испытуемым антибиотиком, зависит только от химической природы препарата и его концентрации. Процесс инкубации осуществляется в течение 16- часов при 36-38°С.

При определении биологической активности методом диффузии в агар необходимо, чтобы зона задержки роста была достаточного диаметра и имела четкие границы. После завершения инкубации измеряют диаметры зон задержки роста (ЗЗР) тест-микроорганизма стандартным и испытуемым растворами. Для повышения точности измерений находят среднее значение площадей зон диффузии из трех опытов.

При изучении зон задержки роста и четкости краев рационально применят микрофотометры (например, марки, ИОФ-451), что позволяет получать более объективные количественные оценки результатов микробиологического анализа.

Единица действия (ЕД) является величиной биологической активности антибиотиков. За ЕД принимают минимальное количество антибиотика, подавляющего развитие тест-микроорганизма в определенном объеме питательной среды. Количественное выражение ЕД различно у различных антибиотиков. Например, у натриевой соли бензилпенициллина 1 ЕД соответствует 0,5988 мкг химически чистого вещества, а у стрептомицина, тетрациклина и его производных 1 ЕД соответствует 1 мкг химически чистого вещества.

Расчет биологической активности производят по стандартной кривой, предварительно построенной на основании результатов определения пяти концентраций стандартного препарата. Степень активности антибиотика в1 мг препарата вычисляют, умножая полученную концентрации в ЕД/мл на степень разведения.

Среднее значение активности, найденной биологическим методом, несколько ниже, чем рассчитанная теоретическая активность. В соответствующих фармакопейных статьях приводятся значения теоретической активности и нижний допустимый предел активности испытуемого антибиотика в ЕД/мг.

В настоящее время разработаны ускоренные биологические методы определения антибиотиков в биологических жидкостях. К ускоренным микробиологическим методам относят методы, основанные на подавлении изменений рН питательной среды в процессе роста тестмикроорганизмов. Концентрацию определяют путем сравнения изменений рН в средах испытуемых и стандартных образцов через 1, часа после инкубации. На этом принципе основан так называемый уреазный метод, заключающийся в наблюдении за изменением рН жидкой питательной среды, содержащей 2% мочевины. Выделяющийся в процессе роста микроорганизма аммиак вызывает изменение рН среды.

Ферментный метод основан на инактивации аминогликозидов в крови специфическими ферментами (аденилтрансфераза и ацетилтрансфераза), продуцируемые грамотрицательными микроорганизмами, устойчивыми к препаратам этой группы. Эти ферменты катализируют процесс аденилирования или ацетилирования аминогликозидов в присутствии 14С-аденозинтрифосфата или 14Сацетилкоэнзима А. Они являются источником радиоактивности.

Инактивированный антибиотик имеет положительный заряд и остаточную радиоактивность, что позволяет адсорбировать его на фосфоцеллюлозной бумаге. После адсорбции, методом подсчета радиоактивности делают заключение о концентрации антибиотика.

Определение занимает 1-2 часа.

Радиоиммунный метод основан на сравнительной оценке конкуренции антибиотика, меченного тритием, и испытуемого антибиотика по отношению к специфическим антителам иммунной сыворотки.

Метод отличается очень высокой чувствительностью (0,003-0, мкг/мл), результаты получают в течение 1 - 2 часов, точность данного метода довольно высока – коэффициент вариации составляет 4 – 5%.

Анализируя различные методы анализа антибиотиков можно прийти к заключению, что наиболее простыми и доступными в настоящее время являются метод диффузии в агар-агар и уреазный метод специфичные и точные. Они не требуют предварительной обработки сыворотки крови, когда в ней присутствуют другие антибиотики.

Однако применение этих методов требует соответствующих условий и оборудования для работы с радиоактивными веществами, труднодоступных реактивов и специфической иммунной сыворотки. На точность биологических методов оказывают влияние целый ряд факторов – характер питательной среды, условия инкубации, точность измерения зон угнетения роста и т.д.

