[ «БИОБЕЗОПАСНОСТЬ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ Учебное пособие Казань - 2006 Федеральное агентство по образованию Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Казанский государственный ...»
Проведение эксперимента Водную вытяжку мяса или мясопродукта (образец предварительно измельчают), которую готовят из расчета 1:4 (образец : деионизированная вода) помещают в герметично закрывающуюся колбу и встряхивают на качалке в течение 1 ч. При отсутствии токсического эффекта соотношение образца и воды можно изменить на 1:2. Затем взвесь отделяют от водной фазы с помощью центрифугирования (15 мин, 8000 g). Концентрация солей в экстракте должна соответствовать содержанию NaCl в количестве 2%. Для корректировки солесодержания используют сухую соль NaCl или концентрированный раствор этой соли (22%).
Тестируемая система во избежание искажения результатов должна иметь рН около 7. Для корректировки рН используют одномолярный раствор NaOH или HCl в зависимости от того, нужно ли подксилять или подщелачивать водную вытяжку образца. Если рН находится в пределах от 6 до 8,5, то корректировка не требуется. После корректировки осмотичности и рН раствора приступают к анализу водного экстракта.
В случае тестирования чистых биологических добавок их растворяют в % растворе NaCl; полученный раствор подвергают тестированию по нижеприведенной схеме.
Для анализа токсичности производят посев маркированной колонии Vibrio fischeri в пробирку на скошенную агаризованную среду Босса, культивируют при 20oC в течение 24 ч. Делают смыв колоний, выросших в пробирках, 3% раствором NaCl (добавляют 1-2 мл и интенсивно встряхивают) так, чтобы получилась концентрированная суспензия.
Приготовленную таким образом бактериальную суспензию охлаждают до 15оС, вносят в исследуемую водную вытяжку и контрольный образец объемом 5 мл (которые тоже охлаждают в холодильнике до 15о С) так, чтобы в результате получилась плотность суспензии в пределах 1-1,5 опт. ед. (плотность измеряют на фотоэлектроколориметре при 600 нм). Объем вносимой в пробу суспензии вычисляется по формуле где Vсуспен -объем суспензии, который нужно внести в исследуемую пробу;
Dжелаемое -оптическая плотность, которую хотелось бы иметь в исследуемой пробе (1 – 1,5 опт.ед.);
Dдействит-оптическая плотность исходной суспензии в пробирке после смыва;
Vпробы -объем исследуемой пробы (5 мл).
Затем измеряют интенсивность свечения в контрольном (3% растворе NaCl) и опытном (водной вытяжке) образцах. Время контакта люминесцентных бактерий с водным образцом в стандартных тестах соответствует 5, 15 и/или мин. По истечении времени контакта проводят измерения светоэмиссии. Измерение интенсивности свечения проводят в сравнении с дистиллированной водой при 400 нм на фотоэлектроколориметре.
Процент ингибирования люминесценции рассчитывается по формуле где Нt-процент ингибирования светоэмиссии;
Iконтt -скорректированное значение светоэмиссии в контроле через время t (15, 30 мин);
Iопытt -значение светоэмиссии в опыте через время t (15, 30 мин).
Корректировка производится по формуле где Io – значение светоэмиссии в начале эксперимента в контрольном образце;
f – поправочный коэффициент, равный где Iдейстt –реальное значение светоэмиссии в контрольном образце через время t (15, 30 мин).
Результаты тестирования выражают в виде ЕС50 и ЕС20, отражающих эффективную концентрацию, при которой наблюдается 50 или 20, соответственно гашение люминесценции. Однако, в некоторых случаях (высокой гетерогенности объекта, невозможности определения концентрации действующего вещества в смеси) целесообразнее представлять результаты в процентах ингибирования светоэмиссии.
Тест повторяют не менее трех раз и вычисляют среднее значение процента ингибирования люминисценции.
Проведите тестирование на токсичность с использованием люминесцентных бактерий различных концентраций нитрита натрия, используемого в колбасном производстве.
Приготовьте на основе 3% раствора NaCl 10 мл раствора NaNO2 в концентрации 1%, 2% и 3%. Добавить к каждому из образцов 0,25 мл суспензии светящихся бактерий. Провести измерение интенсивности свечения в начале и через 15, 30 мин инкубирования.
Результаты запишите в таблицу. Рассчитывают токсичность, эффективную концентрацию EC20 и EC50.
