«БИОБЕЗОПАСНОСТЬ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ Учебное пособие Казань - 2006 Федеральное агентство по образованию Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Казанский государственный ...»

Никитина Е.В., Решетник О.А.

БИОБЕЗОПАСНОСТЬ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

Учебное пособие

Казань - 2006

Федеральное агентство по образованию

Государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Казанский государственный технологический университет»

Никитина Е.В., Решетник О.А.

БИОБЕЗОПАСНОСТЬ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

Учебное пособие Казань - 2006 1 УДК 575:613.261.29 Биобезопасность пищевых продуктов: Учебное пособие. / Никитина Е.В., Решетник О.А.; Казан. гос. технол. ун-т. - Казань, 2006, 92 с.

Предназначено для студентов, выполняющих научно-исследовательские работы, обучающихся по специальностям 270900 «Технология мяса и мясных продуктов», 271200 «Технология продуктов общественного питания». В учебном пособии рассмотрены вопросы, связанные с биобезопасностью пищевых продуктов, раскрыты механизмы биоповреждений организма, индуцированных химическими агентами. Представлена широкая информационная база по индуцированному мутагенезу, генотоксичности и системам защиты организма от агрессивных агентов на генетическом уровне. В методической части подробно рассмотрены методы тестирования генотоксического и токсического потенциала пищевых продуктов. Приведены вопросы для самоконтроля.

Подготовлено на кафедре технологии пищевых производств.

Печатается по решению редакционно-издательского совета Казанского государственного технологического университета Рецензенты: В.П. Фролов, засл. деятель науки РФ и РТ д-р. биол. наук, проф. каф. ветеринарносанитарной экспертизы КГАВМ;

Т.В. Багаева, д-р биол. наук, проф. кафедры микробиологии КГУ Казанский государственный технологический университет, 2006 г.

СОДЕРЖАНИЕ

Введение 1. Биологическая безопасность пищевых продуктов. Основные требования 1.1. Теоретические основы генетической токсикологии 1.1.1. Пути попадания генотоксических агентов в пищевые продукты 1.2. Механизм возникновения мутаций 1.3 Системы исправления повреждений ДНК (системы репарации) 2. Современные краткосрочные тесты для выявления мутагенов и канцерогенов 2.1. Бактериальные тест-системы для определения генотоксичности 2.2.Проблема интерпретации результатов, полученных в бактериальных тестах 2.3.Тесты на мутагенность с использованием эукариот 2.4. Вопросы для обсуждения 3. Экспериментальная часть 3.1. Тест на гашение люминесценции 3.2. Методы оценки генотоксичности 3.2.1.Определение токсичности на бактериях 3.2.2. Тест Эймса (полуколичественный метод учета генных мутаций с внесением препарата в слой полужидкого агара (без ме- таболической активации)) Проблема обеспечения безопасности пищи является важнейшим государственным и научным приоритетом, направленным на сохранение и улучшение здоровья населения, производство высококачественных и безопасных продуктов. Ухудшение экологической ситуации в мире, связанное, прежде всего, с антропогенной деятельностью человека, повлияло на качественный состав потребляемой пищи. Именно с продуктами питания в организм человека из окружающей среды поступает до 70% токсинов различной природы. Эти вещества попадают и накапливаются в пищевых продуктах по ходу как биологической цепи, обеспечивающей обмен между живыми организмами и воздухом, водой и почвой, так и пищевой цепи, которая включает все этапы производства продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также их хранение, упаковку и маркировку. В связи с этим обеспечение безопасности и качества продовольственного сырья и пищевых продуктов является одной из основных задач, определяющих здоровье человеческого общества и сохранение его генофонда [1].

В 1958 г. конгресс США принял закон, т.н. поправку Делани, согласно которой ни одна пищевая добавка не может быть названа безопасной (а значит и использована в пище), если доказано, что она вызывает рак у животных или у людей. Для того, чтобы предупредить и избежать подобной катастрофической возможности, необходим целый комплекс социальных и специальных мероприятий, которые для их реализации по всем нравственным нормам и жизненным показаниям требуют значительных капитальных вложений, существенно превышающих сегодняшние финансовые "вливания".

Согласно прогнозам в течение ближайших 30—40 лет (при сохранении существующих тенденций развития индустрии) состояние здоровья населения России на 50—70% будет зависеть от качества среды обитания (ныне 20—40%), а затраты материальных ресурсов, энергии и труда на стабилизацию условий окружающей среды станут самой крупной статьей экономики, превысив 40— 50% валового национального продукта. Процессы предупреждения этой тенденции должны сопровождаться глубоким социально-психологическим преобразованием общества, изменением структуры ценностей.

Один из основных путей недопущения загрязнения биосферы — создание действенной системы всесторонней экологической экспертизы как планируемых, строящихся и действующих объектов промышленности, выпускаемой продукции, развития малоотходных и безотходных технологий, так и оценка риска для здоровья человека разнообразных загрязнителей среды [30].

Ряд факторов, представляющих очевидную экологическую опасность?

охарактеризован выше. Однако, целесообразно рассмотреть дополнительно к уже упоминаемым приоритетным факторам и некоторые другие, специфические для определенных объектов окружающей человека среды — воздуха, воды, почвы, жилища, продуктов питания.

Пища, наряду с такими важными компонентами как белки, углеводы, аминокислоты, витамины, жиры и другие вещества, содержит большое количество различных по химической структуре соединений, представляющих потенциальную опасность для здоровья. В связи с повсеместным загрязнением окружающей среды, наличие токсикантов в пищевых продуктах — весьма актуальная проблема.

Согласно заключению Международной организации по исследованию канцерогенного риска [2] и ряда высокоавторитетных ученых [3], пища является источником сложной смеси мутагенов и канцерогенов различной природы.

Среди них главенствующее положение занимают микотоксины, нитрозосоединения, нитроарены, растительные (прежде всего пиролизидиновые) алколоиды, гетероциклические амины, флавоноиды, хинолиновые и хиноксалиновые производные, отдельные ароматические углеводороды [3].

1. Биологическая безопасность пищевых продуктов.

Контаминанты пищевых продуктов (естественные и антропогенные) представляют наибольшую опасность для здоровья человека. К подобным загрязнителям химического происхождения относятся: металлы (ртуть, свинец, хром, мышьяк, кадмий и т.д.), пестициды и продукты их деградации и метаболизма (в частности хлорорганические и фосфорорганические), радиоизотопы (цезий-137, стронций-90, йод-131), такие вещества как нитриты и нитраты, асбест, соединения фтора, селен, полихлорированные соединения, стимуляторы роста растений и сельскохозяйственных животных и т.д.

Среди контаминантов биологического происхождения выделяют бактериальные токсины (клостридии ботулизма, стафилококки), целый спектр микотоксинов (афлатоксины, охратоксины, трихотецены, патулин, стеригматоцистин, цитринин и т.п.), токсины одноклеточных и многоклеточных водорослей.

Надзор за безопасностью пищевых продуктов и биологически активных добавок к пище осуществляется территориальными органами Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Показатели безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов должны соответствовать гигиеническим нормативам, установленными Санитарными нормами и правилами (СанПиН) 2.3.2.-1078-01 "Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов", ГОСТами и другими действующими нормативными документами для конкретных видов продуктов.

Таким образом, законодательно закреплены гигиенические требования (табл.1) к качеству продуктов.

Таблица 1 - Основные гигиенические требования к пищевым продуктам, установленные СанПиН Гигиенические требования к пищевым продуктам Показатели пищевой и биолоПоказатели безопасности 1. Пищевая ценность 1. Потенциально опасные химические -количество белков; вещества:

-количество жиров; -металлосоединения;

-количество углеводов; -пестициды;

-количество витаминов; -антибиотики, кормовые добавки, -количество минеральных ве- гормоны;

-энергетическая ценность; -гистамин;

-органолептические свойства; -бенз(а)пирен;

-биодоступность 2. Биологическая ценность 2. Радионуклиды -степень соответствия 3. Биологические контаминанты:

аминокислотного состава белка -микотоксины (афлотоксин В1, вомипродукта токсин, зеароленин, патулин, Т- потребностям организма в ами- токсин, дезоксиниваленол);

-содержание минорных компо- 4. Вредные растительные примеси нентов пищи (фитосоединений) (спорынья, вязель, гелиотроп, триходесма и др.) Безопасность пищевых продуктов оценивается по гигиеническим нормативам, которые включают биологические объекты, потенциально опасные химические соединения, радионуклиды и вредные растительные примеси (табл.

2). Указанные показатели безопасности установлены для 11 групп продуктов, в это число входят мясо и мясопродукты.

Таблица 2 - Гигиенические показатели для мяса и мясопродуктов по химическим показателям Объект Регламентируемые химические показатели Несмотря на то, что в продуктах питания наблюдается определенный баланс между канцерогенными и неканцерогенными соединениями, некоторые пищевые продукты могут обладать мутагенной активностью [4]. Такие свойства они приобретают в результате термической обработки пищевого сырья, при нарушении технологических процессов или хранения, а также при внесении в продукты питания пищевых добавок, консервантов, ароматизаторов.

Официальная политика в области предотвращения риска раковых заболеваний и сохранения стабильности генома человека сконцентрирована, главным образом, на анализе отдельных соединений, в основном синтетического происхождения, в стандартных тестах. Однако интерпретация результатов анализа целого продукта, несмотря на сложность и неоднозначность, позволяет сделать более адекватные выводы, чем результаты тестирования изолированных веществ, в связи с чем приоритеты в анализе канцерогенности и генотоксичности смещаются в область анализа не отдельных веществ, а целого продукта или комплекса. Оценка отдельно взятых химических веществ, безусловно, важна для предотвращения поступления в организм высоких доз мутагенных соединений, вместе с тем, оценка продукта как комплекса важна, потому что частично учитывает и синергические эффекты разных соединений [3].

В данном контексте используются общепринятые определения терминов «мутагенный», «мутаген», «мутации» и «генотоксичность». Мутация определяется как постоянное изменение в количестве или структуре генетического материала в клетке. Термин "мутация" применяется как к наследственным генетическим изменениям, которые могут проявляться на фенотипическом уровне, так и к основным модификациям ДНК, когда таковые являются известными (включая, например, конкретные изменения базовых пар и хромосомные транслокации). Термины мутагены и мутаген будут использоваться для агентов, приводящих к увеличению числа мутаций в популяциях клеток и/или организмов [5].

Более общие термины «генотоксичный» и «генотоксичность» применяются к агентам или процессам, которые изменяют структуру, информационное содержание или сегрегацию ДНК, включая те, которые повреждают ДНК, вмешиваясь в нормальные процессы воспроизводства. Результаты испытаний на генотоксичность обычно используются в качестве индикаторов мутагенных последствий.

