Главная >> Диссертации - все темы

Pages: |

| 2 |

«СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ГЕНА FRIGIDA У ВИДОВ BRASSICA ...»

-- [ Страница 1 ] --

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ РОССИЙЧКОЙ АКАДЕМИИ

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

На правах рукописи

Фадина Оксана Алексеевна

СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ГЕНА FRIGIDA У ВИДОВ

BRASSICA

Специальность 03.01.06. – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

профессор, доктор биологических наук Э.Е. Хавкин Москва – 2014 г.

1.8. Эколого-географические особенности вернализации у арабидопсиса.. 1.9. SCAR маркеры как инструмент для выявления полиморфизма, различения и идентификации геномов Brassica

Обзор патентов, связанных с практическим использованием генов 1.10.

развития

Заключение и постановка задач диссертационной работы.................. 1.11.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Растительный материал

2.2. Методы исследования

2.2.1. Выделение геномной ДНК из тканей растений

2.2.2. Выделение плазмидной ДНК

2.2.3. Определение концентрации нуклеиновых кислот

2.2.4. Амплификация фрагментов геномной ДНК

2.2.5. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК

2.2.6. Клонирование амплифицированных фрагментов ДНК

Методы биоинформатики

2. 2.4. Номенклатура маркеров.

2.5. Регистрация последовательностей ДНК в базу данных GenBank NCBI ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Поиск гомологов гена-прототипа FRIGIDA A. thaliana в генетических базах данных

3.2. Поиск и первичный анализ полноразмерных гомологов FRIGIDA из генома А с помощью методов in silico

3.3. Клонирование гомологичных последовательностей FRI.a и FRI.b из геномов А, С и В Brassica

3.3.1. Создание и верификация локус-специфичных праймеров для клонирования FRI.a и FRI.b из геномов А и С Brassica

3.3.2. Клонирование полноразмерных последовательностей локусов FRI.a и FRI.b из геномов А и С Brassica

амплификации консервативного участка гена FRIGIDA из генома В Brassica

3.3.4. Клонирование консервативного участка гена FRIGIDA из В генома Brassica

3.4. Клонирование гомологичных последовательностей FRI.a и FRI.b из субгеномов А, С и В Brassica

3.5. Строение нуклеотидных последовательностей FRI.a и FRI.b в геномах и субгеномах Brassica

3.5.1. Экзон-интронная структура клонированных нами нуклеотидных последовательностей FRI.a и FRI.b Brassica

3.5.2. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей FRI.a и FRI.b Brassica

3.6. Анализ последовательностей белков FRIGIDA.a и FRIGIDA.b у видов Brassica

3.7. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей FRI.a и FRI.b Brassica

3.8. Локусы FRIGIDA у фенотипически контрастных форм Brassica........... 3.9. SCAR маркеры, сконструированные на основе полиморфизмов гена FRIGIDA

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Полиморфизм гена FRIGIDA в семействе Brassicaceae

4.2. Строение белка FRIGIDA у Brassica

4.3. Возникновение двух локусов гена FRIGIDA в семействе Brassicaceae в контексте эволюции геномов Arabidopsis и линий Brassica

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

БИБЛИОГРАФИЯ

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

BRAD (Brassica database) информацию о геномах культурных видов Brassica CBC ( nuclear cap-binding complex) - кэп-связывающий комплекс Coiled-coil domain – домен белка, обладающий суперспиральной структурой DMRs (differentially methylated regions) - дифференциально метилированных регионов) dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate) – дезоксинуклеозидтрифосфат EST (expressed sequence tag sequences) - экспрессирующиеся маркерные последовательности FM (floral meristem) - флоральная меристема GSS (genome survey sequences) – последовательности, полученные при секвенировании геномов GWA (genome wide association) - метод картирования полных геномов InDel (insertion/deletion) – инсерция/делеция IPTG – ИПТГ, изопропил--D-тиогалактозид LB – питательная среда Лурия-Бертани LncRNA (long noncoding RNA) – длинная некодирующая РНК miRNA (microRNA) - микроРНК NCBI (National Center for Biotechnology Information) – Национальный центр биотехнологической информации США Pfu -ДНК полимераза – термостабильная ДНК-полимераза из Pyrococcus furiosus QTL (quantitative trait locus) - локус количественного признака SAM (shoot apical meristem) – апикальная меристема побега SCAR (от sequence characterized amplified region) – охарактеризованная последовательность амплифицированного участка ДНК.

SNP (single nucleotide polymorphism) - мононуклеотидный полиморфизм SRA - high-throughput DNA and RNA sequence read archive – архив последовательностей ДНК и РНК высокого разрешения TAE-буфер - трис-ацетатный буфер Taq-ДНК полимераза - термостабильная ДНК-полимераза из Thermus aquaticus UTR (untranslated regions) - нетранслируемые участки X-Gal – 5-бромо-4-хлоро-3-индоил-бета-D-галактопиранозид а.о. – аминокислотный остаток ДД – длинный день ИПТГ - изопропил-в-тиогалактозид КД – короткий день КО – кодирующая область п.н. – пара нуклеотидов ПЦР – полимеразная цепная реакция Наиболее часто употребляемые сокращения названий генов:

AG – AGAMOUS AGL24 – AGAMOUS-LIKE AP1 - APETALA CO - CONSTANS FES1 - FRIGIDA ESSENTIAL

FLC - FLOWERING LOCUS C

FLX - FLOWERING LOCUS C EXPRESSOR

FRI – FRIGIDA FRL1 - FRIGIDA-LIKE

FT - FLOWERING LOCUS T

Hd1- HEADING DATE Hd3 - HEADING DATE LFY - LEAFY

SOC1 - SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS

SUF4 - SUPPRESSOR OF FRIGIDA

SVP – SHORT VEGETATIVE PHASE

TFL1- TERMINAL FLOWERING

VIN3 - VERNALIZATION INSENSITIVE

VRN1 – VERNALIZATION VRN2 – VERNALIZATION

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ (ВВЕДЕНИЕ)

Важным этапом жизненного цикла растений является переход от вегетативного к репродуктивному развитию, который запускается и контролируется различными эндогенными и экзогенными сигналами. В умеренных широтах в ходе эволюции в результате длительного воздействия изменяющихся условий внешней среды формировались экологические особенности конкретных видов растений, и тем самым увеличивалось их разнообразие. Повторяющаяся смена ледниковых и межледниковых эпох оказала сильное влияние на растительность: с наступлением ледниковых эпох теплолюбивые виды растений отступали к югу, в межледниковые эпохи они вновь возвращались на север. Изменялись рельефы поверхности Земли, состав почв, температура, влажность, продолжительность дня и ночи и освещенность. В результате одни типы растительности сменялись другими.

Каждый раз, с изменением окружающей среды, растения приспосабливались к определенной экологической нише, вырабатывая определенные требования к условиям существования. Поэтому в каждой из природных зон (тундра, тайга, степь, пустыня) закрепились те жизненные формы растений, которые наилучшим образом приспособлены к конкретным условиям произрастания.

наследственности и адаптации, возникли растения, различные по периодичности цветения: однолетние, двулетние, многолетние, монокарпики - и времени зацветания: ранне- и поздноцветущие формы.

культурных растений раздвигает границы полевого сезона, а в ряде случаев, обеспечивает круглогодичное получение хозяйственного урожая.

Способность одних растений зацветать раньше, а других - позже регулируется сложным генетическим механизмом. На примере арабидопсиса (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) создана подробная модель генетической регуляции перехода к цветению, которая хорошо объясняет особенности этого процесса у многих групп однолетних растений.

Ключевым геном этой модели является FLOWERING LOCUS T, продукт экспрессии которого входит в состав предсказанного М.Х.

Чайлахяном флоригена - мобильного сигнала, необходимого для индукции цветения (Аксенова и др., 2006; Corbesier et al., 2007; Tamaki et al., 2007; Turk et al., 2008). На экспрессию FLOWERING LOCUS T влияют различные факторы внешней и внутренней среды (продолжительность освещения и качество света, температура, гормональный статус, углеводное питание и др.), поэтому при анализе генетической регуляции экспрессии FLOWERING

LOCUS T

фотопериодический путь, путь гиббереллина, автономный путь, реакцию на температуру окружающей среды, включая путь вернализации, и др. Эти пути взаимодействуют между собой, и их относительный вклад изменяется в различных экологических условиях и у разных жизненных форм растений.

Эта модель (Бернье и др., 1985; Amasino, 2004; Bernier and Perilleux, 2005) постоянно дополняется и усложняется по мере появления новой информации о генах, контролирующих ключевые гены каждого пути, включая гены эпигенетического контроля, и об участии miRNA в молекулярном механизме перехода к цветению (Adrian et al., 2009; Andres and Coupland, 2012; Kim et al., 2009; Moghaddam and Van den Ende, 2013; Rataj and Simpson, 2014; Song et al., 2012; Yamaguchi and Abe, 2012).

Изучение генов, регулирующих переход к цветению, может быть полезным при создании новых инструментов для селекции культурных растений на раннеспелость и продолжительность вегетационного периода.

Одним из важных направлений селекционных работ является создание высокоурожайных сортов и гибридов, обеспечивающих круглогодичное получение сельскохозяйственной продукции. Другими экономическими характеристиками продуктивных форм культурных растений являются одновременное достижение хозяйственной спелости и морфологическая выравненность посева, необходимые для механизации их возделывания.

Изучение генов, стоящих за этими признаками, также имеет большое практическое значение.

Процесс первичного одомашнивания растений и современная селекция используют полиморфизмы генов перехода к цветению и регулирующих их генов, которые, при генетическом анализе популяций, обнаруживаются как QTLs основных хозяйственных признаков. Особенно плодотворными оказались исследования, в которых результаты QTL анализа высокого разрешения совмещены с физическим картированием и клонированием генов перехода к цветению у культурных растений и их дикорастущих сородичей.

