«НА ПРАВАХ РУКОПИСИ CТАРКОВА Дарья Андреевна МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ Mycobacterium avium subspecies hominissuis 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени ...»

Условия проведения ПЦР для амплификации локусов TR 10, TR 32 и MATR-9: 5 мин – 95 °C, 35 циклов: 30 сек. – 95 °С, 30 сек – 57 °С, 45 сек – 72 °С, 10 мин – 72 °С.

Условия проведения ПЦР для амплификации локусов TR292, TRX3, TR25, TR3, TR7: 5 мин – 95 °C, 35 циклов: 30 сек. – 95 °С, 30 сек – 58 °С, 45 сек – 72 °С, 10 мин – 72 °С.

При постановке ПЦР в качестве контроля применяли ДНК штаммов M.

avium subsp. avium ATCC 35712.

Продукты ПЦР разделяли в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Для определения «размера» продуктов амплификации в гель вносили маркеры молекулярной массы 100 bp DNA Ladder (ООО «Интерлабсервис», г.

Москва) и 50 bp (GE Healthcare, США). Результаты визуализировали с помощью системы документации гелей «GelDoc» (BioRad, США). Число тандемных повторов в локусах рассчитывали согласно таблицам 5 и 6 молекулярных масс ампликонов.

Таблица 5 - Размеры ампликонов 8 локусов VNTR Число повторов Ожидаемые размеры в локусе ПЦР-продукта локуса VNTR, п.н.

Число повторов Ожидаемые размеры ПЦР-продукта локуса MATR, п.н.

в локусе MATR- и VNTR-профиль каждого штамма записывали в виде набора цифр, соответствующих числу повторов в локусах в следующем порядке: TR292, TRX3, TR25, TR47, TR3, TR7, TR10, TR32 и MATR-1, MATR-2, MATR-3, MATR-4, MATR-5, MATR-6, MATR-7, MATR-8, MATR-9, MATR-11, MATR-12, MATR-13, MATR-14, MATR-15, MATR-16.

Степень родства между штаммами M. avium оценивали с использованием алгоритма Neighbor Joining (NJ) и графически отображали в виде дендрограммы, построенной с учетом полиморфизма локусов MATR-VNTR на сайте URL:

http://www.miru-vntrplus.org.

2. IS1245-RFLP-типирование Генотипирование изолятов M. avium с помощью метода IS1245-RFLP проводили с использованием стандартного протокола J. van Embden et al. (1993).

Исходным материалом для выделения хромосомной ДНК служили клинические изоляты M. avium и лабораторный штамм IWGMT49, выращенные на среде Левенштейна-Йенсена. Процедура выделения хромосомной ДНК описана в п. 2.3. Энзиматическое расщепление (рестрикцию) ДНК проводили с помощью эндонуклеазы PvuII (Thermo Scientific, Life Science Research). В микропробирки объемом 0,5 мл вносили по 20 мкл смеси, содержавшей 12 мкл раствора рестриктазы PvuII (GE Healthcare Life Sciences, США), приготовленного в соответствии с инструкцией производителя, и 8 мкл пробы ДНК. Пробирки инкубировали 3 часа при 37°C, охлаждали, погружая в ледяную крошку на мин. К содержимому пробирок (продукты рестрикции ДНК) добавляли 2 мкл бромфенолового синего, перемешивали пипетированием и вносили по 20 мкл в лунки приготовленного заранее 0,83% геля (1,98 г агарозы, 240 мл раствора 1хТВЕ, 25 мкл 10% бромистого этидия) в следующем порядке: в первую, среднюю и последнюю лунки геля вносили контроль (продукт рестрикции ДНК штамма M. avium IWGMT49), в остальные – рестрицированную ДНК культур исследуемых клинических штаммов M. avium. Электрофорез проводили в растворе 1хТВЕ, 32 ч при постоянном напряжении 42V для разделения фрагментов рестрикции, различающихся по молекулярной массе. По окончании гель помещали на трансиллюминатор. Множество светящихся полос - фрагментов рестрикции во всех дорожках геля свидетельствовало о хорошем качестве рестрикции проб ДНК.

Далее осуществляли перенос фрагментов рестрикции ДНК на мембрану с последующей гибридизацией с зондом IS1245 (по Саузерну). Гель выдерживали в денатурирующем растворе (0,5М NaOH и 1,5M NaCl) при комнатной температуре 30 мин, затем помещали на мембрану Hybond N+ (GE Healthcare Life Sciences, США) размером 17,5х20 см, расположенную на подложке, и фиксировали в блоттере (Appligene, Франция). Перенос ДНК M. avium из геля на мембрану осуществляли в течение 1,5–2 ч при давлении 50-55 мм водяного столба, постоянно увлажняя гель раствором 2хSSC (0,3М натрия хлорид и 0,03M натрия цитрат). По окончании переноса ДНК гель удаляли, мембрану однократно промывали тем же раствором и подсушивали при комнатной температуре на листе фильтровальной бумаги. ДНК фиксировали на мембране, облучая ультрафиолетом на трансиллюминаторе в течение 4 мин.

Зонд IS1245 (участок последовательности IS1245 размером 427 пн), меченный дигоксигенином (DIG), получали путем амплификации ДНК штамма [34].

Рисунок 2 - Схематическое изображение 1313 п.н. инсерционного элемента IS1245. На схеме показаны: фланкирующие инвертированные повторы (IR);

праймеры Р1 и Р2, используемые для амплификации 427 п.н. зонда IS1245; начало и конец открытой рамки считывания, кодирующей транспозазу [34].

ПЦР осуществляли в термоциклере Bio-Rad С1000 Thermal Cycler (США).

Конечный объем смеси составлял 50 мкл: 10х буфер для ПЦР – 10 мкл; MgCl2 - мкл (конечная конц. 1,5 мМ); 10хdNTP (DIG-labeling mix) – 5 мкл; Р37 – 2,5 мкл;

Р38 – 2,5 мкл; Taq-полимераза (Силекс, Москва) – 0,3 мкл; ДНК – 0,5 мкл;

стерильная дистиллированная вода до 50 мкл.

Суть реакции заключалась в увеличении количества копий IS1245 ДНК M.

avium IWGMT49 при следующих условиях: 95 °C - 3 мин; 35 циклов: 94 °C - мин, 65 °C - 1 мин, 72 °C- 1 мин; 72°C- 10 мин.

Гибридизацию продукта ПЦР с фиксированными на мембране фрагментами рестрикции хромосомной ДНК MAH, содержащими участок элемента IS1245, осуществляли при 60°C, 12 ч в гибридизационной печи (GE Healthcare Life Sciences, США).

Продукты гибридизации на мембране визуализировали колориметрически с использованием конъюгата анти-DIG щелочной фосфатазы, нитротетразолия синего и бром-хлор-индолилфосфата. Полученные профили (паттерны) гибридизации штаммов представляют собой наборы различающихся по количеству и молекулярной массе фрагментов рестрикции хромосомной ДНК, содержащих участок нуклеотидной последовательности IS1245.

Мембрану сканировали и сохраняли файл в формате TIF для последующего компьютерного анализа профилей IS1245 и создания банка данных. Полученные профили IS1245-RFLP анализировали с использованием пакета программ BioNumerics®5.1 (Applied Maths, Бельгия). Степень родства между штаммами MAH использованием иерархического алгоритма связывания UPGMA (Unweighted Pair Group Method of Averages) на основе расчета коэффициента сходства Дайса (Dice coefficient) по формуле:

где nAB – число общих фрагментов рестрикции ДНК у штаммов А и В; nA – число фрагментов у штамма А; nB – число фрагментов у штамма В.

Оценка вариабельности локусов VNTR, MATR и дискриминирующей способности схем типирования Для количественной оценки вариабельности локусов и дискриминирующей способности схем MATR-VNTR- и IS1245-RFLP-типирования рассчитывали индекс разнообразия Хантера-Гастона (Hunter Gaston Diversity Index [HGDI]) [35] с помощью алгоритма, URL: http://www.hpa-bioinformatics.org.uk/cgibin/DICI/DICI.pl. Уровень дискриминации методов рассчитывали по формуле:

где N - общее число штаммов в выборке, s - число типов выявленных данным методом, n – число штаммов относящихся к j-тому типу.

Секвенирование ДНК использованием коммерческого набора реагентов GFX PCR DNA и Gel Band purification kit (GE Healthcare Life Sciences, США) согласно инструкции. Реакцию лимитированного секвенирования проводили с использованием Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Kits (PE Biosystems, version 2.0) и 4 пмоль секвенировали с праймерами 10F и 16F [40, 84]. Капиллярный электрофорез выполняли на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3100 (Life Technologies, США). Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакетов программ Sequence Scanner v1.0 (Life Technologies, США) и Unipro UGENE 1.12 (Россия).