Главной мерой борьбы с индуцированным мутагенезом (о котором идет речь) и его отдаленными патогенетическими последствиями является предупреждение контакта человека с потенциальными мутагенами. В области изучения мутагенности пищевых продуктов следует выделить две тесно взаимосвязанные задачи [3].

Первая задача - предупреждение потребления продуктов, содержащих потенциально мутагенные соединения. Ее решение традиционными методами генетического мониторинга в современных условиях невыполнимо из-за большого объема необходимых исследований. Поэтому потенциально опасные вещества должны исключаться в результате санитарно-гигиенического контроля качества. Для контроля содержания тяжелых металлов, афлотоксина, нитрозаминов и др. в пищевых продуктах достаточно иметь надежные аналитические способы идентификации этих веществ.

Вторая задача - изучение генотоксических свойств наиболее распространенных дополнительных компонентов: пищевых добавок, которых насчитывается 2,5 тысячи, наиболее часто встречающихся загрязнителей и необязательных компонентов пищи, возникающих при термическом воздействии, с тем чтобы иметь базу данных для направленного выявления потенциальных мутагенов в пищевых продуктах методами аналитической химии. Такая задача представляется достаточно сложной из-за определения первоочередности тестирования, выбора тест-объектов для тестирования, доз, способов и схем применения испытуемых соединений и продуктов, из-за антагонизма и синергизма действия пищевых компонентов с мутагенами, повседневно воздействующими на человека (полициклические углеводороды, хиноны и др.). Недостаточное внимание к указанным вопросам приводит к получению неоднозначных результатов и значительно затрудняет разработку мер, направленных на предупреждение применения потенциального мутагена.

1.1. Теоретические основы генетической токсикологии 1.1.1. Пути попадания генотоксических агентов Безопасность пищевого продукта – это показатель, зависящий от присутствия возможных ксенобиотиков, содержавшихся ранее в сырье, соединений, образовавшихся под влиянием ряда факторов в ходе технологического потока или специально внесенных при его получении. На безопасность готового продукта влияет большое число факторов: характер сырья и количество содержащихся в нем ксенобиотиков, особенности технологического процесса его переработки – продолжительность, температура, наличие и активность ферментов, химизм протекающих процессов и характер образующихся при этом соединений, вносимые пищевые добавки. Безопасность готового продукта – результат всего вышеперечисленного. Она создается совокупностью большого числа соединений и оценивается с помощью «сенсорного анализа» и аналитических методов.

Известны несколько принципиально различных путей попадания потенциальных мутагенов в пищу [3].

Основными путями загрязнения продуктов питания и продовольственного сырья являются:

• загрязнение сельскохозяйственных культур и продуктов животноводства пестицидами, используемыми для борьбы с вредителями растений и в ветеринарной практике для профилактики заболеваний животных. Они могут быть аккумулированы из внешней среды в процессе жизнедеятельности растений и животных. Известно, что широкое распространение в биогеоценозах имеют соли металлов и пестициды. Не менее половины из 230 тестированных пестицидов обладают мутагенной активностью. Их аккумуляция в пищевых растениях и остаточные количества в продуктах питания могут представлять генетическую опасность для человека, что подтверждено обследованием лиц, профессионально контактирующих с пестицидами. В растениях и животных могут накапливаться и другие потенциально мутагенные соединения или соединения, способные образовывать мутагены в организме человека. Например, нитраты, накапливающиеся в растениях, взаимодействуют с вторичными и третичными аминами с образованием мутагенных нитрозоаминов в кислом содержимом желудка человека [6]. Следует также упомянуть, что мутагенную опасность для человека могут представлять остаточные количества препаратов, используемых для стимуляции роста и лечения животных, которые могут переходить в продукты питания человека;

• нарушение гигиенических правил использования удобрений (в растениеводстве), оросительных вод, твердых и жидких отходов промышленности и животноводства, коммунальных и других сточных вод, осадков очистных сооружений и т. д.;

• использование в животноводстве и птицеводстве неразрешенных кормовых добавок, консервантов, стимуляторов роста, профилактических и лечебных медикаментов или применение разрешенных добавок и других соединений в повышенных дозах. В кормах для животных белковый и аминокислотный дефицит восполняется добавлением отходов пищевой промышленности (рыбная мука, гидролизаты субпродуктов), кормовыми дрожжами, подсолнечными шпротами и т.п., а также премиксов, содержащих биологически активные вещества (витамины, гормоны, ферменты), ростоускорители, антибиотики, сульфаниламиды. Например, транквилизаторы азоперон и ацепрамазин, используемые при производстве мяса, мутагенны в тесте Эймса; диоксидин, применяемый в ветеринарии в качестве антимикробного соединения, мутагенен в эукариотических тестах. Наряду с этим, в состав кормовых рационов могут попадать такие антропогенные загрязнители как пестициды, ПАУ, диоксины, полихлорированные бифенилы и трифенилы, нитриты, нитраты, микотоксины и другие опасные для здоровья вещества.

Для стимуляции репродуктивной функции и роста животных часто применяют гормональные препараты — тиреостатики, половые гормоны, их синтетические аналоги и анаболические стероиды, фитогормоны. Часть из них быстро метаболизируется в организме и потому не представляет собой очевидной опасности для человека, но остаточные количества в мясе и молоке других (например, диэтилстильбестрола) могут оказывать негативные эффекты на потребителей этих животных продуктов.

Продуктивность животноводства увеличивают азотсодержащие кормовые добавки — белково-витаминный концентрат, дрожжевые, бактериальные и водорослевые белки, мочевину, синтетические аминокислоты. Поскольку белково-витаминный концентрат производится на п-парафинах нефти, то в организм могут попадать неутилизированные углеводороды, в частности бензо(а)пирен, а также липиды, не свойственные традиционным продуктам питания, и микотоксины. В продуктах животного происхождения весьма нередко обнаруживаются и пестициды, которые попадают в мясо, молоко, яйца как с кормами, так и в результате обработки сельскохозяйственных животных и птицы. Хлорорганические пестициды накапливаются в тканях и органах и могут сохраняться в них продолжительное время, а фосфорорганические пестициды, являясь ферментными ядами, могут длительно циркулировать в организме.

Для профилактики ряда заболеваний сельскохозяйственных животных применяют различные лекарственные препараты. Скандальную известность в Германии получила история нелегального использования сердечных средств — бета-блокаторов. Известно, что домашние свиньи из-за близкородственного скрещивания склонны к стрессам и развитию инфарктов. Поэтому им вводили бета-блокаторы при транспортировке с фермы на бойню для предупреждения гибели от инфаркта. Эти лекарственные средства, обладающие рядом отрицательных побочных эффектов, через свинину попадают в организм человека.

Также негативное влияние на людей могут оказывать остаточные количества антибиотиков как в результате прямого токсического действия, так и путем вызывания аллергических реакций или развитием устойчивых к антибиотикам штаммов микроорганизмов. В последнем случае попытки лечения человека такими антибиотиками окажутся безуспешными. Эта проблема относительно новая и пока последствия внедрения химизации в животноводство, особенно отдаленные эффекты, изучены не достаточно.

Кроме того, определенную мутагенную опасность могут представлять пищевые добавки, используемые в качестве консервантов, ароматизаторов, красителей, подсластителей, загустителей и пр. Пищевые добавки люди стали применять с незапамятных времен, в частности, поваренную соль, винный уксус, пряности, сахароподобные вещества. В основном пищевые добавки представляют собой химические вещества природного или синтетического происхождения, которые вносят в продукты питания с целью улучшения качества, придания приятного вкуса, запаха или цвета, увеличения сроков хранения и т.д.

В нашей стране в отношении пищевых добавок действует экологически оправданный принцип — "запрещено все, что не разрешено". Так, среди синтетических красителей применяются лишь два — индигокармин и тартразин, в то время как в мире используется довольно большое их количество.

Часть из них обладает аллергенными, мутагенными или канцерогенными свойствами. То же относится и к консервантам, эмульгаторам, стабилизаторам, осветлителям, подсластителям. В связи с тем, что сегодня отечественный рынок наполняется продуктами иностранного производства, содержащими самые разнообразные пищевые добавки и не всегда удовлетворительного качества, очень важно знать негативные свойства этих добавок.

Таблица 3 - Примеры наиболее часто применяемых пищевых добавок [31] Красители Стабилизаторы ных кислот Окончание табл. Сладкие веще- Сахарин, ксилит, сорбит Диетические кондитер- 300, венные Консерванты Ферментные препараты Проторизин Мясо, сельдь 0,075Например, известны сведения о мутагенной активности консерванта нитрита натрия и бактериального ингибитора для вин и соков бисульфита натрия, а также широко используемого сахарозаменителя - сахарина. Значительное внимание уделено изучению мутагенных свойств различных антиоксидантов, применяемых в качестве консервантов пищевых продуктов;

• кроме того, загрязнение пищевых продуктов может происходить путем миграции в продукты питания токсических веществ из пищевого оборудования, посуды, инвентаря, тары, упаковок вследствие использования неразрешенных полимерных, резиновых и металлических материалов. Пищевое сырье может быть загрязнено мутагенами при хранении. Например, в результате накопления переокисленных соединений липидов, мутагенность которых хорошо известна [7], или в результате поражения плесневыми грибами- продуцентами мутагенных микотоксинов. Мутагенные свойства одного из микотоксинов афлатоксина В1 выявлены в исследованиях на самых разных биологических объектах, включая обезьян. Минимальная генотоксическая доза этого вещества, установленная в экспериментах на китайских хомячках, весьма незначительна - 0,1 мкг/кг. При этом увеличение уровня спонтанного мутирования после однократного введения этого соединения обезьянам сохраняется на протяжении почти двухлетнего периода наблюдений. Также имеются сведения о мутагенных свойствах других микотоксинов: патулина, зеараленона, охратоксина А.

Показано образование мутагенов 1-(2- фурил) - пиридо[3,4-b]индола и 1-(2фурил) - пиридо[3,4-b]индол - 3 - уксусной кислоты при смешении и совместной 60-дневной инкубации при 37°С L-триптофана и L-аскорбиновой кислоты.

Это может свидетельствовать о возможности образования мутагенов при хранении пищи, содержащей указанные естественные компоненты;

• в пищевых продуктах может происходить образование эндогенных токсических соединений в процессе теплового воздействия (например, кипячения, жарения, облучения), других способов технологической обработки. В пищевых продуктах, не подвергавшихся кулинарной обработке (кроме варки) и хранению, нитрозамины (НА), как правило, встречаются реже и в значительно более низких концентрациях.

