«Организация и проведение учебного процесса по подготовке специалистов в области биобезопасности и лабораторной диагностики возбудителей некоторых опасных инфекционных болезней (учебно-методическое пособие для ...»

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ

ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА

Федеральное казённое учреждение здравоохранения

«Иркутский ордена Трудового Красного Знамени

научно-исследовательский противочумный

институт Сибири и Дальнего Востока»

Организация и проведение учебного процесса

по подготовке специалистов в области

биобезопасности и лабораторной диагностики

возбудителей некоторых опасных инфекционных болезней (учебно-методическое пособие для врачей-бактериологов, эпидемиологов, лаборантов) Иркутск, 2012

АННОТАЦИЯ

Учебно-методическое пособие предназначено для использования при профессиональной переподготовке врачей-бактериологов (биологов), эпидемиологов и лаборантов по основным и дополнительным профессиональным образовательным программам (свыше ч), на циклах повышения квалификации по профилю программ профессиональной переподготовки по опасным инфекционным болезням (144 ч, 72 ч), подготовке специалистов по программам послевузовского образования (аспирантура по специальностям 03.02. «микробиология», 14.02.02 «эпидемиология»), для практической работы специалистов, занимающихся диагностикой инфекционных болезней.

Пособие составили специалисты Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Г.Г. Онищенко, Е.Б. Ежлова, Ю.В. Демина, Н.В. Шеенков), ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (Т.Ю. Загоскина, С.В. Балахонов, Л.Е. Токарева, Т.С. Тайкова, О.А. Носкова, Т.М. Долгова, Т.А. Иванова).

Содержание

ОБЩИЕ ТРЕБОВАНИЯ К ОРГАНИЗАЦИИ РАБОТ В

1.

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРЯХ

1.1. Требования к помещению и оборудованию лабораторий. 1.2. Обеззараживание помещений и оборудования лабораторий Обеззараживание и утилизация отходов деятельности 1.3. лаборатории 2. СРЕДСТВА ЗАЩИТЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ ПРИЁМЫ И ОСОБЕННОСТИ РАБОТЫ С

3.

ВОЗБУДИТЕЛЯМИ I-II ГРУПП ПАТОГЕННОСТИ

Организация рабочих мест и особенности методических 3.1. приемов при посеве инфицированного материала 3.2. Пипетирование заразного материала 3.3. Микроскопические методы исследования 3.4. Центрифугироване Основные методы изучения биологических свойств 3.5. микроорганизмов 3.6. Обеззараживание исследуемого материала при постановке ПЦР

ОСОБЕННОСТИ ТЕХНИКИ БЕЗОПАСНОЙ РАБОТЫ С

4.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМИ ЖИВОТНЫМИ

Требования к размещению и оснащению помещений блока 4.1. инфицированных животных 4.2. Вскрытие животных 4.3. Заражение лабораторных животных

ИММУНОСЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ

5.

ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

5.1. Теоретические основы взаимодействия антигена с антителом 5.1.1. Антигены 5.1.2. Антитела 5.1.3. Взаимодействие антитела с антигеном 5.1.4. Иммуносерологические методы исследования 5.1.5. Методы иммунофлуоресценции 5.1.6. Варианты иммуносорбентного анализа на твердой фазе Серологические реакции, протекающие с участием 5.1.7. комплемента 5.1.8. Реакции нейтрализации

6. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ЭНТЕРОБАКТЕРИОЗОВ

6.1. Характеристика семейства Enterobacteriaceae 6.2. Эшерихиозы 6.3. Шигеллезы 6.4. Сальмонеллезы 6.5. Приложение 7. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ 7.1. Биологические свойства холерных вибрионов 7.2. Бактериологический анализ 7.3. Серологическая диагностика 7.4. Приложение

8. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ТУЛЯРЕМИИ

8.1. Биологические свойства возбудителя туляремии 8.2. Лабораторная диагностика туляремии

9. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ

9.1. Биологические свойства возбудителя 9.2. Лабораторный диагноз 9.3. Приложение 10. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ЧУМЫ 10.1. Биологические свойства возбудителя чумы 10.2. Контроль диагностических питательных сред 11. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА 11.1. Биологические свойства возбудителя бруцеллеза 11.2. Лабораторная диагностика бруцеллеза В настоящее время бесспорным является признание факта, что безопасность, в особенности биологическая, является важной в т.ч. международной проблемой. В последние десятилетия резко возрос интерес к биологическим поражающим агентам - вирусам, бактериям и их токсинам.

В Российской Федерации на государственном уровне принят ряд законодательных актов, директивных и инструктивно-методических документов, направленных на борьбу с биотерроризмом. Принимаются меры по повышению эффективности работы различных служб, в том числе медицинской, в условиях чрезвычайных ситуаций. В связи с этим, остро встает вопрос подготовки квалифицированных специалистов. Надлежащие микробиологические технологии, правильное использование оборудования для обеспечения биологической безопасности и хорошо обученный персонал остаются основными факторами биологической безопасности при работе в лабораторных условиях.

В связи с этим теоретические знания и практические навыки в этой области должны быть составной частью профессиональной подготовки врачей и среднего медицинского персонала по вопросам противодействия биотерроризму, биобезопасности, индикации и лабораторной диагностики ООИ.

Цель данного учебного пособия – обобщить имеющийся материал и использовать его для проведения обучения специалистов в области биобезопасности и лабораторной диагностики отдельных опасных инфекционных болезней.

Профессиональная переподготовка и повышение квалификации врачей и среднего медицинского персонала по особенностям работы с патогенными биологическими агентами (ПБА) I-IV групп патогенности и лабораторной диагностики опасных инфекционных болезней осуществляется на базе отдела подготовки и усовершенствования специалистов (ОПиУС) ФКУЗ Иркутского научно-исследовательского противочумного института Роспотребнадзора. Отдел является самостоятельным структурным подразделением. В своей деятельности он руководствуется действующим законодательством, Уставом института, приказами и распоряжениями администрации института, а также приказами и инструкциями Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, имеет лицензию Федеральной службы по надзору в сфере образования и науки на право осуществления образовательной деятельности. Основными задачами ОПиУС являются совершенствование существующих и внедрение новых методов организации учебного процесса, в том числе на основе использования современных информационных технологий, научно-методического обеспечения обучающихся, материально-технической и информационной базы, разработка учебно-методических пособий для преподавателей и слушателей циклов. Контингент обучающихся - врачи-бактериологи, эпидемиологи, биологи, средний медицинский персонал противочумных учреждений, ФБУЗ Управлений и Центров гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, лечебно-профилактических учреждений, ветеринарной службы и др.

Институт располагает квалифицированными профессорско-преподавательскими кадрами, обеспечивающими подготовку по всем циклам дисциплин, в соответствии с требованиями Рособрнадзора. Учебно-методическое и информационное обеспечение образовательной деятельности осуществляется за счет приобретения новых современных изданий и путем выпуска собственной учебной литературы как на бумажных, так и электронных носителях. Оборудование учебных лабораторий обеспечивает возможность реализации всех заявленных в лицензии образовательных программ.

Проведение учебного процесса по вопросам профессиональной переподготовки и повышения квалификации специалистов проводится в соответствии с разработанными типовыми учебными программами для подготовки и повышения квалификации кадров, в том числе специалистов специалиализированных противоэпидемических бригад (СПЭБ), утвержденными Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, в частности:

Бактериология. Основы безопасной работы с патогенными биологическими агентами (ПБА) I-II групп Эпидемиология. Основы безопасной работы с патогенными биологическими агентами (ПБА) I-II групп Лабораторное дело. Особо опасные инфекции Эпидемиология. Инфекционные болезни, требующие проведение мероприятий по санитарной охране территории Российской Федерации Биологическая безопасность Подготовка личного состава специализированных противоэпидемических бригад для работы в чрезвычайных ситуациях Программа курсов повышения квалификации врачейбактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму Подготовка специалистов по Международным медико-санитарные правилам (2005 г.) и санитарной охране территории Российской Федерации Бактериология. Инфекционные болезни, требующие проведения мероприятий по санитарной охране территории Российской Федерации Оценка знаний слушателей проводится после каждого пройденного цикла программы в форме зачетов, в конце обучения - заключительного государственного экзамена. По окончании курсов слушателям выдаются документы государственного образца.

Обучение слушателей основным правилам работы с ПБА I-IV групп патогенности – первоочередной и один из важнейших разделов всех образовательных программ. Теоретическая его часть составлена в соответствии с Санитарно-эпидемиологическими правилами (СП 1.3.1285-03) «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)» и СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

В ходе представления материала акцентируется внимание на вопросах организации работы режимных лабораторий, защиты от инфицирования биологическими поражающими агентами, методах и средствах обеззараживания различных объектов, основных методических приемах безопасной работы с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность возбудителями I – II групп патогенности, при проведении бактериологических, иммуносерологических, молекулярно-генетических исследований.

Обучение слушателей проводится согласно составленному расписанию, включающему теоретические и практические занятия, семинары. При проведении практических занятий 1 преподаватель курирует курсантов. Перед началом работы преподаватель ставит цель и задачи каждого занятия, дает объяснение материала, методик работы с конкретизацией каждого этапа исследования, обучает правильному ведению необходимой документации.

Вопросам безопасной работы с ПБА уделяется большое внимание с первого дня обучения и до конца цикла. При этом общие положения Санитарно-эпидемиологических правил работы с микроорганизмами I-II и III-IV групп патогенности, планировка, оборудование лабораторий, порядок работы в них, виды допуска сотрудников к работе, виды аварий и мероприятия по ликвидации их последствий и т.п. излагаются в виде лекций, остальные разделы обсуждаются на практических занятиях в виде объяснений с одновременной демонстрацией соответствующих методических приемов безопасной работы.

1. ОБЩИЕ ТРЕБОВАНИЯ К ОРГАНИЗАЦИИ

РАБОТ В БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ

ЛАБОРАТОРИЯХ

1.1. Требования к помещению и оборудованию лабораторий Вся работа с патогенными микроорганизмами проводится в лабораториях, которые, в зависимости от основных задач, могут быть научно-исследовательскими, диагностическими или производственными.

Кроме того, лаборатории, как правило, специализированы и работают преимущественно с той или иной группой микроорганизмов (бактериальная, вирусная, риккетсиозная, грибковая и др.). Существует и более узкая специализация лабораторий. Например, работа бактериологических лабораторий может быть направлена на изучение анаэробных бактерий, лептоспир, возбудителя туберкулеза и др.

Условия работы лабораторий регламентированы степенью опасности микроорганизмов для человека. По этому признаку выделено четыре группы возбудителей инфекционных заболеваний.

Группа I - возбудители особо опасных инфекций:

чума, натуральная оспа, лихорадки Ласса, Эбола и др.

Группа II - возбудители высококонтагиозных бактериальных, грибковых, вирусных инфекций: сибирская язва, туляремия, бруцеллез, холера, лихорадка Скалистых гор, сыпной тиф, бешенство. В эту группу включен бластомикоз, ботулотоксин.

Группа III - возбудители бактериальных, грибковых, вирусных и протозойных инфекций, выделенные в отдельные нозологические группы (возбудители коклюша, столбняка, ботулизма, туберкулеза, кандидоза, малярии, лейшманиоза, гриппа, полиомиелита и др.).