Личный вклад автора в получении результатов Автором составлен план исследования, проведен аналитический обзор литературы, сформирована выборка изолятов микобактерий, выполнен весь объем молекулярно-генетических исследований. Культивирование и идентификация микобактерий, в том числе с использованием тест-системы GenoType Mycobacterium (Hain Lifescience, Германия), проведены совместно с Т.Ф. Оттен и В.Ю. Журавлевым - сотрудниками отдела лабораторной диагностики ФГБУ «СанктПетербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии»

Минздрава России (СПбНИИФ). Лимитированное ДНК-секвенирование проведено совместно с А.Б. Комиссаровым (ФГБУ НИИ гриппа Минздрава РФ). Автор провела анализ, статистическую обработку и систематизацию полученных лично данных, сформулировала выводы и практические рекомендации.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Изоляты микобактерий, полученные от больных микобактериозом, принадлежали к M. avium subspecies hominissuis.

2. Клинические изоляты M. avium subspecies hominissuis, полученные от больных микобактериозом, были неоднородны по 8 локусам VNTR и 15 локусам MATR.

3. Для дифференциации клинических изолятов M. avium subspecies hominissuis и установления генетического родства между ними оптимальна схема типирования по 14 локусам MATR и VNTR с последующим анализом кластеров методом IS1245-RFLP.

Степень достоверности и апробация результатов Результаты исследования полиморфизма ДНК 90 клинических изолятов M.

avium, в частности локусов VNTR и MATR, полученные с использованием современных высокочувствительных и специфичных молекулярно-генетических методов, воспроизводимы. Экспериментальные данные подвергнуты обработке и систематизации с помощью методов описательной статистики, пакетов компьютерных программ и информационных баз данных и представлены в виде таблиц и графических изображений.

Диссертация апробирована на заседании Ученого совета Федерального бюджетного учреждения науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» (протокол № 5 от 21 мая 2014 г.).

Основные результаты исследований доложены и обсуждены на Российских и международных конференциях: «Health and environment: environmental problems and infectious diseases», 19 марта 2012 г., г. Осака, Япония; 34th congress European society of mycobacteriology, 30 июня-03 июля 2013 г., г. Флоренция, Италия; международная конференция «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций», 5-7 июня г., Санкт-Петербург; 8-я Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика», 18-20 марта 2014 г., Москва; научно-практическая конференция «От эпидемиологии к диагностике инфекционных заболеваний: подходы, традиции, инновации», 23-25 апреля 2014 г., Санкт-Петербург; 35th congress European society of mycobacteriology, 29 июня- июля 2014 г., г. Вена, Австрия.

Публикации По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Структура и объем диссертации Основной текст диссертации изложен на 99 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, рекомендаций и приложения. Диссертация иллюстрирована 11 таблицами и рисунками. Список литературы содержит 94 источников, в том числе 5 отечественных и 89 - зарубежных авторов.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Микобактерии относят к единственному роду Mycobacterium семейства Mycobacteriaceae. В настоящее время род Mycobacterium включает более видов, подвидов и комплексов, и их число продолжает расти [27, 50].

Исторически сложилось подразделение микобактерий на типичные (классические возбудители туберкулеза человека и животных) и «атипичные»

микобактерии, которые различают по морфологическим и физиологическим свойствам [1, 2, 3, 4, 85].

К «типичным» представителям рода микобактерий относят бактерии Mycobacterium tuberculosis complex. Данная группа включает возбудителей туберкулеза человека и животных (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum и др.).

Несмотря на различия фенотипических характеристик и вариабельность круга «хозяев» среди млекопитающих, они представляют один из наиболее ярких примеров генетической гомогенности (99,7–99,9% гомологии) и консерватизма важнейших структурных генов, включая гены, кодирующие многие внутриклеточные энзимы, 65-kD протеин теплового шока, 16-kD антиген и другие белки [77, 78].

Для «атипичных микобактерий» в 90-е годы ХХ столетия был предложен более нейтральный термин – «нетуберкулезные микобактерии» (НТМБ). К НТМБ относят сапрофитные и условно-патогенные виды. НТМБ обитают в почве и воде, за что получили название убиквитарных (вездесущих) микобактерий, которые относительно контагиозны и слабопатогенны для лабораторных животных [21, 28, 55].

В настоящее время восемь видов медленно растущих НТМБ – M. avium, M.

intracellulare, M. chimaera, M. colombiense, M. arosiense, M. bouchedurhonense, M.

marseillense и M. timonense – относят к Mycobacterium avium complex (МАС) [15].

Еще E. Runyon (1943 г.) установил, что речь идет о комплексе родственных микобактерий, среди которых имеются вирулентные (М. avium), способные вызывать заболевания, и авирулентные (М. intracellulare), которые, как было показано впоследствии, также могут быть вирулентными для животных и человека [4].

Ранее считалось, что один из типичных представителей МАС - М. avium – является возбудителем «птичьего» туберкулеза (отсюда и наименование возбудителя) и редких заболеваний других животных. Типовой штамм М. avium АТСС 25291 был выделен от больной курицы [88]. В качестве потенциального возбудителя болезней человека М. avium стали рассматривать несколько десятилетий назад [31].

M. avium – медленнорастущие кислотоустойчивые микобактерии, которые являются типичными обитателями окружающей среды [21]. Вместе с тем, M.

avium являются оппортунистическими патогенами диких и домашних животных (свиней и др.), птиц и человека. Особенно широко M. avium представлены в природных источниках соленой и пресной воды, а также в питьевой и водопроводной воде, госпитальных системах горячего водоснабжения [30, 32, 33, 38, 59, 80] и биопленках, которые M. avium легко формируют благодаря своим гидрофобным свойствам и устойчивости к широкому спектру дезинфектантов и антибиотиков [39, 74, 82]. Биопленки, возможно, являются основным фактором распространения микобактерий в питьевой воде [28, 94]. Генетические детерминанты, отвечающие за способность М. avium формировать биопленки, в настоящее время до конца не выявлены. Однако установлено, что важную роль в данном процессе играют продукты генов кластера GPL (отвечает за синтез гликопептидолипида, который является одним из основных компонентов клеточной стенки микобактерий). Так, у штаммов М. avium с мутациями в генах sukA (кодирует 6-оксидегидрогеназу), pstB (протеин синтетаза), а также генах, участвующих в синтезе белков цикла трикарбоновых кислот, нарушается способность к формированию биопленок [94].

Имеются данные о выделении M. avium из аэрозолей, которые образуются в результате скопления мельчайших капель воды, что способствует поддержанию жизнеспособности микробных клеток. Такие аэрозоли возникают как над природными (реки, озера), так и над искусственными (закрытые плавательные бассейны, сауны и др.) источниками пресной воды. Будучи устойчивыми к хлору, бактерии M. avium в составе аэрозолей представляют угрозу для обслуживающего персонала современных водно-развлекательных и оздоровительных комплексов, поскольку могут вызывать повреждения дыхательных путей различного характера [29].

контаминировать медицинские инструменты и оборудование (бронхоскопы, стоматологические сверла и т.д.), что является результатом неправильной дезинфекции или наличия возбудителя в системе водоснабжения. Сырые помещения, почва и пыль также являются источниками M. avium [7].

В пределах вида М. аvium выделяют несколько подвидов, которые имеют специфические геномные паттерны, ассоциированные с определенным кругом хозяев, экологическими и географическими характеристиками штаммов.

Наибольшее клиническое значение имеют микроорганизмы M. avium subsp.

hominissuis, вызывающие микобактериоз у людей (в т.ч., ВИЧ-инфицированных) и животных (свиней). M. avium subspp. avium (MAA), silvaticum (MAS) и paratuberculosis (MAP) поражают в основном птиц и/или диких и домашних животных [15, 28, 88].

Степень патогенности (потенциальной способности микроорганизма вызывать инфекционное заболевание) каждого штамма определяется набором факторов вирулентности. При этом известно, что у М. avium и других НТМБ отсутствует корд-фактор – главный среди многочисленных факторов вирулентности МБТ.

Полагают, что вирулентность микобактерий туберкулезного комплекса связана с семейством генов, контролирующих экспрессию белков PE (Pro-Glu) и PPE (Pro-Pro-Glu) на поверхности макрофагов. Недавно у трех подвидов M. avium - MAH, MAA и MAP были выявлены 12 PE и 49 PPE ортологов [52]. Доказано, что инактивация участка гена PPE (Mav 2928) у штаммов MAH приводит к нарушению способности микроорганизма реплицироваться внутри макрофагов при сохранении способности к проникновению. Однако до настоящего времени функции большинства белков семейства PE/PPE у штаммов M. avium изучены недостаточно [42, 52].

Подобно М. tuberculosis, М. avium является внутриклеточным паразитом, который проникает в клетки, используя комплементарные рецепторы CR1, CR3, CR4 и маннозный рецептор макрофагов. Попав в макрофаг, микроорганизм препятствует созреванию эндосомы и нарушает слияние фагосом и лизосом (незавершенный фагоцитоз) [44, 51, 73]. Данный микроорганизм способен также к размножению в клетках простейших (амебы) [22].