Сравнительный исторический, экологический и эволюционный анализ природной и искусственно созданной изменчивости признаков, связанных со временем перехода к цветению и скороспелостью, позволяет не только прояснить роль этих признаков в одомашнивании и адаптации культурных растений в различных экологических зонах и разнообразных агроценозах, но и выявить гены, которые могут быть точкой приложения молекулярной селекции на основе традиционных методов гибридизации и отбора и с использованием методов генной инженерии (Alonso-Blanco et al., 2009;

Blackman et al., 2011; Doebley et al., 2006; Ehrenreich et al., 2009; Izawa, 2007;

Olsen and Wendel, 2013).

В качестве масличных, овощных и технических культур растения рода Brassica L. занимают важное место в сельскохозяйственном производстве, в том числе в нашей стране. Растения Brassica представлены яровыми и озимыми однолетними и двулетними жизненными формами, происходящими из субтропиков и умеренных широт. Эти формы сильно различаются по классический треугольник U (Nagaharu, 1935) из диплоидных видов с геномами A, B и C: Brassica rapa L. (геном A), Brassica nigra (L.) W. D.J.Koch (геном B), Brassica oleracea L. (геном C) и амфиплоидов Brassica juncea (L.) Czern. (геном AB), Brassica napus L. (геном AC) и Brassica carinata A.Braun (геном BC).

Для климатических условий нашей страны особенно важна регуляция времени зацветания однолетних культурных растений Brassica под влиянием длительного воздействия низких положительных температур (путь вернализации). Этот путь наиболее подробно исследован на растениях арабидопсиса, близкого родственника растений Brassica. Ключевыми элементами этого пути у арабидопсиса являются гены FLOWERING LOCUS C и FRIGIDA (Johanson et al., 2000; Shindo et al., 2005); аллельное экологических условиях (Lovell et al., 2013; Strange et al., 2011).

У растений Brassica ген FLOWERING LOCUS C исследован достаточно подробно (см. Zou et al., 2012); напротив, ген FRIGIDA у растений Brassica к исследование строения гена FRIGIDA в геномах Brassica было призвано хотя бы отчасти восполнить этот пробел. За время нашего исследования функциональные особенности гена FRIGIDA у B. napus (Wang et al., 2011) и B. oleracea (Irwin et al., 2012). Детально изученная эволюция геномов Brassica (Cheung et al., 2009; Couvreur et al., 2010; Lysak et al., 2005; Schranz et al., 2006) создает благоприятные предпосылки для анализа дивергенции FRIGIDA в связи с особенностями перехода к цветению у жизненных форм Brassica.

Цель и задачи исследования. Провести in silico анализ гомологов гена FRIGIDA A. thaliana среди культурных видов Brassica. Клонировать и провести сравнительный анализ строения гена FRIGIDA в геномах и субгеномах A, B и C культурных видов Brassica. Выявить локус- и геномспецифичные полиморфизмы гена FRIGIDA. Создать на этой основе интрогрессивной селекции, для картирования и функционального анализа гена FRIGIDA.

Научная новизна исследования. Обоснована двухлокусная модель гена FRIGIDA у растений рода Brassica. Получены новые данные о структурных особенностях двух локусов FRIGIDA в геномах A, B и C и дивергенции гена FRIGIDA у растений рода Brassica. Создана система SCAR маркеров для изучения разнообразия двух локусов FRIGIDA в геномах и картирования и функционального анализа гена FRIGIDA.

Практическая значимость работы. Созданы локус- и геномспецифичные маркеры гена FRIGIDA, которые могут оказаться полезными для уточнения связи этого гена с QTL времени перехода к цветению. Эти маркеры могут также быть использованы в интрогрессивной селекции культурных форм Brassica, в том числе на время зацветания и скороспелость.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Экономическое значение культурных видов Brassica 1.1.

Среди культурных растений рода Brassica особое место занимают шесть видов: B. rapa, B. oleracea, B. napus, B. nigra, B. juncea и B. carinata.

Разнообразные формы этих видов возделываются как овощные, кормовые, масличные и декоративные культуры (Жуковский, 1971; Branca and Cartea, 2011).

Вид Brassica rapa L. включает экономически важные масличные, овощные и кормовые, листовые и корнеплодные культуры и широко распространен на земном шаре. К листовым культурам относятся всевозможные виды китайской (B. rapa subsp. chinensis) и пекинской (B. rapa subsp. pekinensis) капусты, возделываемых в Китае и Японии еще с древних времен. В Восточной Азии листовая капуста занимает первое место по посевной площади и считается основной овощной культурой. Она характеризуется высоким содержанием каротина, разнообразных витаминов (В1, В2, В6, B9, С, Е, К, РР) и селена, которые являются активными природными антиоксидантами и важными элементами защитных и адаптивных систем живого организма. Турнепс и репа представляют корнеплодные культуры B. rapa, которые употребляются в пищу и на корм скоту. Наибольшие площади возделывания турнепса находятся в Германии, Дании, Великобритании, США, Канаде, Австралии. Репа очень богата витаминами и минеральными солями. В России репу издавна сеют по всей стране.

Вид B. oleracea L. представлен такими разнообразными формами, как кормовая капуста кале (kale), капуста кочанная (cabbage), капуста цветная (cauliflower), брокколи (broccoli), брюссельская капуста (Brussel sprouts), кольраби (kohlrabi). Эти растения богаты важными питательными веществами, которые сохраняются в листьях при длительном хранении, что особенно важно для стран с продолжительной зимой. Капуста кочанная, основное овощное растение во всех странах умеренных широт, культивируется в России и занимает примерно 30% площади, отведенной под овощные культуры. Цветная капуста широко возделывается во всей Европе, в Северной и Южной Америке, в Китае и Японии. По масштабам культуры занимает второе место после белокочанной капусты. Площадь под этим видом в СНГ составляет около 0,8—1 % посевов капусты. В Германии на долю цветной капусты приходится 10 % площади, занимаемой овощными растениями. Брюссельскую капусту широко культивируют в странах Западной Европы, США и Канаде, в России ее возделывают в ограниченном количестве, в основном в центральных районах Европейской части страны.

Капуста кале употребляются в пищу, а также в качестве кормовой культуры и в декоративных целях. Кольраби является ценным диетическим продуктом, ее мякоть богата глюкозой, фруктозой, соединениями серы, солями калия, витаминами В1, В2, C и РР. Она популярна во многих странах Европы, в Америке и Канаде. В России, благодаря ее холодостойкости, кольраби выращивают на Сахалине и Камчатке.

Растения рапса (B. napus) используются для получения пищевого растительного масла (масличный рапс) и в качестве кормовой культуры (брюква). Рапсовое масло используют, как и другие масла, в приготовлении блюд, для приготовления маргарина, в металлургической, мыловаренной, кожевенной и текстильной промышленности. Рапсовый шрот используется в животноводстве как пищевая основа для различных комбикормов и премиксов. В связи с ростом цен на ископаемое топливо возникла новая важная область использования масличного рапса для производства биодизельного топлива, неистощаемого источника энергии взамен ископаемых энергоресурсов. Масло из семян используют в качестве добавки в традиционное дизельное топливо в промышленных масштабах (Jeong and Park, 2006). Рапс возделывают в Канаде, Индии, Китае, и других странах.

Основные районы возделывания озимого рапса в СНГ — лесостепная зона Украины, ярового рапса — северная часть лесостепной зоны Украины. Для кормовых целей озимый рапс можно выращивать почти во всех районах степи, лесостепи и лесолуговой зоны России и стран СНГ. В России, в связи с погодными условиями, в основном возделывается яровой рапс. Озимый рапс распространён на юге, в Ставропольском и Краснодарском крае.

Виды Brassica, содержащие геном В, представлены тремя горчицами – сарептской, черной и индийской (соответственно, B. juncea, B. nigra и B.

carinata). Все три вида горчиц выращиваются для получения масла, специй и салатных листьев. Горчица сарептская (B. juncea) является одной из важнейших масличных культур. Она является хорошим медоносом. Масло горчицы используют в кулинарии, хлебопекарной, кондитерской, консервной, мыловаренной, текстильной, фармацевтической и парфюмерной промышленности, а также как техническое. Обезжиренный жмых семян используют для приготовления столовой горчицы, а порошок из размолотых семян горчицы применяют как приправу и ароматизатор. В Китае листья этой горчицы в сыром виде употребляют в пищу. Культивируется она в Индии, Китае, Индокитае, Малой Азии, Северной Африке, в странах Европы.

В России горчица, по большей части, культивируется в Волгоградской, Саратовской, Ростовской областях, Ставропольском крае и Западной Сибири.

Масло черной горчицы (B. nigra) идёт для пищевых и технических целей, а обезжиренные семена используют на изготовление лучших сортов столовой горчицы и в медицине для производства горчичников. Как масличная культура индийская горчица (B. carinata) значительно превосходит рапс (B.

napus) в способности адаптироваться и давать большие урожаи при таких неблагоприятных условиях окружающей среды, как высокие температуры и засуха. Большинство сортов B. carinata имеют низкую питательную ценность из-за высокого содержания глюкозинолатов (синигрин) и эруковой кислоты (Getinet et al., 1996). Благодаря приспособленности B. carinata к засушливым условиям климата Средиземноморья получаемое из нее масло становится выгодной альтернативой рапсовому маслу для производства биодизельного топлива в странах этого региона (Cardone et al., 2003). Виды Brassica, содержащие геном В, используют в качестве донора генов устойчивости к черной ножке при создании новых сортов рапса с долговременной устойчивостью к этой болезни (Chvre et al., 2008).

Систематика культурных форм Brassica 1.2.