1. Назовите основные группы антибиотиков, учитывая механизм их действия и спектр влияния на клетки возбудителей инфекционных болезней.

2. -лактамы, их структура и механизм действия.

3. Напишите радикалы, входящие в состав антибиотиков цефалоспоринового ряда.

4. Методы получения антибиотиков на фармацевтических предприятиях.

5. Структура и механизм действия антибиотиков – полиенов.

6. Структура и механизм действия антибиотиков – депсипептидов.

7. Схема производства антибиотиков в процессе микробного биосинтеза.

8. Методы культивирования продуцентов, применяемых при производстве антибиотиков.

9. Питательные среды, используемые на фармацевтических предприятиях при производстве антибиотиков.

10. Методы выделения и очистки антибиотиков, применяемых при производстве антибиотиков.

11. Методы получения 6-аминопенициллиновой кислоты, применяемые в промышленной технологии.

12. Основные способы получения 7- аминоцефалоспориновой кислоты.

13. Схема выделения антибиотика из культуральной жидкости.

14. Принципиальная схема выделения и очистки канамицина.

15. Промышленный метод получения полусинтетических антибиотиков.

16. Биологические методы анализа качества антибиотиков.

6. ИНЖЕНЕРНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА.

ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ ФЕРМЕНТЫ.

Химическая энзимология изучает широкий круг вопросов, связанных с новыми аспектами функционирования ферментов как гетерогенных биокатализаторов, создаваемых для промышленного производства фармацевтических препаратов и пищевых продуктов. Ферменты традиционно и давно (еще в древности) применялись в практической деятельности как уникальные ускорители многих химических реакций.

Скорость реакций, протекающих при участии ферментов, в 10 12-1014 раз выше, чем реакций, катализируемых катализаторами неорганической природы.

Ферменты – биологические катализаторы белковой природы, которые применяются в различных отраслях народного хозяйства, в том числе при производстве лекарственных средств, а также в медицинской практике как лечебные и диагностические препараты. Всего для клинического применения разрешено свыше 40 ферментных препаратов животного, растительного и микробного происхождения.

Среди основных направлений использования ферментов как терапевтических средств наибольший удельный вес занимают три области, которые и потребляют основное количество выпускаемых промышленностью препаратов:

1) заместительная терапия при недостаточной функции пищеварительных желез и ряде наследственных заболеваний;

2) местная (локальная, литическая) терапия для расщепления и удаления из организма некротических масс и экссудатов;

3) парентеральное применение свободных и связанных форм ферментов для лизиса тромбов в кровеносных сосудах и как противовоспалительные средства.

В фармацевтической промышленности ферменты используются в качестве биокатализаторов, биодатчиков и биосенсоров и для биотрансформации.

Путем микробиологического синтеза для медицинских целей получают следующие ферментные препараты:

- солизим (липолитический фермент, гидролизующий жиры), применяется при хронических заболеваниях желудочно-кишечного тракта;

- амилазы (расщепляют крахмал до глюкозы), в составе лечебного препарата «Фестал» используется при недостаточной функции поджелудочной железы;

- террилитин (протеолитический фермент), рекомендуется для лечения гнойных ран, ожогов, трофических язв;

- стрептокииаза (фибринолитический фермент) эффективен при лечении тромбозов;

- -галактозидаза (расщепляет лактозу), применяется для лечения лактозной недостаточности.

Традиционные биотехнологии, основанные на переработке тканей животных, поставляют в медицинскую практику:

- трипсин, химотрипсин (протеолитические ферменты), используемые для рассасывания рубцов и спаечных процессов;

- урокиназу (протеолитический фермент), предназначенный для лечения тромбозов;

- пепсин (протеолитический фермент), незаменимый при расстройствах пищеварения;

- бромелин, папаин, фицин, которые используются в заместительной терапии при нарушении пищеварения, а также для лечения гнойновоспалительных процессов.