NaNO (контроль) NaNO 2% NaNO 3% NaNO Расчет эффективной концентрации проводят в программе Excel. Производится построение графика зависимости токсичности от концентрации тестируемого вещества, проводим линию тренда.
На оси абсцисс откладываем от 50% прямую, параллельную ординат, от точки пересечения с экспериментально полученной линией тренда (точка А) откладываем прямую, перпендикулярную оси ординат до её пересечения с ней.
Точка пересечения на оси ординат соответствует концентрации вещества, которая ингибирует свечение бактерий на 50%, что соответствует ЕС50.
Подготовка образцов к тестированию генотоксичности Тест Эймса. В качестве растворителей соединений в образцах для тестирования генотоксичности могут быть использованы водопроводная вода или органические растворители. Чаще всего для гидрофобных соединений используют диметилсульфоксид (ДМСО), для которого показано отсутствие мутагенных свойств.
В экспериментах на мутагенность необходимо исследовать ряд концентраций для выявления зависимости доза-эффект. Рекомендуемые концентрации 1, 10, 100, 1000 мкг/чашку. Концентрации в опытах могут быть изменены по желанию исследователя, учитывая технологию производства продукта и производственные нормативы.
Пробы, взятые для экспериментов, должны быть средними, показательными для каждой партии продукта. Транспортировку проб следует осуществлять в кратчайшие сроки, целесообразно использовать для этого сумкихолодильники для предотвращения развития сопутствующей микрофлоры.
Жидкие и полужидкие продукты тщательно перемешивают и в случае резко кислой реакции подщелачивают 10% раствором бикарбоната натрия до рН 7,2-7,4.
Исходным материалом для продуктов плотной консистенции обычно является 10% взвесь продукта. Навеску массой 15 г измельчают или растирают, прибавляют 135 мл стерильной дистиллированной воды или 0,9% раствора NaCl. Оставляют на 30-40 мин при комнатной температуре для экстрагирования водорастворимой фракции продукта. Затем фильтруют через обеззоленный фильтр и через стерильные мембранные фильтры, которые задерживают клетки микроорганизмов. В экспериментах в качестве исследуемого материала используют полученный таким образом стерильный фильтрат.
ДНК-повреждающий тест. Пробоподготовка ведется аналогичным образом. Однако необходимо учитывать, что в суспензионной модификации теста нельзя исследовать вещества, имеющие яркую окраску или выпадающие в осадок, а также образующие пленку на поверхности питательной среды.
В чашечной модификации теста рекомендуется исследовать вещества, обладающие хорошими диффундирующими свойствами.
3.2.1.Определение токсичности на бактериях Во избежание получения ложноотрицательных результатов в бактериальных тест-системах на генотоксичность химические соединения должны быть тестированы только в концентрациях, не оказывающих токсического действия на тестерные штаммы.
Проведение эксперимента За 12-15 ч до проведения эксперимента культуру тестерного штамма переносят стерильно со скошенного агара (косяка) в пробирки с 5 мл мясопептонного бульона (МПБ) или глюкозопептонной среды (ГПС) для получения «ночной культуры». Пробирку с посеянной культурой ставят в термостат с температурой, оптимальной для роста данного микроорганизма.
2% мясо-пептонный агар (МПА) растапливают и разливают стерильно в чашки Петри. МПА равномерно распределяют по дну чашки, накрывают крышкой и оставляют на столе до полного застывания.
Делают последовательно ряд разведений «ночной культуры» в стерильной водопроводной воде. В пробирку с 4,5 мл стерильной воды добавляют 0,5 мл культуры, тщательно перемешивают и переносят 0,5 мл в следующую пробирку и т.д.
В пробирки с 3 мл 0,6 % растопленным МПА и охлажденным до 45°С добавляют 0,1 мл раствора исследуемого соединения (или стерильной вытяжки продукта) и 0,1 мл бактериальной суспензии нужного разведения. В негативном контроле вместо вещества добавляют 0,1 мл растворителя.
Раствор перемешивают и содержимое пробирки наслаивают на 2 % МПА в чашках Петри. Через 24 ч инкубации при 37°С подсчитывают число колоний в опытных и контрольных чашках.
Токсичность исследуемого соединения оценивают по степени выживаемости (%), определяемой как отношение числа колоний в варианте с исследуемым соединением к числу колоний в контрольном варианте.
Опыт повторяют не менее двух-трех раз.
Определите токсичность нитрита натрия и аскорбиновой кислоты в тесте с S. typhimurium TA98 и TA100. Приготовьте растворы концентрации 2.5, 5, 7. %. Проведите эксперимент как описано выше. Результаты внесите в таблицу (приведена ниже) для каждого вещества.