1.2.1. Виды Brassica, составляющие треугольник U Brassica, один из 51 рода трибы Brassiceae, принадлежащих к семейству Brassicaceae (капустных/крестоцветных), является одним из наиболее экономически важных родов этой трибы. Культурные виды Brassica L. включают яровые и озимые однолетние и двулетние жизненные формы, происходящие из субтропиков и умеренных широт и представленные диплоидными и тетраплоидными видами с геномами A, B и C: Brassica rapa L. (геном A), Brassica nigra (L.) W. D.J.Koch (геном B), Brassica oleracea L.

(геном C), Brassica juncea (L.) Czern. (геном AB), B. napus L. (геном AC) и Brassica carinata A.Braun (геном BC). Цитогенетические взаимоотношения между различными видами Brassica представлены треугольником U (Nagaharu, 1935). Этот треугольник (рис. 1A) включает шесть наиболее распространенных культурных видов Brassica: три диплоида (B. rapa, B.

oleracea и B. nigra) и три аллотетраплоида (B. napus, B. juncea и B. carinata).

Аллотетраплоидные виды произошли в результате гибридизации диплоидных видов Brassica. В процессе одомашнивания каждого вида дивергентный отбор обогащал разнообразие сортов и культур (Rakow, 2004).

Brassica nigra (L.) Koch (n = 8), черная горчица. Растения B. nigra не нуждаются в вернализации для индукции цветения. Вид возник в Средиземноморье, и представители диких форм B. nigra распространены по всей Северной Африке, а также найдены в Эфиопии и Эритрее. Как сельскохозяйственная культура черная горчица возделывалась на Родосе, Крите, Сицилии, Турции и Эфиопии.

Рис. 1. Виды Brassica, составляющие треугольник U. (A) Треугольник U (Nagaharu, 1935). Диплоидные виды B.

rapa (2n=20, геном АА), B. nigra (2n=16, геном ВВ) и B. oleracea (2n=18, геном СС) и тетраплоидные аллополиплоиды B. napus (2n=38, B. rapa x B. oleracea, геном ААСС), B. juncea (2n=36, B. rapa x B. nigra, геном ААВВ) и B. carinata (2n=34, B. nigra x B. oleracea, геном ВВСС). n – число хромосом одного гаплоидного генома. (Б) Географическое распространение и возможные ареалы происхождения видов Brassica (Dixon, 2007, с изм.).

В настоящее время возделывается в небольших количествах в Англии, Франции, Италии, Румынии, Индии, Турции и Китае.

Brassica oleracea L. (n = 9). Дикие виды были найдены на небольших изолированных территориях и сформировали очень разные фенотипы. B.

oleracea была найдена на побережье северной Испании, западной Франции и южной и юго-западной Англии. Культурные формы B. oleracea представлены западноевропейской дикой В. oleracea под действием мутаций, адаптаций и искусственного отбора: B. oleracea Acephala Group - капуста кормовая Кале (Kale и collard greens) (var. acephala); B. oleracea Capitata Group - кочанная капуста (Cabbage) (var. capitata, var. sabauda, var. bullata), B. oleracea Gongylodes Group - кольраби (Kohlrabi) (var. gongylodes); B. oleracea Botrytis Group - цветная капуста (Cauliflower Romanesco, broccoli и broccoflower) (var.

botrytis); B. oleracea Gemmifera Group - брюссельская капуста (Brussel sprout) (var. gemmifera); B. oleracea Alboglabra Group - брокколи (Chinese broccoli) (B.

alboglabra); B. oleracea Italica Group – брокколи (Broccoli) (var. italica).

Brassica rapa L. (синоним B. campestris L., n = 10) представлена разнообразными формами, которые можно разделить на три группы:

масличные, листовые и корнеплодные. B. rapa произошла от дикого вида B.

rapa ssp. sylvestris, который встречается в горной местности недалеко от Средиземного моря. Отсюда она распространилась по всей Европе.

Считается, что B. rapa ввезена в Китай через Западную Азию и Монголию в качестве сельскохозяйственной культуры. В Японию, вероятно, этот вид попал из Китая и Сибири. Известно, что B. rapa культивировалась в качестве масличной культуры в Индии, но дикие формы этого вида там не обнаружены. Масличные культуры этого вида также, возделываются в Швеции, Финляндии и Канаде. Известны семь овощных культур B. rapa: var.

campestris, var. pekinensis, var. chinensis, var. parachinensis, var. narinosa, var.

japonica и var. rapa. Капуста пекинская (var. pekinensis) возникла в Северном Китае и похожа на масличную культуру B. rapa, произрастающую в Китае.

Она приспособлена к несколько более прохладному климату. Капуста китайская (var. сhinensis) является листовой культурой и отличается от масличного типа B. rapa в Китае; var. parachinensis - производная от var.

Сhinensis. B. rapa var. narinosa устойчива к холоду и предъявляет те же требования к условиям роста, что и var. chinensis. B. rapa var. japonica - это вид листовой капусты, произрастающей в Японии. B. rapa var. rapa (репа) культивируется во всем мире как корнеплодный овощ и в качестве корма для животных.

Brassica carinata A. Braun (n = 17) - это амфиплоидный вид, возникший в результате межвидовой гибридизации B. nigra (n = 8) и B.

oleracea (n = 9). Нет никаких сведений о существовании диких видов B.

carinata. Этот вид возник в высокогорьях Эфиопии, где по преимуществу возделывается в качестве масличной и овощной культуры. Как масличная культура B. carinata значительно превосходит B. napus по способности адаптироваться к неблагоприятным условиям окружающей среды и давать большие урожаи в засушливом климате.

Brassica juncea (L.) Czern & Coss (n = 18) - амфиплоидный вид, произошедший в результате межвидовой гибридизации B. nigra (n = 9) и B.

rapa (n = 10). Дикие формы B. juncea были найдены на Ближнем Востоке и в южной части Ирана. Этот вид выращивается в Индии в качестве масличной культуры (коричневая, или индийская горчица). В Китае в пищу используют листья и корнеплоды (B. juncea var. napiformis). Однако Китай не рассматривается, как место происхождения этого вида, так как дикие виды B.

nigra и B. rapa в этой стране не были обнаружены.

Brassica napus L. (n = 19 представляет собой амфиплоидный вид, возникший в результате межвидовой гибридизации B. oleracea (n = 9) и B.

rapa (n = 10). Дикие формы B. napus найдены в Швеции, Нидерландах и Великобритании. Считается, что вид B. napus появился на побережье Северной Европы, где произрастали дикорастущие виды В. oleracea и B.

rapa. Другие исследователи считают, что B. napus возник в Средиземноморье или на западе Европы. Вполне вероятно, что формы B. napus могли образоваться независимо в разных местах в результате скрещивания различных форм В. oleracea, и B. rapa. Существуют озимые и яровые масличные культуры B. napus, которые выращивают во многих странах мира.

1.2.2. Геномы Brassica A, B и C Выдающиеся успехи в области геномики и молекулярной цитогенетики позволили составить достаточно определенную картину происхождения видов Brassica (см. Navabi et al., 2013; Schranz et al., 2006; Schranz et al., 2007). Диплоидные виды B. rapa, B. nigra и B. oleracea, по всей видимости, произошли от общего гексаплоидного предка Brassicaceae (2n=6x=24), который в ходе эволюции несколько раз подвергся полиплоидизации и транслокации хромосом (рис. 2). Линии Brassica и Arabidopsis разошлись в интервале между 14,5 и 20 миллионами лет назад (Cheng et al., 2013; Cheung et al., 2009; Couvreur et al., 2010; Lysak et al. 2005). Считается, что линия B дивергировала около 7.9 - 14.6 миллионов лет назад (Lysak et al. 2005).

Однако недавний сравнительный анализ трех генов Brassica позволил более точно определить время дивергенции этих двух линий, около 6.2(± 2.19) миллионов лет назад (Navabi et al., 2013). Разделение генома А и генома С предположительно произошло около 3,7 миллионов лет назад (Lysak et al.

2005).

Теория происхождение современных видов Brassica от общего гексаплоидного предка поддерживается цитогенетическими и молекулярными исследованиями Robbelen (1960) и Truco (1996). Показано наличие шести основных типов хромосом (ABCDEF) у диплоидных видов Brassica и происхождение их от шести предковых хромосом (W1-W6), которые подвергались нескольким дупликациям и перестройкам в процессах видообразования (рис. 3).

Рис. 2. Предполагаемая модель происхождения видов Brassica. x – число хромосом, n – число хромосом одного гаплоидного генома вида Brassica, ABCDEF – шесть основных типов хромосом. Сплошной и пунктирной линиями показаны, соответственно, женская и мужская родительские формы (Prakash et al., 2009, с изм.).

Каждый диплоидный вид Brassica содержит все шесть типов хромосом, но некоторые хромосомы дуплицированы или триплицированы, что привело к различному количеству хромосом в геномах диплоидных Brassica. Так, у B.

rapa произошла дупликация хромосом A и D и трипликация хромосомы F (n=10 AABCDDEFFF), у B. oleracea дуплицировались хромосомы B, C и E (n=9, ABBCCDEEF), у B. nigra были дуплицированы хромосомы D и F (n=8, ABCDDEFF). С учетом этих различий, геномы видов B. rapa, B. nigra и B.

oleracea обозначают соответственно как A, B и C. Геномы А и С являются близкородственными, тогда как геном В в большей степени отличается от геномов А и С (Prakash et al., 2009).

Рис. 3 Предполагаемая модель эволюции хромосом современных геномов A, B и C Brassica. W1-W6 – основные типы предковых хромосом; Bx и Cx – промежуточные хромосомы, давшие начало некоторым хромосомам современных геномов B и A Brassica; C1 – C9 - хромосомы генома C, давшие начало образованию хромосом генома A; A1 - A10 – хромосомы генома A;

B1 -B8 - хромосомы генома B. Пунктирной линией обозначены предполагаемые гомологи (Truco et al., 1996).