При энзиматическом очищении ран сроки заживления сокращаются в 1,5-2 раза. Бромелин, папаин, фицин применяются в заместительной терапии при нарушении пищеварения, а также в акушерской практике при выявлении и предотвращении резус-конфликтных ситуаций.

В традиционных технологиях ферментные препараты могут быть получены из животного, растительного сырья и микроорганизмов.

Лекарственные формы на основе ферментов характеризуются большим разнообразием – это таблетки, капсулы, мази, аэрозоли.

В нашей стране и за рубежом первое место по объему выпускаемых ферментных препаратов занимают протеолитические – наиболее глубоко изученные среди всех известных ферментов. Протеазы в числе первых белков были получены в высокоочищенном кристаллическом состоянии.

Ферменты группы ацилаз используются в биотехнологическом производстве медицинских препаратов как реагенты для трансформации биологически активных веществ (например, N-ацилоаминокислот).

Иммобилизацию ферментов можно определить как процесс включения молекул в какую-либо изолированную фазу, которая отделена от фазы свободного раствора, но способна обмениваться с находящимися в ней молекулами субстрата, эффектора или ингибитора.

Химический метод иммобилизации Иммобилизация ферментов путем образования ковалентной связи с носителем в настоящее время является доминирующим способом получения биокатализаторов пролонгированного действия. Первые работы в этом направлении относятся к 1949 году.

Различают 2 основных метода химической иммобилизации ферментов:

1. Иммобилизация на носителе любого типа за счет образования ковалентных связей;

2. Поперечная сшивка молекул белка без носителя специальными реагентами.

Методы образования ковалентной связи между носителем и белком классифицируют по типам происходящих химических реакций. Наиболее часто используются следующие виды химических реакций: реакции диазосочетания, ацилирования, окислительно-восстановительные и радикальные реакции, а также смешанные методы.

Адсорбционная иммобилизация Адсорбционная иммобилизация является наиболее разработаным из всех существующих способов иммобилизации ферментов. Еще в 1916г. Дж.

Нельсон и Э. Гриффин провели успешную иммобилизацию инвертазы путем адсорбции на активированном угле и геле гидроксида алюминия. В настоящее время адсорбционная иммобилизация благодаря целому ряду преимуществ является наиболее широко распространенным способом получения иммобилизованных ферментных препаратов промышленного значения.

Носителей для адсорбционной иммобилизации можно разделить на два основных класса — неорганические и органические. В качестве неорганических носителей главным образом используются кремнезем, оксиды алюминия, титана и других металлов, различные природные алюмосиликаты (глины), пористое стекло, керамика, активированный уголь и др.

Среди органических носителей наибольшее распространение получили различные полисахариды и полимерные ионообменные смолы, коллаген.

Обычно носители применяются в виде порошков, мелких шариков и гранул. Иногда для снижения гидродинамического сопротивления носители изготавливают в форме монолитов, пронизанных большим числом узких параллельных каналов, разделенных тонкими стенками. Важнейшими характеристиками носителей являются удельная поверхность, размер пор, механическая прочность и химическая стойкость.

Иммобилизация ферментов путем включения в гели Сущность этого метода иммобилизации состоит в том, что молекулы фермента включаются в трехмерную сетку из тесно переплетенных полимерных цепей, образующих гель. Среднее расстояние между соседними цепями в геле меньше размера молекулы включенного фермента, поэтому он не покидает полимерную матрицу и не выходит в окружающий раствор, т.е. находится в иммобилизованном состоянии. Дополнительный вклад в удерживание фермента в сетке геля могут вносить также ионные и водородные связи между молекулой фермента и окружающими ее полимерными цепями.

Иммобилизация ферментов с использованием полупроницаемых оболочек (мембран) Общий принцип, лежащий в основе этого способа иммобилизации, состоит в том, что водный раствор фермента отделяется от водного раствора субстрата полупроницаемой мембраной, которая легко пропускает небольшие молекулы субстрата, но представляет собой непреодолимый барьер для крупных молекул фермента. Существующие модификации этого метода различаются лишь способами получения полупроницаемой мембраны и ее природой.

