[ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ
ИНСТИТУТ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК
На правах рукописи
СИНИЦЫНА
Екатерина Сергеевна
ПОЛИМЕРНЫЕ МОНОЛИТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ БИОЧИПОВ С
КОНТРОЛИРУЕМОЙ ПОРИСТОСТЬЮ И РАЗЛИЧНЫМИ
РЕАКЦИОННОСПОСОБНЫМИ ГРУППАМИ
02.00.06 – высокомолекулярные соединенияДИССЕРТАЦИЯ
на соискание ученой степени кандидата химических наук
Научный руководитель:
профессор, д. х. н.
Тенникова Татьяна Борисовна
САНКТ-ПЕТЕРБУРГ
Список сокращений БСА – бычий сывороточный альбумин ГДМА – глицерин-1,3-диметакрилат ГМА – глицидилметакрилат ГЭМА– 2-гидроксиэтилметакрилат ДГПМА – дигидроксипропилметакрилат ДНКaза I– дезоксирибонуклеаза I ДМАП – 4-(диметиламино)-пиридин ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ДТТ – дитиотреитол ДВБ – дивинилбензол КДИ – карбодиимид кДНК–комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота К– коэффициент изменчивости МВ – муковисцидоз НХЦБ – натрий-хлоридно-цитратный буфер ПДМС – полидиметилсилаксан ПС – полистирол ПЦР – полимеразная цепная реакция ПЭГ – полиэтиленгликоль СИТР– соевый ингибитор трипсина СТ – стирол РНК – рибонуклеиновая кислота ФСБ – фосфатно-солевой буфер ЦЭМА – 2-цианоэтилметакрилат ЭДМА – этиленгликольдиметакрилат – параметр взаимодействия Флори-Хагинса – параметр растворимости CF – cysticfibrosis CFTR – сystic fibrosis transmembrane conductance regulator dNTP`s – deoxyribonucleotide triphosphates IgG – иммуноглобулин G MES – 2-(N-морфолин)-этансульфоновая кислотаОГЛАВЛЕНИЕ
Список сокращенийВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Формирование сильно сшитых полимерных сеток с постоянными поровыми 1. характеристиками
Фазовое разделение в синтезе сшитых систем
1. 1.2.1 Модели фазового разделения (макро- и микросинерезис)
1.3 Влияние процесса сшивки на формирование поровой структуры
1.3.1 Механизм формирования пор в полимерных частицах
1.3.2 Влияние времени реакции на формирование поровой структуры полимерных частиц
1.4 Полимерные монолиты
1.4.1 Особенности полимеризации в массе
1.5 Влияние параметров синтеза на поровую структуру полимерных монолитов........... 1.5.1 Влияние времени полимеризации
1.5.2 Температура
1.5.3 Влияние порообразующих агентов
1.5.4 Мономеры
1.5.4.1 Влияние сшивающего агента
1.5.4.2 Функциональные мономеры
1.6 Введение в структуру твердых фаз реакционноспособных групп
1.7 Методы синтеза монолитов
1.7.1 Полимеризация
1.7.1.1 Свободно-радикальная полимеризация
1.7.1.2 Полимеризация с раскрытием цикла
1.7.2 Поликонденсация
1.7.3 Получение монолитов из ранее синтезированных полимеров
1.8 Основные области применения полимерных монолитных материалов
1.9 Технология микрочипов: основные принципы
1.9.1 Материалы, используемые для создания платформ микрочипа
1.9.1.1 Двумерные носители
1.9.1.2 Трехмерные носители
ГЛАВА 2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1 Материалы
2.2 Оборудование
2.3 Методы
2.3.1 Получение пластин на основе стеклянной поддерживающей среды и метакрилатного монолита
2.3.2 Синтез ГМА-ЭДМА сополимера
2.3.3 Синтез сополимеров ГЭМА-ГДМА, ГМА-ГДМА и ЦЭМА-ГДМА
2.3.4 Модификация монолитного ГМА-ЭДМА сополимера
2.3.4.1 Кислотный гидролиз эпоксидных групп ГМА-ЭДМА сополимера
2.3.5 Иммобилизация модельных белков на поверхности модифицированной полимерной матрицы
2.3.5.1 Характеристики и подготовка стационарных фаз
2.3.5.2 Иммобилизация белка
2.3.7 Применение макропористых гидрофильных полимерных материалов в чип-анализе
2.3.7.1 Сравнительное исследование разработанных материалов с использованием модельной биокомплементарной пары белков
2.3.8. Анализ белков и ДНК на повехности стеклянных пластин
2.3.8.1 Анализ белков на стеклянных чипах
2.3.8.2 Анализ ДНК на стеклянных чипах
2.3.9 Создание чипов для анализа ДНК на основе монолитных полимерных матриц..... 2.3.9.1 Оптимизация процесса иммобилизации олигонуклеотидов на поверхности монолитных слоев
2.3.9.2 Оптимизация условий анализа на чипе
2.3.9.3 Создание чипов для диагностики муковисцидоза
2.3.9.4 Аптамер-содержащие микротест-системы
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Синтез и исследование характеристик гидрофильных сополимеров ГЭМА-ГДМА, ГМА-ГДМА и ЦЭМА-ГДМА
3.1.1 Выбор инициатора
3.1.2 Время полимеризации
3.1.3 Влияние порообразующих веществ на морфологию ГЭМА-ГДМА монолита....... 3.1.4 Синтез ГМА-ГДМА монолитов