В дополнение к цитогенетическим исследованиям, предположение о роли трипликации в происхождении диплоидных геномов Brassica подтверждается исследованиями по сравнительному картированию гомологичных регионов хромосом A. thaliana в культурных видах Brassica, показана высокая коллинеарность ортологичных областей этих геномов Navabi et al., 2013; Panjabi et al., 2008; Parkin et al., 2002; Parkin et al., 2005;

Schranz et al., 2006; Schranz et al., 2007). Сравнительный анализ сегментной организации геномов подтвердил различие между геномом B. nigra и близкородственными геномами Rapa/Oleracea. Важным отличием генома B от геномов линии A/C является наличие одной крупной хромосомной перестройки, которая могла сделать невозможной рекомбинацию между геномами этих линий (Navabi et al., 2013).

В ходе эволюции диплоидные виды Brassica развивались независимо, количественные изменения, приводящие к накоплению и сочетанию предпочтительных аллелей генов, обеспечивающих выживание в ходе естественного отбора и формирование хозяйственно ценных признаков в ходе искусственного отбора.

Цветение растений как экономическая проблема 1.3.

Сдвиг сроков цветения является важной задачей селекции растений с целью получения новых сортов, которые лучше приспособлены к местным условиям возделывания и изменяющимся условиям окружающей среды, включая глобальное потепление. Время зацветания влияет и на урожайность сельскохозяйственных культур. Для зерновых культур, переход к цветению является ключевым этапом развития, который определяет количество и качество получаемых семян. У таких овощных культур, как капуста, сахарная свекла или кормовые травы, ранний переход к цветению приводит к потере урожая.

разнообразие хорошо изучены у модельных видов растений, а в последние годы большое число гомологичных генов цветения обнаружено и у культурных видов. Идентифицированные последовательности регуляторов цветения могут использоваться селекционерами в качестве функциональных целенаправленного управления признаками цветения посредством генетических модификаций. Например, для увеличения биомассы урожая листовой китайской капусты (B. rapa ssp. pekinensis) Salehi и соавторы (Salehi et al., 2005) предложили увеличить вегетационный период этой культуры.

сверхэкспрессии гена FLOVERING LOCUS C, основного репрессора цветения (Jung and Miller, 2009).

Таким образом, понимание генетических и молекулярных механизмов перехода к цветению открывает новые возможности для селекции растений.

1.4.

1.4.1. Основные пути регуляции перехода к цветению Процессы роста и развития растений находятся под контролем внутренними факторами. Реализация каждой генетической программы развития осуществляется в постоянно изменяющихся условиях внешней среды. Поэтому для растений определяющее значение имеет согласованный (интегрированный) ответ на внешние и внутренние факторы, участвующие в регулировании процессов роста и развития каждой клетки и целого растительного организма (Медведев, 2004). К внутренним факторам, влияющим на ростовые процессы, относятся, прежде всего, фитогормоны, а к внешним – температура (ее величина и периодичность), свет (его интенсивность, спектральный состав, продолжительность и периодичность), минеральные и органические питательные вещества, влажность почвы и вегетативной фазы развития растений к репродуктивной включает три стадии: 1) индукция цветения с образованием флорального стимула; 2) транспорт флорального стимула; 3) эвокация цветения.

Индукция цветения осуществляется эндогенными и экзогенными факторами. К эндогенным факторам относятся эндогенные ритмы и содержание фитогормонов, к экзогенным – свет и температура. В ответ на эти факторы запускаются молекулярные механизмы, приводящие к появлению в листьях мобильного сигнала (флоригена), который инициирует формирование зачатков цветка в апикальной меристеме побега (shoot apical meristem, SAM) и тем самым индуцирует цветение (Чайлахян, 1937).

Рис 4. Генетическая регуляция индукции цветения в апикальной меристеме побега (по Andres and Coupland., 2012, с изм.).

Генетические основы перехода к цветению, включая механизмы формирования и передачи флоральных сигналов, хорошо изучены на модельном растении A. thaliana. Были определены четыре основных сигнальных пути перехода к цветению: холодовой, фотопериодический, автономный и гиббереллин-зависимый (рис.4). Сигналы, формирующиеся в этих путях, передаются по генетическим сетям к основным генаминтеграторам: FLOWERING LOCUS T (FT), SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1 (SOC1) и LEAFY (LFY). В апикальной меристеме побега белок FLOWERING LOCUS T в комплексе с белком FLOWERING LOCUS D активирует экспрессию транскрипционного фактора флоральных меристем: LEAFY, и APETALA1/CAULIFLOWER/FRUITFULL (AP1/CAL/FUL). Генам-интеграторам противодействуют гены-супрессоры перехода к цветению: TERMINAL FLOWER 1 (TFL1) и AGAMOUS-LIKE (AGL24). Таким образом, переход растений к цветению осуществляется посредством активации и/или супрессии генов, контролирующих процесс цветения (Andres and Coupland, 2012).

1.4.1.1. Фотопериодический путь Сезонные изменения длины дня (фотопериода) влияют на процесс перехода растений к цветению. Ключевую роль в фотопериодической регуляции цветения играет ген CONSTANS (CO) (рис. 5) (Turck et al., 2008;

Andres and Coupland., 2012). У длиннодневных видов растений белок CONSTANS накапливается только на длинном дне, стабилизируется светом и быстро разрушается в темноте (Valverde et al., 2004). CONSTANS экспрессируется в паренхиме сосудистой системы листьев и активирует экспрессию гена FLOWERING LOCUS T. В течение суток ген CONSTANS экспрессируется циклически. Регуляция цветения по фотопериодическому пути происходит посредством восприятия светового сигнала различными фоторецепторами, различающими качество и количество света (Putterill et al., 2004). Свет является основным сигналом, синхронизирующим циркадные часы с сезонными изменениями в длине дня (Mouradov et al. 2002).

По восприятию основных компонентов белого света фоторецепторы разделяются на фитохромы PHYA, PHYB, PHYC, PHYD, PHYE (красный и дальний красный свет) и криптохромы CRY1, CRY2, CRY3 (синий свет).

Сигналы, воспринимаемые фоторецепторами в ответ на качество и Рис. 5. Основные пути инициации цветения на примере A. thaliana.

Ключевыми генами в путях инициации цветения: CONSTANS (CO),

FLOWERING LOCUS C (FLC), FLOWERING LOCUS T (FT), SUPPRESSOR OF

OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1 (SOC1), LEAFY (LFY) и APETALA 1/FRUITFUL/CAULIFLOWER (AP1/FUL/CAL).

количество света, передаются по генетическим цепям к циркадным часам (рис. 5).

Фитохромы PHYA - PHYE и криптохромы CRY1 и CRY2 являются основными фоторецепторами, вовлеченными в регуляцию циркадных часов.

Фитохром PHYB участвует в деградации белка CONSTANS в утренние часы, тогда как CRY1, CRY2 и PHYA необходимы для стабилизации этого белка в конце дня, причем действие этих стабилизаторов взаимозаменяемое.

В деградацию белка CONSTANS также вовлечены белки SUPPRESSOR OF PHYA-105-1 (SPA1), SPA3 и SPA4 (Valverde et al., 2004). Под контролем циркадных часов в условиях длинного дня (ДД) экспрессия CONSTANS также регулируется белками GIGANTEA (GI), FLAVIN-BINDING KELCH REPEAT F-BOX 1 (FKF1) и CYCLING DOF FACTOR1 (CDF1) (Srikanth et al, 2011).

Способности CONSTANS индуцировать экспрессию FLOWERING LOCUS T противодействуют несколько регуляторов, которые репрессируют этот ген посредством различных механизмов или путей, тем самым предотвращая преждевременное цветение (Yant et al., 2009). Это так называемые флоральные гены-репрессоры: TEMPRANILLO1 и 2 (TEM1 и TEM2), APETALA2 (AP2), TARGET OF EAT 1–3 (TOE1–3), SCHLAFMU TZE (SMZ) и SCHNARCHZAPFEN (SNZ) и FLOWERING LOCUS C (FLC) (Srikanth et al., 2011). Взаимодействие этих генов схематически представлено на рис. 5.

Важную роль в пластичности развития растений, включая определение времени перехода к цветению, играет реакция на затенение, воспринимаемая как изменение интенсивности и спектрального состава света. Изменение соотношения красного и дальнего света воспринимается описанными выше фитохромными рецепторами. Ответ растения на эти изменения не зависит от фотопериодической реакции; в нем участвуют гены FLOWERING LOCUS C и FRIGIDA и фактор процессинга РНК FY (Adams et al., 2009).

1.4.1.2. Вернализация Одним из факторов внешней среды, запускающих процесс цветения, является продолжительное холодовое воздействие, или вернализация (яровизация). Вегетационный период раннецветущих экотипов арабидопсиса в условиях длинного дня составляет несколько недель, а поздноцветущих – несколько месяцев. Однако после воздействия низких положительных температур (4°C) на протяжении 4-8 недель время зацветания поздноцветущих экотипов приближается ко времени зацветания раннецветущих экотипов (Michaels et al., 2000). В случае арабидопсиса молекулярно-генетическая регуляция вернализации исследована достаточно подробно (Kim and Song, 2014). У видов Arabidopsis время зацветания раннеи поздноцветущих экотипов определяется соотношением сильных и слабых аллелей генов FLOWERING LOCUS C и FRIGIDA. Одновременное присутствие активных аллелей двух этих генов обуславливают поздноцветущий фенотип, потеря функциональности одного из этих генов приводит к раннему зацветанию (Johanson et al., 2000; Kim et al., 2009).

Ген FLOWERING LOCUS C кодирует MADS-box фактор транскрипции, высокий уровень экспрессии которого приводит к подавлению цветения. Ген FRIGIDA необходим для усиления экспрессии FLOWERING LOCUS C (Johanson et al., 2000; Michaels and Amasino, 1999). Белок FLOWERING LOCUS C ингибирует цветение путем репрессии генов FLOWERING LOCUS

T, SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1 и FLOWERING

LOCUS D (Michaels, 2009). При экспрессии FLOWERING LOCUS C в проводящих тканях листа происходит репрессия транскрипции FLOWERING LOCUS T. В апикальной меристеме побега FLOWERING LOCUS C подавляет экспрессию FLOWERING LOCUS D и SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1, что препятствует инициации апикальной меристемы в ответ на перемещающийся из листа сигнал FLOWERING LOCUS T.