Микрокапсулирование Этот способ иммобилизации разработан Т. Чангом (1964 г.). Суть его состоит в том, что водный раствор фермента включают внутрь микрокапсул, представляющих собой замкнутые сферические пузырьки с тонкой полимерной стенкой (мембраной). В зависимости от условий получения размер микрокапсул изменяется от нескольких десятков до нескольких сотен микрометров, а толщина мембраны составляет сотые – десятые доли микрометра при диаметре пор порядка нескольких нанометров.

Включение в волокна От микрокапсулирования этот способ иммобилизации, предложенный Д. Динелли (1972), отличается главным образом формой получаемых препаратов: в первом случае образуются сферические микрокапсулы, а во втором — нити. Суть состоит в том, что эмульсию водного раствора фермента в органическом растворе волокнообразующего полимера продавливают через фильтры в жидкость (например, толуол), вызывающую коагуляцию полимера. Полученные волокна представляют собой пористые полимерные гели, содержащие гомогенную дисперсию небольших капель водного раствора фермента размером около 1 мкм. Ферментсодержащие волокна обладают высокой механической прочностью, например, из них можно изготовить ткань, которая будет обладать ферментативной активностью. Для дополнительного повышения механической прочности волокна иногда заключают в тонкую полиамидную оболочку.

1. История инженерной энзимологии как науки.

2. Структура и функции ферментов.

3. Способы получения ферментов.

4. Основные представления о ферментативном катализе.

5. Методы выделения и очистки ферментов.

6. Основные физико-химические свойства иммобилизованных ферментов.

7. Отличия иммобилизованных ферментов от нативных препаратов.

8. Химические методы иммобилизации ферментов.

9. Физические методы иммобилизации ферментов.

10. Носители, применяемые для иммобилизации ферментов.

11. Иммобилизация ферментов путем включения в гели.

12. Иммобилизация ферментов с использованием полупроницаемых оболочек (мембран).

13. Методы иммобилизации клеток.

14. Применение иммобилизованных клеток.

15. Получение аминокислот с использованием иммобилизованных клеток.

16. Получение антибиотиков с помощью иммобилизованных клеток.

17. Основные промышленные технологии с использованием гетерогенных биокатализаторов.

18. Применение иммобилизованных ферментов.

19. Типы связей ферментов с поверхностью носителя.

20. Отличие химических методов иммобилизации ферментов от физических методов.

7. ПРИМЕНЕНИЕ ГЕТЕРОГЕННЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ В

ПРОМЫШЛЕННОЙ ТЕХНОЛОГИИ

Ферментативная модификация -лактамных антибиотиков Получение новых, более эффективных аналогов пенициллина, связано с изменением его боковой цепи при сохранении целостности остальной части, так называемого ядра антибиотика – 6-аминопенициллановой кислоты (б-АПК).

Поскольку масштабный химический синтез таких соединений невозможен, самым простым путем проведения необходимого превращения является отщепление боковой цепи биосинтетического пенициллина, выделение 6-АНК и последующее ацилирование ее аминогруппы с получением «полусинтетического» аналога.

Подобное превращение может быть проведено в одну стадию и самых обычных условиях при 10-40°С в водной среде с использованием специфического фермента – пенициллинамидазы.

С использованием иммобилизованной пенициллинамидазы связан 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты, ключевого соединения для синтеза новых цефалоспоринов.

Ферментативное превращение рацематов в энантиомеры Примером практического использования биокатализа служит ферментативное превращение рацематов в энантиомеры аминокислот. При помощи ацилаз можно разделить рацемические смеси большинства аминокислот. Ацилазы аминокислот – широко распространенные ферменты, содержащиеся в тканях животных (ацилаза из почек свиньи хорошо изучена и широко используется), в растениях и микроорганизмах.

Разделять рацемические смеси аминокислот можно, используя не только ацилазы, но также и ряд протеолитических ферментов, обладающих высокой стереоспецифичностью в реакции гидролиза сложных эфиров аминокислот.