Технологическая обработка - копчение, жарка, посол, вяление, сушка и другие - один из главных путей загрязнения пищевых продуктов нитросоединениями, которые образуются из содержащихся в пище предшественников. Так, при производстве мясных продуктов синтез нитрозаминов возможен на стадиях посола, копчения и внесения пряностей и специй. В процессе посола распадаются белковые компоненты мяса, образуются полипептиды и низкомолекулярные азотсодержащие соединения, в частности, нитрозируемые аминокислоты и амиды. Вторая важнейшая операция, при которой происходит образование НА в мясных продуктах, - обработка их коптильным дымом. Копчение не только ускоряет реакции нитрозирования, но из-за присутствия в коптильном дыме нитрозогазов способствует образованию НА [8, 9]. При содержании в посолочных смесях 1 -2% нитритов и использовании смесей, содержащих нитрит и специи (перец, лук, танин, чеснок и др.), необходимые для изготовления мясных продуктов, происходит образование нитрозаминов, преимущественно при хранении этих смесей [6].

Консервирование мясных продуктов, особенно из предварительно посоленного мяса, способствует восстановлению нитратов до нитритов и нитрозированию аминов и других веществ, содержащих аминогруппы. Тепловая обработка при консервировании, в частности, бланшировка, обжарка и стерилизация, также усиливает эти реакции. В пищевых продуктах, не подвергшихся кулинарной обработке (кроме варки) и хранению, НА, как правило, встречаются реже и в значительно более низких концентрациях. Существенного снижения образования нитрозосоединений можно достичь совершенствованием технологии копчения мяса и рыбы - уменьшением концентрации окислов азота, температуры дымообразования, заменой дыма коптильными жидкостями и многое другое.

Холестерин, окисляясь при хранении и приготовления пищи, может также приобретать мутагенные свойства. Термическая обработка также приводит к образованию и накоплению в пищевых продуктах генотоксических полициклических ароматических углеводородов, прежде всего бензо(а)пирена, кроме того мутагенными свойствами обладают пирролизаты фосфолипидов, образующиеся при нагревании пищевых продуктов до 500-700оС. Подобная активности выявлена у продуктов пиролиза глутаминовой кислоты и других аминокислот или белков. Пирролиз последних приводит к возникновению мутагенных ароматических аминов Тгр-Р-1, Тгр-Р-2, GIu-P-1, GIu-P-2, АС, МеАС [3] (табл. 4).;

• несоблюдение санитарных требований в технологии производства и хранения пищевых продуктов приводит к образованию бактериальных токсинов (микотоксины, батулотоксины и др.).

• поступление в продукты питания токсических веществ, в том числе радионуклидов, из окружающей среды — атмосферного воздуха, • использование неразрешенных красителей, консервантов, антиокислителей или применение разрешенных в повышенных дозах. Французскими специалистами из Исследовательского центра HospitalVillejuif составлен перечень вредных для здоровья веществ, применяемых для окрашивания и консервирования пищевых продуктов.

Согласно этому списку агенты, обозначенные на этикетках продуктов как Е102, Е110, Е120, Е124, Е127, классифицированы как "опасные" (Е123 "очень опасный"), к "запрещенным" отнесены Е103, Е105, Е111, Е 121, Е125, Е126, Е130, Е152; канцерогенными считаются Е130, Е142, Е210, Е211, Е212, Е213.

Е214, Е215, Е216, Е217, Е240, ЕЗЗО; вызывающими расстройство кишечника Е221, Е222, Е223, Е224, Е226; вызывающими расстройство желудка Е338, Е339, Е340, Е341, Е407, Е450, Е461, Е462, Е463, Е465, Е466; нарушения кровяного давления вызывают препараты Е250, Е251; кожные заболевания возникают при применении Е230, Е231, Е232, Е2393, а "подозрительными" считаются Е104, Е122, Е141, Е150, Е171, Е173, Е180, Е241, Е467;

• применение новых нетрадиционных технологий производства продуктов питания или отдельных пищевых веществ, в том числе полученных путем химического и микробиологического синтеза.

• в пище имеются мутагены естественного происхождения. Например, в экспериментах на лимфоцитах человека показано, что кофе, помимо кофеина, содержит и другие мутагенные факторы. Также известно более 200 растений, содержащих соединения, обладающие Перечень мутагенов, выделенных из мясного сырья, представлен в таблице 4.

Приведенные примеры однозначно указывают на необходимость широких исследований, направленных на оценку мутагенных свойств пищевых продуктов, вспомогательных пищевых компонентов, распространенных пищевых добавок, а также роли отдельных технологий в возникновении мутагенов в готовых продуктах, произведенных из доброкачественного сырья.

Однако именно оценка мутагенных свойств является наименее разработанной проблемой в области теоретической пищевой токсикологии. Согласно рекомендациям Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), в пищевой токсикологии можно использовать методологии изучения мутагенности, применяемые в смежных областях [11].

Однако не вызывает сомнений необходимость учета специфики изучения пищевых продуктов.

Таблица 4 - Мутагены, выделенные из мясных продуктов МеАС Тгр-Р-1 3-амино-1,4-диметил-5Н-пиридо-(4,3-b) индол 211 C13 H13 N Тгр-Р-2 3-амино-1-метил-5Н-пиридо (4,3-b) индол 197 C12 H11 N GIu-P-1 2-амино-6-метилдипиридо-(1,2-а:3`,2`-d) C11 H10 N Glu-P-2 2-аминопиридо(1,2-а:3`,2`-d)имидазол 184 C10 H8 N Lys-P-1 3,4-циклопентенпиридо-(3,2-а)карбазол 258 C18 H14 N 4-амино-6-метил-1Н-2,5,10,10b- тетразафлуоран- I-M-5- 2-амино-1-метил-5фенилимидазопиридин 224 C13 H12 N Ph1P N,n,n,- 2-амино-n,n,n-триметилимида-зопиридин 176 C9 H12 N ТМ1Р 2-амино-З-метилимидазо (4,5-f) хинолин 2-амино-3,4-диметил-3Н-имидазо-(4,5-f) хинолин MeIQx 2-амино-3,8-диметил-имидазо-(4,5-f)-хиноксалин 213 C11 H11 N 4,8- 2-амино-3,4,8-триметилимидазо-(4,5-f)- 227 C2 H13 N DiMeIQx 7,8- 2-амино-3,7,8-триметилимидазо-(4,5-f)- 227 C12 H13 N DiMelQx Мутации - это наследуемые изменения в молекулах ДНК. Мутации происходят постоянно и во всех локусах генома [12].

Далеко не всякая модификация молекулы ДНК (мутация) является опасной для организма. Более того, эволюция была бы не возможна без мутаций, поскольку именно она лежит в основе изменчивости. Опасность представляет случайный, ненаправленный мутагенез, как правило, несущий для организма негативные последствия. Неблагоприятные эффекты мутагенеза определяются тем, в клетках какого типа он реализуется: половых или соматических, стволовых и делящихся или созревающих и зрелых. Результатом грубых мутаций половых клеток и делящихся клеток развивающегося плода являются: стерильность особи, врожденная патология у потомства, тератогенез, гибель плода.

Мутации стволовых и делящихся соматических клеток сопровождаются структурно-функциональными нарушениями тканей с непрерывной физиологической регенерацией (система крови, иммунная система, эпителиальные ткани) и канцерогенезом. Повреждение токсикантом ДНК зрелой соматической клетки не приводит к пагубным последствиям для организма.

Известно, что существуют как индуцированные, так и спонтанные мутации. К спонтанным относят такие мутации, причину возникновения которых трудно и даже невозможно связать с действием определенного фактора. Частота спонтанных мутаций не велика и составляет всего 10-5 – 10 -8 на клетку.

Спонтанные мутации образуются самопроизвольно в любой популяции организмов без видимого внешнего воздействия. Они составляют так называемый естественный, или спонтанный фон, величина которого колеблется и зависит от вида организма. Индуцированные мутации получают экспериментально под влиянием определенного фактора физической или химической природы (их часто называют мутагенами) [13].

Различают мутации точечные (или генные), которые затрагивают один какой-нибудь ген, и хромосомные, связанные с изменением структуры целой хромосомы или хромосом. Точечные мутации представляют собой выпадение, вставку или замену пары оснований их делят на три группы [5]:

• Мутации, приводящие к изменению смысла кодона (missense-мутации).

Это может произойти при замене пар оснований, ответственных за включение определенной аминокислоты при синтезе белка, например замена Г-Ц на А-Т. В результате происходит подстановка другой аминокислоты в полипептидную цепь. При этом новая аминокислота может исказить свойства белка и сделать его функционально незначимым.

• Мутации, делающие кодоны бессмысленными (nonsence-мутации), т.е. не несущими информации (например УАА или УАГ). В этом случае происходит обрыв полипептидной цепи и образование дефектного белка.

• Мутации, сдвигающие рамку считывания информации. Это может происходить при выпадении какого-либо нуклеотидного звена ДНК (делеции) или вставки дополнительных нуклеотидов (инсерции). Сдвиг рамки считывания меняет всю программу синтеза полипептидной цепи и, как правило, приводит к образованию нефункциональных белков, которые быстро деградируют в клетках.

В клетках высших организмов гены располагаются в клеточном ядре, в особых образованиях - хромосомах. Хромосомные мутации носят характер крупных перестроек в отдельных фрагментах ДНК. Мутагенные факторы могут не просто вызывать изменение одного гена, а повреждать хромосому или хромосомы, вызывая выпадение или видоизменение (в случаях транслокаций и инверсий) целого блока сцепленных генов. В таких случаях говорят о хромосомных мутациях или аберрациях хромосом.

Аберрации хромосом, как правило, ведут к изменению или выпадению целой группы генов. Такие мутации регистрируют не по изменению функции генов, а цитологически. При этом удается не только констатировать наличие или отсутствие аберрации хромосом, но и их тип. Различают хромосомные и хроматидные аберрации, первые затрагивают целые хромосомы, вторые - лишь их хроматиды. В результате мутагенного повреждения хромосома может утратить большую или меньшую часть своего материала (делеция), оторвавшийся участок хромосомы может перевернуться на 180° и воссоединиться к другой хромосоме (транслокация). В некоторых случаях в одном клеточном ядре могут быть повреждены одновременно несколько хромосом, также как и в одну транслокацию может быть вовлечено не две, а большее число хромосом [13].

Накопление хромосомных мутаций в соматических клетках является одним из факторов инициирования злокачественных опухолей.

Геномные мутации – это серьезное нарушение генетического аппарата.