Если процент токсичности (выживаемости) составляет менее 3%, исследовать данную концентрацию в опытах на мутагенность не следует.
Сделайте вывод о пригодности использования каждой из концентраций в экспериментах по выявлению мутагенного эффекта в тесте Эймса.
Исследуемые Токсичность, % Токсичность, % концентрации S. typhimurium TA98 S. typhimurium TA 2.5 % 7.5 % 3.2.2. Тест Эймса без метаболической активации (полуколичественный метод учета генных мутаций с внесением Сущность метода заключается в том, что тестерные штаммы бактерий S.
typhimurium культивируют на специальной среде без гистидина, на которой растут лишь те микроорганизмы, у которых произошла мутация от ауксотрофности по гистидину к прототрофности. Без внешних воздействий такие мутации происходят крайне редко. Если в среду культивирования внести химический мутаген, то частота мутаций значительно увеличивается, что регистрируется по числу колоний-ревертантов микроорганизмов, выросших на данной питательной среде.
Метод позволяет определить способность химических соединений индуцировать генные обратные мутации к гистидиновой прототрофности hishis + у тестерных штаммов S. typhimurium. В работе используют ауксотрофные по гистидину штаммы ТА 100 и ТА 98, ревертирующие по типу сдвига рамки считывания или замены пар оснований соответственно [19]:
ТА 100 - his G46, rfa, uvr-, bio -, pkm ТА 98 - his D3052, rfa, uvr-, bio-, pkm Следовательно, по результатам тестирования на данных штаммах в ряде случаев можно судить о механизме индукции мутации исследуемым соединением. Однако оба штамма несут плазмиду рКМ 101, имеющую в своем составе гены mucА, В, которые принимают участие в работе ошибочной SOSрепарации. Таким образом, если соединение индуцирует SOS-ответ, следствием ошибок SOS-репарации могут быть как замены пар оснований, так и мутации типа сдвига рамки считывания, независимо от того, индуцирует ли само соединение такие мутации или нет.
Эксперименты проводят согласно методу, описанному Маron and Ames [22, 27]. В работе используют суспензию тестерных бактерий экспоненциальной фазы роста плотностью (1-2)*109 кл/мл. Каждая концентрация тестируемых соединений исследуется как минимум в трех повторностях. Метод предусматривает два контроля: негативный - контроль на растворитель, и позитивный супермутаген N-метил -N'-нитрозометилмочевина (10 мкг/чашку) для штамма ТА 100 и 1-метил-3-нитро-1-нитрозогуанидин (5мкг / чашку) для штамма ТА 98.
Данный тест подходит для тестирования отдельных химических соединений и смесей, не содержащих в своем составе гистидин. В случае тестирования гистидинсодержащих соединений в концентрации выше 150 нмоль/чашку можно получить ложноположительный результат.
Культуру с косяка стерильно переносят петлей в 5 мл МПБ и инкубируют 12-18 ч при 37° С. Предварительно в МПБ вносят ампициллин в концентрации 50 мкг/мл. В день постановки эксперимента 5 мл проинкубированной культуры переносят в 20 мл свежего МПБ и инкубируют с принудительной аэрацией при 37°С в течение 2 - 2,5 ч до плотности 3-4*107 кл/мл. Затем культуру переносят в стерильные центрифужные пробирки и центрифугируют 20 мин при об/мин. Осадок ресуспендируют, концентрируя его до плотности 2 * 109 кл/мл в 0,02 М фосфатном буфере или минимальной жидкой среде, разведенной стерильной водой в отношении 1:4.
В стерильные чашки Петри разливают нижний селективный агар и выдерживают 2 ч при комнатной температуре.
0,6% верхний агар с микродобавками биотина и гистидина растапливают и разливают в пробирки по 3 мл и помещают в водяную баню при температуре 45-46° С.
В полуобогащенный 0,6% верхний агар вносят 0,1 мл бактериальной суспензии и 0,1 мл исследуемого соединения. Все перемешивают и наслаивают на нижний селективный агар. Полужидкий агар должен покрыть поверхность нижнего минимального агара ровным тонким слоем. Чашки оставляют при комнатной температуре на 30-40 мин и после полного застывания переносят в термостат при 37°С. В опыте также ставят негативный контроль. В негативном контроле в слой верхнего агара вместе с суспензией бактерий добавляют 0,1 мл растворителя.