В эту группу включены аттенуированные штаммы бактерий I, II и III групп.

Группа IV- возбудители бактериальных, вирусных, грибковых септицемий, менингитов, пневмоний, энтеритов, токсикоинфекций и острых отравлений (возбудители анаэробных газовых инфекций, синегнойной инфекции, аспергиллеза и амебиаза; аденовирусы, герпес-вирусы и др.), относящиеся к условно-патогенным микроорганизмам.

Важнейшей особенностью работы в микробиологических лабораториях является риск инфицирования персонала и возможность заражения окружающей среды. Исходя из этого, лаборатории подразделяются, по классификации ВОЗ, на четыре группы риска.

Первая группа риска: лаборатории особого режима работы (максимально изолированные) с высоким индивидуальным и общественным риском.

Вторая группа риска: лаборатории (изолированные) с высоким индивидуальным и низким общественным риском.

Третья группа риска: базовые (основные) лаборатории с умеренным индивидуальным и ограниченным общественным риском.

Четвертая группа риска: базовые (основные) лаборатории с низким индивидуальным и общественным риском.

Большая часть микробиологических лабораторий работает с патогенными биологическими агентами (ПБА) III и IV групп и только специализированные лаборатории с возбудителями I и II групп патогенности.

Любая микробиологическая лаборатория, в которой проводится работа с патогенными микроорганизмами, должна соответствовать принятым нормам и правилам и располагать соответствующими оборудованием и материалами для исследования, а также иметь подготовленные кадры.

Особые требования предъявляют к лабораториям, в которых проводят работу с ПБА I-II групп патогенности – микроорганизмами (бактериями, вирусами, риккетсиями, грибами, хламидиями), включая генно-инженерно-модифицированные; ядами, биологического происхождения (токсинами); любыми объектами и материалами (полевой, клинический, секционный), подозрительными на содержание перечисленных агентов (СП 1.3.1285-03). Эти лаборатории размещают в отдельно стоящем здании или в изолированной части здания. Желательно располагать такие лаборатории на окраине города или за его пределами, а территорию, на которой расположена стационарная лаборатория, ограждать забором с камерами видеослежения. Лабораторию обеспечивают круглосуточной военизированной охраной, средствами сигнализации и пожаротушения. Входная дверь лаборатории обозначена знаком «Биологическая опасность», и должна быть постоянно закрыта. На окна первого и цокольного этажей здания устанавливают металлические решетки.

Лабораторию обеспечивают, не нарушая правил безопасности, водопроводом, канализацией, электроэнергией, отоплением, вентиляцией и телефонной связью.

Желательно иметь отдельный вход для выполнения производственной работы (доставка чистых биопробных животных, фуража и другого чистого материала).

Помещение лаборатории разделяют на «заразную»

зону, где проводят манипуляции с ПБА и их хранение, и «чистую» зону, где не работают с ПБА. В «заразной»

зоне располагают блок для работы с инфицированными животными (вскрытие, заражение, зоолого-паразитологические исследования); боксированные помещения для различных микробиологических манипуляций;

комнаты для иммуно-серологических исследований;

помещение для ПЦР-диагностики; комнаты, оснащенные боксами биологической безопасности (БББ), для работы, связанной с высоким риском образования аэрозоля (центрифугирование, гомогенизация, измельчение, интенсивное встряхивание, обработка ультразвуком, вскрытие ампул с ПБА, манипуляции с большими объемами и концентрациями ПБА); автоклавная для обеззараживания материала; термальная (при необходимости);

комната для ведения записей; туалет.

Набор помещений и их оснащение могут варьировать в зависимости от целей и задач лаборатории.

В «чистой» зоне предусмотрены: гардероб для верхней одежды, препараторская, моечная, средоварня, стерилизационная, помещение с холодильной камерой, кабинеты для работы с документами, подсобные помещения, туалет. Вход в «заразную» зону и выход из нее осуществляют через санитарный пропускник. При входе обязательно полное переодевание сотрудников в специальную одежду, при выходе перед переодеванием в личную одежду персонал проходит целевую санитарную обработку.

Помещение, где непосредственно проводится работа с ПБА, герметизируют и оснащают автономной системой приточно-вытяжной вентиляции, изолированной от других вентиляционных систем здания. Эту систему вентиляции оборудуют на выходе (каскадом фильтров) и на входе фильтрами тонкой очистки (ФТО), проверенными на защитную эффективность. Периодически, по плану, контролируют эффективность работы фильтров. Эксплуатацию систем приточно-вытяжной вентиляции лабораторий осуществляют в соответствии с инструкцией, составленной на основании требований соответствующих нормативных документов.

Замену ФТО приточных и вытяжных систем проводят при планово-предупредительных ремонтах при достижении предельно допустимого перепада давлений, установленных проектом. Перед демонтажем фильтры и магистральный воздуховод обрабатывают парами формалина или аэрозолями дезинфектантов.

Снятый фильтр помещают в крафт-мешок или другую упаковку и автоклавируют или сжигают. Работу по демонтажу фильтра проводят в костюме IV типа с использованием респиратора и резиновых перчаток (под рабочими рукавицами).

Проверка боксов биологической безопасности II и III классов проводится при их установке и в процессе эксплуатации (ежегодно).

В помещениях «заразной» зоны лаборатории, за исключением комнат для содержания биопробных животных, в исключительных случаях (работа в условиях жаркого климата) допускается кондиционирование воздуха. При этом кондиционеры устанавливают на приточных вентиляционных системах до ФТО. Категорически запрещается работать с ПБА при включенных кондиционерах.

Водоснабжение лаборатории должно быть обеспечено техническими средствами защиты от подсоса и обратного тока воды. Категорически запрещен слив (сток) необеззараженных жидкостей в общую канализацию.

Как правило, сточные воды перед сбросом в общегородской канализационный коллектор обеззараживают химическим, физическим или термическим способами. Периодически (не реже 1 раза в месяц) эффективность обеззараживания контролируют бактериологическим методом, а также проверяют на остаточную концентрацию активного вещества применяемого дезинфицирующего средства.

Лаборатории, проводящие работу с ПБА I-II групп патогенности, обязательно исследуют сточные воды на содержание в них специфической микрофлоры. Кратность исследования проб сточных вод зависит от вида возбудителя, характера и объема проводимых работ.

Аварийную звуковую и/или световую сигнализацию устанавливают в комнатах, где проводят работу с ПБА. Кроме того, лабораторию оборудуют пожарной сигнализацией и средствами пожаротушения.

Помещение лаборатории должно быть светлым и достаточно просторным для обеспечения безопасного проведения лабораторной работы. Ширина проходов к рабочим местам – не менее 1,5 метров. Стены, потолок, пол должны иметь гладкую поверхность, легко моющуюся, непроницаемую для жидкостей и устойчивую к дезинфицирующим средствам. Стены и потолки окрашивают масляной краской светлых тонов или облицовывают глазурованной плиткой. Полы покрывают нескользкой плиткой, пластиком или линолеумом, тщательно заделывая швы, поскольку помещение должно быть непроницаемым для грызунов и насекомых.

Лабораторное оборудование и мебель должны быть гладкими, без острых краев, шероховатостей и иметь покрытие, устойчивое действию моющих и дезинфицирующих веществ. Для рабочих поверхностей столов используют химически - и термоустойчивые (выдерживающие действие температур до 170 – 200°С) материалы. Следует создать хорошую освещенность для всех видов работ, обратив внимание на нежелательность бликующих поверхностей. Согласно рекомендациям IES – RP – CC012 (США), типовые значения освещенности должны составлять 770 – 880 лк на высоте рабочего места.

Если окна лаборатории ориентированы на юг, необходимо предусмотреть защиту рабочих столов от прямых солнечных лучей путем использования жалюзи из материала, устойчивого к дезинфектантам.

Лаборатории оснащают вытяжными шкафами, где проводят работу с кислотами, щелочами и растворителями. Вытяжной шкаф оборудуют светильниками, кранами горячей и холодной воды, сигнальной лампой вытяжного вентилятора, заземленными розетками.

Химические реактивы хранят в вентилируемых шкафах из нержавеющей стали или дерева, которые оснащают вентиляционной системой. Скорость потока воздуха в различных моделях должна составлять от 85 до 125 м3/ч.

Весы устанавливают на специальные антивибрационные столы, которые позволяют их правильно эксплуатировать.

Приборы, оборудование и средства измерения, используемые в работе лаборатории, должны быть аттестованы, технически исправны, иметь технический паспорт и рабочую инструкцию по эксплуатации с учетом требований биологической безопасности.

Средства измерения регулярно подвергают метрологическому контролю. Используемые приборы должны соответствовать нормам безопасности и электромагнитной совместимости.

Работа с ПБА I-II групп может проводиться только в лицензированных лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологические заключение о возможности проведения определенного вида исследований с конкретными микроорганизмами. Разрешение на работу утрачивает силу, если в лаборатории проведена перепланировка.

1.2. Обеззараживание помещений и оборудования Под микробным обеззараживанием понимается комплекс мероприятий, средств и методов, обеспечивающих снижение воздушного и поверхностного загрязнения рабочих помещений до требуемых уровней. Это понятие более широкое, чем понятие дезинфекция, которая служит лишь одним из элементов микробного обеззараживания.

Для обеззараживания различных объектов имеется большой выбор дезинфицирующих средств, а также комбинаций дезинфектантов и детергентов с приемлемой бактерицидной активностью и незначительным коррозионным действием. Однако средства и методы обеззараживания определяются в каждом конкретном случае в зависимости от вида ПБА и характера обрабатываемого объекта (СП 1.3.1285-03).

Например, при работе с вегетативными формами бактерий I – II групп патогенности обеззараживание поверхностей (стол, оборудование, стены, двери) в помещениях «заразной» зоны лаборатории проводят 1% раствором хлорамина Б, 3% раствором перекиси водорода (время экспозиции 60 мин), 0,2% раствором ДП- (экспозиция 30 мин) или другим дезинфицирующим средством, обладающим бактерицидной активностью в отношении указанных агентов.

Режим обеззараживания аналогичных объектов в лаборатории, проводящей исследование со спорообразующими бактериями, отличается. В этом случае стол, стены, двери, оборудование др. протирают двукратно с интервалом 30 мин 6% раствором перекиси водорода с 0,5% моющего средства (экспозиция 120 мин) или двукратно с интервалом 30 мин орошают 1% активированным раствором хлорамина Б (экспозиция мин), используя гидропульт, автомакс или распылитель типа «Квазар» (рис. 1).

Каждая серия поступающего в лабораторию дезинфицирующего средства должна проверятся на бактерицидную активность и процентное содержание активного вещества. Так, содержание активного хлора (АХ) в хлорамине Б должно быть не менее 24%. Перекись водорода медицинская может быть использована с содержанием перекиси водорода не менее 30%.

Дезинфицирующие растворы для лабораторного использования готовит лаборант или дезинфектор под руководством врача или научного сотрудника в специально оборудованном помещении, надев халат, очки, маску, резиновые перчатки. Сроки использования готовых (рабочих) дезинфицирующих растворов регламентированы нормативными документами. Например, рабочий раствор велтолена, хлорамина необходимо менять на свежеприготовленный каждый день.