Они связаны с нарушением числа хромосом, которое в норме является табильным показателем для данного организма. Геномные мутации подразделяют на анеуплоидии и полиплоидии. Анеуплоидией называют изменение количества отдельных хромосом уменьшение (нулли – и моносомия) или увеличение (тритетра- и полисомия) их числа, т.е. несбалансированный хромосомный набор.

Полиплоидия – это увеличение числа хромосомных наборов соматических клеток по сравнению с обычным, диплоидным.

Для изучения мутагенных свойств различных соединений предложено более 200 краткосрочных тест-систем, основанных на применении тестобьектов разного уровня организации - от микроорганизмов до млекопитающих, - позволяющих тестировать различные типы генетических изменений (табл. 5).

Однако в настоящее время применяются не только тест-системы, перечисленных в табл. 5, разрабатываются новые системы. К примеру, тестирование генотоксичности акриламида, который трансформируется в гликоамид в продуктах после нагревания и способен к образованию аддуктов с ДНК в клетках in vivo, в стандартных тест-системах in vitro затруднено. Возможно, это связано с низким уровнем активности ферментов в стандартных методиках, отвечающих за превращение промутагена акриламида в мугатен гликоамид [15].

Для решения этих проблем разрабатываются модификации стандартных тестов, в данном случае предложено применение модифицированных линий клеток китайского хомячка с повышенной активностью человеческой ферментной системы Р450 и сульфотрансферазы, ответственных за трансформацию акриламида в глюкоамид. Наличие этих систем делает данную клеточную линию чувствительной к генотоксическо му эффекту промутагенов. Но ни одна не может регистрировать все типы возникающих мутаций. В связи с этим для скрининга химических соединений на мутагенность целесообразнее использовать набор тест-систем.

Таблица 5 - Типы генетических повреждений, выявляемых в основных тест-системах Бактерии Насекомые Культуры клеток Клетки мышиной Интактные млеко- Крыса питающие Химические вещества, попадая в организм человека и животных, подвергаются сложным метаболическим превращениям, которые необходимо учитывать при выборе той или иной тест-системы или индикаторного организма.

Ниже дается в общей форме оценка имеющихся методов учета метаболизма в различных тест-системах (табл. 6).

Таблица 6 - Живые системы для характеристики мутагенного эффекта Система или организм Характеристика активности мутагена Микросомальная активи- Мутагенная активности соединений морующая систем in vitro жет быть активирована различными методами in vitro.

Дрозофила Мутагены «прямого» действия и премутагены, нуждающиеся в метаболической активации в среде, сходной со средой организма млекопитающего.

Интактные животные (тесты Определение в основном только мутагенна репарацию, цитогенети- ных соединений, вызывающих разрыв ческие тесты, доминантные хромосом.

летали и тест специфического локуса у мыши) Важной проблемой является соотношение мутагенных и канцерогенных свойств у химических соединений. Процессы канцерогенеза и мутагенеза тесно сопряжены. Это послужило основанием рассматривать результаты краткосрочных тестов на мутагенез в качестве прогностических показателей наличия у изучаемых соединений канцерогенных свойств.

Пищевые добавки и вспомогательные вещества могут приниматься вместе с пищей длительное время, в том числе детьми и подростками, поэтому возможность их влияния на различных стадиях канцерогенеза должна быть исследована в высшей степени детально. Как известно, развитие опухолей процесс длительный и поэтапный. В соответствии с концепцией многоступенчатости он может быть подразделен на следующие фазы:

экспозиция, инициация, промотирование, конверсия и прогрессирование.

Инициатором возникновения рака в большинстве случаев является генотоксичные вещества, т.е. вещества, способные ковалентно модифицировать ДНК, поэтому обнаружение ковалентного связывания испытуемого вещества (или его метоболитов) с ДНК (ДНК-аддукта) играет особую роль в выявлении его канцерогенного действия [13].

Некоторые авторы стали рассматривать генотоксикологические исследования как возможную альтернативу классическим методам оценки канцерогенной активности [16, 17]. Последнее может быть оспорено, до 90% ксенобиотиков, обладающих генотоксическим действием в краткосрочных тестах, не проявляют канцерогенных свойств экспериментах на грызунах [18]. С другой стороны, отсутствие мутагенности не гарантирует отсутствия канцерогенности.

Классическая оценка канцерогенности на грызунах дорогостоящая и требует на мене 2 лет экспериментального времени, поэтому они не приобретают массовый характер. Таким образом, краткосрочные тесты на генотоксичности играют роль своеобразного «сита», которое позволяет определить химикаты, требующие проведения первоочередной проверки на канцерогенность.

Преимущества оценки в микробных тест-системах можно суммировать следующим образом: а) их высокая чувствительность; б) экономичность; в) быстрота ответа; г) генетическая изученность тестерных штаммов; д) возможность тестирования генных мутаций.

Существует и другая классификация мутаций [13, 14] - по типу клеток, в которых они возникают. Согласно этой классификации различают мутации, возникающие в соматических клетках и мутации в половых клетках. Соматические мутации вызывают гибель отдельных клеток или развитие мозаицизма у их носителей, а в ряде случаев приводят к злокачественному перерождению соответствующих тканей. Но на потомков такие мутации, как правило, не влияют.

Мутации же в половых клетках передаются по наследству, приводят к рождению детей с тяжелыми наследственными болезнями, уменьшают фертильность, способствуют спонтанным абортам и мертворождениям. В то же время такие мутации обычно не влияют на их носителя.

Подавляющее большинство существующих методов анализа мутагенных потенций химических соединений направлено на обнаружение мутаций в соматических клетках. При этом допускают, что если вещество в данной дозе вызывает мутации в соматических клетках, то оно вызывает их и в клетках половых.

Но это положение не столь самоочевидно и требует специального изучения, в особенности в вопросе о дозах.

Возникновение мутаций не является единичным одновременным актом.

Два типа нарушений структуры ДНК приводят к мутациям. Это, во-первых, включение нормальных нуклеотидов в аномальное окружение из последовательностей нуклеотидов, приводящих к образованию неправильно спаренных оснований и петель разных размеров. Во-вторых, появление повреждений ДНК в виде аномальных нуклеотидов в правильных последовательностях ДНК. В этом случае речь идет о различных химических модификациях нуклеотидов, включая их разрушение и образование поперечных сшивок. Повреждения ДНК могут приводить к задержке и блокированию репликации и транскрипции.

Под влиянием химических соединений в генетическом аппарате клеток, как правило, возникают лишь потенциальные изменения, которые в результате дальнейших событий с участием ряда внутриклеточных ферментов реализуются в истинную мутацию либо залечиваются, репарируются. Системы репарации действуют в каждой клетке и степень их активности приходиться учитывать при определении мутагенности данного вещества [14]. Известно, что существуют различия в уровне активности систем репарации повреждений в различных типах тканей и у различных животных. Это обстоятельство заставляет настороженно относиться к экстраполяции данных о мутагенной активности данного вещества, полученных на клетках одной ткани, для других тканей и, следовательно, на другие виды животных.

При оценке вклада процессов репарации первичных повреждений в развитие мутационных событий следует учитывать и то обстоятельство, что имеется ряд химических соединений, которые сами по себе не вызывают мутации, но подавляют процессы репарации повреждений ДНК и тем самым, могут способствовать существенному возрастанию мутагенной активности маломутагенного вещества [19].

Репарация - это процесс восстановления генома от поражающего действия мутагена. Например, сопутствующие репликации одноцепочечные разрывы восстанавливаются при помощи ферментов ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы.

ДНК-полимераза в данном случае проверяет правильность присоединения нуклеотидов вновь образованной нити в процессе репликации ДНК, и если его основание не комплементарно основанию матричной цепи, то фермент гидролизует его.

В 1949 году было установлено, что под действием УФ-облучения наиболее часто возникает взаимодействие двух соседних пиримидиновых оснований, чаще всего тиминов. При этом образуется тиминовый димер, блокирующий действие ДНК-полимеразы в процессе репликации. Этот димер вырезается специфичной нуклеазой, которая вырезает кусочек однонитевой ДНК, который потом застраивается ДНК-полимеразой. Это явление получило название фотореактивации. Обработка клеток длинноволновым ультрафиолетом после УФоблучения частично снимает повреждающее действие последнего. Система ферментативной фотореактивации ДНК, основным компонентом которой является ДНК-фотолиаза, разделяет пиримидиновые димеры, превращая их в нормальные пиримидиновые основания. Кроме того, поврежденные УФ- светом молекулы ДНК могут репарироваться с участием систем рекомбинации и в процессе пострепликативного синтеза ДНК. Действие систем репарации поврежденной ДНК распространяется не только на фотопродукты, но и на другие модифицированные основания, образующиеся под действием химических мутагенов. Отдельно следует упомянуть систему, распознающую неправильно спаренные основания в двойной спирали ДНК, возникающие в результате ошибок репликации.

Долгое время считалось, что феномен фотореактивации является исключением. Но в конце 50- начале 60 годов были получены факты существования темнового восстановления, то есть восстановления, не требующего активации светом. В отличие от фотореактивации этот процесс обеспечивает восстановление после действия не только УФ, но и всех изученных в настоящее время мутагенов.

Известны два типа темнового восстановления - дорепликативная (эксцизионная) и пострепликативная (толерантная или рекомбинационная) репарации.

В ходе первой поврежденный участок ДНК вырезается (происходит эксцизия) и восстанавливается первоначальная структура по принципу комплиментарности цепи и, таким образом, полностью восстанавливается генетическая информация. В ходе второй восстанавливается двунитевая структура ДНК за счёт восстановления, возникающего в ходе репликации брешей во вновь синтезированной нити ДНК [20].

В эксцизионной репарации и пострепликативной участвует ряд ферментов, образование которых контролируется специальными генами. К этим ферментам относятся эндонуклеазы, ДНК-полимераза 1, которой свойственны экзонуклеазная и ДНК-полимеразная активности, лигаза, обеспечивающая воссоединение вновь синтезированных в процессе репарации фрагментов ДНК. В пострепликативной репарации существенное значение имеют ферменты, участвующие в рекомбинационных процессах.