Учет результатов проводят через 48 ч инкубации. Сравнивают число колоний-ревертантов в опыте и контроле.
Принято считать, что исследуемое соединение обладает мутагенной активностью, если:
- число колоний his+ ревертантов в варианте с исследуемым соединением достоверно превышает число колоний his+ ревертантов в негативном контроле более чем в два раза;
- мутагенный эффект исследуемого соединения носит четкий дозозависимый характер.
Если число колоний-ревертантов в опыте и контроле достоверно различаются менее чем в 2,5 раза, считают, что мутагенной активности не выявлено.
Результат отмечают индексом «-».
Если фиксируют превышение от 2,5 до 10 раз, то препарат обладает слабой мутагенной активностью и получает индекс «+».
Превышение более чем в 10 раз, говорит о средней мутагенности соединения. Индекс мутагенности «++».
Если же число колоний в опыте превышает число колоний в контроле более чем в 100 раз, это говорит о сильной мутагенной активности. Индекс мутагенности «+++».
Определите генотоксичность нитрита натрия и аскорбиновой кислоты в тесте с S. typhimurium TA98 и TA100. Приготовить растворы NaNO2 в концентрации 2,5 % и аскорбиновой кислоты – 2,5 %. Проведите эксперимент по определению генотоксических свойств нитрита натрия и аскорбиновой кислоты вместе и поотдельности как описано выше. Результаты внесите в таблицу (приведена ниже) для каждого вещества.
Исследуемые Токсичность, % Токсичность, % концентрации S. typhimurium TA98 S. typhimurium TA Аскорбиновая корбиновая Сделайте выводы о генотоксических свойствах нитрита натрия, используемого в мясной индустрии, и аскорбиновой кислоты, известной своими антимутагенными свойствами.
3.2.3. Тест Эймса Salmonella/микросомы Метод представляет собой вариант теста Эймса с метаболической активацией in vitro и позволяет моделировать некоторые реакции, имеющие место в организме млекопитающих при участии цитохром Р-450-зависимых монооксигеназ. Микросомную активирующую смесь готовят на основе микросомных фракций печени животных. Перед началом эксперимента фракцию S9 необходимо хранить в холодильнике или емкости со льдом. Добавки глюкозо-6фосфат и НАДФН добавляются непосредственно перед опытом. В качестве позитивного контроля используют 2-аминофлуорен (3 мкг/чашку) для штамма ТА 98 и циклофосфамид (10 мкг/чаш.) для штамма ТА 100.
Метод дает возможность исследовать мутагенную активность метаболитов данного соединения. Метаболические превращения соединения происходят в слое полужидкого агара, в который вместе с тест-культурой вносят микросомную активирующую смесь.
Подготовку культуры проводят, как описано выше (см. раздел 2.2.2).
В стерильные чашки Петри разливают нижний селективный агар и выдерживают 2 ч при комнатной температуре. 0,6% верхний агар с микродобавками биотина и гистидина растапливают, разливают в пробирки по 3 мл и помещают в водяную баню при температуре 45-46° С.
В полуобогащенный 0,6% верхний агар вносят 0,1 мл бактериальной суспензии, 0,1 мл исследуемого соединения и 0,5 мл микросомальной активирующей смеси. В опыте также ставят негативный контроль. В негативном контроле в пробирки вносят 0,1 мл культуры, 0,1 мл растворителя и 0,5 мл микросомальной активирующей смеси. Все перемешивают и наслаивают на нижний селективный агар. Полужидкий агар должен покрыть поверхность нижнего минимального агара ровным тонким слоем. Чашки оставляют при комнатной температуре на 30 - 40 мин и после полного застывания переносят в термостат при 37° С. В опыте также ставят негативный контроль. Учет результатов проводят через 48 ч инкубации. Сравнивают число колоний - ревертантов в опыте и контроле.
В работе могут быть использованы микросомные фракции растений, печени животных. При приготовлении микросомной фракции печени животных используют самцов. Для активации ферментов печени животных можно использовать фенобарбитал (80 мг/кг), который вводят внутрибрюшинно в течение трех дней, 3-метилхолантрен (40 мг/кг), вводимый внутрибрюшинно однократно за 48 ч до забоя, или раствор совола в масле, который вводится однократно внутрибрюшинно или подкожно за 5 суток до забоя в дозе 500 мг/кг веса животного.
Выделение и приготовление гомогенатов печени готовят согласно методу, описанному в [22]. Микросомная фракция (S9) представляет собой супернатант, полученный при 20-минутном центрифугировании гомогената печени при 9000g. Гомогенат может храниться в холодильнике в замороженном виде в течение нескольких суток.