Существует зависимость между вирулентностью М. avium, лекарственной устойчивостью и морфологическими типами колоний (прозрачность и цвет на среде с Конго красным). Так, показано, что гладкие прозрачные колонии (не окрашиваются на среде с Конго красным) доминируют при первичном посеве на питательных средах и содержат бактерии М. avium, резистентные к большинству антибиотиков и вирулентные для лабораторных животных [25]. Непрозрачные колонии М. avium, преобладающие при последующих пассажах культуры in vitro, содержат менее вирулентные бактерии [4, 13]. Установлено, что за переключение морфотипов колоний ответственна двухкомпонентная регуляторная система генов mtrAB [13].

способствуют развитию инфекционного процесса у лабораторных животных. При этом из всех видов НТМБ, М. avium обладает наибольшей вирулентностью [4, 65].

Показана разная степень вирулентности штаммов М. avium, выделенных от больных микобактериозом, для морских свинок. Штаммы М. avium низкой вирулентности практически не вызывали у животных нейропаралитических симптомов; средняя и высокая степени характеризовались выраженной симптоматикой (паралич задних конечностей и гибель животных) [4].

Исследование антигенных свойств штаммов М. avium, выделенных от больных СПИД, выявило преобладание серотипов 4, 6, 8 и 11, которые характеризовались большей вирулентностью, чем другие серотипы в опытах in vitro и на животных [4, 72].

Микобактериоз (лат. mycobacteriosis) — инфекционное заболевание животных и человека, возбудителями которого являются представители большой группы нетуберкулзных микобактерий (НТМБ) – «других (нежели возбудители туберкулеза и лепры) микобактерий», согласно МКБ-10 (1993).

Заболеваемость микобактериозом среди лиц, перенесших туберкулез, в среднем в десять раз превышает этот показатель среди не имевших в анамнезе туберкулеза легких [4].

Микобактериоз – одно из самых частых осложнений СПИД: у 20% больных, несмотря на профилактическое лечение, в течение года развивается диссеминированная форма инфекции, а у нелеченных больных этот показатель в два раза выше [4, 75].

Среди основных клинических проявлений микобактериоза чаще всего встречается поражение легких, главным образом, у пожилых лиц, имеющих профессиональные заболевания легких (пневмокониоз и силикоз), а также у больных, излеченных от туберкулеза и микоза органов дыхания. У ВИЧинфицированных и больных СПИД в основном развиваются диссеминированные заболевания с неблагоприятным прогнозом [1, 4, 54].

По данным ряда авторов, потенциальными возбудителями микобактериоза человека являются от 10 до 24 видов НТМБ, среди которых наиболее распространены представители вида М. avium [1, 4].

Резервуаром М. avium являются объекты окружающей среды, включая госпитальные системы горячего водоснабжения. Ряд авторов указывают на существование общих источников инфицирования и возможность передачи возбудителя от свиней к человеку [42, 45].

Повышен риск инфицирования у людей, работающих в тесном контакте с сельскохозяйственными животными и птицей.

Однако вопрос о передаче возбудителя от человека к человеку до сих пор остается открытым.

В США, Австралии, Японии и ряде стран Европы М. avium считается самым распространенным возбудителем микобактериоза человека [16, 40, 43, 55, 61]. В нашей стране случаи заболевания микобактериозом до недавнего времени носили спорадический характер, что не позволяло составить их эпидемиологическую характеристику. Однако немногочисленные исследования свидетельствуют о том, что, например, на территориях Санкт-Петербурга и Ленинградской области возбудители микобактериоза по видовому составу существенно не различались – более половины заболеваний вызывали М. avium. Только за период 2011-2013 г.г.

в Санкт-Петербурге от пациентов выделено 450 НТМБ, среди которых штаммов (53,3%) были идентифицированы как М. avium [4]. Также отмечено, что в центрах горнодобывающей промышленности (г. Норильск) и тяжелой металлургии (г. Череповец) выделение М. avium значительно превышало средние показатели. На других территориях в структуре НТМБ отмечалось уменьшение удельного веса М. avium и увеличение доли других видов [4].

По данным OBrien D. и соавт. М. avium – более частая причина заболевания у ВИЧ-инфицированных, нежели М. intracellulare [61]. Отчасти это можно объяснить тем, что входными воротами для М. avium служит не только респираторный (как в случае М. intracellulare), но и желудочно-кишечный тракт.

Бактерии М. avium, попадая с пищей или водой в полость рта, способны сохраняться в кислой среде желудка и поражать слизистую кишечника, вызывая бактериемию и вторичное поражение костного мозга и селезенки [56].

За последние десять лет сформировалась тенденция к росту числа случаев заболевания микобактериозом, вызванного МAH, что связывают с такими факторами как рост распространенности иммуносупрессивных состояний, в особенности ВИЧ-инфекции, «предрасположенность» (обусловленная генетически), повышение вирулентности штаммов возбудителя, а также с появлением новых диагностических тестов [1, 41, 55, 92].

Хронические заболевания легких, сходные с туберкулезом, являются самыми частыми клиническими проявлениями микобактериоза. Симптомы поражений легких, обусловленные МAH, как правило, не отличаются от таковых при туберкулезе. Рентгенологическая картина также не позволяет дифференцировать поражения легких, вызванные МAH, от поражений, вызванных классическими микобактериями туберкулезного комплекса [87, 92].

У иммунокомпетентных лиц МAH вызывают не только легочную патологию. Так, лимфадениты – наиболее частые клинические проявления инфекции, вызванной МAH у детей. При этом поражаются подчелюстные и околоушные лимфатические узлы [87, 88, 92].

1.4.2 Микробиологическая диагностика микобактериоза Верификация диагноза микобактериоза требует неоднократного выделения чистой культуры микобактерий с последующей идентификацией возбудителя [2, 3, 4].

Для выявления микобактерий группы МАС и дифференциации их от остальных НТМБ и M. tuberculosis complex проводят обычную обработку клинического материала и микробиологическое исследование, которое включает следующие этапы:

1. Микроскопическое исследование (мазок из мокроты, окраска по ЦилюНельсену и ауромином-родамином);

2. Посев на питательные среды: Левенштейна-Йенсена, Финна II и Миддлбрука 7Н10, а также – элективные;

3. Идентификация выделенной культуры (оценка скорости роста при температуре 22 С, 37 С и 45 С, пигментообразования, биохимических свойств);

4. Определение лекарственной чувствительности выделенной культуры [3, 4].

микробиологического исследования длительна и осуществляется с помощью набора малодоступных и недостаточно специфичных биохимических тестов. И лишь недавно для этой цели стали использовать молекулярно-генетические микобактерий. Метод характеризуется быстротой и простотой в исполнении, 100% чувствительностью и специфичностью, поэтому он стал рутинным во многих диагностических лабораториях [3, 4].

идентификации и классификации видов, входящих в род Mycobacteria, является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), которая основана на анализе состав высокомолекулярных миколовых кислот клеточной стенки микобактерий. Однако несмотря на преимущества (быстрота проведения исследования, высокая специфичность и воспроизводимость), метод ВЭЖХ требует значительных экономических затрат и специально обученного персонала, поэтому используется в основном только в микробиологических референслабораториях [1, 2].

1.4.3 Лекарственная чувствительность М. avium Известно, что лечение микобактериоза, вызванного М. avium, является достаточно сложным вследствие природной множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) к большинству противотуберкулезных и других антибактериальных препаратов, обычно не применяющихся для терапии туберкулеза [1, 4, 13]. При исследовании механизма МЛУ М. avium установлено, что полисахариды внешнего слоя клеточной стенки препятствуют диффузии химиотерапевтических препаратов внутрь клетки, поэтому условия, способствующие нарушению ее целостности, приводят к повышению лекарственной чувствительности микроба. Такие препараты как кларитромицин, азитромицин, рифабутин, этамбутол, амикацин и фторхинолоны теряют свою эффективность при раздельном действии, поэтому лечение микобактериоза, зачастую, требует использования комбинации из нескольких препаратов, хирургического вмешательства или сочетания обоих методов [1, 67]. Попытки лечения больных с диссеминированными процессами, вызванными М. avium, в большинстве случаев оказываются безуспешными [4].

Данные о генах и мутациях в них, оказывающих влияние на возникновение ЛУ штаммов М. avium, малочисленны [13, 67].

Благодаря полной расшифровке нуклеотидной последовательности генома штамма M. avium 104 стало возможным его использование в качестве референсного для сравнения с участками или целыми последовательностями других геномов, а также поиска полиморфных участков, которые могут быть использованы для внутривидовой дифференциации возбудителя микобактериоза.