В лаборатории хранят не менее чем недельный запас дезсредств. Следует отметить, что запрещено одновременное использование 6% раствора перекиси водорода и 3% раствора хлорамина в пределах лаборатории в связи с взрывоподобным характером протекания химической реакции при смешивании этих растворов.

Спецобработка помещений, оборудования и различных объектов лаборатории подразделяется на ежедневную (текущую) и периодическую (генеральную).

В случае возникновения аварии, при которой создается реальная или потенциальная возможность попадания ПБА в воздух или на поверхность оборудования лаборатории, обеззараживание проводится незамедлительно.

Текущую дезинфекцию рабочих поверхностей в микробиологических комнатах (боксах) проводит лаборант под контролем врача, используя соответствующий виду ПБА дезинфектант и режим обработки.

После необходимой экспозиции младший персонал под наблюдением лаборантов делает влажную уборку помещения.

Каждую рабочую зону лаборатории обеспечивают индивидуальным промаркированным набором уборочного инвентаря, который не разрешается использовать для уборки других помещений. После каждой уборки ветошь обрабатывают дезраствором, прополаскивают в воде и просушивают. Емкости также подвергают обработке.

Еженедельно в помещениях «заразной» зоны проводят генеральную уборку, используя дезинфицирующие средства. Протирают стены на высоту до 2 м, мебель, приборы, аппараты и др. Термостаты и холодильники (после очищения от наледи) один раз в месяц подвергают дезинфекционной обработке.

После влажной уборки проводят обеззараживание воздуха и поверхностей помещениях «заразной» зоны ультрафиолетовыми лучами (УФ).

Бактерицидным действием обладает ультрафиолетовое излучение с диапазоном длин волн 205-315 нм, которое проявляется в деструктивно-модифицирующих фотохимических повреждениях ДНК клеточного ядра микроорганизма, что приводит к гибели микробной клетки в первом или последующем поколении. Однако следует учитывать, что УФ-излучение оказывает на микроорганизмы не только бактерицидное, но и мутагенное действие, приводя к появлению резистентных к данному фактору форм.

Более чувствительны к воздействию ультрафиолетового излучения бактерии в вегетативной форме и вирусы. Менее чувствительны грибы и простейшие микроорганизмы. Наибольшей устойчивостью обладают споровые формы бактерий.

Бактерицидные лампы вмонтированы в бактерицидные облучатели, которые подразделяются на открытые (потолочные, напольные или настенные), комбинированные (настенные) и закрытые. Открытые и комбинированные облучатели предназначены для обеззараживания помещения только в отсутствии людей или при кратковременном их пребывании в помещении в защитных очках со светофильтрами. Бактерицидные облучатели устанавливают в соответствии с нормативными документами по их установке и эксплуатации.

Время УФ-облучения зависит от профиля лаборатории, габаритов помещения, типа бактерицидной установки, объекта обеззараживания (воздух, поверхность) и других показателей.

На каждый бактерицидный облучатель заводят журнал регистрации и контроля эксплуатации лампы. В журнале фиксируются время их горения и бактерицидная эффективность облучения.

При оценке бактерицидной эффективности ультрафиолетового облучения воздушной среды помещения или поверхностей в качестве санитарно-показательного микроорганизма принимается Staphylococcus aureus.

Для контроля обсемененности воздуха в помещениях бактериологических и вирусологических лабораториях может быть использован седиментационный метод.

В соответствии с этим методом на рабочий стол ставят две чашки Петри с 2% питательным агаром и открывают их на 15-20 минут. Посевы инкубируют при температуре 37°С в течение 48 часов. При росте не более колоний S. aureus на чашке, уровень микробной обсемененности воздуха считается допустимым.

Бактерицидные лампы, отработавшие гарантийный срок службы, указанный в паспорте, должны заменяться на новые. Для определения окончания срока службы могут быть использованы электрические счетчики, суммирующие общую наработку ламп в часах, или замеры радиометров, свидетельствующие о падении бактерицидного потока ниже номинального. Периодически (не реже одного раза в неделю) лампы следует очищать от пыли ветошью, смоченной спиртом.

При экстремальных ситуациях для обеззараживания воздуха и поверхностей в боксированных комнатах «заразной» зоны лаборатории применяют аэрозольную дезинфекцию при условии герметизации помещения и отключении приточно-вытяжной вентиляции.

Аэрозоли представляют собой гетерогенные аэродисперсные системы с размерами частиц жидкой дисперсной фазы от 0,1 до 1 000 мкм. Для аэрозольной дезинфекции выбирают системы с диаметром частиц 5 -25 мкм. Распыление дезинфектанта проводят с помощью пневматической (ПВАН) или тубулирующей (ТАН) аэрозольных насадок. Источником сжатого воздуха для распыления служит компрессор производительностью не менее 300 м3/ч при рабочем давлении 3-4 атм или аэрозольный генератор. Можно пользоваться аппаратами типа «Квазар».

При аэрозольной дезинфекции наиболее приемлемы жидкие химические препараты (формальдегид, перекись водорода медицинская, велтолен и др.). Концентрация дезинфектанта и режим обеззараживания зависит от вида ПБА, с которым велась работа в лаборатории.

Во время обеззараживания аэрозоль заполняет обрабатываемое помещение, оседает мельчайшими каплями на поверхностях стен, пола, оборудования и воздействует на обсеменяющие их микроорганизмы.

Частично аэрозольные капли испаряются и в виде пара проникают в трудно доступные места.

При работе с формальдегидом после необходимой дезинфекционной экспозиции следует провести его нейтрализацию раствором аммиака.

Персонал, проводящий обработку, должен иметь кроме халата средства защиты органов дыхания, глаз и кожи.

1.3. Обеззараживание и утилизация отходов деятельности лаборатории Все отходы деятельности лаборатории по степени эпидемиологической и токсикологической опасности подразделяются на следующие классы (СанПиН 2.1.7.2527-09, СанПин 2.1.7.728-99):

- класс А (неопасные) – отходы, не имеющие контакта с зараженными или условно зараженными ПБА I-IV групп патогенности (различная макулатура, упаковочный материал, негодная мебель, строительный мусор и др.);

- класс Б (опасные) – биологические отходы вивариев, иммуноклиник, мусор из помещений лаборатории, где не проводится работа с живыми ПБА I-IV групп патогенности, стеклянная лабораторная посуда из препараторских, стерильные отработанные ватно-марлевые материалы, бумажная макулатура из письменных комнат и др.;

- класс В (чрезвычайно опасные) – медицинские отходы из лабораторий, работающих с ПБА I-IV групп патогенности: отработанные посевы, остатки диагностического материала (сыворотки, сгустки крови, трупный материал и др.), вскрытые биопробные животные, остатки их корма, подстилочный материал от экспериментальных животных, пипетки, шприцы, тестконтроли работы автоклавов, ампулы из-под лиофилизированных культур, ватно-марлевый материал, макулатура из письменных комнат и другой отработанный материал, зараженный или подозрительный на зараженность бактериальными и вирус содержащими ПБА;

- класс Г – просроченные медицинские и иммунобиологические препараты (МИБП), питательные среды с истекшим сроком годности, химические реактивы, ртутьсодержащие предметы, приборы, оборудование.

К отходам деятельности лаборатории, в зависимости от их класса, предъявляют различные требования по обеззараживанию, сбору, временному хранению, транспортированию и утилизации.

Отходы класса А (неопасные) не требуют специального обеззараживания. Их собирают в пластиковые пакеты белого цвета, герметично закрывают и в твердых емкостях (например, баках) с крышками переносят к мусороприемнику для дальнейшего вывоза на полигон твердых бытовых отходов (ТБО).

Отходы класса Б (опасные) подвергают обязательной дезинфекции на месте их образования в соответствии с действующими нормативными документами (СП I.

3.1285-03). Обеззараженные отходы собирают в одноразовую герметичную упаковку желтого цвета. Для твердых отходов, имеющих острые края (битая стеклянная посуда, пипетки и т.п.), используют твердую упаковку, для игл от шприцов испльзуют специальные одноразовые контейнеры. Одноразовые емкости желтого цвета с отходами класса Б маркируют надписью «Опасные отходы – «Класс Б» с указанием названия лаборатории, кода учреждения, даты, фамилии ответственного за сбор отходов лица. Заполненные емкости помещают во влагонепроницаемые баки желтого цвета с той же маркировкой, герметично закрывают крышкой и переносят к металлическим контейнерам, которые размещены на специальной площадке хозяйственного двора учреждения (лаборатории). Дальнейшую утилизацию отходов проводят централизовано специальным автотранспортом на полигон ТБО или децентрализовано к месту кремации, если учреждение имеет крематорий для сжигания отходов.

Использованные для переноса (перевоза), временного хранения многоразовые емкости (баки, контейнеры) дезинфицируют и моют.

Отходы класса В (чрезвычайно опасные) подвергают обязательной дезинфекции на месте их образования в соответствии с действующими нормативными документами (СанПиН 2.1.7.2527-09, СП 1.3.1285-03; СанПин 2.1.7.728-99). Обеззараживание отходов проводят автоклавированием или обработкой дезрастворами.

Эффективность работы автоклавов контролируют с помощью химических (каждый цикл автоклавирования) или биологических (ежемесячно) тестов. Путем автоклавирования обеззараживают жидкие и плотные питательные среды с посевами ПБА I-IV групп патогенности и без посевов; вскрытые ампулы из-под лиофилизированных культур (предварительно обеззараженные в дезрастворе); пробирки, флаконы, колбы с бактериальными взвесями; сыворотки; лабораторную посуду; обгоревшие ватно-марлевые пробки и другой материал, инфицированный или подозрительный на зараженность ПБА I-IV групп.

Жидкие питательные среды с посевами микроорганизмов после обеззараживания автоклавированием разводят водопроводной водой 1:2 и сбрасывают в канализацию. Рабочие растворы отработанных дезсредств после экспозиции в течение не менее 24 ч разводят водопроводной водой 1:2 и сливают в канализацию.

Лабораторные отходы класса В (из блока для работы с инфицированными животными) после обеззараживания в дезрастворах могут содержать ватные и ватномарлевые тампоны, салфетки, вскрытые трупы мелких экспериментальных животных, трупы отловленных в природе грызунов, остатки корма и подстилочный материал из садков, где содержались лабораторные животные до и после экспериментов, шприцы, ампулы и флаконы с остатками вакцинных препаратов, сколы концов пастеровских пипеток и ампул и др.

После обеззараживания отходы класса В собирают в одноразовую упаковку красного цвета. Одноразовая упаковка может быть мягкой (пакеты) и твердой (одноразовые емкости). Каждая упаковка маркируется надписью «Чрезвычайно опасные отходы – «Класс В»

с указанием названия лаборатории, кода, даты и фамилии ответственного сотрудника. Бактериальные культуры, вирусологически опасный материал, различные острые предметы, экспериментальных животных складывают в твердую герметичную упаковку, нетвердые отходы – в герметичную мягкую упаковку.