Механизм эксцизионной репарации включает гидролиз фосфодиэфирной связи по 3'- или 5'- концу на некотором расстоянии от ошибочно спаренного (поврежденного) нуклеотида, который далее целиком удаляется под действием 5'->3'- (или 3'->5')-экзонуклеазы, гидролизующей цепь ДНК нуклеотид за нуклеотидом в соответствующем направлении от первоначального одноцепочечного разрыва в репарируемой ДНК. Образующаяся брешь далее заполняется ДНКполимеразой. Такой механизм репарации реализуется у Escherichia coli и человека для вырезания неповрежденных (немодифицированных) ошибочно спаренных нуклеотидов. Механизм последовательного эндо- и экзонуклеазного расщепления ДНК не используется для удаления поврежденных (измененных) нуклеотидов. Это связано, по-видимому, с тем, что такие нуклеотиды (например, возникшие в результате образования аддуктов с мутагенами) часто являются ингибиторами экзонуклеаз. Второй механизм функционирует у всех исследованных видов организмов и заключается в использовании ферментной системы, которая вносит одноцепочечные разрывы по обе стороны от поврежденного нуклеотида на некотором расстоянии от него с последующим удалением одноцепочечного фрагмента ДНК, содержащего измененный нуклеотид.

Все описанные выше типы репарации катализируются конститутивными ферментами, присутствующими в клетках в постоянных количествах. Кроме того, существует репарация, осуществляемая индуцибельными ферментами, так называемая SOS-репарация. SOS-система - генетическая программа изменения ДНК путем ее мутагенной репарации или рекомбинации с целью адаптации клетки к изменившимся внешним условиям, результатом чего является наращивание ее эволюционного потенциала. Этот механизм включается для спасения клетки в условиях, когда нарушения ДНК реально угрожают её жизнеспособности. Во-первых, при этом снижается скорость репликации, что делает процесс репарации более эффективным; во-вторых, блокируется деление клеток; и, втретьих, индуцируются синтез ряда белков, участвующих в образовании олигонуклеотидов, в частности белков теплового шока. Действие SOS-репарации носит кратковременный характер, и примерно через 40-60 мин она переключается на конститутивную репарацию.

Для оценки мутагенных свойств химических соединений предложено около 200 различных тест-систем, многие из которых хорошо разработаны и нашли широкое применение. Однако до настоящего времени нет универсальной тест-системы, которая могла бы выявить все основные типы генетических повреждений. Это обстоятельство ведет к необходимости использования в работе по выявлению и оценке мутагенности исследуемых объектов целого набора методов. При этом в качестве тест-объектов служат самые различные виды организмов от микроорганизмов до трансгенных животных и клеток человека в условиях in vitro и in vivo. Большинство широко используемых в настоящее время тест-систем разработаны были еще в 70-х годах и подробно описаны в различных методических руководствах и обзорах.

Основные принципы тестирования на мутагенность большого числа продуктов, химических соединений, которые в той или иной форме введены в окружающую среду или будут введены в результате возрастающего химического синтеза, были сформулированы еще в начале 70-х годов Бриджесом (7) и Фламмом (14). Эти принципы основаны на идее поэтапного тестирования, когда каждый из этапов является просеивающим по отношению к последующему этапу, то есть тестирование того или иного соединения на следующем этапе проводится только в случае, если оно проявило мутагенную активность на предыдущем этапе. Такое тестирование предполагает создание набора или батареи тестов, в котором первый этап состоит из простых и высокочувствительных методов, а последующие этапы состоят из методов по возрастающей сложности проведения и филогенетической близости к человеку. Следует отметить, что батарея тестов должна содержат максимально информативный набор методов, позволяющих регистрировать различные типы генетических изменений, в то же время достаточно экономичных, чтобы обеспечить реальность выполнения программы испытаний. С другой стороны, набор методов, схема испытаний, анализ и оценка результатов должны быть одобрены и утверждены государственными органами, чтобы все системы оценки в рамках поставленной задачи имели официальный характер и обеспечивали унификацию проверки на мутагенность во всех лабораториях.

Тестами для определения мутагенов регистрируются, главным образом, генные, геномные и хромосомные мутации. Эти пробы характеризуются простотой, краткосрочностью, высокой "пропускной" способностью и экономически выгодны. С помощью проб на мутагенность в различных лабораториях Западной Европы, США и Японии было испытано около 20000 химических веществ, в том числе практически все соединения, канцерогенность которых установлена для животных. При этом удалось предсказать канцерогеннную активность алкилнитрозомочевин, этиленоксида, фенацетина, пищевого консерванта AF-2, синтезированных на основе ароматических аминов красителей для волос, содержащихся в дизельных выхлопах нитропиренов, некоторых белковых пиролизатов пищевых продуктов и ряда других соединений. Вместе с тем, сами по себе отдельно взятые краткосрочные тесты дают хотя и важную, но ограниченную информацию.

Информативность краткосрочного тестирования существенно повышается созданием батарей ускоренных методов. Батареи должны отвечать следующим принципам:

• взаимодополняемость проб, включаемых в батарею;

• каскадность в применении различных методов;

• интегральность оценки результатов.

Принятые в различных странах схемы тестирования, и соответственно набор методов, последовательность тестирования и правила принятия решения о прекращении или продолжении испытаний, несколько различаются. Эти различия сложились исторически в 70-80-х – годах ХХ века, в период бурного развития работ по апробации и валидизации тест-систем и их батарей. В настоящее время эти различия являются препятствием на пути к унификации схем тестирования в период необходимости формирования общих требований к химической безопасности, в том числе и к генетической безопасности.

Создание в начале 70-х годов тест-систем, способных учитывать метаболическую трансформацию химических агентов in vitro (например, тест Эймса Salmonella/микросомы), показало, что многие канцерогены являются также и мутагенами. Это привело к тому, что тестирование соединений, в том числе продуктов питания, на генетическую активность стали проводить в двух целях.

Во-первых, для регистрации собственно мутагенов, то есть соединений, потенциально способных индуцировать мутации в половых клетках человека, и, вовторых, для выявления потенциальных канцерогенов, способных индуцировать мутации в соматических клетках человека.

Теоретическое обоснование использования тестов на генотоксичность для выявления потенциальных канцерогенов связано с представлением о том, что в основе развития большинства опухолей, индуцированных канцерогенами (по крайней мере, на стадии инициации), лежит генотоксический эффект. Сами же тест-системы, используемые для предсказания канцерогенной активности, получили статус "краткосрочных" тест-систем (КСТ), под которым следует понимать ускоренные методы (по отношению к стандартным методам определения канцерогенной активности на животных), позволяющие предсказывать канцерогенный риск для человека тех или иных веществ и основанных на определении биологической активности, прямо или косвенно связанной с канцерогенным потенциалом этих соединений. Разработка КСТ для предсказания канцерогенной активности основывается на представлениях о механизмах действия канцерогенов, то есть, если конечным критерием тестирования на канцерогенность в опытах на животных является опухоль, то в КСТ - это те генетические или иные эффекты, которые ведут к ее возникновению.

Таким образом, тесты на генотоксичность и их батарей могут быть использованы для определения как мутагенного, так и канцерогенного потенциала. Все зависит от схемы тестирования. Если для предсказания канцерогенного потенциала достаточно одного или двух этапов тестирования (на 1 этапе тестирование проводится в тесте Эймса и/или на клеточных культурах, на 2 этапе для тестирования используются животные и регистрируется индукция микроядер или хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей), то для предсказания мутагенного потенциала для половых клеток человека необходима оценка мутагенной активности в половых клетках животных.

Следует подчеркнуть, что широко используемые КСТ и подходы к оценке мутагенного и канцерогенного потенциала, основаны на достижениях науки 70-х годов. Однако хорошая проработанность протокола проведения тестирования и валидизированность самих КСТ, а также наличие достаточно солидной базы данных по результатам исследования генотоксичности с помощью этих тестов тысячи ХС делает их вполне применимыми и сегодня.

Благодаря достижениям в технологии рекомбинантной ДНК в течение последних двух десятилетий произошли существенные изменения в области молекулярного генетического анализа и цитогенетики. Новые методические приемы позволили вводить чужеродные гены в клетки млекопитающих и конструировать сигнальные системы для мутационного анализа. Так, методы полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирования ДНК по сути дела сделали революцию в этой области и в настоящее время широко используются для определения типа мутаций в сайтах или кодонах их локализации. Одновременно были достигнуты существенные успехи в изучении механизмов развития опухолей. Если в течение многих десятилетий развитие опухолей рассматривали как следствие изменений стадий прогрессии и развития опухолей, то в настоящее время больше внимания привлекает точка зрения о том, что рак является следствием ошибки в нормальном жизненном цикле клетки. Так, изменения в контроле роста клеток может быть результатом функциональных изменений в белках, влияющих на «контрольные точки» или альтернативные пути клеточного деления. Эти функциональные изменения являются часто следствием мутации в критических сайтах генов, которые изначально были идентифицированы как онкогены или антионкогены, то есть опухоль-супрессорные гены.

Генетические изменения именно в критических сайтах таких генов, повидимому, имеют непосредственное отношение к развитию опухолей, тогда как генетические изменения в других частях генома не имеет или имеет мало последствий. Например, мутации в критических сайтах опухоль-супрессорного гена р53 (подавляет перерождений нормальной клетки в опухолевую) предрасполагают к развитию широкого спектра опухолей у человека и, особенно, лимфолейкозов и опухолей молочной железы. Многочисленные исследования функции онкогенов и антионкогенов показали, что они, как правило, кодируют белки, участвующие в сложной системе позитивной и негативной регуляции клеточной пролиферации и дифференцировки.

Технология рекомбинантной ДНК позволяет конструировать клетки и организмы, содержащие чужеродные гены и создавать новые тест-системы для обнаружения мутагенного или канцерогенного потенциала соединений. Созданы рекомбинантные клеточные системы, в которых репортерный ген находится под контролем промоторов, которые активируются под действием генотоксичных химических соединений. Экспрессию репортерного гена отслеживают биохимическими методами. Наиболее ярким примером является бактериальный SOS-хромотест, разработанный в 70-80 годы, в котором экспрессия галактозидазного гена свидетельствует об активации генов SOS-ответа.

Ряд трансгенных мышиных моделей были созданы позже на таком же принципе. Трансгенные мыши Big Blue и Mutamouse содержат в своем геноме множественные тандемные дупликации бактериального lac-гена. Наиболее распространенная модель Big Blue имеет в своем геноме шаттл вектор общеизвестного бактериофага ( LIZ), который в качестве мишеня содержит ген lacI, а в качестве репертора - ген lacZ. После обработки мышей изучаемым агентом, выделяется геномная ДНК из клеток интересующих исследователей тканей и затем, используя упаковочный экстракт фага, из этой ДНК выделяют вектор LIZ. Инфекция клеток E.coli SCS-8 этим фагом позволяет обнаруживать фаги, несущие мутантный ген lacI. Если нормальная функция гена – репрессора lacI нарушена, то экспрессируется ген lacZ, продукт которого -галактозидаза легко обнаруживается по голубому цвету фаговых бляшек в присутствии хромогенного субстрата Х-gal. Подсчет отношения мутантных голубых бляшек к бесцветным немутантным бляшкам позволяет определить частоту мутации в интересующей ткани. В настоящее время с помощью этой модели исследована мутагенная активность в различных органах мышей ряда известных канцерогенов, как афлатоксин В1, 7,12-диметилбензантрацен и другие. Ценность данной модели заключается в возможности оценивать мутагенную активность агентов в органах-мишенях и сравнивать ее с активностью в других органах и тканях. Например, показано, что уровень мутагенной активности афлатоксина В1 в различных органах мышей коррелирует с данными исследования органной специфичности его канцерогенного действия.