M. avium 104 был выделен от больного СПИД с диссеминированной формой инфекции [71, 88]. Нуклеотидная последовательность хромосомной ДНК данного штамма (5475491 пар нуклеотидов) насчитывает около 5313 генов, которые входят в состав функциональных групп, занимающих 88% потенциальной кодирующей емкости генома. Из них, 5120 генов кодируют белки, 50 генов кодируют стабильную РНК. Информация о полной нуклеотидной последовательности (сиквенсе) генома штамма M. avium 104 доступна в GenBank (accession no. NC008595). Хромосомная карта штамма M. avium 104, построенная нами, представлена на рисунке 3.

Имеющиеся в составе генома последовательно расположенные открытые рамки считывания (Open Reading Frame, ORF) определяют термином «геномные острова» (genomic island, GI) [10, 17].

Геномные острова содержат мобильные элементы (IS-последовательности, профаги); регуляторные элементы транскрипции, в частности, семейства TetR, регулирующие экспрессию гена устойчивости к тетрациклину; различные опероны гена mce, обеспечивающего проникновение в клетки млекопитающих;

опероны гена drrAB, кодирующие устойчивость к антибиотикам доксорубицину и даунорубицину, что является серьезной проблемой при лечении инфекций, вызванных M. avium у больных СПИД [9, 14, 17, 19].

На рисунке 3 представлены следующие обозначения: внешняя окружность – шкала в п.н.; внешнее кольцо показывает кодирующие участки на плюс-цепи (темно-зеленые), второе кольцо – кодирующие участки на минус-цепи (светлозеленые); третье кольцо (серого цвета) показывает гены с известными функциями;

четвертое кольцо (красного цвета) отображает все кодирующие последовательности ДНК (включая гены, кодирующие гипотетические белки).

Указатели: – отображает повторяющиеся инсерционные последовательности - инсерционные последовательности IS1311; - локализация локусов IS1245;

тандемных повторов TR и MATR. Гистограмма в центре показывает % (G+C) (желтый - 50%).

В результате исследований, проведенных J. Philalay с соавт. (2004) обнаружено, что два гена – pks12 (Маа1979) и Maa2520 – принимают участие в формировании МЛУ штаммов М. avium. В результате инсерционной мутации ципрофлоксацину, кларитромицину, пенициллину и рифампицину. Они не образовывали лекарственно-устойчивых колоний, по сравнению с их диким предшественником, и являлись чувствительными к минимальной ингибирующей гипотетические белки клеточной стенки, которые имеют высокую степень гомологии с белками M. tuberculosis и M. leprae, и, возможно, выполняют роль ее стабилизаторов [67].

Мутации в гене pks12 (Маа1979) М. avium приводят не только к увеличению лекарственной чувствительности ко всем вышеперечисленным препаратам (что, возможно, является результатом увеличения проницаемости клеточной стенки), но также изменению морфологии колоний (шероховатый тип). Продукт гена pks12 (ген поликетидсинтазы) штамма М. avium 104 на 87% гомологичен таковому микобактерий туберкулеза, у которых кодирует поликетиды, необходимые для синтеза фтиоцеролдимикоцерозата (DIM) – одного из основных компонентов клеточной стенки M. tuberculosis, обеспечивающих проницаемость [67].

1.5.2 Молекулярная эволюция и геномный полиморфизм Экспрессия ключевых антигенов и факторов вирулентности, которые необходимы для выживания микроорганизма во внешней среде и в организме хозяина, опосредована инсерциями/делециями и инверсиями участков генома [17].

Единичные нуклеотидные замены (англ., Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) – наиболее распространенный тип геномных перестроек, обуславливающий генетическое разнообразие микроорганизма. В результате исследования конститутивных генов (housekeeping) домашнего хозяйства (recF, sodA, aspB, gnd1, lipT, pepB, gnd2, est, hsp65, groEL1) четырех подвидов M. avium методом MLSA (Multilocus Sequence Analysis) установлено, что изоляты MAH имеют наибольшее количество нуклеотидных замен (синонимичных и несинонимичных) в данных генах. Различные варианты рекомбинационных событий между аллелями в геноме MAH привели к формированию гетерогенности популяции в целом [71].

Сравнительный анализ геномов M. avium subsp. hominissuis 104 и M. avium subsp. paratuberculosis К-10 показал наличие протяженных делеций LSPs (Large Sequence Polymorphisms), которые обуславливают различия между геномами данных подвидов. Изначально выявлено 14 регионов LSPs (LSPA1- LSPA14), присутствующих в геноме MAH 104, но не характерных для MAP К-10.

Впоследствии в геноме MAH 104 было обнаружено еще 11 LSPs, которые отсутствовали у MAP К-10 [17, 76].

Изучение геномного полиморфизма, основанное на выявлении филогенетически информативных маркеров SNPs и LSPs, позволило взглянуть на фундаментальные основы генетического разнообразия М. avium и установить филогенетическое родство между подвидами М. avium [36, 71, 88].

Модель эволюционного развития четырех подвидов М. avium основана на оценке вариабельности генома MAH по сравнению с геномами MAA, MAP и MAS.

Перестройки протяженных участков (LSPs), замены отдельных нуклеотидов (SNPs), обуславливающие эволюцию генома, привели к селективному разделению микроорганизмов с учетом их адаптационной способности к широкому кругу хозяев. Полагают, что предковым является клон MAH, от которого берут начало две ветви независимых друг от друга эволюционных событий: одна ветвь ведет к формированию «птичьих» подвидов MAA и MAS, другая – к подвиду MAP (крупный рогатый скот и овечий тип) (Рисунок 4) [71].

Рисунок 4 - Модель эволюционного развития М. avium (Rindi L. et al., 2013).

Секвенирование области ITS гена 16S-23S rRNA выявило восемь SNPsсеквоваров MAH (Mav-A – Mav-H). Примечательно, что существует зависимость между SNPs-секвоварами штаммов MAH и вирулентностью: так, секвовар Mav-A выделяли как от больных микобактериозом, так и от источников окружающей среды и животных, в то время как секвовар Mav-B выделяли исключительно от больных СПИД с диссеминированной формой инфекции. Оба секвовара являлись продуцентами большего количества гемолизина по сравнению с секвоварами остальных типов. Напротив, MAP, MAS и MAA, принадлежали к единому секвовару Mav-A [60, 71, 88].

Горизонтальный перенос генов (Horizontal Gene Transfer, HGT) – динамический процесс, являющийся важным механизмом эволюции генома прокариот. Поступление чужеродной ДНК в клетку посредством конъюгации, трансдукции и трансформации позволяет микроорганизму приобретать новые свойства, которые, зачастую, дают виду селективные преимущества при воздействии жестких условий окружающей среды. Ярким примером является обмен генетическим материалом, например, генами резистентности к антибиотикам и детерминантами вирулентности [62].

Известно, что у таких видов как M. tuberculosis, M. bovis и M. leprae способность к горизонтальному обмену генетической информацией и рекомбинации, контролируемой геном recA, до сих пор дискутируется, однако в настоящее время получены убедительные данные о возможности горизонтального переноса генов у НТМБ. Так, анализ нуклеотидных последовательностей кластера GPL (высоко консервативный 5'-регион, располагающийся между генами mtfB и gtfB) штаммов М. avium различных серотипов (2151, 724, 104) выявил мозаичную структуру этого участка у штамма М. avium 2151: одна часть идентична последовательности М. avium 724, а другая – М. avium 104. Подобная идентичность блоков GPL М. avium 2151, 724 и 104 может свидетельствовать о горизонтальной передаче и гомологичной рекомбинации участков ДНК [48].

Однако механизм обмена хромосомной ДНК (конъюгация, трансформация, трансдукция) у М. avium остается неясным [68].

Известно, что у М. avium, М. intracellulare и М. scrofulaceum имеются родственные плазмиды, которые способны к самостоятельной репликации. Так, среди плазмид М. avium и М. intracellulare обнаружена конъюгативная плазмида pVT2, что свидетельствует о возможности конъюгативного пути передачи ДНК в популяциях МАС. Описана конъюгативная плазмида pMA100, в состав которой входил интактный инсерционный элемент IS1245. Данная плазмида была выделена из смешанной культуры М. avium-М. kansasii, полученной от ВИЧпозитивного пациента. В результате RFLP-анализа выявлено наличие IS1245 у штаммов М. kansasii, что свидетельствует о способности плазмиды pMA100 к межвидовому переносу IS1245 от М. avium к М. kansasii. В экспериментах in vitro был подтвержден конъюгативный перенос плазмиды pMA100 не только между М.

avium и М. kansasii, но и между М. avium и M. bovis BCG Moreau [68, 69].

Передача ДНК может происходить также в процессе трансформации, природная способность к которой была открыта у М. avium [68].

происходить и путем трансдукции посредством бактериофагов, которых у микобактерий известно более 250 [48].

Таким образом, существование различных механизмов горизонтального обмена генетическим материалом и функциональной гомологичной рекомбинации у НТМБ не вызывает сомнения, однако требует дальнейших доказательств в отношении М. avium.