Все заполненные емкости укладывают в маркированные водонепроницаемые металлические баки (контейнеры) с плотно закрывающимися крышками и хранят до кремирования в специально отведенном месте в пределах лаборатории. Транспортирование отходов класса В для утилизации осуществляют только в закрытых кузовах специально применяемых для этих целей автомашинах, которые после вывоза подвергают спецобработке.

Подготовку обеззараженных отходов лабораторной деятельности к утилизации (сбор, упаковка, герметизация, размещение в емкости для временного хранения) осуществляет ответственное лицо из числа работников лаборатории в средствах индивидуальной защиты (противочумный костюм III типа, дополненного при необходимостиреспиратором и прорезиненным фартуком).

Отходы лаборатории класса Г по степени токсичности делятся на следующие подклассы (Сан ПиН № 4286-87, Приказ МПР РФ от 02.12.2002 г. № 786):

1 – ртуть, термометры, лампы люминесцентные 2 – масла, серная кислота, электролиты 3 – медицинские отходы 4 – картонная упаковка Использованные люминесцентные лампы, ртутьсодержащие приборы собирают в закрытые влагонепроницаемые емкости черного цвета с маркировкой «Отходы – «Класс Г» и хранят в специально выделенном помещении до утилизации, которая осуществляется в соответствии с действующими нормативными документами. Если во время работы повреждена целостность ртутьсодержащих приборов или термометров и ртуть вылилась, необходимо немедленно провести демеркуризацию.

Масла, минеральные (хлорводородная, азотная, серная) и сильные органические кислоты, щелочи утилизируют согласно действующим нормативным документам.

Вакцинные, диагностические и лекарственные препараты с истекшим сроком годности после обеззараживания путем автоклавирования измельчают, помещают в пакеты черного цвета и хранят до утилизации в водонепроницаемом герметически закрытом контейнере с маркировкой «Отходы – «Класс Г». В эти же контейнеры складывают ненужную картонную упаковку в мягких одноразовых маркированных пакетах черного цвета. Вывоз этих отходов на полигон ТБО осуществляют централизованно специализированным автотранспортом.

Основным правилом работы в режимных лабораториях является эффективная первичная изоляция персонала от ПБА, которая обеспечивается использованием одного (или более) из перечисленных средств:

– средства индивидуальной защиты (СИЗ) – боксы биологической безопасности (БББ) – изоляты из гибкой пленки аналогичного боксам стандарта.

Любые лабораторные манипуляции с микроорганизмами приводят к их рассеиванию в большей или меньшей степени во внешнюю среду. В связи с этим все работники микробиологических и вирусологических лабораторий, вне зависимости от их устройства и оборудования, должны применять средства индивидуальной защиты. Это предполагает использование той или иной спецодежды: противочумного костюма, пневмокостюма (типа «Антибелок»), изолирующего костюма типа К3М-1 с противогазом, пневмошлема, различных респираторов и т.п. Тип применяемой спецодежды зависит от вида ПБА, с которым ведется работа, и характера выполняемых манипуляций.

Например, при работе в стационарных, полевых или передвижных лабораториях сотрудники надевают противочумные костюмы I-IV типов, изолирующие костюмы типа К3М-1 и другие, разрешенные к применению защитные средства (рис. 1,2). В стационарных максимально изолированных лабораториях при работе с ПБА I-II групп патогенности персонал использует пневмокостюмы типа «Антибелок-5», пневмосистемы (типа ЛИЗ) или их аналоги (рис. 3,4,5).

При экстремальных ситуациях (например, авариях) работники применяют аварийный комплект защитной одежды типа Л-1, «Корунд» или их аналоги с фильтрующим противогазом (рис. 1,6).

Костюм изолирующий с авто- Одноразовый костюм «Тайкем».

номным обеспечением подачи воздуха.

Защитный костюм «Кварц». Комбинезон защитный и панорамная полумаска со сменными Защитный колпак с принудитель- Защитный костюм «Л-1».

ной подачей воздуха.

Существуют 4 основных типа противочумных костюмов:

I тип – комбинезон (пижама), носки, тапочки, большая противочумная косынка (120 х 120 х 150 см) или капюшон, противочумный халат, ватно-марлевая маска (из марли 125 х 50 см со слоем ваты 25х17х1,5 см весом 20 г) или противопылевой респиратор, или фильтрующий противогаз, плотно прилегающие очки-консервы или полимерная пленка одноразового использования (17 х 39 см с учетом 6 см с каждой стороны для привязывания тесёмок длиной по 30 см), резиновые перчатки, сапоги резиновые или водонепроницаемые бахилы, полотенце. При необходимости (вскрытие трупов людей или крупных животных) дополнительно надеваются прорезиненные фартук, нарукавники и вторая пара перчаток.

II тип – комбинезон (пижама), носки, тапочки, большая косынка (капюшон), противочумный халат, ватномарлевая маска (респиратор), резиновые перчатки, сапоги (водонепроницаемые бахилы), полотенце. Отличается от костюма I типа отсутствием очков.

III тип - комбинезон (пижама), носки, тапочки, большая косынка, противочумный халат, резиновые перчатки, защитная обувь (глубокие галоши, сапоги или водонепроницаемые бахилы), полотенце.

IV тип – комбинезон (пижама), носки, тапочки, шапочка (малая косынка), противочумный (хирургический) халат.

Разработан порядок надевания и снятия противочумного костюма.

К работе в пневмокостюмах допускаются только лица, не имеющие медицинских противопоказаний к ношению этого типа защитной одежды, прошедшие специальное обучение, инструктаж по правилам работы и сдавшие зачёт. На централизованном специальном участке перед использованием пневмокостюм проверяют на целостность, а комплектные к ним фильтры ТОВ (В-0,4) – на оценку коэффициента проскока и фиксируют результаты в специальном журнале. Сотрудник лаборатории получает пневмокостюм под личную роспись и визуально проверяет его на целостность перед непосредственной работой. В соответствующих инструкциях регламентируется порядок надевания-снятия пневмокостюмов и правила работы в них.

После использования пневмокостюмы обрабатывают в дезинфицирующем душе, в парагазовых передаточных камерах и затем проверяют на целостность.

Для защиты органов дыхания надевают различные респираторы. Респираторы-капюшоны положительного давления представляют собой легкий капюшон из прозрачного материала, покрывающий голову, шею и плечи. Подача воздуха осуществляется из переносных баллонов со сжатым воздухом (запас воздуха на 15-20 мин) или через шланги, связанные с небольшим компрессором с ВД (высокого давления) - фильтрами, который питается от батарей. Продолжительность их работы (6-7 ч) зависит от качества фильтров.

Маска-респиратор закрывает большую часть лица, обеспечивая надежную защиту глаз и дыхательных путей. Маска может иметь одновременно биологический фильтр системы ВД и химический патрон. Наличие химического патрона не обязательно, если респиратор применяется при биологической защите.

Маска-респиратор должна плотно прилегать к лицу, чтобы обеспечить необходимую герметичность. При слабом натяжении крепящих маску лент вдыхаемый воздух минует фильтрующие элементы и снижает защитную способность маски. В помещениях, где содержание кислорода не соответствует нормативам, не разрешается применять респираторы с химическим патроном.

Полумаска-респиратор не защищает глаза, прикрывая только рот и нос. Блок с фильтрами системы ВД, размещенный сбоку маски, обеспечивает лучшую видимость, чем в случае его расположения впереди. Наличие химического фильтра-патрона в полумаске-респираторе необязательно, если нет угрозы применения ОВ.

При необходимости защитить глаза можно использовать «очки-консервы», которые должны плотно прилегать к коже в области глаз.

Если нет опасности воздушной микробной инфекции для защиты глаз от химических веществ (в виде брызг) можно рекомендовать специальные козырьки (щитки).

Козырьки должны полностью закрывать лицо и при необходимости легко откидываться назад.

Большинство лабораторных манипуляций, когда смешивают, встряхивают, измельчают или центрифугируют инфицированный материал, сопровождается образованием случайных аэрозолей. Неправильная работа бактериологической петлей, пипеткой также создают целый ряд возможностей образования аэрозолей. Использование современных защитных боксов при работе с инфицированными материалами обеспечит удержание и контролируемое удаление из рабочей зоны образовавшихся аэрозолей. Выбор конструкции защитного бокса определяется степенью опасности ПБА, с которым предстоит работа.

Различают боксы с частичным удержанием микроорганизмов (боксы I и II классов) и с полным их удержанием или изолирующие боксы (III класса).

Эффективность боксов биологической безопасности (БББ) контролируется проверкой работы фильтров, определением скорости потока воздуха, надежностью общей изоляции и других инженерно-технических характеристик.

БББ I класса – это открытая спереди рабочая камера с принудительным удалением через ВД-систему отработанного воздуха. Удаляемый воздух очищается от частиц аэрозоля в предфильтре и в специальном фильтре тонкой очистки (ФТО) и выводится в центральную вытяжную систему лаборатории. Скорость движения воздуха в проёме передней панели бокса должна составлять 0,5-1,0 м/с, а высота проёма 20 см. Снижение или повышение скорости движения воздуха в проме недопустимо.

Боксы I класса предназначены для работы с агентами низкой (микроорганизмы, которые обычно не вызывают заболеваний человека или животных) или умеренной (микроорганизмы, которые могут вызывать не представляющее серьезной опасности заболевание человека или животного и риск распространения инфекции невысок) степени риска, согласно классификации ВОЗ.

Боксы II класса представляют собой защитные конструкции также с проёмом в передней панели для рук работающего. В этих боксах создается нисходящий вертикальный ламинарный воздушный поток благодаря рециркуляции части засасываемого в бокс воздуха. Рециркулируемый и выводимый из бокса воздух очищается в высокоэффективных аэрозольных фильтрах.

Разработано два типа БББ II класса: тип А и тип Б. В боксах типа А минимальная скорость поступающего воздуха через рабочий проём высотой 20 см составляет 0,4 м/с. Скорость вертикального нисходящего потока воздуха внутри камеры такая же. Конструкция обеспечивает рециркуляцию около 70% всего воздуха. В боксах типа Б воздух поступает внутрь устройства через изменяемый по вертикали рабочий проём со скоростью 0,5 м/с, а средняя вертикальная скорость нисходящего потока воздуха внутри камеры равна 0,25 м/с. Эта конструкция обеспечивает удаление около 70% всего воздуха, протекающего через рабочую зону, и является предпочтительней конструкции типа А, поскольку исключает накопление в высоких концентрациях опасных и токсичных агентов при работе с ними. Эффективная работа защитных боксов II класса достигается только при хорошо сформированном и тщательно поддерживаемом ламинарном потоке воздуха.

Все манипуляции в боксах проводятся ближе к задней стенке камеры на специальных поддонах с салфетками, смоченными дезинфицирующим раствором.

Работа с ПБА проводится в противочумном костюме IV типа, поскольку не исключается загрязнение рук экспериментатора, необходимо использование резиновых перчаток. После окончания работы все извлекаемые из боксов предметы и материалы подвергают предварительному обеззараживанию непосредственно в боксах путем протирания или погружения в соответствующие дезинфицирующие растворы и заключительной дезинфекции вне боксов. СИЗ после окончания работы помещают в контейнеры для последующего обеззараживания.