Определите генотоксичность нитрита натрия и аскорбиновой кислоты в тесте с S. typhimurium TA98 и TA100 в присутствии метаболической активации (фракции S9). Приготовьте растворы NaNO2 в концентрации 2.5 % и аскорбиновой кислоты - 2.5 %. Проведите эксперимент по определению генотоксических свойств нитрита натрия и аскорбиновой кислоты вместе и поотдельности как описано выше. Результаты внесите в таблицу (приведена ниже) для каждого вещества.
концентрации S. typhimurium TA98 S. typhimurium TA Аскорбиновая корбиновая В плане разнообразия конечных точек приложения действия генотоксикантов бактериальные тест-системы позволяют прояснить многие биохимические и молекулярные механизмы генотоксического действия веществ. Например, подавление роста бактериального штамма с тем или иным дефектом в генах, ответственных за определенный путь репарации, по сравнению со штаммом дикого типа, позволяет судить об участии определенных компонентов репарационных путей в исправлении повреждений ДНК, вызываемых исследуемым соединением.
В исследованиях чаще всего используют штаммы Escherichia соli:
Wp - дикий тип (работают все системы репарации);
Lex A - lex А (нарушена индуцибельная система репарации);
Pol А - pol А- 1 (нарушен синтез ДНК-полимеразы 1);
Uvr A - uvr A 155 (нарушена эксцизионная репарация);
Rec A - rec А (нарушена пострепликативная репарация, общая рекомбинация).
Принцип метода заключается в селективном ингибировании роста мутантных штаммов по сравнению с диким типом.
Подготовка культуры За 12-15 ч до проведения эксперимента культуру тестерного штамма переносят стерильно со скошенного агара (косяка) в пробирки с 5 мл мясопептонного бульона (МПБ) или глюкозопептонной среды (ГПС) для получения «ночной культуры». Пробирку с посеянной культурой ставят в термостат с температурой 37° С, оптимальной для роста E.coli.
Проведение эксперимента 2% мясо-пептонный агар (МПА) растапливают и разливают стерильно в чашки Петри. МПА равномерно распределяют по дну чашки, накрывают крышкой и оставляют на столе до застывания.
На чашки с МПА делают посев газоном, внося 0,1-0,5 мл ночной культуры, равномерно распределяя клетки бактерий шпателем. Чашки оставляют на 60-90 мин для подсыхания культуры. Затем в середину чашки на поверхность газона помещают стерильный бумажный диск (d=2cм), который пропитывают 0,05 мл раствора исследуемого соединения. Раствор диффундирует, образуя при этом градиент концентраций вокруг диска. Чашки, не переворачивая, инкубируют 24 ч при 37° С.
Если исследуемое соединение обладает ДНК-повреждающим действием, то на чашках со штаммом, дефектным по репарации, вокруг диска образуется зона подавления роста, причем большая, чем у дикого штамма. Разница между размерами зон ингибирования на чашках с нормальными и мутантными по репарации бактериями служит показателем наличия ДНК-повреждающей активности у изучаемой пробы.
В качестве позитивного контроля используют фурацилин; (500 мкг/мл), растворяя его в стерильной дистиллированной воде.
Опыты обязательно повторяют два-три раза.
Проверьте ДНК-повреждающий эффект трех видов крахмала, к примеру:
1. картофельный набухающий с повышенным содержанием Са и Р; 2. кукурузный С-6); картофельный амилозный повышенным содержанием амилозы).
“Кукурузный (амилацетат Вид крахмала можно варьировать. Приготовиьте раствор крахмала в концентрациях 1%, 2% и 3%. Проведите эксперименты как описано выше, результаты запишите в таблицу. Сделайте выводы о ДНК-повреждающем эффекте крахмалов.
В суспензионном методе индикаторные бактерии инкубируют в жидкой среде, содержащей исследуемую пробу.
Подготовка культуры За 12-15 часов до проведения эксперимента культуру тестерного штамма переносят стерильно со скошенного агара (косяка) в пробирки с 5 мл мясопептонного бульона (МПБ) или глюкозо-пептонной среды (ГПС) для получения «ночной культуры». Пробирку с посеянной культурой ставят в термостат с температурой 37°С, оптимальной для роста E.coli.