Регуляция экспрессии SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS осуществляется за счет конкуренции между генам-активатором перехода к цветению CONSTANS и геном-репрессором FLOWERING LOCUS C. Белки FLOWERING LOCUS C и CONSTANS связываются с различными участками промотора гена SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1 и противодействуют друг другу (см. рис.5).

Процесс цветения запускается при низком уровне экспрессии

FLOWERING LOCUS C,

вернализации. Под воздействием холода запускаются механизмы эпигенетического контроля, переводящие ген FLOWERING LOCUS C в репрессированное состояние. Важными регуляторам процесса модификации хроматина FLOWERING LOCUS C являются белки VERNALIZATION (VRN1) и VERNALIZATION2 (VRN2), VERNALIZATION INSENSITIVE (VIN3). Белок VERNALIZATION INSENSITIVE 3 необходим для запуска молекулярных механизмов модификации хроматина FLOWERING LOCUS C, а VERNALIZATION1 и VERNALIZATION2 необходимы для поддержания FLOWERING LOCUS C в репрессированном состоянии (Adrian et al., 2009, Andres and Coupland, 2012). Кроме того, в ответ на холодовое воздействие возникает временное увеличение экспрессии некодирующей РНК, комплементарной FLOWERING LOCUS C - COOLAIR RNA. Транскрипция COOLAIR RNA может подавлять транскрипцию смысловой цепи еще до появления VERNALIZATION INSENSITIVE 3 (Swiezewski et al., 2009). РНКсвязывающие белки и регуляторы эпигенетического механизма так же играют важную роль в регуляции транскриптов FLOWERING LOCUS C RNA (Simpson et al., 2004). К другим активаторам экспрессии FLOWERING LOCUS C относятся: FRIGIDA-LIKE (FRL) гены, FRL1 и FRL2, EARLY IN SHORT DAYS 4 (ESD4) (Michaels et al., 2004) (см. рис.5).

1.4.1.3. Регуляция цветения температурой внешней среды Переход к цветению зависит также от температуры окружающей среды, на которую растение реагирует на протяжении всего вегетационного периода (Samach et al., 2005). В условиях повышенной температуры (25 C) на коротком дне растения A. thaliana зацветают раньше, чем в условиях длинного дня при 230C. (Balasubramanian et al., 2006). Точно так же мутанты по генам phyB и cry2 зацветают раньше в условиях повышенной температуры (Blazquez et al., 2003; Halliday et al., 2003). Раннее зацветание наблюдали при повышенной температуре у растений с нефункциональными аллелями fri и flc. Напротив, растения, несущие активные аллели FRI/FLC, слабо реагируют на повышенную температуру, и это говорит о том, что FLOWERING LOCUS C играет ключевую роль в подавлении температурной индукции (Balasubramanian et al., 2006). Другим важным регулятором перехода к цветению в ответ на температуру окружающей среды является ген SHORT VEGETATIVE PHASE (SVP). Этот белок является MADS box транскрипционным фактором, который связывается с промоторами генов

FLOWERING LOCUS T и SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF

CONSTANS 1 и подавляет их транскрипцию (Hartmann et al., 2000, Lee et al., 2007). Взаимодействие белков FLOWERING LOCUS C и SHORT VEGETATIVE PHASE подавляет переход к цветению (Andres and Coupland, 2012).

1.4.1.4. Путь гиббереллина Регуляторы роста растений гибберелловые кислоты (гиббереллины, GA) являются активаторами перехода растений к цветению (Putterill et al., 2004). Среди генов индукции цветения по пути гиббереллинов выделяют гены, отвечающие за биосинтез активных гибберелловых кислот GA1, GA3, GA4 и GA7 (Hedden and Thomas., 2012) и гены, отвечающие за пути передачи GA сигнала, GIBBERELLIC ACID INSENSITIVE (GAI), REPRESSOR OF GA1- (RGA) и RGA-LIKE 1 (RGL1), SPY, PHOR1 (PHOTOPERIOD RESPONSIVE 1), FPF1 и SHI (Srikanth et al., 2011). Фитогормон GA, рецептор GID1 (GA INSENSITIVE DWARF1) и репрессор DELLA формируют GA–GID1–DELLA модуль каскада сигналов GA. Действие GA на цветение наиболее выражено в условиях короткого дня. Мутанты по ga1, у которых отсутствует первый этап биосинтеза GA, никогда не зацветают в условиях короткого дня. Мутанты по gai нечувствительны к GA и в условиях КД зацветают позже (Wang et. al., 2013) (см. рис. 5).

1.4.1.5. Автономный путь Помимо генов холодового пути индукции цветения в супрессию вовлечены гены автономного пути. Автономный путь регулируется генами LUMINIDEPENDENS (LD), FCA, FY, FPA, FLOWERING LOCUS D (FLD), FVE, FLK, и REF6 (Amasino et al., 2004; Simpson, 2004). Белки, кодируемые генами автономного пути, участвуют в реорганизации хроматина и принимают участие в процессинге РНК. Такие белки как FCA, FPA, FLOWERING LOCUS K и FY участвуют в процессинге РНК, а FLOWERING LOCUS D и RELATIVE OF EARLY FLOWERING6 принимают участие в метилировании и деметилировании хроматина (см. рис. 5).

Переход к цветению происходит тогда, когда вернализация и гены автономного пути снижают уровень экспрессии FLOWERING LOCUS C, и накопление белка фотопериодического пути CONSTANS активирует экспрессию FLOWERING LOCUS T и SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1, запуская переход к цветению (Michaels and Amasino, 2001).

1.4.1.6. Некодирующие РНК Выделяют два типа некодирующих РНК: микроРНК (miRNA) и длинные некодирующие РНК (long noncoding RNA, lncRNA). Эти РНК играют важную роль в трансляции и деградации мРНК. МикроРНК представляют собой последовательности размером 21-22 нуклеотида, которые регулируют активность специфичной целевой мРНК на уровне транскрипции и/или трансляции. Регуляция осуществляется путем комплементарного связывания микроРНК с частично комплементарными сайтами в нетранслируемых участках (UTRs) мРНК генов-мишеней. Эти РНК могут также непосредственно взаимодействовать с ДНК генов в процессе РНК-зависимого метилирования ДНК, которое является одним из ключевых механизмов репрессии генов. Некодирующие РНК играют важную роль в определении времени зацветания. МикроРНК miR172, miR156 и miR159 и длинные некодирующие РНК COOLAIR и COLDAIR способствуют цветению путем регулирования экспрессии ключевых генов цветения (Matthew et al.;

2012, Spanudakis et al., 2013; Yamaguchi et al., 2012).

miR159 принимает участие в контроле перехода к цветению в гиббереллин-зависимом пути. Мишенью для miR159 являются гены семейства GAMYB, кодирующие транскрипционные факторы MYB. Эти индуцируемых GA, включая регулятор идентичности флоральной меристемы LEAFY (Yamaguchi et al., 2012).

miR172 играет важную роль в репрессии трансляции и деградации мРНК генов-мишеней (Wollmann et al. 2011). У Arabidopsis мишенями этой микроРНК являются мРНК генов APETALA2, TARGET OF EAT1 (TOE1), TARGET OF EAT2 (TOE2), TARGET OF EAT3 (TOE3), SCHLAFMUTZE (SMZ) и SCHNARCHZAPFEN (SNZ) (Yamaguchi et al., 2012).

Мишенями miR156 являются SBP box транскрипционные факторы, SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN LIKE 1 (SPL1) - SPL16.

Комплекс miR156/SPL регулирует время зацветания двумя путями: 1) снимает репрессию зацветания, вызванную активностью гена типа APETALA2; 2) непосредственно активирует интеграторы цветения и регуляторы идентичности меристемы. Белок SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN LIKE 3 контролирует регуляторы идентичности меристемы LEAFY, APETALA1 и FRITFULL (Yamaguchi et al., 2009). К тому же было установлено, что этот белок взаимодействует с промоторной областью FLOWERING LOCUS T (Kim et al. 2012). Взаимодействуя с FLOWERING LOCUS T, комплекс miR156/SPL3 участвует в регуляции времени цветения в ответ на температуру окружающей среды (Yamaguchi et al. 2012).

последовательность РНК размером более 200 нуклеотидов. Такие РНК обычно транскрибируются с другой цепи локуса, кодирующего белок.

LncRNAs влияют на экспрессию генов в основном двумя путями, через прямое воздействие на транскрипцию и вовлечение модификаторов хроматина (см. обзоры Nagano and Fraser et al., 2011; Wang and Chang et al., 2011). В качестве примера можно указать на гены COOLAIR и COLDAIR.

LncRNAs регулируют экспрессию FLOWERING LOCUS C (De Lucia and Dean et al., 2011; Kim et al. 2012; Kim and Sung, 2012).

1.4.1.7. Взаимодействие генетических систем, регулирующих переход к Генетические пути, которые регулируют переход к цветению, не изолированы друг от друга, а составляют сложную генетическую сеть, которая обеспечивает точное регулирование относительно небольшого числа интеграторов цветения, представляющих собой общие ключевые точки пересечения отдельных путей (crossroads). FLOWERING LOCUS C (FLC),

FLOWERING LOCUS T (FT), SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO

(SOC1) и LEAFY (LFY) являются важными регуляторными точками в сети, контролирующей цветение (рис. 6). Экспрессия FLOWERING LOCUS C регулируется по пути вернализации и автономному пути. FLOWERING LOCUS C подавляет гены-интеграторы цветения FLOWERING LOCUS T и SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO1. Действие FLOWERING LOCUS T и SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO1 находится под контролем фотопериодического пути на транскрипционном уровне.