Особенности классификации мутаций и разнообразие механизмов их возникновения привели к разработке многочисленных методов тестирования мутагенного действия. На сегодняшнем уровне развития исследований трудно отдать предпочтение какому-то одному методу. В каждом конкретном случае исследователю приходится выбирать из них те, которые соответствуют данной задаче. При этом приходится решать вопрос об адекватности выбранного метода объекту исследований. Естественно, что большинство исследований, связанных с тестированием мутагенного действия отдельных химических соединений или их комплексов, направлено на изучение их безопасности для человека.

Широкое распространение в мире получили методы с использованием в качестве тест-объекта микроорганизмов. Это обусловлено рядом преимуществ микроорганизмов перед другими объектами, как то:

• хорошая изученность генетического аппарата;

• высокая скорость размножения;

• экономичность экспериментов;

• возможность регистрации типа мутаций и механизма ее возникновения;

• высокая чувствительность штаммов;

• разнообразие тест-объектов: представители различных групп прокариот и низших прокариот;

• единая химическая организация нуклеиновых кислот как в клетках прокариот, так и эукариот.

Наибольшее распространение в мире получили штаммы Salmonella typhimurium, используемые в тесте Эймса [22], которые позволяют регистрировать обратные генные мутации в гистидиновом опероне. Штаммы постоянно совершенствуются путем введения новых мутаций, повышающих чувствительность бактерий к воздействию мутагенов. Применение теста Эймса положило начало интенсивному исследованию мутагенной активности широкого круга химических соединений синтетического и природного происхождения. В настоящее время тест также применяется в лабораториях, изучающих потенциально опасные соединения в окружающей среде (воздух, почва, вода). С его помощью изучена мутагенная активность почти всех известных канцерогенных соединений, широко использующихся в промышленности, медицине, сельском хозяйстве. Полученные результаты позволили рекомендовать тест Эймса в качестве ускоренного метода прогнозирования канцерогенности. Одна из новых областей применения этого теста - изучение мутагенов/канцерогенов в пищевых продуктах, особенно после кулинарной обработки. Показана мутагенная активность продуктов пиролиза триптофана, фенилаланина, глутаминовой кислоты, глобулинов сои и соединений, образующихся при обжаривании на открытом огне рыбы, мяса.

Определенным ограничением применения теста Эймса является невозможность тестирования образцов, содержащих свободный гистидин. Показано, что для удвоения числа ревертантов необходимо присутствие минимального количества гистидина, составляющего 150 нмоль/чашку [22]. Поэтому в пробах, содержащих данное или большее количество гистидина, невозможно отнести обнаруженную мутагенность к какому-либо иному фактору смеси.

Поэтому при тестировании в классическом тесте Эймса проб природных комплексов, а именно, воды открытых водоемов, водных вытяжек почвы, продуктов питания необходимо определять свободный гистидин.

Согласно современным представлениям мутации связаны с изменениями в структуре ДНК. В эукариотических клетках ДНК располагается внутри клеточного ядра, следовательно, для того чтобы достигнуть ее, мутаген должен пройти достаточно сложный путь, на котором он испытывает ряд метаболических превращений. Нередко в результате таких превращений безвредное вещество превращается в сильный мутаген или, напротив, исходное мутагенное вещество утрачивает свою активность. Метаболическая активация мутагенов обычно происходит в микросомах клеток печени животных или человека под влиянием ферментов - монооксигеназ смешанных функций. Чтобы учесть этот процесс при использовании в качестве тест-объекта микроорганизмов, в среду их культивирования вносят микросомную фракцию (S9), полученную из клеток печени крыс, предварительно обработанных индукторами монооксигеназ смешанных функций. Для того, чтобы учитывать метаболическую активацию мутагенов, разработан специальный метод [22], получивший название теста Эймса Salmonella/микросомы.

Тест Эймса в настоящее время широко используется в большинстве лабораторий мира как один из основных первичных методов, когда нужно сравнительно быстро проанализировать большое число химических соединений и отобрать среди них те, которые потенциально могут явиться мутагенными для человека. Прямая экстраполяция данных, полученных в тесте Эймса, на человека затруднена в силу того, что в тесте Эймса химические соединения действуют на отдельные клетки и дозы химических мутагенов, используемых в тесте, как правило, значительно превышают те, которые получает человек. Различия в уровне концентраций могут оказать модифицирующее действие на выход мутаций, обусловленный репарацией, абсорбцией, взаимодействием с клеточными органеллами и т.д. Наконец, Salmonella оказывается неудобным объектом при тестировании мутагенов, обладающих значительной бактерицидной активностью.

Известно, что большинство летальных и мутационных изменений ДНК могут быть восстановлены в клетках бактерий и животных системами репарации. Этот интенсивно изучаемый в генетике феномен является основой широко распространенных методов тестирования химических соединений на ДНКповреждающую активность, которая определяется по селективному ингибированию роста бактериальных штаммов, несущих мутации в генах, контролирующих различные этапы репарации ДНК. Эти методы, наряду с тестом Эймса Salmonella/микросомы, успешно применяются для первичного выявления мутагенов и канцерогенов [23].

2.2. Проблема интерпретации результатов, полученных Существенное значение имеет также проблема адекватной оценки полученных данных. Существуют данные, демонстрирующие мутагенные свойства ароматизирующих компонентов лука и чеснока в бактериальных тест-системах.

С одной стороны, эти данные свидетельствуют о генотоксическом потенциале этих ароматизаторов, с другой, - хорошо известны бактериостатические свойства компонентов указанных растений. Следовательно, выявленные мутагенные эффекты могут быть биоспецифичны для микроорганизмов, что не позволяет однозначно экстраполировать данные о мутагенности ароматизаторов чеснока и лука на человека [3].

Аналогичная ситуация складывается с распространенными загрязнителями среды и пищевых продуктов пероксиацетилнитратами, возникающими в результате взаимодействия фотохимически переокисленных органических продуктов с оксидами азота. Эти соединения проявляют мутагенные свойства в бактериальных тест-системах, но не у эукариот in vivo [24].

Известно, что в клетках всех живых организмов процессы метаболизма имеют много общего и протекают под действием одних и тех же ферментов, но, согласно результатам исследований сравнительной биохимии, бактерии наиболее далеки от высших организмов. Поэтому при трактовке результатов испытаний, в которых используются микроорганизмы (в виду того, что данные тестобъекты размножаются быстро, содержать их достаточно просто и дешево), и перенесении их на человека возникает ряд затруднений. Во-первых, в данном случае изучается действие химического мутагена на прокариотах, а значимость результатов переносится на эукариоты. Во-вторых, при исследованиях на микроорганизмах выпадает феномен метаболической активации промутагенов в мутагены. И, в-третьих, не учитываются возможности репарации возникающих предмутационных повреждений в эукариотических клетках, которые существенно отличаются от таковых в клетках прокариот.

При общей оценке тест-систем важно проводить различие между тестами, которые могут однозначно оценивать потенциальную мутагенность, т.е. отвечать на вопрос: «да» или «нет», и тестами, которые способны дать в определенной степени оценку риска применительно к организму человека (комплексные исследования точечных мутаций и хромосомных аббераций на млекопитающих in vitro и in vivo). Уровни частот спонтанных мутаций должны быть при этом достаточно низкими по сравнению с частотами мутаций, индуцируемых стандартными мутагенами, используемыми в качестве позитивных контролей. О пригодности тест-систем можно судить по следующим признакам:

• степень генетического и метаболического сходства с человеком;

• широта спектра регистрируемых генетических событий;

• возможность экстраполяции эффектов, регистрируемых в соматических клетках, на мейотические клетки.

К примеру, прямая экстраполяция данных, полученных в тесте Эймса, на человека затруднена в следствии ряда причин:

• в тесте химические соединения действуют на отдельные клетки;

• дозы химических мутагенов, используемых в тесте, как правило, значительно превышают те, которые получает человек;

• различия на уровне концентрации могут оказать модифицирующее действие на выход мутаций, обусловленный репарацией, абсорбцией, взаимодействием с кисточными органеллами и т.д;

• Salmonella оказывается неудобным объектом при тестировании мутагенов, обладающих значительной бактерицидной активностью.

В настоящее время в используемых тест-системах не удается найти соответствия по всем трем из перечисленных выше признаков. Для повышения надежности экстраполяции сведений о мутагенных свойствах пищевых продуктов и их компонентов следует продолжить исследования этих веществ с использованием в качестве тест-объекта высших организмов.

2.3. Тесты на мутагенность с использованием эукариот Стремление снять ограничение, связанное с трудностью перенесения на эукариот исследований, полученных на прокариотических организмах, заставило исследователей разработать методы, аналогичные тесту Эймса, но с использованием в качестве тест - объекта не микроорганизмов, а культуры клеток млекопитающих. При этом можно использовать любые клетки, подбирая лишь соответствующие селективные среды. Наиболее широко используют некоторые перевиваемые клеточные линии. Так, часто используют штаммы опухолевых клеток мышей L5178Y, линию клеток яичника китайского хомячка (клетки СНО) (табл. 3). Обе клеточные линии являются эукариотическими, но это опухолевые перевиваемые линии, которые обладают повышенной чувствительностью к мутагенному действию химических соединений, в связи с этим в ряде случаев можно получить ложно положительные результаты.

Использование опухолевых клеток связано с их способностью неограниченно долго развиваться в условиях культивирования in vitro, в то время как жизнеспособность любой первичной культуры клеток ограничена. Обычно при тестировании генных мутаций на первичных культурах клеток млекопитающих такие клетки стареют и погибают раньше, чем исследователи успевают выяснить у них зависимость в потребности того или другого вещества (мутацию по специфичному локусу) и подобрать селективную среду, на которой развивались бы лишь обратные мутагены по этому локусу.

При работе с культурами клеток млекопитающих используют тот же принцип, что и при работе с микроорганизмами: изучают точечные мутации, возникающие в каком - либо одном локусе. Существует ряд методов выявления прямых и обратных мутаций.