Проведение эксперимента В колбочки с 20 мл МПБ стерильно вносят равное количество ночной культуры, предварительно доведя их до одинаковой плотности. В негативных контрольных вариантах в колбочки добавляют только культуру (0,5-1,0 мл в зависимости от плотности культуры). В опытные колбочки добавляют то же количество культуры и исследуемый раствор. Измеряют начальную относительную плотность (Днач) суспензии на фотоэлектроколориметре (ФЭК) или спектрофотометре (СФ) по поглощению при 660 нм.
Затем посевы инкубируют в течение 5-6 ч при температуре 37°С. По окончании срока инкубации проводят измерение плотности суспензии (Дкон) и определяют интенсивность роста культуры в каждом варианте опыта ДД.
В экспериментах параллельно с мутантными штаммами обязательно засевают дикий тип (Wp). Итого, при проверке вещества в одной концентрации на одном дефектном штамме необходимы следующие варианты опыта:
Wp -контроль (К), т.е. культура микроорганизмов и растворитель,;
Wp -опыт (О), т.е. культура микроорганизмов и исследуемое вещество;
Uvr А -контроль (К), т.е. культура микроорганизмов и растворитель;
Uvr А -опыт (О), т.е. культура микроорганизмов и исследуемое вещество.
Для определения силы влияния вещества на мутантный штамм используют формулу где О (деф)-ДД дефектного штамма в опыте;
О (дик)-ДД дикого штамма в опыте;
К (дик)-ДД дикого штамма в негативном контроле;
К (деф)-ДД дефектного штамма в негативном контроле.
Процент выживаемости указывает на отсутствие ДНКповреждающей активности, 86-98% -активность слабая, менее 85%-наличие ДНК-повреждающего действия. В качестве позитивного контроля используют раствор фурацилина (500 мкг/мл) в воде.
Проверьте ДНК-повреждающий эффект колбас с добавлением трех видов крахмала, к примеру картофельного набухающего с повышенным содержанием Са и Р; 2. кукурузного (амилацетат С-6); 3. картофельного амилозного (с повышенным содержанием амилозы). Вид крахмала можно варьировать. Приготовьте водные вытяжки колбасных изделий в соотношении 1:4 и 1:2 (колбаса:буфер).
Проведите эксперименты как описано выше, результаты запишите в таблицу. Сделайте выводы о ДНК-повреждающем эффекте колбасы с добавлением различных видов крахмала.
“Кукурузный (амилацетат 3.2.4.3. ДНК-повреждающий тест с метаболической активацией В экспериментах можно использовать метаболическую активацию для метаболизма исходного соединения. Для этого готовят микросомную фракцию, как описано в тесте Эймса, проводят преинкубацию вещества с микросомами фракции S9 в течение 30-40 мин. Состав смеси: 0,5 мл микросомной активирующей смеси; 0,5 мл исследуемого вещества или вытяжки пищевого продукта.
По окончании срока инкубации экспериментальную смесь центрифугируют при 5000g в стерильных центрифужных пробирках и далее, в ДНК-повреждающем тесте, в опытных вариантах используют надосадочную жидкость в качестве исследуемого материала. Подготовка культуры и дальнейший ход эксперимента проводятся, как описано выше.
Проверьте ДНК-повреждающий эффект колбас: вареной, копченой и полукопченой. Приготовьте водную вытяжку исследуемых образцов в соотношении 1:4 и 1:2 (колбаса : буфер). Проведите эксперимент, полученные результаты запишире в таблицу.
Вид колбасного изделия Полукопченная Сделайте выводы о зависимости ДНК-повреждающего эффекта от вида термической обработки колбасного изделия.
Оформление отчетов по работам производится в соответствии с требованиями стандарта вуза СТП 2069635-23-88 «Комплексная система управления качеством деятельности вуза. Лабораторные работы. Структура и правила оформления».
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
ОСНОВНОЙ
Шабад Л.М. О циркуляции канцерогенов в окружающей среде.-М.:Медицина, 1973. - 367с.
2. Sugimura T. Food as source of complex mixtures and carcinogens. // Would Health Organ. Int. Agency Res. Cancer. Lyn, - 1990. - P.399-407.
Дурнев А.Д., Середенин С.Б. Мутагены: скрининг и фармакологическая профилактика воздействий. //М.: Медицина. 1998.-328с.
Дурнев А.Д. Мутагены и антимутагены в продуктах питания. // Генетика. -1997. - Т.33, №2. - С. 165-176.
Комов В.П., Шведова В.Н. Биохимия. -Дрофа - 2004 -. 640с.