3.1.5 Макропористые монолиты на основе ЦЭМА-ГДМА сополимера
3.2 Модификация ГМА-ЭДМА сополимера
3.2.2 Введение в структуру ГМА-ЭДМА монолитов альдегидных, сукцинимидкарбонатных и имидазолкарбаматных групп
3.2.3 Иммобилизация модельного белка на поверхности модифицированных носителей
3.2.3.1 Зависимость емкости иммобилизации от концентрации белка в растворе........... 3.2.3.2 Влияние рН раствора
3.2.3.3 Зависимость емкости иммобилизации от времени реакции
3.2.3.4 Зависимость емкости иммобилизации от температуры
3.3 Апробация разработанных материалов в режиме биологического анализа в формате микрочипов
3.3.1 Анализ белков на поверхностях гидрофильных платформ биочипа
3.3.2 Применение макропористых монолитов для создания ДНК-чипов
3.3.2.1 Оптимизация условий анализа ДНК на модельных ГМА-ЭДМА слоях............. 3.3.2.2 Сравнение результатов анализа ДНК на макропористых и стеклянных чипах.. 3.3.2.3 Создание тест-системы на основе монолитов для выявления мутаций гена CFTR
3.3.2.4 Аптамер-содержащие микроаналитические линейки для детектирования белков
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Приложение I: Cтруктурные формулы используемых в работе мономеров
Приложение II: Формулы для оценки эффективности разработанных тест-систем...... БЛАГОДАРНОСТИ
ВВЕДЕНИЕ
Методология получения макропористых полимерных материалов, заключающаяся в одностадийном синтезе сильно сшитых сополимеров в виде монолитных блоков в форме выбранного размера и дизайна (монолитные сорбенты), была разработана и предложена в начале 90-х годов прошлого века. В настоящий момент подобные системы широко используются в качестве твердых сред (неподвижной фазы) при проведении широкого ряда процессов, основанных на массообмене в условиях сквозного потока жидкости или газа (подвижной фазы). В качестве примеров можно привести жидкостную и газовую хроматографию, высокопроточные ферментные реакторы и т.д.Повышенный интерес к монолитным носителям обусловлен их эффективностью и производительностью, связанной с высокой скоростью межфазового переноса вещества, основанного на механизме конвекции, и, в связи с этим, возможностью скоростного разделения биологических объектов различного строения и размера (белки, ДНК, РНК, вирусы), а также их механической и химической устойчивостью. Вышеперечисленные характеристики позволили данным материалам занять привилегированное место в ряду традиционно используемых сорбентов, получаемых в виде частиц, однако для решения более широкого круга задач необходимость продолжения исследований в области синтеза и практического применения полимерных монолитов не теряет своей актуальности. При этом одним из наиболее важных вопросов является получение материалов с прогнозируемой поровой структурой, а именно, решение проблемы управления процессом порообразования.
Сравнительно недавно макропористые метакрилатные материалы монолитного типа были впервые предложены для использования в качестве основы при создании микрочипов, предназначенных для высокочувствительного анализа белков (protein microarrays). При сравнении с широко используемыми в данном методе биологического анализа стеклянными носителями (двумерные, или 2D-чипы) было установлено, что используемые в качестве операционного слоя макропористые монолитные матрицы (трехмерные, 3D-чипы), имеют ряд преимуществ, позволяющих существенно повысить чувствительность анализа. Несмотря на высокую практическую значимость данной характеристики, существует ряд свойств обсуждаемых материалов, которые могут быть улучшены, например, введением в структуру полимерной матрицы групп, повышающих ее гидрофильность. Дополнительная гидрофилизация поверхности операционного слоя микрочипа apriori приведет к улучшению условий для принятия белком необходимой для последующего биоаффинного связывания конформации, уменьшению влияния неспецифических гидрофобных взаимодействий, а также, поскольку при работе с микрочипом используются водные растворы, к улучшению смачиваемости слоя. Также известно, что некоторые белки особенно чувствительны к микроокружению. Для этой категории анализируемых объектов создание условий, максимально приближенных к физиологическим, необходимо для предотвращения денатурации или инактивации активного центра в процессе иммобилизации на поверхности твердой фазы.