К перспективному способу получения оптически чистых аминокислот относится энантиоселективное ферментативное превращение и аминокислоты ряда циклических производных, химический синтез рацематов которых представляет собой более легкую задачу, чем получение рацемата самой аминокислоты Подобно тому, как аминоацилазы и некоторые протеазы используются для получения энантиомеров аминокислот, многие другие гидролитические ферменты могут применяться для получения различных оптических изомеров сложных органических соединений.

Биокатсиштическое получение простаноидов Простагландины являются гидроксилированными продуктами превращения в организме полиненасыщенных жирных кислот. Они состоят из 20 атомов углерода и включают циклопентановое кольцо. В зависимости от структуры пятичленного кольца все простагландины делят на четыре группы: А,В,Е и F, а в зависимости от числа двойных связей в метильной и карбоксильной боковых цепях в каждой из групп различают индивидуальные простагландины, обозначаемые буквой, выражающей принадлежность к группе, и цифрой, показывающей число двойных связей в боковых цепях (Al, A2 и т.д.). В организме простагландины синтезируются из полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) посредством специальной ферментной, системы (простагландинсинтетаза), фиксированной в микросомальных мембранах. Источниками субстрата для биосинтеза простагландинов в организме являются фосфолипиды клеточных мембран, триглицериды, этирифицированный холестерин, высвобождающие свободные полиненасыщенные жирные кислоты активированной ферментной системой (ацилгидролазы) в ответ на нейрогуморальную простагландинсинтетазы является арахидоновая кислота, содержащаяся в фосфолипидной фракции клеточных мембран практически всех клеток животных организмов.

Переход арахидоновой (5, 8, 11, 14-эйкозатетраеновой) кислоты в простагландины, тромбоксаны и простациклин осуществляют сложные полиферментные системы. Ключевым ферментом синтеза следует считать общий для всех этих соединений первый фермент цепи – простагландинэндопероксидсинтетазу. Этот фермент катализирует образование простагландина Н2 – общего промежуточного соединения при получении всех простагландинов, тромбоксанов и простациклина.

Простагландины и их основные предшественники ПНЖК (арахидоновая, зйкозатетраеновая, эйкозатриеновая) содержатся во всех тканях млекопитающих в очень малых количествах. Наибольшим содержанием характеризуется семенная жидкость млекопитающих и человека, предстательная железа, а также эндометрий матки и яичников. ПГ найдены в мозговой ткани различных животных и человека, слизистой оболочке желудка и кишечника, селезнке, почках, печени, поджелудочной железе, мышечной ткани, радужной оболочке.

Простагландинэндопероксидсинтетаза – гемсодержащий фермент, катализирующий трехсубстратную реакцию, в ходе которой происходит сопряженное окисление кислородом арахидоновой кислоты и какого-либо донора электронов. Донорами электронов могут служить слабые органические и неорганические восстановители, например ферроцианид, адреналин, триптофан, НАДН2.

Лейкотриены представляют собой соединения, играющие важную роль при протекании воспалительных процессов, бронхиальной астмы, регуляции адгезии и агрегации нейтрофилов, полиморфноядерных лейкоцитов и т.д.

Арахидоновая кислота может быть получена из подходящих масс биокаталитическим путем с использованием специфических фосфолипаз.