Активация FLOWERING LOCUS T является особенно важным этапом в переходе к цветению, так как является компонентом сигнала цветения «флоригена». Интеграция внешних и внутренних сигналов в листе приводит к экспрессии FLOWERING LOCUS T, и этот белок по флоэме перемещается в апикальную меристему, где инициирует переход к цветению (Andres and Coupland, 2012).

транскрипционный фактор LEAFY активирует многие другие гены-мишени, запуская программу формирования цветка.

Рис. 6. Ключевые «точки» в генетической системе, регулирующей переход к цветению. FLOWERING LOCUS C (FLC) – репрессор цветения, FLOWERING LOCUS T (FT), SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO1 (SOC1) и LEAFY (LFY) – активаторы цветения.

Частные модели регуляции пути вернализации 1.5.

Разнообразие в поведении растений в ответ на холодовую индукцию цветения можно объяснить, используя три модели регуляции этого процесса (рис. 7).

Во время вернализации A. thaliana экспрессия FLOWERING LOCUS C снижается, затем следует индукция транскрипции FLOWERING LOCUS T и TWIN SISTER OF FT (TSF) посредством CONSTANS в условиях длинного дня (рис. 7A).

Рис. 7. Модели процесса холодовой индукции цветения. (А) – A. thaliana; (Б) – рис; (В) – пшеница и ячмень; (Г) – сахарная свекла. ДД – длинный день; КД – короткий день. Серыми и черными линиями обозначена репрессия и индукция, соответственно. Звездочкой отмечены гены, аллельное разнообразие которых связано со временем перехода к цветению. Красные круги обозначают гомологи гена FLOWERING LOCUS T (FT), желтые гомологи CONSTANS (CO) и голубые – гомологи GIGANTEA (GI) (по Andres and Coupland, 2012) По сравнению с A. thaliana, гомолог CONSTANS у риса, HEADING DATE 1 (HD1), подавляет цветение в условиях длинного дня, ингибируя гена HEADING DATE 3A (HD3A), но в условиях короткого дня HEADING DATE (HD1) способствует транскрипции гомологов FLOWERING LOCUS T, HEADING DATE 3A и RICE FT-LIKE 1 (RFT1). В свою очередь, HEADING DATE 3A и RICE FT-LIKE 1способствуют цветению, подобно FLOWERING LOCUS T и TWIN SISTER OF FT в A. thaliana. GHD7 является репрессором цветения в условиях длинного дня и подавляет транскрипцию EARLY HEADING DATE 1 (EHD1) (Xue et al., 2008). Этот ген активирует транскрипцию HEADING DATE 3A и RICE FT-LIKE 1 в условиях короткого дня. В растениях риса GIGANTEA (GI) усиливает транскрипцию HEADING DATE 1, подобно GIGANTEA и CONSTANS в A. thaliana. Современные модели регуляции цветения риса в условиях короткого дня предполагают, что совпадение действия света и суточных ритмов в EHD1 или GHD приводит либо к активации, либо к репрессии транскрипции HEADING DATE 3A, соответственно, и что это может обеспечить своевременную реакцию на сезонные изменения длины дня (Itoh et al., 2010, Osugi et al., 2011). Для перехода к цветению рис не нуждается в вернализации. У пшеницы и ячменя индукция цветения происходит в условиях длинного дня. В ответ на длинный день гомологи белка CONSTANS активируют FT-like гены (Campoli et al., 2011). Однако для транскрипционной активности FT-like генов в условиях длинного дня также необходим белок Ppd-H1 (Turner et al., 2005). Подобно A.

thaliana, для перехода к цветению эти виды нуждаются в вернализации. Во время вернализации, возрастает транскрипция гена VERNALIZATION (VRN1), который кодирует MADS box транскрипционный фактор, сходный с белками FRUITFULL и APETALA1 из A. thaliana. VERNALIZATION усиливает развитие соцветия и репрессирует VERNALIZATION 2. В условиях

VERNALIZATION

FLOWERING LOCUS T 1, подобного FLOWERING LOCUS T из A. thaliana и эта экспрессия подавляется во время вернализации посредством VERNALIZATION 1 (см. рис. 7). В условиях короткого дня экспрессия гена VERNALIZATION 12 подавляется, вследствие чего возрастает экспрессия FLOWERING LOCUS T1, и запуск цветения происходит летом (Cockram et al., 2007). У сахарной свеклы, ген BOLTING TIME CONTROL 1 регулирует сигналы от путей фотопериодической индукции. У однолетних форм, доминантный аллель BOLTING TIME CONTROL 1 индуцирует цветение в условиях длинного дня посредством репрессии FLOWERING LOCUS T 1 и активации FLOWERING LOCUS T 2 (Pin et al., 2012). Двулетняя сахарная свекла содержит рецессивный аллель btc1, который не блокирует экспрессию репрессора цветения FLOWERING LOCUS T 1. Такой аллель btc1 становится достаточно активным, чтобы подавить экспрессию FLOWERING LOCUS T и индуцировать FLOWERING LOCUS T 2, и тем самым запустить процесс цветения, только после вернализации (Andres and Coupland, 2012) (см. рис. 7).

Механизм вернализации на примере A. thaliana 1.6.

1.6.1. Гены FRIGIDA и FLOWERING LOCUS C Жизненные формы A. thaliana обычно разделяют на раннецветущие и поздноцветущие. Однолетние раннецветущие растения арабидопсиса рано зацветают в условиях длинного дня (ДД), и их жизненный цикл длится всего несколько недель. Поздноцветущие экотипы в условиях длинного дня могут расти несколько месяцев и не зацветать. Однако, если растения поздноцветущего экотипа подвергнуть вернализации, время их зацветания в условиях длинного дня приблизится ко времени зацветания раннецветущего экотипа (Johanson et al., 2000; Michaels and Amasino, 2000).

Классический генетический анализ различий между поздно- и раннецветущим экотипами показал, что поздноцветущие экотипы содержат активные аллели FLOWERING LOCUS C (FLC) и FRIGIDA (FRI), в то время как раннецветущие экотипы содержат мутации в одном или обоих этих генах (Clarke and Dean, 1994). Таким образом, эти гены являются основными факторами, определяющими природное разнообразие по времени зацветания у A. thaliana (Shindo et al., 2005; Stinchcombe et al., 2005). Предполагается, что раннецветущие экотипы произошли от поздноцветущих экотипов в результате мутаций в последовательностях FRIGIDA и/или FLOWERING LOCUS C, которые привели к потере функции гена (Johanson, et al., 2000;

Michaels et al., 2003). У большинства раннецветущих экотипов наблюдается

FLOWERING LOCUS C

нефункционального аллеля FRIGIDA, а у поздноцветущих экотипов наблюдается высокий уровень экспрессии FLOWERING LOCUS C и наличие функционального аллеля FRIGIDA. Таким образом, аллельное разнообразие гена FRIGIDA является основным фактором, определяющим изменение времени цветения (Shindo et al., 2005).

При более подробном изучении аллельного разнообразия гена FRIGIDA из A. thaliana было показано, что различие между популяциями в требовании к вернализации связано с изменениями в кодирующей области FRIGIDA (Le Corre et al., 2002; Shindo et al., 2005). Ген FRIGIDA состоит из трех экзонов и двух интронов и содержит области, соответствующие coiledcoil доменам, на обоих концах гена (Johanson et al., 2000). Область первого экзона является наиболее вариабельной и содержит больше несинонимичных замен, чем второй и третий экзон. Мутации в этой области, нарушающие функции гена, включают сдвиг рамки считывания или возникновение стопкодонов, обуславливают способность природных популяций A. thaliana адаптироваться в местных условиях (Le Corre et al., 2002; Shindo et al., 2005;

Stinchcombe et al., 2004).

Johanson и соавторы (Johanson, et al., 2000) идентифицировали у A.

thaliana два рецессивных аллеля FRIGIDA в раннецветущих экотипах Columbia (Col) и Landsberg erecta (Ler). В отличие от поздноцветущего экотипа H51, в последовательностях этих рецессивных аллелей FRIGIDA обнаружены две различающиеся делеции, которые нарушают открытую рамку считывания, что приводит к потере функциональности гена.

функциональной последовательности H51 двумя несинонимичными аминокислотными заменами (Gly146 – Glu и Met148 – Ile), которые приводят к потере сайта рестрикции Bsm FI), и делецией в 16 пар нуклеотидов (п.н.) в области первого экзона, которая приводит к появлению преждевременного стоп-кодона в начале второго экзона. Между аллелями FRIGIDA из экотипов H51 и Ler обнаружены три отличия: две однонуклеотидные замены, приводящие к сдвигу рамки считывания, и индел полиморфизм: делеция ( п.н.), совмещенная с инсерцией (31 п.н.), - который приводит к удалению старт-кодона и тем самым нарушает начало открытой рамки считывания.

Инсерция длиной 31 п.н. появилась, вероятно, в результате частичной дупликации последующего участка длиной 53 п.н. и содержит ATG кодон, который может быть воспринят как старт-кодон во время трансляции. В результате вне рамки считывания может образоваться короткий белок длиной в 41 аминокислотный остаток. Однако транскрипты FRIGIDA у растений экотипа Ler обнаружены не были, тогда как у экотипов H51 и Col такие транскрипты присутствовали. Результаты сравнительного анализа последовательностей FRIGIDA из ранне- и поздноцветущих экотипов на основании двух делеций, 16 и 376 п.н., и несинонимичной аминокислотной замены, Gly146 - Glu, обуславливающей наличие или отсутствие сайта рестрикции Bsm FI, позволили предположить, что аллель FRIGIDA из поздноцветущего экотипа является предковой формой гена, а раннецветущие экотипы произошли от поздноцветущих экотипов в результате делеций в гене FRIGIDA, приводящих к потере функциональности этого гена (Johanson et al. 2000). Позже, Le Corre и соавторы (Le Corre et al., 2002) подтвердили эти результаты и обнаружили еще шесть мутаций, приводящих к потере функциональности гена FRIGIDA и к раннему зацветанию.