Таким образом, поиск новых макропористых полимерных материалов, позволяющих осуществлять биофункционализацию матрицы в мягких условиях и в короткие промежутки времени, является, несомненно, актуальной задачей.
Цель настоящей работы состояла в разработке методов синтеза новых макропористых полимерных материалов (монолитов) на основе сополимеров 2,3эпоксипропилметакрилата (глицидилметакрилата), 2-цианоэтилметакрилата и 2гидроксиэтилметакрила с гидрофильным сшивающим агентом глицерин-1,3диметакрилатом (ГМА-ГДМА, ЦЭМА-ГДМА и ГЭМА-ГДМА, соответственно) с контролируемой поровой структурой и заданной химической функциональностью поверхности, а также в выявлении факторов, определяющих перспективность использования монолитов для построения микроаналитических тест-систем (микрочипов).
Достижение поставленной цели определило следующие задачи:
синтез новых гидрофильных метакрилатных сильно сшитых сополимеров и оптимизация условий сополимеризации, а именно, выбор эффективного инициатора, подбор его концентрации, времени реакции и системы порообразующих веществ;
изучение влияния природы низкомолекулярных и полимерных порообразующих веществ на морфологию и другие характеристики монолитных сорбентов;
разработка способов химической модификации сополимера на основе глицидилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата (ГМА-ЭДМА); подтверждение введения в структуру матрицы альдегидных, сукцинимидилкарбонатных и имидазолкарбаматных групп;
исследование факторов, оказывающих влияние на эффективность введения в структуру макропористого сополимера биоаффинных лигандов;
изучение закономерностей анализа белков на поверхности гидрофильных макропористых монолитов.
макропористые гидрофильные материалы на основе метакрилатных сополимеров, содержащие на поверхности функциональные группы, способные взаимодействовать с аминогруппами молекул белков и ДНК-фрагментов.
В качестве методов исследования использовались: свободно-радикальная фотоинициируемая полимеризация в массе (синтез сильно сшитых гидрофильных метакрилатных сополимеров); методы твердофазного ядерного магнитного резонанса (SSNMR), ИК-спектроскопии и элементного анализа (подтверждение химического строения полученных продуктов); интрузионная ртутная порометрия (определение среднего размера пор и распределения их по размерам); растровая (сканирующая) электронная микроскопия (качественная оценка поровой структуры полученных материалов); флуоресцентный анализ (оценка эффективности высокоспецифичных биологических взаимодействий на поверхности разработанных полимерных слоев).
Научная новизна работы состоит в следующем:
разработаны методы синтеза новых макропористых гидрофильных полимерных материалов (монолитов) на основе сополимеров глицидилметакрилата, 2цианоэтилметакрилата или 2-гидроксиэтилметакрила с глицерин-1,3диметакрилатом (ГМА-ГДМА, ЦЭМА-ГДМА и ГЭМА-ГДМА) с контролируемой поровой структурой;
впервые исследована роль полистиролов с различной молекулярной массой как макромолекулярных порообразующих веществ в формировании морфологии монолитных продуктов (структур) и показано соответствие экспериментальных данных теории взаиморастворимости Гильдебранда;
разработан и оптимизирован алгоритм высокочувствительного анализа ДНК на поверхности макропористых монолитных платформ микрочипа;
показана возможность создания высокочувствительной аптамер-содержащей тестсистемы на основе разработанного микрочипа.
Практическая значимость работы определяется тем, что:
на основе данных по исследованию влияния низкомолекулярных и полимерных порогенов на поровые характеристики синтезированных монолитных сорбентов предложены научно-практические рекомендации, позволяющие направленно структурой, необходимой для решения конкретных аналитических задач;
макропористые монолитные слои, закрепленные на поверхности стеклянной высокочувствительного анализа белков, так и для анализа ДНК;
по результатам разработанного анализа на определение тяжелого генетического заболевания муковисцидоза установлено, что гидрофильные макропористые материалы являются перспективными для анализа генных мутаций.