Идентификацию наиболее часто встречающихся видов микобактерий осуществляют с помощью ДНК-стриповой технологии GenoType®Mycobacterium CM/AS (Hain Lifescience, Германия), AccuProbe (GenProbe, США) [4], однако, определение подвида М. avium представляло проблему ввиду 97% сходства геномов некоторых подвидов [17].

геноидентификации М. avium и других видов НТМБ используют анализ полиморфизма структурных генов rpoB (контролирует синтез бета-субъединицы РНК-полимеразы), gyrB (ответственен за синтез бета-субъединицы фермента ДНК-гиразы), secA1 (кодирует белок Sec1, обеспечивающий транспорт белков через цитоплазаматическую мембрану), recA (принимает участие в процессах рекомбинации ДНК, индукции SOS-ответа и SOS-репарации), sodA (кодирует последовательности рибосомной РНК) и область ITS гена 16S-23S rRNA (транскрибируемая последовательность ДНК, разделяющая активные участки гена 16S-23S rRNA) [6, 26].

Также для видовой идентификации в качестве генетической мишени используют видоспецифический участок гена hsp65 - одного из основных факторов патогенности Mycobacterium, кодирующего белок теплового шока (heat shock protein) молекулярной массой 65kDa [18, 57].

рестрикционного анализа для идентификации микобактерий – PCR-restriction enzyme analysis (PRA)-hsp65. Амплифицированный в ходе ПЦР участок гена hsp65 обрабатывают рестриктазами BstEII и HaeIII; полученные фрагменты рестрикции анализируют с помощью электрофореза в агарозном геле. Это позволяет идентифицировать виды микобактерий, отличающиеся друг от друга набором фрагментов рестрикции [83]. Однако недостатком данного метода является наличие идентичных профилей рестрикции данного участка у некоторых видов НТМБ, включая M. avium.

Для определения подвидов M. avium удобным инструментом является использование различных видоспецифических инсерционных элементов (IS901, IS900, IS1245). Принято считать, что специфические последовательности IS901 и IS900 имеются лишь в геномах штаммов MAA (IS901), MAP (IS900) и MAS (IS901), выделяемых от животных и птиц, но не МАН [11, 20, 24, 26, 49, 88]. Элемент IS1245 присутствует в геномах всех подвидов M. avium, за исключением MAP, и не характерен для M. intracellulare. Поэтому отсутствие продуктов амплификации свидетельствовать о принадлежности изученных штаммов M. avium к подвиду hominissuis. Однако ряд зарубежных авторов отмечали наличие IS901 у некоторых изолятов MAH, выделенных от больных микобактериозом людей в Японии, Германии, Чехии и Франции [37, 63, 72, 79]. Таким образом, выявление мобильных элементов IS901 и IS900 для определения подвида M. avium представляется оправданным с учетом географического происхождения исследуемых штаммов микобактерий.

Благодаря полной расшифровке нуклеотидных последовательностей генома нескольких штаммов М. avium, стало известно, что существуют полиморфные участки, которые могут быть использованы не только для внутривидовой идентификации, но и дифференциации штаммов (генотипирования) возбудителя.

В пределах большинства биологических видов существуют значительные различия между отдельными штаммами, что можно доказать при использовании использования каждого метода специфична [40, 45, 72].

Сопоставление ДНК-паттернов штаммов возбудителя, выделенных от больных с установленными эпидемиологическими связями и несвязанных, является ключевым звеном при проведении молекулярно-эпидемиологических исследований. Совпадение профилей ДНК возбудителя, полученных с помощью одного и того же высокоразрешающего метода генотипирования, позволяет доказать принадлежность изолятов к единому штамму и обосновать общность источника инфекции.

Применение молекулярно-генетических методов позволило установить в большинстве случаев отсутствие эпидемиологических связей между заболеваниями микобактериозом, что свидетельствует о роли объектов окружающей среды в качестве главного источника инфицирования человека М.

avium. Так, показано совпадение профилей генотипирования ДНК штаммов М.

avium, выделенных от пациентов и из источников пресной воды, таких как питьевая водопроводная вода, в том числе, госпитальных систем водоснабжения.

Сообщают о генетическом родстве между изолятами М. avium, полученными от человека и свиней, что может свидетельствовать об общем источнике инфицирования или о возможной передаче возбудителя от животных к человеку (Рисунок 5) [43]. Однако вопрос о передаче возбудителя от человека к человеку до сих пор остается открытым.

Рисунок 5 – Возможные пути заражения М. avium [T. Iwamoto (2012), personal Полиморфизм генетических локусов VNTR (Variable Number Tandem Repeat), содержащих различное число тандемных повторов, используется в качестве маркера для дифференциации штаммов M. avium.

Вариабельность локусов VNTR, отражающая микроэволюцию генома, возникает в результате любых изменений минисателлитных последовательностей ДНК - коротких (10-100 п.н.) тандемных повторов (Tandem Repeat, TR), расположенных, как правило, между структурными генами [81]. Количество этих повторов может варьировать у разных штаммов, что и определяет общую протяженность локуса. Поскольку длина повторяющихся единиц известна, то по размеру полученного в ходе ПЦР ампликона можно рассчитать количество VNTR-копий в данном локусе. Число тандемных повторов в определенном локусе определяет мультилокусный числовой профиль штамма.

воспроизводимым (100%) и простым в исполнении. Цифровой формат данных позволяет легко сравнивать данные генотипирования, полученные в разных лабораториях.

До недавнего времени для дифференциации изолятов MAH использовали восемь локусов VNTR (TR292, TRX3, TR25, TR47, TR3, TR7, TR10, TR32), которые первоначально были описаны у M. avium subsp. paratuberculosis К10 [84].

Учитывая невысокую степень вариабельности большинства из восьми локусов VNTR для типирования штаммов M. avium subsp. hominissuis, японские исследователи предложили 15-локусную схему, которая включала локусы MATR (Mycobacterium Avium Tandem Repeats): 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16.

Анализ in silico выявил высокую гомологию последовательностей TRX3 и MATRTR292 и MATR-2, TR10 и MATR-9 [40].

Для анализа штаммовой вариабельности M. avium также используют инсерционные последовательности – мобильные IS-элементы (англ., insertion sequence – встраивающаяся последовательность) IS1245 и IS1311 [20, 23, 46, 81].

Мобильные элементы IS1245 и IS1311, имеющие высокую степень родства (85%) [23, 47], являются представителями семейства инсерционных элементов IS256 [53], впервые описанного C. Guerrero с соавт. в 1995 г., является специфичным для генома M. avium и кодирует фермент транспозазу [34]. IS (1414 п.н.) представлен множественными копиями, что свидетельствует о наличии «горячих точек» (сайтов интеграции) для их встраивания.

Круг «хозяев» IS1245 ограничивается подвидами M. avium subspp.

hominissuis, avium и silvaticum и не характерен для M. avium subsp. paratuberculosis и M. intracellulare [66]. В составе хромосомы подавляющего большинства клинических изолятов M. avium, как правило, представлено до нескольких десятков копий IS1245. Однако встречаются штаммы, лишенные данного элемента [40].

Использование IS1245 в качестве маркера для анализа ДНК M. avium генотипирования M. tuberculosis методом RFLP (англ., Restriction Fragment Length Polymorphism – полиморфизм длин рестрикционных фрагментов), предложенным в качестве «золотого» стандарта, благодаря своей высокой дискриминирующей способности [88].

последовательности IS1245 и их расположения в геноме M. avium. В процессе обработки рестриктазой PvuII геномная ДНК M. avium распадается на несколько фрагментов, количество и длина которых зависят от количества и локализации копий IS1245. Затем фрагменты разделяют путем электрофореза в агарозном геле.

Визуализацию осуществляют методом блот-гибридизации по Саузерну с меченными пероксидазой ДНК-зондами, комплементарными фрагменту IS1245.

Таким образом, для каждого штамма получают набор фрагментов рестрикции (гибридизационный паттерн) [89, 90, 91].

При помощи RFLP-анализа с использованием инсерционных элементов IS1245 и IS901 были обнаружены значительные различия между изолятами M.

avium, полученными от разных источников [90]. Так, штаммы, выделенные от птиц, характеризовались малым числом копий IS1245 и присутствием элемента IS901, тогда как изоляты, полученные от человека и свиней, напротив, были представлены полиморфными многокопийными паттернами IS1245 (более восьми) и отсутствием элемента IS901. Полученные данные легли в основу положения о существовании эволюционно различных подвидов M. avium, обозначенных как M. avium avium (изоляты, полученные от птиц) и M. avium hominissuis (изоляты, полученные от человека и свиней) [24, 26, 58, 72]. Более того, были продемонстрированы значительные различия в вирулентности этих генетически близкородственных подвидов. Установлено, что штаммы M. avium subsp. avium (IS901+), выделенные от больных птиц и других животных являются гораздо более вирулентными, чем штаммы M. avium subsp. hominissuis (IS901–), полученные от ВИЧ-позитивных больных [36, 46]. Вирулентность штаммов, содержащих элемент IS901, была подтверждена экспериментально [24, 63, 65].