Защитные боксы II класса используют для работ с микроорганизмами низкой категории риска, если лабораторные манипуляции сопровождаются массовым образованием аэрозолей, или агентами с высоким уровнем риска для индивида и низким – для общества.

В боксах БББ II Б класса проводят диагностические исследования, связанные с изоляцией вирусов и риккетсий II группы патогенности. Если в помещении блока для работы с животными отсутствует приточно-вытяжная вентиляция или фильтры тонкой очистки на выходе вытяжной вентиляции, разрешается проводить работу с инфицированными (кроме вирусов I группы патогенности) животными в боксах БББ II (А, Б) класса, а исследование на чуму – в боксах БББ II Б или III класса.

Защитные боксы III класса – полностью изолированная воздухонепроницаемая камера, внутри которой создается пониженное давление (на 0,1-0,24 кПа ниже окружающего), что обеспечивает надежный барьер между инфицированным материалом и экспериментатором. Резиновые перчатки плечевого типа герметично заделаны в передней, а иногда и задней (при боксах двустороннего типа) панелях камеры. Засасываемый в бокс и выводимый из него вентилятором воздух очищается в предфильтре и в двух последовательно установленных высокоэффективных фильтрах. Жидкие отходы из бокса собирают в специальную емкость и подвергают термической обработке.

Для проведения специальных исследований боксы III класса можно объединять в защитные технологические линии. Эти линии оснащают изолированными от окружающей среды и друг от друга инкубаторами, центрифугами, измельчителями, гомогенизаторами, рефрижераторами и другим оборудованием и приборами. Возможно изолированное содержание подопытных животных. Соединение отдельных элементов в линии осуществляется с помощью камер-шлюзов.

Камеры-шлюзы могут быть оформлены в виде автоклавов проходного типа. Места ввода коммуникаций и соединения боксов между собой герметизируют, чтобы исключить возможность утечки аэрозолей, как при работающих вентиляторах, так и в случае их неисправности или перерыва в подаче электроэнергии.

Перед началом работы в боксе включают вентиляцию, проверяют наличие отрицательного давления по шкале боксового манометра, наличие запаса дезинфицирующих средств и загружают материал.

Время непрерывной работы ограничивают четырьмя часами, после которых устанавливают 30-60-минутный перерыв.

Защитные боксы III класса предназначены для работы с ПБА любого уровня опасности, являясь в этом отношении универсальными для всех современных микробиологических и вирусологических лабораторий.

Максимально изолированные лаборатории оборудуют боксами биологической защиты III класса. В них проводят исследование материала от больных людей с подозрением на особо опасное инфекционное заболевание, заражение культур ткани, членистоногих (на биомембране), биопробных животных (материалом из объектов окружающей среды, диких грызунов и членистоногих), заражение и вскрытие куриных эмбрионов, постановку серологических реакций с необеззараженными пробами. Исследование материала от больных с неясной этиологией, когда невозможно исключить наличие вирусов I группы патогенности, также проводят в БББ III класса.

В БББ III класса или отдельных боксированных помещениях проводят все манипуляции, связанные с высоким риском образования аэрозоля: центрифугирование, гомогенизация, измельчение, интенсивное встряхивание, обработка ультразвуком, вскрытие объектов с зараженным материалом, работа с большими объёмами и высокой концентрацией ПБА и др.

Микологические лаборатории также оборудуют БББ III класса, поскольку отдельные манипуляции при работе с возбудителями глубоких микозов требуют максимальной изоляции. Так, все манипуляции с культурами мицелиальной фазы, изучение выживаемости грибов во всех фазах проводят в БББ III класса. Не разрешается открывать пробирки и матрацы с посевами мицелиальной фазы грибов вне БББ.

При работе в БББ III класса сотрудники надевают противочумный костюм IV типа дополненный резиновыми перчатками.

Изоляторы отрицательного давления из мягкой пленки представляют собой в основном бокс биологической безопасности III класса. Эта конструкция выполнена в виде мешка из мягкой пленки, смонтированного и укрепленного на металлической раме. В переднюю стенку изолятора герметично заделаны резиновые перчатки плечевого типа. Ввиду недостаточной прочности его использование ограничено. Только хорошо обученный и опытный персонал может быть допущен к работе с этим оборудованием.

3. МЕТОДИЧЕСКИЕ ПРИЁМЫ И ОСОБЕННОСТИ РАБОТЫ С ВОЗБУДИТЕЛЯМИ I-II ГРУПП

ПАТОГЕННОСТИ

3.1. Организация рабочих мест и особенности методических приемов при посеве инфицированного Безопасность работ с возбудителями особо опасных инфекций обеспечивается строгим соблюдением правил работы, требованием к лабораторным помещениям и их оснащению (см. выше), обучением и тренировкой персонала, а также диспансерным наблюдением за состоянием здоровья сотрудников. К работе с ПБА допускаются лица не моложе 18 лет с высшим и средним медицинским, биологическим, ветеринарным образованием, которые окончили соответствующие курсы профессиональной переподготовки и не имеют противопоказаний к лечению специфическими препаратами и к работе в СИЗ. Сотрудников лаборатории, работающих с ПБА (кроме возбудителя холеры) и посещающих помещения «заразной» зоны, где ведутся исследования с заразным материалом, вакцинируют, предварительно проведя оценку уровня иммунитета одним из стандартных методов до и после вакцинации (ревакцинации). В исключительных случаях (наличие эффективных специфических средств лечения и длительный опыт работы с ООИ) к работе допускают лиц, имеющих медицинские противопоказания. Сотрудник лаборатории обязан немедленно сообщать руководителю подразделения о появлении симптомов заболевания, вызываемого возбудителем, с которым проводились исследования. В этом случае руководитель учреждения решает вопрос о необходимости изоляции и проведении специфического лечения.

Микробиологические лаборатории, в зависимости от их назначения, имеют тот или иной набор помещений: боксы с предбоксниками, комнаты для проведения серологических исследований и люминесцентной микроскопии, помещение для ПЦР-диагностики и др.

Боксы с предбоксами, где проводятся манипуляции с ПБА, должны быть достаточно просторны, оснащены только необходимыми лабораторной мебелью и приборами. У входной двери помещают смоченный дезинфицирующим раствором коврик. Входная дверь бокса и все объекты с ПБА обозначены знаком биологической безопасности. В предбоксах, оснащенных водопроводом и раковиной для мытья рук, желательно с краном ножного управления, персонал одевает и снимает СИЗ. На случай аварии в предбоксах предусмотрены емкости с дезинфицирующим средством и гидропульт.

Оснащение бокса должно способствовать предупреждению контакта исследователя с инфицированным материалом. Оборудование (в том числе лабораторные столы) изготавливается из материалов, непроницаемых для жидкостей, устойчивых к коррозирующему действию дезинфицирующих средств.

Некоторые виды лабораторной работы и использование того или иного оборудования могут создавать опасность заражения бактериолога. Обычная проволочная бактериологическая петля, являясь традиционным лабораторным инструментом, при неправильном и невнимательном использовании может приводить к образованию аэрозоля. При быстром прожигании петли с жидким инфицированным материалом происходит его вскипание, пленка лопается и образуется бактериальный аэрозоль. Для предотвращения этого явления предложены газовые и электрические приспособления для прожигания петли в экранированном пространстве. Безопасной альтернативой является применение пластиковых петель одноразового использования.

Предотвратить образование аэрозолей при обжиге бактериологической петли может применение правильной техники обеззараживания. Петлю подносят к пламени горелки так, чтобы между ней и оператором находилось пламя горелки. Осторожно нагревают сначала иглодержатель, затем саму петлю в нижней части пламени (где наиболее низкая температура) и постепенно переводят петлю в верхнюю часть пламени спиртовки. Таким образом, петлю прокаливают докрасна 2-3 раза.

Образованию аэрозолей при работе с бактериологической петлей способствует оставленное при изготовлении незамкнутым проволочное кольцо петли. Стандартная бактериологическая петля имеет диаметр замкнутого кольца 3 мм и, так называемый, хвостик, не превышающий 6 см.

Аварийная ситуация возникает, когда экспериментатор неправильно (без предварительного осторожного подсушивания) обжигает петлю с остатком агаровой бактериальной культуры: материал может обуглиться, отскочить от петли и упасть на стол. В этом случае необходимо прекратить работу, осмотреть поверхность стола, найти упавший комочек и убрать его с помощью пинцета и ватного тампона, смоченного в дезинфицирующем растворе, т.к. внутри комочка микроорганизмы остаются жизнеспособными. На место падения патогена накладывают свежий тампон с дезсредством на 1 час, а находящиеся на столе предметы обрабатывают дезинфицирующим раствором. Ватные тампоны, бывшие в употреблении, опускают в емкость для отбросов с дезраствором.

Не исключается образование бактериальных аэрозолей при посевах жидкой культуры и отборе с чашек Петри колоний микроорганизмов, если пользоваться не остывшей петлей. Во избежание этого достаточно работать одновременно двумя бактериологическими петлями, одна из которых остывает после прожигания, или применять одноразовый инструмент. Не рекомендуется остужать петлю о поверхность плотного агара с посевом во избежание разбрызгивания или гибели патогена, а также возможности его загрязнения посторонней микрофлорой, не заметной невооруженным глазом.

Остудить петлю можно прикосновением её к внутренней поверхности крышки чашки Петри.

Образование бактериальных аэрозолей возможно также при изготовлении мазков на предметных стеклах, постановке ориентировочной реакции агглютинации на стекле, смывах бактериальной культуры с поверхности агара, пипетировании инфицированного материала и других манипуляциях, наиболее часто применяемых в практике бактериологических исследований.

До начала работы с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность возбудителями инфекционных заболеваний I-II групп патогенности, следует подготовить всё необходимое.

На лабораторном столе справа от центра (условно «заразная» зона) размещают: фиксатор для мазков (банка с притертой или плотно закрывающейся крышкой с фиксирующей жидкостью), ёмкости с дезинфицирующими растворами для погружения отработанных предметных стекол, инфицированных отбросов, обработки рук, большой стерилизатор или высокий стеклянный цилиндр в металлическом корпусе для погружения использованных пипеток; от центра слева (условно «чистая» зона) помещают банки с предметными стеклами в 96 спирте, банку со стерильными и нестерильными ватными тампонами, чашки Петри с ватными тампонами, смоченными 70 спиртом (для текущей дезинфекции), бактериологические петли и иглы, пастеровские и градуированные пипетки, пинцет анатомический и скальпель, карандаш (ручка) по стеклу, спички. Все предметы на лабораторном столе расставляют таким образом, чтобы исключить перекрещивание рук в процессе работы и тем самым обеспечить удобство и безопасность манипуляций (рис. 7).

Рис.7. Оборудование лабораторного стола В центре стола на расстоянии не менее 30 см от края со стороны оператора размещают спиртовку на устойчивой подставке или горелку. Между работающим и спиртовкой на расстоянии не менее 10 см от края стола должна находиться широкая низкая кювета с дезинфицирующим раствором, над которой проводят все манипуляции с жидким материалом.