Положения, выносимые на защиту:
повышение гидрофильности одного мономера или сомономеров приводит к изменению термодинамической совместимости компонентов реакционной системы, и, как следствие, оказывает существенное влияние на поровую структуру;
введение в полимеризационную смесь макропорогена полистирола не приводит к изменению классической микроглобулярной структуры синтезированных образцов;
гидрофилизация поверхности макропористых монолитных матриц позволяет существенно повысить чувствительность биологического анализа на чипе, а также расширить сферы его применения;
макропористые монолитные слои на основе синтезированных полимеров являются перспективными для высокочувствительного анализа ДНК.
Обоснованность и достоверность данных и выводов настоящей работы подтверждается хорошей воспроизводимостью всех полученных результатов, их согласованностью при использовании независимых методов исследования полученных полимеров.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались в виде устных и стендовых сообщений на следующих международных симпозиумах и конференциях: Cанкт-Петербургской конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, 2007, 2008, 2010); International Congress on Analytical Sciences (Москва, Россия, 2006); Baltic Polymer Symposia (Друскининкай, Литва) и 2008 (Отепа, Эстония); Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009); International Symposium «Molecular Mobility and Order in Polymer Systems» (Санкт-Петербург, Россия, 2008); Monolith Summer Schools (Порторож, Словения, 2008 и 2010); 30th International Symposium on the Separation of Proteins, Peptides and Polynucleotides (Болония, Италия, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей в рецензируемых международных и отечественных изданиях, а также 14 тезисов докладов, представленных на вышеуказанных конференциях.
Личный вклад автора состоял в выполнении всех представленных в диссертации экспериментов, активном участии в интерпретации полученных результатов, а также в подготовке докладов и публикаций.
Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института высокомолекулярных соединений Российской академии наук (ИВС РАН) по темe:
«Полифункциональные, биологически активные полимерные системы» (2011 – 2013 гг.) фундаментальных исследований Президиума РАН № 27 «Основы фундаментальных исследований нанотехнологий и наноматериалов», Раздел Программы:
Бионанотехнологии, Научное направление Программы: Нанодетекция и нанодиагностика; Проект: «Разработка макропористых полимерных материалов для создания трехмерных нанодиагностических панелей (биоочипов) нового поколения»;
Правительства Санкт-Петербурга для студентов и аспирантов, 2010 г. (серия ПСП № 10615); Федеральной целевой программой «Научные и педагогические кадры»
Министерства науки и образования РФ (государственный контракт №14.740.11.0382, 2010-2012 г.); также молодежных грантов «У.М.Н.И.К» в 2011-2012 г. Для выполнения части исследования на территории Германии автор дважды получала персональную стипендию от Немецкой Службы Академических Обменов (DAAD (1.09.2009-31.12. и 1.04.2010-30.04.2010). Исследования с ДНК-материалом проводились при участии Научно-исследовательского института акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта Российской академии медицинских наук.
Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав (обзор литературы, экспериментальная часть, результаты и их обсуждение), выводов и списка использованной литературы (189 наименований) и приложений. Работа изложена на странице, включает 11 таблиц и 47 рисунков.
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Формирование сильно сшитых полимерных сеток с постоянными поровыми В течение многих лет фундаментальный и практический интерес в области химии макромолекул представляет получение макропористых материалов на основе сшитых сополимеров. В первую очередь, твердые полимерные продукты широко используются в качестве сорбентов, предназначенных для различных целей, например, классические ионообменные смолы.Первоначальная идея получения твердых ионитов заключалась в сульфировании природного сырья, например, угля, лигнина или торфа. Позже для этих же целей был предложен метод сшивки полимерных цепей. В качестве наиболее распространенного примера можно привести производство фенолформальдегидных смол, основанное на реакции конденсации и приводящее к формированию набухающих полимерных сеток [10]. В 1935 году Staudinger и Husemann впервые осуществили полимеризацию стирола в присутствии небольшого количества сшивающего мономера дивинилбензола (ДВБ) и получили продукт, набухающий, но не растворимый в хорошем для полистирола растворителе [11]. Степень набухания зависела от количества участвующего в синтезе дивинилбензола. Сополимеры данного вида обладали так называемыми «виртуальными» порами, когда эффект их появления связан с набуханием полимера в хорошем растворителе вследствие солюбилизации полимерных цепей и диффузии молекул последнего в структуру полимерной матрицы. В плохом растворителе, равно как и в сухом состоянии, синтезированные материалы характеризовались практическим отсутствием пор.