считывания. Это может произойти по трем следующим причинам. Первая, некоторые из наблюдаемых синонимичных замен в гене FRIGIDA могли изменить или подавить функцию белка. Вторая, экспрессию FRIGIDA могли нарушать мутации в промоторной области гена. Третья, раннее цветение могло произойти в результате действия других генов, регулирующих процесс цветения. (Le Corre et al., 2002).

последовательностей FRIGIDA из экотипов A. lyrata открытая рамка считывания кодирует полноразмерный белок, т.е. в этом случае не было обнаружено мутаций типа Col и Ler, которые привели бы к значительным нарушениям в белке (преждевременному стоп-кодону, сдвигу рамки считывания или изменению в старт-кодоне). Однако эти последовательности содержали многочисленные несинонимичные и синонимичные замены. Как и у A. thaliana, в последовательностях FRIGIDA у A. lyrata первый экзон является более вариабельным, чем второй и третий. Отношение числа синонимичных полиморфизмов к числу несинонимичных между близкородственными видами A. lyrata и A. thaliana было значительно выше в первом экзоне, чем во втором и третьем. Среди множества несинонимичных полиморфизмов наибольший интерес представляет индел в 42 п.н. в области третьего экзона, который приводит к образованию варианта белка, укороченного на длине в 14 а.о. Длинный и короткий аллельные варианты гена FRIGIDA транскрибируются, кодируют функциональные белки и обуславливают разницу во времени зацветания на 15 дней. Помимо индела, эти аллели отличались четырьмя аминокислотными заменами, одна из которых находилась в пределах coiled-coil домена. Поэтому вполне вероятно, что и другие несинонимичные полиморфизмы в области гена FRIGIDA могут влиять на время зацветания (Kuittinen et al., 2008). Таким образом, полиморфизмы последовательностей гена FRIGIDA влияют на время зацветания растений в популяциях A. thaliana и A. lyrata. Однако в структуре гена присутствуют различия, которые, вероятно, возникли из-за разницы жизненных циклов развития. У A. thaliana независимые мутации в последовательности гена FRIGIDA, приводящие к потере функциональности, обуславливают способность к локальной адаптации, но у FRIGIDA A. lyrata таких мутаций практически не обнаружено. В качестве альтернативы, у A.

lyrata в последовательностях FRIGIDA найдены нетипичные изменения, например, индел в 16 п.н., которые не приводят к потере функции гена.

По сравнению с A. thaliana, результаты исследования Kuittinen et al.

(2008) не поддерживают представление о ведущей роли гена FRIGIDA в диверсификации популяций A. lyrata: поздноцветущие популяции в северной Европе одновременно содержали поздно– и раннецветущие аллельные варианты FRIGIDA, а среди раннецветущих популяций южной Европы часто встречались аллельные варианты FRIGIDA, ассоциированные с поздним цветением. Вероятно, полиморфизм этих популяций по времени перехода к цветению связан и с другими генетическими факторами, ответственными за этот признак. Однако данные Kuittinen et al. (2008) позволяют предположить, что полиморфизм гена FRIGIDA влияет на разнообразие по времени зацветания внутри некоторых популяций A. lyrata и в отсутствие вернализации.

1.6.2. Молекулярный механизм вернализации и эпигенетический контроль перехода к цветению Этот механизм заключается в репрессии гена FLOWERING LOCUS C путем модификаций структуры хроматина и поддержании его в репрессированном состоянии до следующего мейоза (рис. 8А).

На протяжении всего жизненного цикла растений арабидопсиса ген FLOWERING LOCUS C проходит через три состояния (рис. 8A). Первое, активное состояние, когда белок FRIGIDA обеспечивает высокий уровень

FLOWERING LOCUS C.

устанавливается во время полового размножения и позднего эмбриогенеза (Choi et al., 2009). Этот механизм гарантирует, что для перехода к цветению каждое новое поколение растений, полученных от вернализованных родителей, снова нуждается в вернализации; этот механизм предотвращает преждевременное цветение осенью. Второе, полуактивное состояние, когда экспрессия FLOWERING LOCUS C начинает снижаться. На этой стадии происходит переход из активного в репрессированное состояние в результате снижения уровня экспрессии FLOWERING LOCUS C в ответ на холодовое воздействие. Третье, репрессированное состояние этого гена, которое поддерживается эпигенетическими механизмами (Adrian et al,, 2009).

С учетом постепенного изменения уровней экспрессии FLOWERING LOCUS C в ответ на воздействие холодом, процесс вернализации можно Рис. 8. (А) Состояние FLOWERING LOCUS C (FLC) на протяжении жизненного цикла растений Arabidopsis. FRIGIDA (FRI) активирует транскрипцию FLC; VERNALIZATION INSENSITIVE 3 (VIN3) и VERNALIZATION 5 (VRN5) –- инициаторы репрессии FLC в ответ на воздействие холодом; VERNALIZATION 1-2 (VRN1-2) и LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN (LHP1) –репрессоры, поддерживающие FLC в подавленном состоянии, после возвращения в теплые условия (по Adrian et al, 2009).

(Б). Три фазы процесса вернализации. COOLAIR - некодирующий транскрипт антисмысловой нити FLC, COLDAIR - некодирующий транскрипт смысловой нити FLC, PHD-PRC2 – комплекс, необходимый для модификации хроматина в локусе FLC (По Ietswaart et al, 2012).

разделить на три фазы: 1) определение стационарного уровня экспрессии FLOWERING LOCUS C до воздействия холодом; 2) репрессия (silencing) этого гена посредством воздействия холодом; 3) поддержание эпигенетического подавления экспрессии FLOWERING LOCUS C после возвращения в теплые условия (рис. 8Б). Экспрессия FLOWERING LOCUS C во время определенных фаз вернализации контролируется регуляторами, активирующими транскрипцию этого гена, механизмами эпигенетического контроля, которые представлены белковыми комплексами, изменяющими

FLOWERING LOCUS C,

смысловыми и длинными несмысловыми РНК (COOLAIR и COLDAIR, соответственно).

Установка уровня экспрессии FLC до воздействия холодом. В настоящее время известно множество регуляторов, которые устанавливают Рис. 9. Пути, регулирующие уровень экспрессии FLOWERING LOCUS C (FLC) до воздействия холодом. Зеленым обозначены пути, усиливающие экспрессию FLC, красным обозначены пути, репрессирующие FLC.

ARABIDOPSIS TRITHORAX-RELATED7 (ATXR7) и ARABIDOPSIS

HOMOLOG OF TRITHORAX1/ ARABIDOPSIS HOMOLOG OF TRITHORAX

2 (ATX1/ATX2) - H3K4- метилазы; EARLY FLOWERING IN SHORT DAYS (EFS) - H3K36 метилтрансфераза; PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2) – комплекс, состоящий из белков VERNALIZATION 2 (VRN2), SWINGER

(SWN), FERTILIZATION-INDEPENDENT ENDOSPERM (FIE) и MUSASHI

RNA-BINDING PROTEIN (MSI1); Paf1C (RNA polymerase-associated factor complex) - РНК-связывающий комплекс, связывается с РНК-полимеразой II и играет важную роль при элонгации транскрипции, а также модификации гистонов (По Song et al., 2012).

начальный уровень экспрессии FLOWERING LOCUS C и влияют на состояние хроматина или действие мРНК (рис. 8Б, рис. 9).

FLOWERING LOCUS C, является белок FRIGIDA (Johanson et al., 2000).

Белок FRIGIDA регулирует высокий уровень экспрессии FLOWERING LOCUS C на этапе кэпирования, непосредственно взаимодействуя с кэпсвязывающим комплексом (nuclear cap-binding complex, CBC) (Geraldo et al., 2009). Затем происходит накопление белка ATWDR5a на гене FLOWERING LOCUS C и, как следствие, увеличение триметилирования лизина 4 гистона H3 (H3K4) (Jiang et al., 2009). Комплекс PRC2 связывается с локусом до, во время и после воздействия холодом (рис. 10А).

Автономный путь осуществляет серию процессов, которые связывают процессинг РНК с деметилированием H3K4, тем самым подавляя активаторы FLOWERING LOCUS C. Таким образом, высокий уровень экспрессии FLOWERING LOCUS C поддерживается в стационарном состоянии до начала процесса вернализации.

Репрессия (silencing) гена FLOWERING LOCUS C посредством воздействия холодом. В ответ на воздействие холодом наступает вторая фаза процесса вернализации. Во время этой фазы происходит снижение уровня

FLOWERING LOCUS C.

некодирующие РНК и механизмы модификации хроматина (рис. 8Б, рис. 10).

После 1-2 недель воздействия холода число транскриптов COOLAIR увеличивается. Это приводит к подавлению несплайсированных транскриптов FLOWERING LOCUS C, но не функциональных мРНК, подавление которых требует более продолжительного воздействие холодом (Song et al., 2012). Далее, после 3-6 недель воздействия холодом, формируется комплекс PHD–PRC2, который доставляется транскриптами COLDAIR в специфичную область гена FLOWERING LOCUS C, где начинается увеличение триметилирования H3K27 (рис. 8Б, 10В) (De Lucia et al., 2008; Ietswaart et al., 2012).

Поддержание эпигенетического подавления экспрессии FLOWERING LOCUS C после возвращения в тепло. Третья фаза вернализации начинается, Рис. 10. Экспрессия FLOWERING LOCUS C (FLC) во время различных стадий вернализации. А - установка экспрессии FLC до воздействия холодом;

Б и В - подавление экспрессии FLC во время 1-2 недель и 3-6 недель воздействия холодом, соответственно; Г - эпигенетическое подавление (silencing) после возвращения в теплые условия; PLANT HOMEODOMAIN PROTEIN (PHD) – белки гомеодомена VERNALIZATION INSENSITIVE (VIN3), VERNALIZATION 5 (VRN5) и VEL1 (по Song et al., 2012).