Рубенчик Б.Л. Образование канцерогенов из соединений азота / Под ред. А.И. Быкореза. - Киев: Наука думка, 1990. - 220с.
7. Vaca C.E., Harms-Ringdahl M. Interaction of lipid peroxidation products with nuclear macromolecules // Biochim. Biophys. Acta. Lipids and Lipid Metab.-1989. - V.1001.- P. 31-43.
Рубенчик Б.Л., Костюковский Я.Л., Меламед Д.Б. Экологические аспекты взаимосвязи питания и рака. // Экология и рак. - Киев: Здоров'я, 1983. -160 с.
Заяс Ю.Ф. Качество мяса и мясопродуктов. - М.: Легкая и пищевая пром-сть, 1981. - 480 с 10. Прозоровский В.Б. Почему лекарства лечат? - Л., 1991.-192с.
11. Оценка некоторых пищевых добавок и контаминантов: Серия технических докладов ВОЗ // Тридцать седьмой доклад объединенного комитета экспертов ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам. Женева. 1994.
12. Захаров А.Ф., Бенюш В.А., Кулешов Н.П., Барановская Л.И. Хромосомы человека. -М.: Медицина. 1982.- 264 с.
13. Ауэрбах Ш. Проблемы мутагенеза. -М.: Мир. - 1978. - 463 с.
14. Тарасов В.А. Молекулярные механизмы репарации и мутагенеза. М.:
Наука. 1982 - 228с.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ
15. Glatt H., Schneider H., Liu Y. V79-hCYP2E1-hSULT1A1, a cell line for the sensitive detection of genotoxic effects induced by carbohydrate pyrolysis products and other food-borne chemicals // Mutation Research. - 2005. V.580. - P.41–52.16. Ashby J., Waters M.D., Preston J et al. IPCS harmonization of methods for the prediction and quantification of human carcinogenic/mutagenic hazards and for indicating the probable mechanism of carcinogens / Mutat. Res. - 1996.
- V.352. - P.143-157.
17. Douglas G.R., Blakey D. H., Claysn D. B. International commission for protecting aganst environmental mutagens and carcinogens. ICPEMC working paper N 5. Genotoxicity tests as predictors of carcinogens: an analysis // Mutat. Res. - 1998. - V.196. - P.83-93.
18. Huff J., Haseman J., Rall D. Scientific concepts, value, and significance of chemical carcinogenesis studies // Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. - 1991. V.31. - P.621-652.
19. Порошенко Г.Г., Абилев С.К. Антропогенные мутагены и природные антимутагены // Итоги науки и техники ВИНИТИ. Сер. Общая генетика, 1988. - Т. 12. - 315 с.
20. Молекулярная биология: структура и биосинтез нуклеиновых кислот:
Учебник для вузов // Под ред. А.С.Спирина. -М.:Высш. шк., 1990. - 352с.
21. Nylund L., Einisto P. Mutagenicity testing of protein-containing and biological samples using test Ames /Salmonella plate incorporation test and the fluctuation test // Mutat. Res.-1992/ - V.272, N 3.-P.205-214.
22. Maron D.M., Ames B.N. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test // Mutat.Res.-1983, N 113. - P. 174-210/ 23. Абилев С, Порошенко Г.Г. Ускоренные методы прогнозирования мутагенных и бластомогенных свойств химических соединений /Итоги науки и техники ВИНИТИ. Сер. Токсикология.-1986. - Т. 14. - 171 с.
24. Heddle J.A., Shepson P.B., Gingerich J.D., So K.W. Mutagenecity of peroxyacetil nitrate (PAN) in vivo: tests for somatic mutations and chromosomal aberrations // Environ. Mol. Mutagen. 1993. V.21. P.58-66.
25. Абигеев С.К. Порощенко Г.Г. Антропогенные мутагены и природные антимутагены // Итоги науки и техники / ВИНИТИ.- 1998.- Т.12.-315с.
26. ISO/CD 11348: Water quality - Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischer. (Luminescent Bacteria Test). 1998.
27. Фонштейн Л.М., Калинина Л.М., Полухина Г.Н. и др. Тест-система оценки мутагенной активности загрязнителей среды на Salmonella. -M.
ВИНИТИ, 1977.- 52с.
28. Агаджанян Н.А., Ступаков ГЛ., Ушаков И.Б., Полунин И.Н.. Зуев В.Г.
Экология, здоровье, качество жизни. — Москва — Астрахань: Изд-во АГМА, 1996. — 260 с.
29. Атлас "Окружающая среда и здоровье населения России" /под редакцией М. Фешбаха. М.: ПАИМС, 1995. - 448 с.