В 50-х годах прошлого века был предложен метод получения гранулированных полимерных сорбентов, представляющих собой сополимеры с высокой степенью сшивки [12]. Новизна метода заключалась в проведении свободно-радикальной сополимеризации двух мономеров (основной мономер и сшивающий агент) винилового ряда в капле создаваемой специальным образом стабильной эмульсии. При этом сополимеризация мономеров имела место в присутствии инертного вещества (или смеси веществ), растворимого в полимеризационной смеси, но не являющегося растворителем для образующихся молекул полимера. По окончании процесса данное вещество, или пороген, удаляли из структуры пористого материала многократным промыванием или отгонкой с водяным паром [1315]. Использование порогенов в разработанном процессе приводило к формированию в твердом сополимере системы взаимопроникающих пор, которая сохранялась в сухом состоянии [14].
Наиболее детально исследованы процессы сополимеризации стирола (СТ) с дивинилбензолом, хотя в дальнейшем список мономеров был существенно расширен.
Для исследования морфологии синтезированных твердых веществ использовали метод сканирующей электронной микроскопии. Впервые была обнаружена оригинальная микроглобулярная структура сополимеров, полученных в присутствии порообразующих веществ, что отличало их от гомогенной текстуры сетчатых материалов, синтезированных в отсутствие порогенов. По мере дальнейших исследований в качестве порогенов были предложены сольватирующие и несольватирующие синтезируемый полимер растворители, а также не имеющие к нему сродства линейные полимеры [1618].
Известно, что процесс фазового разделения при формировании сильно-сшитых сополимеров обеспечивает образование стабильной макропористой структуры.
Процесс синтеза обсуждаемых полимеров основан на фазовом разделении, причиной которого является термодинамическая неустойчивость системы. Разделение фаз может иметь место в виде макро- и микросинерезиса [17]. В случае макросинерезиса избыток жидкой фазы переходит в непрерывную фазу, а при микросинерезисе жидкая фаза диспергирована в геле и представляет собой микрочастицы (микрокапли).
Термодинамическая нестабильность системы в процессе сшивания полимерных цепей может быть вызвана: (1) ростом молекулярной массы полимера и изменением молекулярно-массового распределения до точки гелеобразования (т.е. расслоения двух жидкостей); (2) увеличением плотности сшивки после точки гелеобразования (механизм -индуцированного синерезиса); (3) изменением состава и термодинамических параметров между сегментами полимера и жидкой фазы (механизм -индуцированного синерезиса).
1.2.1 Модели фазового разделения (макро- и микросинерезис) В описываемом процессе в момент фазового расслоения образуются две фазы, состоящие из высоко- и низкомолекулярных компонентов. Одним из ключевых понятий для данной системы является набухание. Термодинамическое уравнение, описывающее набухание, имеющее место в бинарной системе растворитель-полимер, учитывает взаимодействия между образующимся гелем и частью реакционной смеси, находящейся в растворе (растворитель + мономеры), а также изменение давления пара над реакционной средой [19]:
где 1- изменение химического потенциала растворенной части системы (растворитель + мономеры) по отношению к начальному моменту времени, 1 и 2 - объемные фракции растворителя и полимера, соответственно, - параметр взаимодействия ФлориХагинса, e- концентрация активных сшитых полимерных цепей, V1 - молярный объем растворенной части системы (растворитель + мономеры), А и В – коэффициенты, зависящие от взаимодействия цепей, а1 - активность растворенной части системы, р1 и р10 - давление пара растворенной части системы по отношению к таковому для геля и чистого растворителя. Кроме того, одним из основных понятий для описываемого случая является так называемый фактор памяти 0 [20, 21]. Данный параметр характеризует состояние сшитых полимерных цепей в сухом состоянии после того как порообразующий растворитель был удален из системы.
Было установлено, что реакционная смесь в процессах свободно-радикальной сополимеризации находится в гомогенном состоянии до тех пор, пока растущие полимерные сетки способны поглощать растворенную часть системы. В некоторый момент химической реакции увеличивается плотность сшивки, и система достигает критической точки, в которой степень набухания полимерной сетки в растворенной части приходит к равновесию. Это означает, что в данной точке внутри гомогенного полимерного геля не может содержаться растворителя больше, чем это позволяет равновесная степень набухания. Этот феномен и является причиной разделения системы на две фазы [22]. Таким образом, условия начала разделения фаз могут быть выражены следующими уравнениями:
Одна из первых моделей фазового разделения для полимерных сеток в присутствии порогенного растворителя была описана в работах [23, 24]. Предложенная модель, рассматривающая образование полимерной сетки после точки гелеобразования без учета влияния золя, схематически представлена на Рисунке 1.
Рисунок 1 Макрофазовое разделение в процессе формирования полимерной сетки в присутствии жидкой части системы (растворитель + мономеры).
В начале процесса, когда активность растворителя меньше единицы, система
«