При работе с агаровой культурой и постановке некоторых лабораторных тестов вместо кюветы используют многослойные марлевые салфетки, смоченные дезинфицирующим средством.

Около бактериологического стола устанавливают бак с педалью или ведро для сбора незаразных отходов.

Все ёмкости, используемые в работе, маркируют.

На специальном столике организуют покраску мазков.

Все виды работ с ПБА проводят по принципу парности (не менее двух человек, один из которых врач или научный сотрудник).

В зависимости от целей и задач исследования врач (научный сотрудник) и лаборант заранее готовят всё необходимое для практических занятий. Для проведения посевов отбирают и тщательно осматривают лабораторную посуду, поскольку незамеченный дефект может стать причиной инфицирования посуды, рук, окружающих предметов. Каждую бактериологическую пробирку осторожно простукивают о твердую поверхность, чтобы исключить невидимые трещины.

Пробирки выбраковывают, если в стекле видны трещины, царапины, пузырьки воздуха. Колбы и флаконы также подлежат осмотру. Не используют сосуды со сколом в области горлышка. Тщательно осматривают посуду со средами. Если крышка чашки Петри с плотной средой запотела, её заменяют на новую, взяв со стерильной чашки. Визуально просматривают все среды на наличие посторонней микрофлоры. Пробирки со средами предварительно проверяют на целостность и размещают в штативы. Пробирки должны входить в штативы без усилий. Рекомендуют на дно штатива класть фильтровальную бумагу, что позволит быстро обнаружить нарушение целости пробирки при неосторожной работе. Если пробирки помещают в банку или стакан, то обязательно дно емкости выстилают слоем ваты или марли. Можно взять кружочек поролона. Все объекты, используемые для посева, маркируют: указывают название микроорганизма (материала), номер штамма (анализа), дату (при необходимости – время) проведения работы. В отдельных случаях указывают особенности штамма (антибиотикоустойчивость, вирулентность и др.). Надписи делают таким образом, чтобы они не мешали в работе: на пробирках – в средней части, флаконах и колбах – ниже горлышка, на чашках Петри – на донышке чашки по краю. Надписи должны быть четкими.

Необходимые для работы объекты с незаразным материалом (физиологический раствор, дистиллированная вода, бакпрепараты, реактивы) также маркируют.

Если посуда с питательными средами подписана, но ещё не засеяна и остаётся на лабораторном столе на какой-то срок, необходимо положить записку: «Подписано, но не засеяно».

Перед работой поверхность лабораторного стола протирают ватным тампоном, смоченным 70 спиртом.

С левой стороны стола, отступив от края, помещают среды и исследуемый материал. При необходимости засеять большое количество объектов на стол не ставят всё сразу.

Техника посева зависит от характера высеваемого материала, консистенции питательной среды и цели исследования. Жидкий материал берут петлей или пипеткой. Пипеткой пользуются в том случае, когда материал засевают в большом количестве или точно отмеряемом объеме.

При посеве жидкого материала в жидкие среды обжигают петлю, большим, указательным и средним пальцами левой руки берут пробирку с исследуемым содержимым ниже горлышка так, чтобы рука была сверху, но не мешала наблюдению за движением петли. Пробирку подносят к пламени спиртовки. Безымянным пальцем и мизинцем правой руки захватывают пробку и, прижимая её к ладони, вынимают. После забора материала горлышко пробирки обжигают, пробкуют и возвращают на прежнее место. Применяя такую же технику, проводят посев в пробирку материала, находящегося на петле. Аналогичным образом засевают флаконы и колбы.

Все манипуляции с заразным материалом проводят у пламени горелки строго над кюветой с дезинфектантом. При посеве в жидкие среды пробирку слегка наклоняют так, чтобы избежать выливания жидкости.

Во время работы бактериологическая петля должна постоянно находиться под визуальным наблюдением, чтобы исключить инфицирование верхней внутренней части пробирки или каких-либо предметов. Желательно оставлять остаток посевного материала прикосновением петли к внутренней стенке пробирки, флакона или колбы ближе к поверхности жидкости. При посеве агаровой культуры в жидкие среды необходимо тщательно растирать комочек посевного материала о внутреннюю стенку пробирки (флакона, колбы), постепенно смывая петлей микробную массу.

В случае попадания материала на внутреннюю верхнюю часть пробирки (флакона, колбы) перед пробкованием необходимо обжечь (прокалить) горлышко посуды, остудить и запробковать. Если пробка при этом обгорит, её следует заменить на новую стерильную.

При малейшем подозрении на прикосновение петли с заразным материалом к наружной поверхности посуды её обеззараживают, погружая в дезинфицирующий раствор.

При посеве исследуемого материала на пластинчатый агар чашку Петри держат в левой руке таким образом, что дно её лежит на ладони, а крышка слегка приподнята большим, указательным и средним пальцами (рис. 8). Крышку открывают с таким расчетом, чтобы можно было, не задевая края чашки и внутреннюю поверхность крышки, произвести посев петлей, пипеткой или шпателем. Таким образом, все манипуляции проводят под защитой крышки. Засеянную бактериологической петлей или шпателем чашку сразу переворачивают крышкой вниз и ставят на стол.

Рис.8. Посев заразного материала на пластинчатый агар 3.2. Пипетирование заразного материала При посеве бактериальной взвеси, титровании сывороток и проведении других исследований пользуются различными пипетками. Работа с пипеткой, как упоминалось выше, создает целый ряд возможностей образования бактериальных аэрозолей. В ряде случаев бактериолог может заразиться в результате ранения острыми краями или концами разбитой инфицированной пипетки. Наибольшую опасность представляет пипетирование ртом. Вместе с тем строгое соблюдение технических приёмов при проведении лабораторных исследований с помощью пипеток предупреждает или сводит до минимума наиболее распространенные аварийные ситуации. Основное правило при пипетировании – пользоваться специальными устройствами даже при работе с незаразным материалом (розлив физиологического раствора, титрование диагностических сывороток и др.).

Для работы с пипетками разработано и введено в практику много специальных приспособлений. Однако наибольше распространение получил резиновый баллон, герметично соединенный с резиновым шлангом, состоящим из трех отрезков (два по 80-90 см и один 30-40 см). Резиновые трубки соединены между собой двумя так называемыми контрольками из пастеровского стекла (4-5 см), рыхло заполненными серой ватой. Они способны задержать исследуемый материал при случайном его засасывании дальше пипетки. В просвет третьего отрезка шланга в 7-15 см от его конца вставлен хорошо опаянный равномерно круглый стеклянный шарик. Его диаметр строго соответствует просвету резиновой трубки. Для удобства работы баллон можно, но необязательно, поместить в деревянную оправу в виде ножной педали. Вместо резиновой груши рекомендуют брать помпу для надувания резиновых изделий.

Перед непосредственной работой смонтированное или не использованное в течение 2-3 дней пипетирующее устройство проверяют на незаразном материале (вода, физиологический раствор).

При пипетировании применяют различную лабораторную посуду, в том числе пипетки: стеклянные градуированные и неградуированные, одноразового использования, пастеровские, изготовленные в лабораторных условиях из стеклянных трубок (дрота) различного диаметра. Для особо точной мерной работы необходимы градуированные пипетки с указанием ГОСТа.

Пипетки должны быть абсолютно чистыми и хорошо обезжиренными. На стекле плохо обезжиренной пипетки при выливании содержимого остается большое количество капель, вследствие чего слитый объем жидкости не будет соответствовать тому количеству, которое указано на шкале деления.

Перед стерилизацией верхнее отверстие пипетки, которое должно быть равномерно оплавлено и не иметь сколов, рыхло заполняют ватой на 10-15 мм. Это необходимо, чтобы задержать заразный материал при случайном засасывании его до конца пипетки. Пипетки упаковывают в специальные металлические пеналы или заворачивают в бумагу индивидуально или по 5-10 штук, делая пометку на пакетах о расположении верхней части пипеток, и стерилизуют.

Необходимую для работы лабораторную посуду тщательно просматривают (см. выше), маркируют и расставляют на столе слева. Слева помещают пипетки, разводящую жидкость, исследуемый материал и др.

Правая часть стола остается свободной. Перед работой открывают стерилизатор с дезинфектантом.

Для того чтобы начать пипетирование необходимо нажатием ногой на баллон выпустить из него часть воздуха. При этом одновременно большим и указательным пальцами правой руки сдавливают стенку резинового шланга у бусинки, и в образовавшийся просвет воздух выходит из груши. После этого убирают ногу с резинового баллона. На пипетку надевают конец шланга и располагают ее между средним и безымянным пальцами правой руки. Между большим и указательным пальцами находится шланг с бусинкой, при этом мизинец и безымянный пальцы остаются свободными (рис.9). Левой рукой берут пробирку с жидким содержимым (исследуемый материал, сыворотка и др.), мизинцем и безымянным пальцами правой руки распробковывают её у пламени горелки. Конец пипетки опускают в жидкость и слегка нажимают большим и указательным пальцами на бусинку. В образовавшееся пространство поступает воздух, увлекая за собой материал. После того, как достаточное количество жидкости набрано, шланг над бусиной опускают и она закрывает просвет трубки. Воздух в неё больше не поступает, а жидкость в пипетке удерживается на нужном уровне. Осторожно, не касаясь внутренней стенки пробирки, вынимают пипетку и, после обжигания горлышка пробирки и последующего пробкования, ставят ее в штатив, далее берут ту пробирку, в которую переносят исследуемый материал. Осторожно, не касаясь стенок пробирки, вводят в неё пипетку.

Кончик пипетки опускают ниже уровня жидкости в пробирки и начинают осторожно выпускать содержимое пипетки. Можно сливать материал по внутренней стенке сосуда, надавливая ногой на резиновый баллон и одновременно расслабляя резиновый шланг у бусины. В результате давления на баллон воздух из него поступает в шланг и через щель над бусиной в пипетку, выдавливая из неё жидкость. После посева одновременно убирают ногу с баллона и отпускают бусину.

Осторожно вынимают пипетку, обжигают, пробкуют пробирку и возвращают её в штатив. После этого конец пипетки опускают в дезинфектант, находящийся в стерилизаторе, выпускают содержимое и набирают в пипетку на 2/3 объёма дезинфицирующего раствора.

Затем осторожно двумя руками снимают шланг пипетирующего устройства и легким движением руки затапливают пипетку.

Аналогичным образом засевают флаконы и колбы.

При посеве исследуемого материала с помощью пипетки на пластинчатый агар применяют метод раскатывания или рассева шпателем. После внесения материала чашку Петри, не переворачивая, необходимо поставить на салфетку, смоченную дезраствором, и погрузить пипетку в дезинфектант. Только после этого, держа чашку двумя руками, инокулированный материал осторожно раскатывают по поверхности среды до полного впитывания или распределяют его стерильным шпателем. Стерилизацию шпателя можно провести непосредственно перед рассевом. Шпатель помещают в стакан со спиртом и обжигают его перед непосредственной манипуляцией.

Очевидно, что технически сложно проводить посев пипеткой в пробирки, флаконы, колбы, поскольку в правой руке необходимо держать пипетку и пробку и одновременно работать левой.