Учитывая опухолевую природу всех клеточных линий, используемых в опытах по тестированию мутагенного действия химических соединений, представляется затруднительным однозначный ответ на вопрос о преимуществах этих методов по сравнению с тестом Эймса. Тест Эймса более чувствителен, прост и дешев, что обусловило более широкое его использование в просеивающих программах.

Первичные культуры клеток человека (лимфоцитов периферической крови или фибробластов) также используют для изучения мутагенного действия химических соединений, но в этих случаях анализируют возникновение цитогенетических изменений, а не генных мутаций [25].

Изучение аберраций хромосом, возникающих под влиянием химических соединений, используется достаточно широко. Это связано с относительной простотой метода при использовании первичных культур клеток, а также с тем, что кроме ответа на вопрос о наличии или отсутствии мутагенного действия данного вещества, внимательный анализ аберраций хромосом порой позволяет высказать и некоторые соображения о механизмах возникновения таких перестроек.

Для мутационного анализа в эндогенных генах человека наиболее подходящим является ген hprt. Метод селекции мутантных клеток по этому гену хорошо разработан. Например, можно проводить анализ этих мутаций в лимфоцитах человека, то есть в клетках легко доступной ткани человека, накапливающей мутации в течение многих лет. Этот материал сравнительно просто получить для исследований (несколько миллилитров периферической крови), а также эти клетки в таких культурах относительно синхронизированы.

Суицидная селективная система позволяет выживать клеткам с мутантным или неактивным геном hprt, тогда как нормальные клетки в этих условиях погибают. Метод позволяет отслеживать мутацию в Х-хромосоме и соответственно только у мужчин. Данная система является пионером в мониторинге человеческих популяций и может быть полезной для проведения сравнения человек -экспериментальная модель.

Оптимальное время для получения наибольшего количества хромосомных аберраций в культурах лимфоцитов составляет 28 часов между введением мутагена и фиксацией. Частота хромосомных аберраций зависит от температуры в момент обработки мутагеном. Дозовые зависимости при химическом мутагенезе определяются не только концентрацией мутагенов, а и временем его воздействия.

Аберрации хромосом, несомненно, являются мутационными событиями, так как любая перестройка хромосом, даже такая как инверсия или транслокация без изменения количества генетического материала, а уже в силу эффекта положения ведет к изменению функционирования определенного гена или генов. Но сравнительно недавно для выявления мутационного действия химических соединений стали использовать анализ частоты сестринских хроматидных обменов, хотя механизмы возникновения сестринских хроматидных обменов, их биологический смысл и взаимосвязь с мутациями не ясны [20].

При определении мутагенного действия того или иного химического соединения путем анализа частоты аберраций хромосом или сестринских хроматидных обменов обычно используемое вещество вводят в культуральную среду, в которой развиваются испытуемые клетки. Можно поступать и иначе - анализировать соответствующие цитогенетические изменения в клетках людей, контактировавших на производстве или в быту с данным химическим соединением. В таких случаях используют культуры лимфоцитов периферической крови обследуемых людей или получают прямые метафазные препараты из пунктатов костного мозга. Безусловно, второй метод предпочтительнее, так как он позволяет исключить культивирование клеток in vitro, которое может искажать состояние хромосомного аппарата клеток, существующее in vivo. Но получать пунктаты костного мозга человека значительно труднее, чем периферическую кровь, поэтому при анализе литературы по данному вопросу обращает внимание существенное преобладание работ, выполненных на культурах лимфоцитов периферической крови.

Еще один метод анализа единичных клеток (Comet assay) позволяет идентифицировать генетические повреждения и нитевые разрывы ДНК в небольшом числе клеток из любого источника (человек или грызуны). Суть метода заключается в том, что образцы клеток лизируют в щелочных условиях и подвергают электрофорезу. Клетки, содержащие разрывы ДНК, проявляются в виде "кометы" с хвостом из фрагментов ДНК, отходящих от основного ядра. Технология метода Comet assay в отличие от метода щелочной элюции ДНК достаточно проста и может быть использована для широкого круга ситуаций, когда необходимо определить наличие разрывов и щелочелабильных сайтов в ДНК клеток из различных тканей человека и животных. При этом анализируется только небольшое число клеток, что делает метод очень удобным при его использовании для тестирования веществ на генотоксичность в клетках млекопитающих.

Современные методы анализа ДНК-аддуктов отличаются высокой чувствительностью и позволяют обнаруживать аддукты ДНК с генотоксикантом в пределах доз, которым подвергается человек (23). Метод особенно полезен когда природа аддукта известна и связь между аддуктом и конечным биологическим эффектом установлена. Он успешно был использован для определения воздействия на человека сигаретного дыма, профессиональных факторов, микотоксинов и химиотерапевтических агентов. Анализ аддуктов ДНК может быть одним из методов прямого сравнения экспериментальных данных на животных и данных на человеке и представляет собой значительную ценность в разрешении вопросов дозовой экстраполяции и оценки риска для человека.

Культуры клеток млекопитающих и человека дают возможность изучить мутагенное действие химических соединений на эукориотические клетки. Но так как в данном случае изучается действие препарата in vitro, возникает ряд новых проблем. Во-первых, это связано с отсутствием или изменением метаболической активации химических мутагенов в большинстве культур клеток. Для того, чтобы устранить это затруднение, приходиться, как и в случаях работы с микроорганизмами, использовать микросомные фракции из клеток печени животных (по аналогии с тестом Эймса). Но в таких случаях возникает вопрос о совпадении ферментных систем человека и животных (чаще всего крыс), микросомная фракция печени которых используется для метаболической активации мутагенов. Вопрос этот не простой, так как известно, что активность ряда монооксигеназ смешанных функций, которые являются основными ферментами, ответственными за метаболические превращения мутагенов в клетках печени крыс, в десятки раз выше, чем в соответствующих клетках человека. Во - вторых, при испытании мутагенного действия химических соединений in vitro исследуемые вещества непосредственно воздействуют на отдельные клетки, то есть имеет место контактное взаимодействие, чего никогда не бывает в условиях in vivo. И, в - третьих, в условиях культуры клеток работают не все системы репарации повреждений ДНК, из тех которые имеются в целостном организме.

Все это приводит к тому, что в качестве одного из этапов испытания мутагенного действия химических соединений используют лабораторных животных, а среди них наиболее часто дрозофилу и мышей или крыс.

Дрозофила является классическим объектом генетических исследований.

Ее несомненным преимуществом для таких исследований является короткий репродуктивный цикл (на протяжении одного года можно получить пятьдесят поколений дрозофилы). Кроме того, за 70 лет интенсивного использования дрозофилы в качестве основного лабораторного животного при генетических исследованиях достаточно хорошо изучена ее биология и генетика и легко определяются малейшие отклонения фенотипа, возникающие в результате мутаций. Но дрозофила является насекомым, поэтому при переносе результатов, получаемых на ней, на человека - возникает ряд возражений. В силу этого многие исследователи стремятся использовать в качестве лабораторных животных, при тестировании мутагенного действия химических соединений млекопитающих, в первую очередь мышей.

При использовании в качестве тест - объектов для выявлений мутагенного действия химических соединений культур клеток млекопитающих исследователи обычно сталкиваются с той же трудностью, что и при работе с микроорганизмами в качестве тест - объекта. Это связано с тем, что ряд химических соединений, требующих для проявления мутагенного действия метаболической активации, в опытах in vitro его не проявляют. В таких случаях также, как при тесте Эймса, используют систему метаболической активации микросомной фракцией клеток печени.

Для создания феномена метаболической активации в культурах клеток обычно используют гомогенаты печени. Использование клеточных гомогенатов может давать ошибочные результаты для некоторых проканцерогенов, в то время как культивируемые фибробласты не способны культивировать многие классы химических канцерогенов. Предложено использовать для метаболической активации клетки - посредники (суспендированные или прикрепленные к стеклу гепатоциты грызунов), культивируемые совместно с клетками, на которых испытывается мутагенное действие химических соединений.

Достаточно широко используют метод обнаружения доминантных летальных мутаций у животных, возникающих при действии химических мутагенов. Испытуемым химическим веществом обрабатывают самцов. Если это вещество обладает мутагенным действием, под его влиянием в сперматозоидах самца возникают доминантные летальные мутации. Обработанных химическим мутагеном самцов скрещивают с интактными самками, которых забивают в разные периоды беременности, и производят подсчет погибших зародышей, их аномалий и желтых тел в яичнике. Такой анализ позволяет судить о частоте доминантных летальных мутаций, произошедших у самцов под влиянием испытываемого химического соединения, так как такие мутации вызывают гибель образовавшихся зигот на ранних стадиях дробления или на разных этапах развития зародышей.

Метод обнаружения доминантных летальных мутаций применяется достаточно широко, хотя несет ряд неточностей. Так, при использовании этого метода нет возможности отличить случаи гибели зародышей в результате действия доминантных летальных мутаций от случаев гибели их под действием модифицирующих влияний факторов внешней среды, воздействующих на материнский организм в процессе беременности. Кроме того, при проведении подобных экспериментов необходимо учитывать системы репарации повреждений ДНК, имеющиеся в яйцеклетках, которые могут залечивать повреждения в наследственном аппарате сперматозоидов, проникших в соответствующую клетку. Так, показано, что выход доминантных летальных мутаций, возникших в сперматозоидах под воздействием химического мутагена, в значительной степени зависит от генотипа самок, которые были оплодотворены этим самцом.

В силу того обстоятельства, что наибольшую опасность представляют мутации, возникающие в половых клетках, разработано несколько методов, направленных на непосредственное обнаружение таких мутаций. Наиболее простым из таких методов является изучение изменений морфологии головок спермиев у самцов, подвергшихся действию испытуемого химического соединения. Этот метод используют обычно по отношению к сперматозоидам мышей. Но, безусловно, его можно использовать и по отношению к сперматозоидам мужчин, подвергающихся действию химических соединений в производственных условиях.

Сравнительно недавно разработан метод, позволяющий непосредственно наблюдать хромосомы сперматозоидов человека. Используя гонадотропные гормоны, вызывают преждевременную овуляцию у самок китайского хомячка.

Путем ферментативных воздействий разрушают первичную оболочку яйцеклеток хомячка и, поместив их в питательную среду, in vitro оплодотворяют сперматозоидами исследуемого мужчины. После проникновения сперматозоида в яйцеклетку его хромосомы конденсируются и становятся доступными для прямого цитологического наблюдения. Метод достаточно сложен, но позволяет непосредственно анализировать набор хромосом данного мужчины, выявляя все структурные или числовые аномалии хромосом. Обнаружение таких аномалий у данного человека позволяет не только делать выводы о мутагенном действии химических соединений, с которыми контактирует данный человек на производстве или в быту, но и давать конкретные медико - генетические рекомендации.