Конверсия ПНЖК в организме под влиянием специфической простагландинсинтетазы осуществляется через образование эндоперекисей простаглаидинов с включением двух молекул кислорода. Образующиеся короткоживущие промежуточные соединения (эндоперекиси) под воздействием других ферментных систем могут образовывать не только соответствующие простагландины, но и другие биологически активные вещества специфического спектра действия для ряда тканей. Так, при специфической энзиматической циклизации арахидоновой кислоты образуются эндоперекиси (простагландииы G2 и Н2, ПГТ2 и ПГН2 ), которые далее трансформируются в простагландины Е2, Д2, F2. В случае каталитического воздействия на эндоперекиси фермента тромбоксансинтетазы, локализованной в мембранах микросом тромбоцитов, образуются тромбоксаны (А2,В2) – вещества с исключительно выраженными адгезионными свойствами. При воздействии на эти же вещества ферментной системы микросомальной фракции артериальных сосудов биосинтез идет в направлении образования простациклина (ПГИ2 и ПГХ) – веществах, характеризующихся мощным антиадгезионным и деагрегирующим эффектом, в десятки раз превосходящим антитромбическую активность ПГЕ1 и ПГД Простагландины синтезируются практически всеми тканями животного организма. Их можно рассматривать как производные «простаноевой кислоты», не существующей в природе, но полученной синтетически.

ПНЖК, непосредственно являющиеся предшественниками биосинтеза простагландинов — арахидоновая и – линоленовая кислоты, содержатся в продуктах питания в крайне малых количествах и чаще всего отсутствуют.

Эти вещества синтезируются в организме из поступающих с пищей эссенциальных жирных кислот: ( – линоленовой и линолевой). При этом происходит ферментативное удлинение углеродного скелета ЭЖК на два метиленовых звена за счт «пристраивания» ацетатного фрагмента с образованием цепочки из 20 углеродных атомов. Все продукты, являющиеся метаболитами ПНЖК с сохранением длины углеродного скелета, обобщнно называются эйкозаноидами по наименованию соответствующего греческого числительного. Нужно отметить, что арахидоновая кислота превалирует в составе ПНЖК, тогда как концентрации – линоленовой на порядок, а тиленодоновой (или эйкозапентаеновой)- на два порядка ниже.

Вновь синтезированная арахидоновая кислота немедленно связывается в мембранные фосфолипиды, которые и являются депо предшественников простагландинов в организме.

Одним из сложных аспектов изучения простагландинов является выявление их роли в образовании и функциях циклического 3',5'- аденозинмонофосфата (цАМФ), который занимает центральное место во внутриклеточных регуляторных механизмах.

Простагландины в зависимости от вида ткани и разновидности аленилатциклазы могут как стимулировать (наблюдается чаще всего), так и ингибнровать синтез цАМФ. Так, например, именно угнетением аденилатциклазы, катализирующей синтез цАМФ спонтанно или индуцированно норадреналином, глюкагоном и активацией симпатической нервной системы и объясняется антимиоматический эффект ПГЕ1. Имеются данные., указывающие на ингибирующее влияние ПГЕ1 на образование цАМФ под воздействием вазопрессина через систему аденилатциклазы.

Простагландины достоверно снижают содержание цАМФ в слизистой оболочке желудка, жировых клетках, тканях собирательных канальцев почек и в некоторых структурах центральной нервной системы. В большинстве тканей простагландины активируют синтез цАМФ. ПГЕ оказывает стимулирующее влияние на синтез гормона роста, вазопрессина, тиреотропина. Простагландины Е 1, Е2 и E2 стимулируют биосинтез стероидов; простагландины Е2 и E2 способствуют высвобождению окситоцина и увеличивают содержание в крови пролактина. Таким образом они оказывают влияние на важнейшие эндокринные железы животных и человека: гипофиз, кору надпочечников, щитовидную железу, яичники.

Существующие в настоящее время способы получения простагландинов можно подразделить на три группы: 1 )выделение, 2)биосинтез и 3)синтез.

Выделение из животного сырья было единственным способом получения ПГ в незначительных количествах. Первые экстракты, выделенные в 1906 и 1913 гг. из предстательных желез собаки и человека, представляли собой неочищенные фракции. В основе этих способов выделения лежала обработка сырья водно-спиртовым раствором метанола, этанола, изопропанола с последующим переводом извлеченных веществ в неводный растворитель (хлороформ, метиленхлорид, эфир, этилацетат, бензол). В последующем стали применять более полное разделение вытяжек путм распределения между несмешивающимися растворителями, используя неводные растворители и буферные растворы.