30. Кузубова Л.И. Токсиканты в пищевых продуктах: Аналитический обзор / СО АН СССР. ГПНТБ. - Новосибирск, 1990. — 127 с.
Питательные среды, буферы и растворы Среда Босса: пептон – 10 г, дрожжевой экстракт – 10 г, 30 г – NaCl, 1000 мл – дистиллированная вода. В агаризованную среду Босса добавляется агар в концентрации 20 г/л.
22% NaCl, 22 г соли на 100 мл дистиллированной воды.
3% NaCl, 3 г соли на 100 мл дистиллированной воды.
1 моль/л NaOH: 40 г на 1000 мл дистиллированной воды.
1 моль/л HCl: 36,5 г на 1000 мл дистиллированной воды.
Мясопептонный бульон (МПБ).
Глюкозо-пептонная среда (ГПС): глюкоза - 5,0 г, пептон-10,0 г, NaClг, вода водопроводная -1000 мл.
2% Мясопептонный агар (МПА): 2,0 г агара, 100 мл водопроводной воды.
0,6% Мясопептонный агар (0,6% МПА): 600 мг агара, 100 мл водопроводной воды.
10. 2% голодный агар: 2,0 г агара, 100 мл дистиллированной воды; рН=7,2раствор глюкозы: 20 г глюкозы, 100 мл дистиллированной воды.
12. 2% раствор сернокислого магния (MgSO4 ): 2 r MgSO4*7H2 O, 100 мл дистиллированной воды.
13. Полужидкий 0,6% агар: Верхний агар (ВА). На 100 мл дистиллированной воды: агар (Bacto agar «Тур USA») - 6,0 г, NaCl-6,0 г, стерилизация при 1 атм. Непосредственно перед опытом на 80 мл ВА добавляют мл 0,5 мМ раствора L-гистидина солянокислого и 10 мл 0,25 мМ раствора биотина.
14. 0,5 мМ раствор гистидина: 9,6 мг гистидина, 100 мл бидистиллированной воды.
15. 0,25 мМ раствор биотина: 6,1 мг биотина, 100 мл бидистиллированной 16. Солевой концентрат (Stm). На 100 мл дистиллированной воды: цитрат натрия трехзамещенный - 0,2 г, КН2РО4 3Н2 О - 4,2 г, К2 НРО4 - 1,8 г, (NH4)2 SO4 - 0,4 г, рН =7,2. Соли растворяют с соблюдением указанного порядка. Стерилизуют при 1атм.
17. Нижний агар (НА) для учета his+ ревертантов в тесте Эймса: 2% водный агар (рН 7.4) -300 мл, 20% раствор глюкозы -10 мл, Stm -100 мл, 2% раствор MgSO4 - l мл.
18. 0,2 М Фосфатный буфер, рН 7,4. 19 мл 0,4М раствора КН2РО4, 81 мл 0,4М раствора К2 НРО4*3Н2О. После измерения рН объем буфера доводят до 200 мл. Стерилизуют при 1 атм.
19. Микросомная активирующая смесь (MAC) 1 мл MAC содержит 0,3 мл микросомной фракции S9, 40 мМ НАДФН, 50 мМ глюкозо-6-фосфата, 33 мМ KCL, 8 мМ MgCl, 0,2 М фосфатного буфера, рН 7,4.
20. Состав микросомной активирующей смеси на 20 мл: 6 мл фракции S9, 2 мл 40 мМ НАДФН, 2 мл 50 мМ глюкозо-6-фосфата, 0,5 мл KCl, 0, мл MgCl, 10 мл 0,2 М фосфатного буфера.
21. 33 мМ KCl: 980 мг KCl, 10 мл дистиллированной воды.
22. 8 мМ MgCl: 650 мг MgCl, 10 мл дистиллированной воды.
23. 4 мМ НАДФН: 33 мг/1 мл дистиллированной воды.
24. 5 мМ глюкозо-6-фосфата: 15мг/1 мл дистиллированной воды.
25. Минеральная среда. Stm разводят дистиллированной водой в соотношении 1:1. На 100 мл такой смеси добавляют 0,4 мл 2% раствора MgSO4, 5 мл 40% раствора глюкозы.
26. Подготовка дисков: диски диаметром 2 см изготовляют из фильтровальной бумаги, стерилизуют в чашках Петри в автоклаве, либо в жарочном шкафу.
Никитина Елена Владимировна Решетник Ольга Алексеевна
«