Работа в паре более безопасна и удобна. Врач, проводящий пипетирование, садится справа, а помощник, распробковывающий пробирки, флаконы, колбы, распределяющий материал по агару, слева.

При работе с пипеткой надо внимательно следить за тем, чтобы заразный конец пипетки не пачкал горлышко посуды, чтобы с пипетки не падали капли заразного материала на стол и окружающие предметы. Необходимо, чтобы правая рука бактериолога всегда находилась в фиксированном неподвижном положении, а конец пипетки – над центром кюветы с дезраствором.

Категорически запрещается подносить пипетку с инфицированным материалом к огню или проводить её через пламя горелки.

В процессе пипетирования не допускаются резкие движения, чрезмерное оттягивание стенки шланга над бусиной, сильное нажатие ногой на баллон.

После окончания пипетирования конец шланга, в который вставлялась пипетка, протирают 70 спиртом, дезинфектантом или обрабатывают обжиганием после опускания в 96 спирт. Периодически всю систему обеззараживают кипячением.

Для работы ножным пипетирующим устройством необходим определенный навык, который обычно приобретается быстро. Ручное пипетирующее устройство более простое и кажется более удобным. Однако ручной баллон более опасен в работе, чем ножное устройство. Поскольку в нем нет предохранителя (бусины), очень трудно во время различных манипуляций с пипеткой, содержащей заразный материал, удерживать грушу в одной и той же степени сжатия. При малейшем нарушении этого условия заразный материал попадает в баллон или выпрыскивается наружу, образуя бактериальный аэрозоль.

3.3. Микроскопические методы исследования При микробиологической диагностике бактериальных инфекций используют различные методы, в том числе бактериоскопический. Он основан на изучении морфологических признаков возбудителя, тинкториальных свойств, особенностей локализации в тканях и клетках пораженного макроорганизма. Использование специальных методов окраски позволяет выявить некоторые морфологические структуры микроба (наличие спор, включений, капсул, жгутиков и др.).

В микробиологических лабораториях применяют как обычные методы оптической микроскопии окрашенных препаратов, так и специальные: в темном поле зрения, фазово-контрастный, люминесцентный и электронный. Темнопольная микроскопия применяется для обнаружения в неокрашенных препаратах (раздавленная или висячая капли) возбудителей сифилиса, возвратного тифа, лептоспироза и других болезней, а также для изучения подвижности микроорганизмов (например, холерного вибриона).

Приготовление мазков осуществляют на заранее подготовленном рабочем месте. На лабораторном столе должны находится только материалы и предметы, необходимые для данного исследования: изучаемый объект, пробирка с физиологическим раствором, бактериологическая петля, пастеровские пипетки, анатомический пинцет, банка с чистыми обезжиренными предметными стеклами, простой карандаш, спиртовка, чашка Петри, салфетка, емкость с дезинфектантом, кювета с дезраствором, на которую устанавливают специальный мостик для размещения предметных стекол.

Отдельно оборудуют место для окраски мазков.

Мазки для микроскопии готовят из культур микробов, выращенных в жидкой питательной среде или на агаре, различного клинического материала (кровь, мокрота, гной, моча, смывы из зева и носа и др.), органов трупа (животного, человека) и др.

На поверхность лабораторного стола расстилают марлевую салфетку, смоченную дезинфицирующим раствором. На салфетку помещают крышку от чашки Петри, на которую кладут предметное стекло. Предметное стекло или несколько стекол можно разместить на мостике. Предварительно на зашлифованном крае стекла простым карандашом делают необходимую маркировку (вид исследуемого материала, номер анализа, дату и др.).

Объекты, из которых предполагают делать мазки, располагают слева от спиртовки.

Техника приготовления препаратов определяется физическими свойствами исследуемого материала.

Жидкий материал наносят в центр предметного стекла бактериологической петлей и плавными круговыми движениями распределяют по поверхности в виде кружка диаметром 8-10 мм. Нельзя допускать резких прерывистых движений, которые приводят к разбрызгиванию заразного материала и образованию аэрозоля. Если мазок делают из агаровой культуры, то сначала на предметное стекло бактериологической петлей или пастеровской пипеткой наносят каплю или несколько капель (если на одном стекле делают несколько мазков) физиологического раствора. Затем бактериологической петлей, слегка прикоснувшись к посеву, забирают небольшое количество агаровой культуры и тщательно растирают ее в капле жидкости. Необходимо следить за тем, чтобы заразный материал не располагался близко к краям предметного стекла.

Приготовляя мазки из мокроты или гноя, посуду с исследуемой пробой располагают как можно ближе к предметному стеклу. Исследуемый материал переносят бактериологической петлей или стерильным анатомическим пинцетом на стекло и осторожно растирают в капле физиологического раствора. Категорически запрещается раздавливать исследуемый материал между двумя стеклами.

После подсушивания (на воздухе!) мазков стекла, размещенные на мостике, с помощью анатомического пинцета захватывают за край и над кюветой с дезинфицирующим раствором опускают в емкость с фиксирующей жидкостью. Аналогичным образом поступают с готовыми препаратами, находящимися в чашке Петри.

Категорически запрещается фиксировать мазки в пламени горелки, поскольку микроорганизмы при этом не погибают.

При погружении в фиксирующую жидкость нескольких предметных стекол с мазками, необходимо следить за тем, чтобы они не слипались, иначе не произойдет обеззараживание материала.

Пинцет после каждой манипуляции опускают в спирт, а затем обжигают. Крышку чашки Петри или мостик, которые использовали для приготовления препаратов, также дезинфицируют: мостик протирают влажным тампоном, смоченным в дезинфектанте, а чашку Петри погружают в дезинфицирующий раствор. То же самое делают с марлевой салфеткой. Использованный физиологический раствор подлежит обеззараживанию путем автоклавирования.

В качестве фиксирующей жидкости при исследовании материала, зараженного или подозрительного на зараженность бактериальными возбудителями I-II групп патогенности, используют метиловый или этиловый спирты, смесь Никифорова (равные объемы этилового спирта и эфира), ацетон, пары формалина.

Чаще всего препараты фиксируют в 96 этиловом спирте и в смеси Никифорова. Мазки из культуры микроорганизмов фиксируют не менее 20 мин; из материала, содержащего белковое вещество (мокрота, гной и др.), – не менее 40 мин; мазки-отпечатки органов – не менее 1 часа. Мазки из споровой культуры, материала, подозрительного на зараженность спорообразующими бактериями (например, возбудителем сибирской язвы), материала от больных с неясной этиологией необходимо фиксировать в 96 этиловом спирте, содержащем 3% Н2О2.

После окончания срока фиксации мазка предметное стекло вынимают пинцетом из фиксирующей жидкости и обжигают в пламени спиртовки.

Препараты для МФА вынимают из фиксирующей жидкости и не обжигают. В этом случае время фиксации мазков увеличивают на 5 – 10 минут.

Фиксированные мазки окрашивают. Метод окраски определяется целью и задачами исследования.

Фильтровальная бумага, использованная для просушивания стекол с мазками в процессе окрашивания, подлежит автоклавированию или обеззараживанию в дезинфектанте. Смывные воды (после обработки мазков) обеззараживают в соответствии с видом возбудителя.

Стекла с мазками после просмотра погружают в дезинфицирующий раствор.

Способы окрашивания мазков делятся на простые и сложные. Простая окраска позволяет быстро визуализировать морфологию микробов и их расположение в мазке.

Сложные или дифференциальные методы основаны на особенностях физико-химического строения микробной клетки. Они применяются для детального изучения структуры клетки, а также для характеристики и дифференциации одних видов бактерий от других.

Простой метод окраски.

Фиксированный мазок красят каким-либо одним красителем, например, фуксином водным (1-2 мин) или метиленовым синим (3-5 мин), промывают водой, высушивают с помощью фильтровальной бумаги и микроскопируют.

Окраска по Граму Метод окраски по Граму является самым универсальным из сложных способов окраски. Все бактерии по своему отношению к этому методу разделяются на грамположительные (грампозитивные) – окрашивающиеся по Граму (микробы сине-фиолетового цвета) и грамотрицательные (грамнегативные) – неокрашивающиеся по Граму (микробы красно-сиреневого цвета).

Окраска по Граму имеет важное дифференциальнодиагностическое значение и широко используется в микробиологии. К грамположительные микроорганизмам относятся стафилококки, стрептококки, возбудители дифтерии, сибирской язвы и др., к грамотрицательным – гонококки, менингококки, кишечная палочка, возбудители холеры, чумы, туляремии, бруцеллеза и др.

Основная ошибка, допускаемая при окраски по Граму, состоит в переобесцвечивании мазка этиловым спиртом. В этом случае грамположительные бактерии утрачивают первоначальную окраску генциановым фиолетовым и воспринимают окраску фуксином. Грамотрицательные микроорганизмы в свою очередь могут сохранять сине-фиолетовый цвет. Чтобы избежать этих ошибок необходимо строго соблюдать технику обесцвечивания мазка.

Окраска по Граму проводится следующим образом:

- на фиксированный мазок помещают полоску фильтровальной бумаги 2х4 см и наливают на нее карболово-спиртовый раствор генцианового фиолетового на – 2 мин;

- снимают бумажку, сливают остаток краски, не промывая препарат водой, наливают раствор Люголя на 1-2 мин;

- раствор Люголя сливают, предметное стекло с помощью пинцета погружают 2 – 3 раза в стаканчик со спиртом (до отхождения фиолетовых струек красителя);

- препарат тщательно промывают водопроводной водой;

- докрашивают мазок водно-спиртовым раствором фуксина в течение 2 мин;

- окрашенный препарат после промывания водой высушивают на воздухе или фильтровальной бумагой и микроскопируют.

Удобной модификацией метода является способ Синева, при котором пользуются заранее приготовленными полосками фильтровальной бумаги, пропитанными красками и затем высушенными. Полоски кладут на фиксированный мазок, смачивают водой и прижимают их пинцетом к стеклу. Излишнюю воду сливают. В остальном техника окраски аналогична оригинальному методу.

Выявление капсул по методу Бурри-Гинса.

На предметном стекле бактериологической петлей смешивают каплю взвеси микробных клеток с каплей туши и при помощи стекла со шлифованным краем делают мазок таким же образом, как мазок из крови, высушивают и фиксируют.

На мазок наносят водный растров фуксина на 1-2 мин, промывают водой, высушивают на воздухе и микроскопируют.

Бактерии окрашиваются в красно-сиреневый цвет, а неокрашенные капсулы контрастно выделяются на черном фоне.

Окраска спор по Пешкову.

Фиксированный мазок окрашивают синькой Леффлера в течение 20 с, нагревая стекло над пламенем горелки до закипания краски. Далее мазок промывают водой и докрашивают 0,5% водным раствором нейтрального красного в течение 30 с. Краску смывают водой. Мазок высушивают и микроскопируют.

Споры окрашиваются в голубой или синий цвет, вегетативные формы микробов – в розовый.

Окраска по методу Романовского-Гимзы.

Этот метод окраски применяют главным образом при микроскопии мазков-отпечатков из органов и мазков крови.