Мобильный элемент IS1311 (1317 п.н.), также относящийся к семейству IS256 [53], встречается у подвидов M. avium avium, M. avium hominissuis и M.

avium paratuberculosis [93] и видов M. intracellulare, M. malmoense и M.

scrofulaceum [47]. Принимая во внимание достаточно широкий круг «хозяев»

этого элемента, можно предположить, что IS1311 является эволюционно более «древним» [93].

Использование обоих элементов (IS1245 и IS1311) для генотипирования методом RFLP повышает степень дискриминации исследуемых штаммов [23, 46].

Однако, несмотря на высокую дискриминирующую способность, к числу недостатков данного метода можно отнести длительность и трудоемкость анализа, особые требования к качеству и количеству бактериальной ДНК.

Сложность интерпретации результатов IS1245-RFLP-типирования связана с определенной долей субъективности при оценке мультибендовых паттернов, содержащих более 20 фрагментов рестрикции, поскольку разрешающая способность метода в этом случае оказывается недостаточно высокой.

В геноме MAH выявлены также другие инсерционные элементы, которые практически не изучены. IS1626 (1418 п.н.) встречается у клинических изолятов MAH и имеет высокую степень сходства с последовательностью элемента IS900.

Элемент IS1613 также встречается у штаммов MAH, выделенных от ВИЧпозитивных пациентов. Последовательности IS666 (1474 п.н.) и IS999 (1347 п.н.) также встречаются в геноме штаммов MAH, выделенных от человека [71, 88].

Присутствие различных инсерционных элементов в геномах подвидов M. avium представлено в таблице 7 [88].

Таблица 7 - Присутствие инсерционных элементов в геноме M. avium различных подвидов Наименование Семейство IS Существуют также более короткие повторяющиеся последовательности, которые могут использоваться для дифференциации штаммов MAH.

Таким образом, применение молекулярно-генетических методов MATR- и VNTR-типирования, IS1245- и IS1311-RFLP-типирования позволяет проводить комплексное исследование геномного полиморфизма штаммов MAH для оценки структуры популяции и эпидемиологической диагностики микобактериоза [40, 70, 84, 86]. При этом для предварительной дифференциации штаммов MAH целесообразно использовать MATR- и VNTR-типирование в качестве первичного, скринингового метода с последующим анализом MATR- и VNTR-кластеров методом IS1245-RFLP для установления эпидемиологических связей между случаями заболевания.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Из 120 изолятов МАС, 90 (72 – получены от больных микобактериозом с неустановленными эпидемиологическими связями, в т.ч. 27 ВИЧ-позитивных; - выделены однократно от пациентов с подозрением на туберкулез) были GenoType®Mycobacterium CM/AS.

Дальнейшее исследование образцов ДНК M. avium c помощью метода PRA– hsp65 с использованием рестриктаз BstEII и HaeIII, с одной стороны, подтвердило их видовую принадлежность, с другой стороны, выявило неоднородность изолятов (Рисунок 6).

Так, паттерны BstEII всех изученных штаммов и референс-штамма M. avium ATCC 35712 были однородны и содержали два фрагмента рестрикции ДНК размерами 235 пар нуклеотидов (п.н.) и 210 п.н. (Рисунок 6 а).

Напротив, паттерны рестрикции HaeIII штаммов M. avium оказались неоднородными: 83 (92.2 %) изученных штаммов и референс-штамм M. avium ATCC 35712 содержали два фрагмента - 130 п.н. и 105 п.н., остальные штаммы имели дополнительный фрагмент 60 п.н. (Рисунок 6 б).

Рисунок 6 - Профили рестрикционных фрагментов участка гена hsp65.

(а): М1 – маркер длин фрагментов ДНК «100 bp Ladder»; 1 – паттерн рестрикции BstEII 90 штаммов M. avium и референс-штамма M. avium ATCC 35712. (б): М2 – маркер длин фрагментов ДНК «50 bp Ladder»; 1 – паттерн рестрикции HaeIII 83 штаммов M. avium и референс-штамма M. avium ATCC 35712; 2 – паттерн рестрикции HaeIII 7 штаммов M. avium, имеющих дополнительный фрагмент рестрикции.

2.1.2 Определение подвида M. avium путем детекции инсерционных Все 90 штаммов M. avium были отнесены к подвиду hominissuis, поскольку, в отличие от штаммов M. avium subsp. avium ATCC 35712 и M. avium paratuberculosis K10, не содержали мобильных элементов IS901 и IS900, о чем свидетельствовало отсутствие продуктов амплификации специфических фрагментов ДНК при постановке ПЦР.

2.2 Оценка аллельного полиморфизма штаммов M. avium subsp. hominissuis (МАН) с использованием вариабельных локусов VNTR и MATR 2.2.1 Генотипирование штаммов MAH с использованием восьми Аллельный полиморфизм штаммов MAH оценивали методом VNTRтипирования по 8 вариабельным локусам, содержащим тандемные повторы TR292, TRX3, TR25, TR47, TR3, TR7, TR10, TR32.

В результате мультилокусного VNTR-типирования у 90 штаммов МАН было выявлено 17 вариантов профилей (типов) VNTR. Степень родства между штаммами различных VNTR-типов отражена на дендрограмме (Рисунок 7).

Как видно из рисунка 7, девять (10,0%) штаммов МАН имели индивидуальные 8-значные числовые профили VNTR. Восемь (40,0%) вариантов профилей с идентичными числовыми профилями из 17 VNTR-типов представлены кластерами Ma81- Ma88, в состав которых входил 81 (90,0%) штамм.

Наиболее крупный кластер Ma84 включал 46 (51,1%) штаммов с числовым профилем 22221128; кластер – Ma83 с числовым профилем 24221128 включал штаммов (14,4%); остальные кластеры содержали два (Ma81), три (Ma82, Ma85, Ma86), четыре (Ma88) и семь (Ma87) штаммов МАН (Рисунок 3.2). При этом в состав кластеров входило большинство штаммов, полученных от больных микобактериозом – 80,2% (65 из 81), в том числе ВИЧ-позитивных – 88,8% (24 из 27).

Рисунок 7 - Дендрограмма VNTR-профилей 90 штаммов M. avium subsp.

обследовании пациентов на туберкулез. Кластеры (Ma8) с идентичными числовыми профилями выделены прямоугольниками.

Cледует отметить, что VNTR-профили изолятов большинства российских кластеров (Ma83, Ma82 и Ma85) MAH описаны и в Финляндии у изолятов MAH, полученных от больных микобактериозом людей и от свиней [86]. В частности, VNTR-профили кластеров Ma83 и Ma82 имели сходную долю в российской и финляндской популяциях MAH (P>0,05): Ma82 – 3,3% и 6,9%, Ma83 – 14,4% и 17,2%, соответственно. В то же время, профиль 25221128 (кластер Ma81) явно доминировал в Финляндии (24,1% против 2,2%, P=0,001), тогда как наиболее распространенный профиль 22221128 (кластер Ma84) российских штаммов был выявлен лишь у 6,90% изолятов из Финляндии (P0,100).

Сравнительная оценка дискриминирующей способности 8- и 15-локусных схем типирования представлена в таблице 10.

Таблица 10 - Дискриминирующая способность схем VNTR- и MATR типирования 90 штаммов MAH Как видно из таблицы 10, число кластеров в обеих схемах типирования существенно не различалось, однако увеличение общего числа профилей в случае MATR-типирования (n=35) по сравнению с 8-локусной схемой VNTRтипирования (n=17) объясняет более высокий индекс разнообразия 15-локусной схемы типирования (HGDI 0,806).

Таким образом, с помощью набора стандартных биохимических тестов, ДНК-стриповой технологии (GenoType®Mycobacterium CM/AS, Hain Lifescience) и метода PRA–hsp65 была установлена принадлежность 90 из 120 чистых культур медленнорастущих кислотоустойчивых микобактерий к виду M. avium.

Дальнейшая идентификация на основе детекции инсерционных элементов IS901 и IS900 позволила выявить принадлежность штаммов M. avium к подвиду hominissuis. Результаты исследования 90 российских штаммов MAH с помощью VNTR-и MATR-типирования неоднородность. При этом высокий уровень кластеризации штаммов, повидимому, был обусловлен относительно невысокой дискриминирующей способностью как 8, так и 15 локусов VNTR и MATR соответственно.

ГЛАВА 3. ОПТИМИЗАЦИЯ СХЕМЫ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ M. avium subsp.

hominissuis С УЧЕТОМ АЛЛЕЛЬНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ЛОКУСОВ

VNTR И MATR

Таким образом, идентичность трех локусов в обеих схемах типирования позволила исключить дублирующие локусы MATR-2, MATR-3 и MATR-9 и в дальнейшем использовать комбинированную схему MATR-VNTR-типирования штаммов MAH, включающую 20 локусов.