Существуют и методы, позволяющие анализировать нарушения мейоза, происходящие при формировании яйцеклеток у самок, подвергнутых действию испытуемого химического соединения. Эти методы достаточно информативны.

В связи с тем, что их применение требует наличия достаточно сложной лабораторной техники, эти методы не нашли еще широкого распространения.

Химические соединения, обладающие мутагенным действием, не только вызывают изменения отдельных генов или аберрации хромосом, но и влияют на процесс рекомбинации. Существуют предположения, что увеличение частоты сестринских хроматидных обменов под влиянием химических мутагенов является отражением увеличения частоты рекомбинаций. Разработаны прямые методы оценки влияния химических мутагенов на частоту рекомбинаций. Тест объектами в таких методах служат грибы. Близок к этим методам и метод анализа влияния химических мутагенов на частоту кроссинговера. Особенно удобным объектом для таких исследований являются самцы дрозофилы, у которых в норме кроссинговер не происходит, а воздействие мутагенных факторов индуцирует его.

В исследованиях, связанных с изучением влияния на хромосомный аппарат ионизирующих излучений и химических мутагенов, достаточно широко используют и растительные объекты, чаще всего Crepis capillaris и Vicia faba. Это обусловлено тем, что эти растения имеют небольшое число четко дифференцируемых хромосом, каждая из которых легко идентифицируется. Достаточно широко используют для целей тестирования мутагенного действия химических соединений и традесканцию.

Для оценки мутагенных свойств химических соединений предложено примерно 100 различных тест - систем, многие из которых хорошо разработаны и широко применяются. Но до настоящего времени нет универсальной тест системы, которая могла бы выявить все основные типы генетических повреждений.

Для окончательного решения о мутагенной опасности данного вещества для человека необходимо использовать комплекс методов, применяемых в определенной последовательности.

Обычно схема тестирования состоит из двух частей: 1) просеивающей и 2) полной программы.

Просеивающая программа представлена двумя тестами: тест на микроорганизмах с метаболической активацией in vitro и цитогенетический анализ костного мозга млекопитающих.

Полная программа тестирования включает четыре теста:

а) тест на микроорганизмах с метаболической активацией in vitro и in vivo;

б) тест на доминантные летальные мутации на млекопитающих;

в) цитогенетический анализ в культуре лимфоцитов человека in vitro.

Полная программа предусматривает более тщательное и всестороннее изучение основных качественных и количественных закономерностей в действии тестируемого вещества (рис.1).

Исследования на микроорганизмах входят в просеивающую и полную программу тестирования. С помощью этой системы определяются различные типы мутаций: замена пар оснований, делеции, вставки.

Достаточная тест - система для оценки генетического риска для человека от химических мутагенов должна иметь тесты:

• высокочувствительные;

• неизменно регистрирующие эффект веществ, которые могут вызывать генетическое повреждение у человека;

• недорогие и простые в выполнении;

• служащие для оценки опасности или безопасности мутагенного воздействия на человеческую популяцию.

тоды тестиМлекопитающие: тест на рования Вещ ество н е обл ад ает м ут аОтрица- Положигенной активностью, может быть допущено к ограниченному применению Вещ ество об л ад ает мут агенной акти вность ю, подлежит полному запрещению к применению или гигиеническому нормированию.

Рис.1 - Схема тестирования химических веществ на мутагенность По результатам полного исследования и в случае наличия генотоксического или мутагенного потенциала вещества, в том числе и возможные пищевые добавки, можно делить на категории по ряду критериев:

Категория 1. Химические вещества, известные как вызывающие наследуемые мутации или которые следует рассматривать как если бы они вызвали наследуемые мутации в репродуктивных органах человека.

Категория 1А. Химические вещества, которые известны как вызывающие наследуемые мутации в репродуктивных органах человека.

Критерий: положительное свидетельство из эпидемиологических исследований человека.

Категория 1В. Химические вещества, которые следует рассматривать как если бы они вызвали наследуемые мутации в репродуктивных органах человека.

положительный(е) результат(ы) испытаний in vivo на предмет наследуемой мутагенности репродуктивных клеток млекопитающих;

положительный(е) результат(ы) испытаний in vivo на предмет соматической мутагенности клеток у млекопитающих в сочетании с некоторыми свидетельствами того, что соответствующее вещество имеет потенциал вызывать мутации репродуктивных клеток. Такое вспомогательное доказательство может, например, быть получено в результате испытаний мутагенности / генотоксичности in vivo в отношении репродуктивных клеток или путем демонстрации способности соответствующего вещества или его метаболита(ов) взаимодействовать с генетическим материалом репродуктивных клеток;

положительные результаты испытаний, показывающих мутагенные последствия в репродуктивных клетках человека без демонстрации передачи потомству; например, повышение частотности анеуплоидии сперматозоидов у подверженных воздействию людей.

Категория 2. Химические вещества, которые вызывают опасение за состояние здоровья людей в связи с возможностью вызывать наследуемые мутации в репродуктивных органах человека.

Критерии: положительный опыт, полученный в результате экспериментов над млекопитающими и/или в некоторых случаях экспериментов in vitro, полученных от:

испытаний in vivo на предмет соматической мутагенности клеток на млекопитающих;

других испытаний in vivo на предмет соматической генотоксичности клеток, которые подтверждаются положительными результатами испытаний мутагенности in vitro.

Химические вещества, которые дают положительные результаты при испытании in vitro на мутагенность у млекопитающих и которые также показывают связь активности химической структуры с известными мутагенами репродуктивных клеток, следует рассматривать на предмет классификации в качестве мутагенов категории 2.

В настоящее время по данным Chemical Absracts Service зарегистрировано более 19 млн. органических и неорганических соединений. Более 3,5 млн.

химических соединений включены в различные каталоги в качестве коммерчески доступных веществ; более 227 соединений, использование которых регулируется различными нормативными документами, находятся в хозяйственном обороте и список этот постоянно возрастает. Вместе с тем, ни для одного химического соединения не показана способность индуцировать наследуемые изменения, лежащие в основе генетически обусловленных патологий у человека. Не показано также ни в одном случае отсутствие такой способности. Последнее представляет еще более трудную задачу. В результате ни для одного химического соединения экспериментально не доказано наличие или отсутствие мутагенной активности в отношении индуцированных наследуемых патологий у человека. Таким образом, каждое химическое соединение может представлять потенциальную опасность для человека.

В настоящее время проводится большая работа по оценке возможностей новых методов и по их валидизации. Вышеописанные методы могут быть включены или уже включены в схему дополнительного тестирования. Следует отметить, что результаты, полученные с помощью дополнительных методов, могут играть в принятии решений такую же роль, как и результаты, полученные с помощью стандартных методов. В этом отношении большие перспективы имеют тесты с использованием трансгенных животных, которые позволяют, по оценкам ряда исследователей, в течение 6 месяцев получить информацию сравнимую с информацией, получаемой в результате биотестирования на грызунах течение двух лет.

Для успешной интеграции в схему генотоксической оценки новые методы должны быть усовершенствованы с целью упрощения технологии их выполнения, валидизированы и приняты для общего использования, что требует согласия на уровне научных, промышленных и правительственных кругов.

Итак, в заключение можно констатировать, что в настоящее время в области пищевой токсикологии одно из главных направлений обеспечения генетического здоровья населения связано с предупреждением потребления мутагенов с пищей, и уже сегодня оно может в достаточной степени решаться в рамках технологических, санитарно-гигиенических и генетических подходов.

1. Критерии безопасности продуктов питания.

2. Что такое мутация?

3. Какие структуры клетки претерпевают изменения при мутации?

4. Под воздействием каких факторов происходят генные мутации?

5. Почему не каждое воздействие на клетку приводит к образованию мутаций?

6. Какие системы репарации существуют?

7. Опишите основы ферментативного механизма репарационных систем.

8. Условия включения SOS-ответа в организме.

9. В результате чего могут происходить хромосомные мутации?

10. Какова роль мутаций в эволюционном процессе?

11. Пути попадания мутагенных факторов в пищевые продукты.

12. Достоинства и недостатки существующих критериев качества продуктов питания.

13. Примеры широкоиспользуемых пищевых добавок, обладающих токсическими свойствами.

14. Методы оценки генотоксичности.

15. Преимущества и недостатки микробных тест-систем.

16. По каким параметрам оценивают безопасность продуктов?

17. В чем суть проблемы интерпретации результатов, полученных в бактериальных тестах?

18. Какие этапы включает тестирование веществ на наличие мутагенных свойств?

19. Каковы основные методы тестирования мутагенности на эукариотах?

20. Опишите основной алгоритм отнесения вещества к мутагену.

21. Критерии отнесения химических веществ к различным категориям мутагенов.

22. Критерии, которым должны отвечать краткосрочные тест-системы?

3.1. Тест на гашение люминесценции Тестированию генотоксичности должно предшествовать определение токсического потенциала исследуемого образца для предотвращения получения ложно положительного результата. В настоящее время широко применяется в мировой практике тест для определения токсичности с использованием люминесцентных бактерий, в частности, Vibrio fischeri, метаболизм которых сопряжен со способностью к люминесценции. Количество испускаемых квантов света свидетельствует о нарушениях метаболизма этих бактерий. Этот тест отличает быстрота ответа и высокая степень воспроизводимости результатов тестирования.

Ингибирование светоэмиссии этого штамма определяется контактным методом. Для этого служат определенные объёмы проб или разведений с суспензией со светящихся бактерий в кювете. Тест критерий – это снижение люминесценции, измеряемое после времени контакта в течение 15-30 минут или по выбору через 5 минут.

Для корректного проведения анализа необходимо учитывать следующие факторы: мутность образца (супернатанта), степень окрашенности образца, концентрацию кислорода. Анализ могут делать невозможным нерастворимые и труднорастворимые или летучие соединения, которые могут реагировать с водой или тест-суспензией или меняют своё состояние в ходе теста.

Тестирование проводится в соответствии со стандартом ISO 11438 (1993) [26]. Поддержание бактериальной культуры Vibrio fischeri проводят на среде Босса:

• светящиеся бактерии переносят стерильно в чашки Петри, содержащие плотную среду Босса;

• инкубируют в термостате 2-3 дня при 20оС;

• люминесцирующие бактериальные колонии выявляются в темноте, маркируются (отмечают маркером на дне чашки) и чашки Петри помещаются в холодильник;

• после хранения (максимум 2 недели) стерильно колонии переносят в свежие стерильные чашки Петри со средой Босса и опять помещают на хранение в холодильник.

Светоэмиссия может снижаться за период применения.