Краситель Романовского-Гимзы состоит из метиленового синего, эозина и азура, благодаря чему он окрашивает элементы крови, ткани органов, микроорганизмы в разные цвета. Перед окраской препаратов краситель разводят 10-20 раз дистилированной водой (рН 7,0 – 7,2).

Степень разведения меняется в зависимости от серии красителя и рН воды. Поэтому каждую новую серию краски рекомендуют проверять на контрольных мазках.

Фиксированный препарат помещают в чашку Петри мазком вниз на две подставки (из предметного стекла, разрезанного вдоль пополам, или двух спичек).

Краску подливают сбоку препарата так, чтобы мазок полностью соприкасался с краской. Окраска длится от 30 мин до одного или нескольких часов, после чего мазок промывают дистиллированной водой (рН 7,0 – 7,2) и высушивают на воздухе.

Можно проводить окрашивание препарата, погружая стекло в стаканчик с красителем.

Краситель Романовского-Гимзы окрашивает протоплазму форменных элементов ткани в голубоватосиний цвет, ядра клеток – в фиолетово-красный. Тела микробных клеток приобретают нежно-фиолетовый цвет. Например, в мазках-отпечатках органов погибших от туляремии грызунов хорошо видны нежнофиолетовые бактерии туляремии на фиолетово-красном или голубовато-синем фоне клеточных элементов ткани.

Приготовление раздавленной и висячей капли.

Для приготовления раздавленной капли используют хорошо обезжиренное стекло, так как на поверхности пыльных и жирных стекол микробы не фиксируются.

Для проверки чистоты стекла достаточно нанести на него каплю водопроводной воды или физиологического раствора. На чистом стекле капля растекается по всей поверхности, на жирном – дробится на множество мелких капель или приобретает шаровидную форму.

Обычно чистые обезжиренные стекла хранят в контейнере со спиртом или со смесью Никифорова, а перед приготовлением препаратов их извлекают пинцетом и насухо вытирают. Держат стекла пальцами за края.

На середину предметного стекла, помещенного на специальный мостик (см. выше), бактериологической петлей диаметром 3-4 мм или стерильной пастеровской пипеткой наносят каплю жидкого исследуемого материала (бульонная культура, моча, спинномозговая жидкость и др.). При исследовании агаровой культуры предварительно готовят взвесь микроорганизмов в небольшом количестве физиологического раствора.

Затем с помощью анатомического пинцета каплю накрывают чистым покровным стеклом таким образом, чтобы его края не выступали за края предметного стекла. Желательно разместить покровное стекло по отношению к предметному «ромбом».

При приготовлении висячей капли чистое покровное стекло помещают на крышку от чашки Петри, наносят в центр каплю исследуемого материала и накрывают его предметным стеклом с луночкой. Предварительно края луночки смазывают вазелиновым маслом. Предметное стекло с луночкой накладывают на покровное так, чтобы капля находилась в центре лунки. Затем стекло осторожно переворачивают и капля свисает в центре герметически закрытой полости лунки, что предотвращает ее высыхание.

Препараты висячей или раздавленной капли микроскопируют, слегка затемняя поле зрения, конденсор при этом опускают, регулируя поступление света вогнутым зеркалом.

При просмотре микроорганизмов в висячей капле под малым увеличением микроскопа (8х) находят край капли. Установив резкость изображения, поднимают вверх объектив и наносят на покровное стекло каплю иммерсионного масла. Под контролем зрения опускают иммерсионный объектив (90х) до легкого соприкосновения с маслом. Затем очень медленно, поднимая объектив, устанавливают фокус изображения и доводят четкость микровинтом. Если изображение не получено, все манипуляции повторяют вновь. При утрате ориентировки, наугад поднимать и опускать иммерсионный объектив запрещено, т.к. такой прием приводит к аварийной ситуации – раздавливанию стекла.

Если пользоваться сухим объективом, то вначале под малым увеличением (8х) находят край капли, устанавливают объектив 40х и под контролем зрения опускают объектив почти до соприкосновения линзы со стеклом (умышленно переходя фокусное расстояние).

Затем, наблюдая в окуляр, поднимают объектив вверх до появления изображения. Четкость устанавливают микровинтом.

После окончания просмотра препарата объектив следует высоко поднять и снять стекло с предметного столика.

Препарат с раздавленной каплей разбирают, проводя все манипуляции над емкостью с дезинфицирующим раствором. Анатомическим пинцетом слегка сдвигают покровное стекло за край предметного. Сдвинутый край покровного стекла захватывают пинцетом и осторожно отделяют от предметного. Покровное стекло с заразным материалом и предметное стекло с луночкой аккуратно опускают в дезинфектант. Пинцет обжигают в пламени спиртовки, предварительно смочив спиртом. Аналогичным образом разбирают камеру с висячей каплей.

В том случае, если луночка предметного стекла в процессе работы не инфицирована, его можно использовать для приготовления висячих капель из следующих проб. Вместе с тем, луночка считается условно заразной, поэтому не следует прикасаться к ней перчатками работника и предметами, находящимися на лабораторном столе, а по окончании работы предметное стекло с луночкой необходимо погрузить в дезраствор.

Проведение некоторых генетических, биохимических, вирусологических и других исследований возбудителей I – II групп патогенности, а также получение биомассы при производстве медицинских иммунобиологических препаратов предусматривают использование специальных методик, включая центрифугирование.

Наиболее часто в лаборатории используют типы центрифуг:

ЦУМ-1 (центрифуга угловая малогабаритная настольная) предназначена для разделения неоднородных жидких систем с удельной массой не более 2 г/ см3 (для полимерных материалов) и не более 1,5 г/см (для стеклянных пробирок) с максимальным объемом центрифугата 180 мл, скоростью вращения от 2000 до 8000 об/мин и фактором разделения 6000.

J2-21 (Beckman) – предназначена для высокоскоростного осаждения материала из жидкостей с удельной плотностью не выше 1,2 г/мл. Скорость вращения до 12000 об/мин.

Центрифугирование инфицированного материала связано с высоким риском образования аэрозоля. Во время работы центрифуги вращение ротора создает воздушные потоки, которые проникают в отверстие для вентиляции, в щели под крышкой центрифуги и т.д. При различных экстремальных (аварийных) ситуациях – разрушение сосуда (пробирки), выскакивание пробки, трещине в пробирке или флаконе, загрязнении наружной поверхности пробирки, инфицированный материал попадает в воздушные потоки, что приводит к образованию аэрозоля и широкому его рассеиванию во внешней среде. Образование аэрозоля создается также при открывании пробок и отсасывании из центрифужных емкостей жидкости.

Одно из основных требований по обеспечению биологической безопасности при центрифугировании заразного материала – проведение всех манипуляций в отдельном боксированном помещении в противочумном костюме I типа или оборудование лабораторий боксами ББ III класса. Боксы ББ, соединенные между собой в единую технологическую линию с герметично обработанными соединениями, являются оптимальными в режимном отношении, так как все манипуляции, связанные с опасностью заражения или контаминации (загрузка ротора, центрифугирование, извлечение пробирок и флаконов, проверка их на целостность), проводят в полной изоляции от окружающей среды. К работе с центрифугами допускают только обученный персонал.

Центрифугирование заразного материала рекомендуется проводить в металлических или пластмассовых стаканах, а также пробирках с безопасными завинчивающимися крышками или герметичными пробками.

Перед началом работы внутреннюю часть металлических или пластмассовых центрифужных стаканов осматривают на наличие шероховатостей на стенках.

Емкости для центрифугирования заполняют материалом на объема и тщательно уравновешивают. При неполной загрузке ротора пробирки размещают симметрично, чтобы обеспечить равномерное распределение пробирок относительно оси вращения ротора. После распределения емкостей с заразным материалом в роторе, центрифугу герметично закрывают зажимами и включают. Необходимую скорость центрифугирования устанавливают постепенно.

После окончания работы центрифугу открывают только через 20-30 мин (время, необходимое для полного осаждения аэрозоля). Аккуратно извлекают емкости (пробирки, контейнеры) с образцами и просматривают их. При отсутствии повреждений обрабатывают дезраствором только внутреннюю поверхность центрифужной камеры. Продолжительность центрифугирования и характер материала регистрируют в специальном журнале.

3.5. Основные методы изучения биологических свойств микроорганизмов КОН-тест Этот тест позволяет отличить грамотрицательные микроорганизмы от грамположительных. В основе метода лежит способность клеточной стенки грамположительных бактерий сохранять целостность при воздействии гидроокиси калия, тогда как клеточная стенка грамотрицательных микроорганизмов разрушается при указанном воздействии.

Исследуемую односуточную агаровую культуру суспендируют в капле 3% раствора КОН в чашке Петри.

При положительной реакции, свойственной грамотрицательным микроорганизмам, жидкость в капле становится вязкой, нити слизи тянутся за петелей на 0,5-2 см.

Определение типа расщепления глюкозы (OF-тест) Испытуемую культуру засевают уколом в столбик среды Хью-Лейфсона в двух пробирках. Посевы проводят иглой (или маленькой петлей), не доводя ее до дна пробирки на 5-6 мм. Затем на поверхность среды одной из пробирок наслаивают стерильное вазелиновое масло (0,5-1 мл). Посевы инкубируют при 37 С в течение 1-4 сут. Изменение цвета среды в обеих пробирках на желтый свидетельствует о расщеплении глюкозы путем ферментации (F), изменение аналогичного характера только в пробирке, не залитой вазелиновым маслом, - об окислительном процессе (О2), а сохранение зеленовато-оливкового цвета среды в обеих пробирках - об отсутствии метаболизма глюкозы.

Определение цитохромоксидазы (Erlich P., 1885) На поверхность 18-20-часовой агаровой культуры наносят каплю 1% водного раствора пара-диметилфенилендиамина и добавляют каплю 1% спиртового раствора L-нафтола. При положительной реакции через 1-3 мин появляется ярко-синее окрашивание, обусловленное образованием индофенола синего.

Цитохромоксидазу (по Эрлиху) можно определить также с помощью коммерческого бумажного индикатора (СИБ).

Реакция на нитриты В 1 мл бульона Хоттингера и бульона Хоттингера с 0,1% азотнокислого калия (KN03) засевают петлю агаровой одно-двухсуточной культуры. Бульон должен быть предварительно проверен на отсутствие нитритов реактивом Грисса. Посевы инкубируют при 28°С и через 3 сут в обе пробирки прибавляют по 0,5 мл реактива Грисса. В положительных случаях сразу же появляется розовое окрашивание, что указывает на наличие в посевах нитритов. В первом случае они образуются при окислении аммиака через промежуточную стадию нитратов, во втором – впроцессе редукции нитратов.

Посев на комбинированные среды Посев на комбинированные среды проводят вначале по скошенной части в виде прямой линии, затем в толщу агарового столбика и заканчивают по скошенному агару штрихом. Следует иметь в виду, что укол в толщу агарового столбика не должен достигать дна, с тем, чтобы не нарушать условия для сбраживания глюкозы в относительно анаэробных условиях. Посевы инкубируют при 37 С. Результаты учитывают не позднее, чем через 18-24 ч.