Сопоставление значений индекса разнообразия Хантера-Гастона для каждого из 20 локусов (12 - MATR и 8 - VNTR) показало, что наиболее информативными» были 14 локусов, а именно: TR292, TRX3, TR25, TR47, TR10, MATR-1, MATR-4, MATR-5, MATR-6, MATR-8, MATR-11, MATR-14, MATR-15, MATR-16.

дискриминирующей способности от 20-локусной (HGDI 0,821), но была более эффективной, чем 8-локусная VNTR- (HGDI 0,714) и 15-локусная MATR- (HGDI 0,806) схемы типирования штаммов МАН (Таблица 11).

Таблица 11 - Дискриминирующая способность различных схем MATR-VNTRтипирования 90 штаммов MAH Таким образом, оценка дискриминирующей способности каждого локуса по отдельности и схем VNTR (8 локусов)- и MATR (15 локусов)-типирования выявила наиболее «информативные» локусы и позволила создать оптимизированную 14-локусную схему типирования российских штаммов МАН, которая была более эффективной (HGDI 0,821), чем 8-локусная (HGDI 0,714) и 15-локусная (HGDI 0,806) схемы.

В результате типирования по 14 локусам MATR-VNTR у 90 штаммов МАН было выявлено 36 вариантов профилей. Степень родства между штаммами различных MATR-VNTR-типов отражена на дендрограмме (Рисунок 11).

Как видно из рисунка 11, индивидуальные 14-локусные профили MATRVNTR имели 28 (31,1%) штаммов; 62 (68,9%) штамма с идентичными числовыми профилями были представлены кластерами Ma141- Ma148.

Наиболее крупный кластер Ma146 включал 37 (41,1%) штаммов с числовым профилем 22222223145443; кластеры Ma142 (24222213145443) и Ma (25332423124222) включали по семь (7,7%) штаммов соответственно, остальные содержали 2-3 штамма.

Таким образом, анализ полиморфизма 14 локусов VNTR-MATR позволил выявить доминирующий профиль 22222223145443, характерный для штаммов МАН, выделенных от людей на территории Северо-Запада России.

Следует отметить, что все семь штаммов кластера Ma148 имели «усеченный» локус TR10 (MATR-9) - аллель 2 (Рисунок 11) и формировали кластеры Ma87 и Ma159 при 8- и 15-локусном типировании соответственно.

Рисунок 11 - Дендрограмма MATR-VNTR-профилей 90 штаммов M. avium subsp.

hominissuis. HIV+ - ВИЧ-инфицированные. • - штаммы, выделенные однократно при обследовании пациентов на туберкулез; 3 - условное обозначение «усеченного» локуса MATR-16; 2 - условное обозначение «усеченного» локуса TR-10; Кластеры (Ma14) с идентичными числовыми профилями выделены прямоугольниками.

Для анализа генетического родства и установления филогенетических связей между штаммами на основе полиморфизма 14 локусов MATR-VNTR был использован алгоритм минимального связывающего дерева (Рисунок 12).

Как видно из рисунка 12, подавляющее большинство генетически близкородственных штаммов - 75,6% (68 из 90), имевших сходные 14-локусные профили (различия в числе копий касались не более двух локусов), входили в состав доминирующего клонального комплекса 1, который существенно (по локусам) отличался от остальных штаммов прочих комплексов.

Это может свидетельствовать о единстве происхождения и клональной экспансии на территории Северо-Запада России штаммов доминирующего кластера Ma146 (n=37), имеющих идентичный профиль (22222223145443), который можно рассматривать в качестве предкового по отношению к остальным.

Рисунок 12 – Минимальное охватывающее древо (Minimum spanning tree) профилей VNTR-MATR (14 локусов: TR292, TRX3, TR25, TR47, TR10, MATR-1, MATR-4, MATR-5, MATR-6, MATR-8, MATR-11, MATR-14, MATR-15, MATR-16) клинических штаммов M. avium subsp. hominissuis. Числовой профиль (число повторов в каждом из 14 локусов) показан у каждого узла. Размеры узлов пропорциональны числу изолятов с одинаковым генотипом. Линии между узлами и цифры показывают изменения, касающиеся: одного локуса (1) - сплошные жирные, двух локусов (2) - сплошные тонкие, трех и более локусов – различные варианты прерывистых линий. Родственные генотипы сгруппированы в клональные комплексы (clonal complex) 1-4, выделенные цветом и обозначенные цифрами.

ГЛАВА 4. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛИМОРФИЗМА КЛИНИЧЕСКИХ

У 59 из 62 изученных штаммов MAH были получены мультибендовые профили рестрикции IS1245 удовлетворительного качества. Один штамм MAH не содержал инсерционного элемента IS1245, профили двух штаммов были неудовлетворительного качества.

На рисунке 13 в качестве примера приведены профили рестрикции исследуемых штаммов MAH и эталонного штамма IWGMT49 (М, маркер молекулярных весов фрагментов рестрикции).

Рисунок 13 - Профили рестрикции IS1245 исследуемых штаммов MAH и эталонного штамма IWGMT49. М – паттерн рестрикции эталонного штамма IWGMT49; дорожки 1-18 – паттерны рестрикции исследуемых штаммов MAH.

Стрелками указаны фрагменты рестрикции (размер указан в п.н.).

отражающей степень генетического родства между штаммами MAH (Рисунок 14).

Как видно из рисунка 13 и 14, профили рестрикции IS1245 штаммов MAH различались между собой как по количеству, так и по молекулярной массе фрагментов. При этом число фрагментов рестрикции, соответствующее числу копий IS1245, варьировало от девяти до 33.

Всего у 59 штаммов MAH в результате RFLP-типирования выявлен 51 тип профилей рестрикции IS1245 (Рисунок 14). Шкала в верхней части рисунка показывает степень генетического родства штаммов, выраженную в (%).

Наименование, профиль MATR-VNTR штаммов и ВИЧ-статус (HIV+) пациентов показаны справа. Кластеры штаммов с идентичными профилями рестрикции IS1245 выделены прямоугольниками.

Как видно из рисунка 12, 47 (92%) типов профилей рестрикции IS1245 были индивидуальны, а остальные представлены кластерами Mav1-Mav4, в состав которых входили 2-3 штамма.

Рисунок 14 - Филогенетическое древо профилей рестрикции IS1245 59 штаммов MAH.

Кластеры Mav1 и Mav2 включали по два штамма MAH ВИЧ-позитивных пациентов. Кластер представлен двумя штаммами больных микобактериозом, один из которых был ВИЧ-позитивным; Mav3 объединял три штамма MAH ВИЧ-негативных пациентов (Рисунок 15).

Рисунок 15 - Профили рестрикции IS1245, изолятов MAH.

Идентичность профилей IS1245, изолятов MAH, входящих в состав кластеров, отражает существование скрытых эпидемиологических связей между случаями заболевания в группах больных и может служить доказательством общности источника заражения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции участка гена теплового шока hsp65 подтвердил принадлежность к данному виду изученных изолятов нетуберкулезных микобактерий, полученных от различных групп Ленинградской области в 2008-2011 гг. При этом была выявлена однородность паттернов рестрикции BstEII, которые характеризовались наличием двух фрагментов (235 п.н. и 210 п.н.) у всех изолятов. Напротив, паттерны HaeIII были неоднородны за счет присутствия у 7% изолятов помимо двух типичных фрагментов (130 п.н. и 105 п.н.) дополнительного фрагмента (60 п.н.) рестрикции.

Указанные размеры фрагментов рестрикции BstEII и HaeIII соответствовали опубликованным [18] для штаммов M. avium, выделенных от различных источников.

Анализ зарубежной литературы позволил оценить эффективность используемых в мировой практике методов и схем определения различных подвидов M. avium, в частности, основанных на выявлении инсерционных последовательностей IS901 и IS900 у штаммов различного географического происхождения. Большинство авторов считают, что данные специфические последовательности имеются лишь в геномах штаммов M. avium subspр. avium (IS901), paratuberculosis (IS900) и silvaticum (IS901), выделяемых от животных и птиц [11, 20, 26, 88]. Таким образом, отсутствие продуктов ПЦР-амплификации инсерционных элементов IS901 и IS900 свидетельствовало о принадлежности всех 90 изученных клинических изолятов M. avium к подвиду hominissuis (МАН).

Вместе с тем, наличие IS901 у ряда изолятов M. avium subsp. hominissuis, выделенных от больных микобактериозом людей в Японии, Германии, Чехии и Франции, по-видимому, может свидетельствовать об общности источников заражения животных и человека [37, 63, 72, 79].

Таким образом, выявление мобильных элементов IS901 и IS900 для географического происхождения исследуемых штаммов микобактерий.

До настоящего времени биоразнообразие российской популяции M. avium subsp. hominissuis - одного из наиболее актуальных возбудителей микобактериоза человека в России – оставалось неизученным, поскольку не была разработана приемлемая схема идентификации и генотипирования штаммов микроорганизма.

В мировой практике используют несколько методов и схем генотипирования изолятов M. avium различных подвидов. В настоящее время наиболее распространенным методом является анализ аллельного полиморфизма различных наборов локусов VNTR, применяемый большинством авторов. Так, схема генотипирования M. avium на основе анализа аллельного полиморфизма локусов (TR292, TRX3, TR25, TR47, TR3, TR7, TR10, TR32) VNTR, предложенная Thibault et al. в 2007 г., несмотря на ограниченную дискриминирующую способность, достаточно широко используется за рубежом для характеристики популяций M. avium subsp. hominissuis и для эпидемиологической оценки случаев заболевания микобактериоза среди людей и животных во Франции [70, 84], Словении [64], Японии [40, 43], Финляндии [86].

VNTR-типирование по 8 локусам 90 клинических изолятов МАН, представленное в диссертационной работе, показало, что 8 из 17 VNTR-типов с идентичными 8-значными числовыми профилями (число повторов в локусах) были представлены кластерами Ma81- Ma88, в состав которых входило 90,0% микобактериозом – 80,2%. Следует учитывать, что однократное выделение штаммов различных VNTR-типов, не имеющее диагностического значения, может свидетельствовать о транзиторном носительстве возбудителя.

Среди ВИЧ-позитивных больных микобактериозом (n=27) показатель кластеризации был еще выше – 88,8%. Так, наиболее крупный кластер (Ma84) с числовым профилем 22221128 включал 46 (51,1%) штаммов, в том числе штаммов от ВИЧ-позитивных, что составляло более половины всех штаммов, полученных от данной группы пациентов.

Подобный высокий уровень кластеризации штаммов МAH с указанным числовым профилем в литературе не описан, однако имеются сообщения о кластеризации нескольких десятков штаммов других VNTR-типов [40, 64, 70, 84].

Учитывая, что заражение человека осуществляется, в основном, от источников окружающей среды, высокий уровень кластеризации изученных штаммов MAH при отсутствии установленной связи между случаями заболевания можно объяснить невысокой вариабельностью (индекс разнообразия HGDI 0-0,61) восьми локусов VNTR. В этой связи, наличие в составе VNTR-кластеров штаммов, выделенных от ВИЧ-позитивных больных микобактериозом, вряд ли можно рассматривать как показатель преимущественного распространения штаммов MAH определенных генотипов среди больных этой группы, особенно принимая во внимание отсутствие доказательств передачи возбудителя от человека к человеку.

Результаты исследования 90 российских штаммов MAH позволили установить, что штаммы MAH (n=7) кластера Ma87 с числовым профилем 25331128 имели «усеченный» аллель (2) в локусе TR10 (он же – MATR-9), который оценивался как независимое дискретное состояние локуса TR10 при филогенетическом анализе. Проведенное лимитированное ДНК-секвенирование показало, что данный аллель (GenBank accession no. JQ935977.1) был на 15 п.н.

короче, чем у изученных другими авторами штаммов M. avium subsp.

paratuberculosis К10, имеющих два полноразмерных тандемных повтора протяженностью по 55 п.н. [84]. Таким образом, данный аллель, по-видимому, является маркерным для изученных российских штаммов МАН.

Полученные данные согласуются с современными представлениям о существовании различий в числе и размерах тандемных повторов у штаммов различных подвидов М. аvium [40, 84].

Сравнительный анализ 8-локусных VNTR-профилей российских штаммов MAH с доступными данными зарубежных выборок показал различия популяций MAH в России, Франции, Словении и Японии [5]. Однако следует отметить, что VNTR-профили изолятов большинства российских кластеров MAH описаны и в Финляндии у изолятов MAH больных микобактериозом людей и у изолятов, полученных от свиней [86]. В то же время, 8-локусный профиль (кластер Ma81) явно доминировал в Финляндии, тогда как наиболее распространенный профиль 22221128 (кластер Ma84), выявленный более, чем у половины российских изолятов, встречался менее, чем у 7% изолятов из Финляндии. Наблюдаемое родство изолятов упомянутых генотипов из России и Финляндии можно объяснить общностью источников MAH, обусловленной территориальной близостью Северо-Западного региона Российской Федерации (включая Санкт-Петербург) и Финляндии. Вместе с тем, рассмотренное межпопуляционное неравновесие может отражать возникновение и циркуляцию большинства филогенетически удаленных штаммов MAH на единой территории, включавшей указанные страны, более 100 лет назад, что не исключает возможности сравнительно недавнего формирования доминирующего российского кластера Ma84 (профиль 22221128) [79, 86].

Учитывая изложенное, а также и тот факт, что инфицирование человека осуществляется, в основном, от источников окружающей среды [43], высокий уровень кластеризации изученных 90 штаммов МАН при отсутствии явных эпидемиологических связей между случаями заболевания можно объяснить невысокой степенью вариабельности (HGDI 0,186 – 0,624) большинства из восьми локусов VNTR. При этом по числу повторов в локусах TR3 и TR7 штаммы вообще не различались, что согласуется с данными зарубежных исследователей [40, 84, 86].

С целью оптимизации схемы типирования российских штаммов МАН был проведен анализ полиморфизма 15 локусов MATR (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16), недавно описанных Inagaki et al. [40].

В результате 15-локусного MATR-типирования у 90 штаммов МАН было выявлено 35 вариантов профилей, что вдвое превышало таковое (n=17) при соответственно).

Сравнение 15-локусных МАTR-профилей кластеров Ma151-9 изученных российских штаммов c опубликованными данными не выявило кластеризации штаммов M. avium subsp. hominissuis с аналогичными профилями в Японии при исследовании выявленного лишь в одном случае [40]. Наоборот, числовой профиль кластера Ma154 (224131342532443') российских штаммов был выявлен лишь у одного японского штамма M. avium subsp. hominissuis, причем локус MATR-16 (аллель 3) не был «усеченным».

Особый интерес представлял описанный впервые у 80,0% (из 90 изученных российских штаммов МАН) «усеченный» аллель (3) в локусе MATR-16, молекулярная масса которого, не соответствовала ожидаемым значениям.

Секвенирование амплифицированного фрагмента MATR-16 штамма МАН (одного из представителей данной группы) выявило делецию двух нуклеотидов во втором повторе и внутреннюю делецию 28 п.н. в третьем повторе (GenBank accession no. KF479191).

Аллель 3в локусе MATR-16, так же как и аллель 2в локусе TR10 (MATRвыявленные у изученных российских изолятов M. avium subsp. hominissuis, не обнаружены у штаммов, выделенных от различных источников в других странах [40, 43, 64, 70, 84, 86]. Таким образом, данные аллели, по-видимому, являются маркерными для изученных российских штаммов M. avium subsp. hominissuis.

дискриминирующей способности MATR- и VNTR-типирования, основанных на анализе отдельных локусов и их различных комбинаций. Всего было оценено локуса: 8 локусов VNTR и 15 локусов MATR.

Идентичность последовательностей TRX3 и MATR-3 (HGDI 0,624), TR292 и MATR-2 (HGDI 0,272), TR10 и MATR-9 (HGDI 0,186), отмеченная также японскими исследователями [40, 43], позволила исключить дублирующие локусы (MATR-2, MATR-3 и MATR-9) и использовать комбинированную схему типирования, включающую 20 локусов (12 - MATR и 8 - VNTR), в ходе изучения полиморфизма 90 российских штаммов. Сопоставление значений индекса разнообразия Хантера-Гастона для каждого локуса показало высокую информативность (HGDI >0,1) 14 из них (TR292, TRX3, TR25, TR47, TR10, MATR-1, MATR-4, MATR-5, MATR-6, MATR-8, MATR-11, MATR-14, MATR-15, MATR-16).

Оптимизированная 14-локусная схема типирования не отличалась по дискриминирующей способности от 20-локусной (HGDI 0,821), но была более эффективной, чем 8-локусная VNTR- (HGDI 0,714) и 15-локусная MATR- (HGDI 0,806) схемы типирования российских штаммов МАН.

В результате типирования по 14 локусам MATR-VNTR у 90 штаммов МАН было выявлено 36 вариантов профилей. При этом подавляющее большинство (68,9%) штаммов входили в состав 8 кластеров, наиболее крупный (Ma146) включал 37 (41,1%) штаммов с числовым профилем 22222223145443.

Для окончательной оценки родства, штаммы MAH, входящие в состав кластеров согласно 14-локусной схеме MATR-VNTR типирования, были подвергнуты генотипированию с использованием высоко дискриминирующего метода IS1245-RFLP-типирования. У 59 штаммов MAH, входящих в кластеры MATR-VNTR, были получены мультибендовые профили рестрикции IS удовлетворительного качества, причем, лишь девять (15,3%) из них входили в состав четырех кластеров RFLP. При этом два кластера Mav1 и Mav2 включали по два штамма MAH ВИЧ-позитивных пациентов; кластер Mav4 был представлен двумя штаммами больных микобактериозом, один из которых был ВИЧпозитивным; Mav3 объединял три штамма MAH ВИЧ-негативных пациентов.