когда растения возвращаются в теплые условия после продолжительного воздействия холодных температур. Во время этой фазы происходят значительные и относительно быстрые изменения в локусе FLOWERING LOCUS C, которые приводят ген в подавленное состояние. В течение нескольких дней после перемещения в теплые условия комплекс PHD–PRC распространяется по всему локусу FLOWERING LOCUS C, (De Lucia et al., 2008) и следовательно модификация гистона, H3K27me3, так же усиливается по всей длине гена, что необходимо для поддержания репрессированного состояния на протяжении всего последующего жизненного цикла растения («памяти о зиме») (Amasino, 2004; Song et al., 2012). (рис. 8Б, рис. 10Г).

Белок FRIGIDA и его роль в процессе вернализации 1.7.

Белок FRIGIDA из A. thaliana длиной 576 а.о. принадлежит к суперсемейству белков FRIGIDA. Все представители этого суперсемейства содержат консервативный центральный домен Frigida и специфичные C- и Nконцевые области. По консервативным последовательностям N-концевой области суперсемейство FRIGIDA можно разделить на пять различных семейств, FRIGIDA I–V. Белки семейства FRIGIDA I содержат консервативный центральный домен, включающий характерные аминокислотные остатки, что позволяет выявить ортологи FRIGIDA и правильно их аннотировать. N-концевая область содержит аминокислотных остатков (а.о.), которые характерны только для семейства FRIGIDA I. Семейство FRIGIDA II представлено белками FRIGIDA-LIKE1 и FRIGIDA-LIKE2. В N-концевой области они содержат участок длиной а.о., характерный только для данного семейства. Семейства FRIGIDA III и FRIGIDA IV представлены белками FRIGIDA-LIKE 3 и FRIGIDA-LIKE4a, FRIGIDA-LIKE4b; соответственно. N-концевые области этого белка также характерны только для членов определенного семейства. Семейство FRIGIDA V представлено белком FRIGIDA-LIKE5. Различия специфичных C- и N-концевых областей говорят о разных биологических функциях этих белков. FRIGIDA и FRIGIDA-LIKE 1/2 (FRL1/2) необходимы для экспрессии FLOWERING LOCUS C, о роли других белков в настоящее время ничего неизвестно (Risk et al. 2010).

Белок FRIGIDA из A. thaliana, является представителем семейства FRIGIDA I. Он содержит консервативный центральный домен Frigida и специфичные C- и N-концевые области, несущие coiled-coil домены (Johanson et al. 2000; Michaels et al. 2004). С-концевая область критична для функциональной активности белка FRIGIDA: в ее отсутствие FRIGIDA не может способствовать транскрипции FLOWERING LOCUS C. Механизм, с помощью которого FRIGIDA активирует экспрессию этого гена, изучен недостаточно. В настоящее время на примере FRIGIDA из A. thaliana определена роль этого белка в активации транскрипции FLOWERING LOCUS C: 1) взаимодействие с кэп-связывающим комплексом (CBP, cap-binding protein complex) (Geraldo et al. 2009); 2) формирование комплекса FRI-C (Choi et al., 2011);

Для первого этапа созревания мРНК необходимо наличие CBP комплекса, состоящего из двух субъединиц CBP20 и CBP80. Потеря CBP приводит к снижению уровня мРНК FLOWERING LOCUS C и увеличению числа несплайсированных транскриптов этого гена. Как часть CBP комплекса, FRIGIDA непосредственно взаимодействует с 5’-кэп сайтом транскрипта этого гена, частично восстанавливая уровень мРНК и нормализируя соотношение сплайсированных и несплайсированных транскриптов FLOWERING LOCUS C. Таким образом, компенсируется потеря CBP20, и уровень экспрессии FLOWERING LOCUS C возрастает (Geraldo et al., 2009).

формирует комплекс FRI-C, необходимый для активации транскрипции FLOWERING LOCUS C. Сборка комплекса осуществляется как физическое взаимодействие, в котором FRIGIDA действует как scaffold, т.е. является основой для сборки компонентов комплекса, FRIGIDA-LIKE 1 (FRL1), FRIGIDA ESSENTIAL1 (FES1), SUPPRESSOR OF FRIGIDA 4 (SUF4), и FLOWERING LOCUS C EXPRESSOR (FLX) (рис. 11). Каждый белок комплекса FRI-C имеет определенную функцию. SUF4 отвечает за связывание с промотором гена FLOWERING LOCUS C, FLOWERING LOCUS C EXPRESSOR и FRIGIDA ESSENTIAL1 необходимы для транскрипционной активности, а FRIGIDA-LIKE 1 и FRIGIDA ESSENTIAL1 стабилизируют комплекс (Choi et al, 2011; Ding et al., 2013).

FRIGIDA Nвзаимодействия с компонентами FRI-C: N –концевая область FRI связывается с N –концевым регионом FRIGIDA-LIKE 1, С –концевая область FRIGIDA взаимодействует с N –концевой областью FLOWERING LOCUS C EXPRESSOR с С –концевой областью SUPPRESSOR OF FRIGIDA 4 и FRIGIDA ESSENTIAL1. SUPPRESSOR OF FRIGIDA 4 взаимодействует с FRIGIDA-LIKE 1, и FLOWERING LOCUS C EXPRESSOR взаимодействует с FES1 (рис. 11А). Высокий уровень экспрессии FLOWERING LOCUS C зависит от физического взаимодействия между специфическими активаторами и основными факторами транскрипции и модификации хроматина. Биохимический и функциональный анализ компонентов FRI-C позволил предложить модель активации транскрипции FLOWERING LOCUS C посредством этого комплекса (рис. 11Б).

Рис. 11. Комплекс FRI-C и его участие в активации транскрипции FLOWERING LOCUS C. (А) Схематическое изображение взаимодействий компонентов комплекса FRI-C; (Б) Модель взаимодействия комплекса FRI-C с факторами модификации хроматина и факторами транскрипции SWR1-C, EFS, и TAF14 (по Choi et al, 2011).

Согласно этой модели, SUF4 непосредственно связывается с cisэлементом, расположенным недалеко от промотера FLOWERING LOCUS C и таким образом, формируется комплекс из FRI-C и другими FLCспецифичными регуляторами. Комплекс FRI-C собирает факторы модификации хроматина и основные факторы транскрипции: SWR1-C, EFS, и TAF14, перед промотором FLOWERING LOCUS C. Образовавшийся комплекс способствует инициации транскрипции FLOWERING LOCUS C и затем опосредует элонгацию транскрипции при взаимодействии с EFS в транскрибируемой области. Однако механизм активации транскрипции образовавшимся комплексом изучен недостаточно (Choi et al, 2011; Ding et al., 2013).

1.8.

арабидопсиса Факторы, запускающие цветение, и определяющая их окружающая среда меняются в зависимости от широты и особенностей климата (Simpson and Dean, 2002). У A. thaliana широта произрастания (широтный клин) влияет на время появления соцветия (bolting time) и зацветания (flowering time) (Brachi et al., 2013a). Считается, что экотипы вдоль широтного клина различаются по восприимчивости к вернализации. Ген FRIGIDA определяет природное разнообразие времени появления соцветия и зацветания в A.

thaliana, что связано с наличием мутаций в локусе FRIGIDA, приводящим к потере функциональности, и предполагается, что такие изменения, способствуют адаптации к местным условиям (Johanson et al., 2000; Le Corre et al., 2002; Le Corre et al., 2005; Stinchcombe et al., 2004).

Stinchcombe и соавторы (Stinchcombe et al., 2004) показали, что экотипы с функциональным аллелем FRIGIDA зацветают в южных широтах значительно раньше, чем северные экотипы. Однако среди экотипов, которые несут нефункциональный аллель FRIGIDA, подобная корреляция не обнаружена. Эти результаты позволили предложить генетическую модель, в которой широтный клин по времени зацветания растений A. thaliana зависит еще от одного гена, для работы которого необходим активный аллель FRIGIDA (Caicedo et al., 2004). А Shindo и соавторы (Shindo et al., 2005) предположили, что такое усиление экспрессии FLOWERING LOCUS C у экотипов с нефункциональным аллелем FRIGIDA может быть связано с возникновением мутаций в генах автономного пути, репрессирующих ген

FLOWERING LOCUS C.

Помимо широтного клина, аллельное разнообразие гена FRIGIDA A.

thaliana связано с высотой места обитания растений над уровнем моря. Когда Mendez-Vigo и соавторы (Mendez-Vigo et al., 2011) описали высотный клин по таким характеристикам, как минимальная зимняя температура и количество осадков, оказалось, что эти показатели связаны с полиморфизмом генов FRIGIDA и FLOWERING LOCUS C и, вероятно, могут быть основными климатическими факторами, оказывающими селективное давление на признаки времени перехода к цветению. Результаты этого исследования еще раз подтверждают, что аллельное разнообразие в генах FRIGIDA и

FLOWERING LOCUS C

изменениям. Таким образом, молекулярное разнообразие гена FRIGIDA сформировано адаптивной эволюцией и обеспечивает способность растений Arabidopsis приспосабливаться к новым климатическим условиям (Toomajian et al., 2006). Точно так же роль гена FRIGIDA в адаптации к изменяющимся климатическим условиям показана при анализе QTL времени зацветания (flowering time) у A. thaliana (Li et al., 2010).

При генетическом анализе популяций A. thaliana полиморфизмы гена FRIGIDA обнаруживается как QTL времени перехода к цветению и вернализации (Koornneef et al. 1998; Levy и Dean, 1998). Однако, несмотря на твердо установленное участие гена FRIGIDA в регуляции времени зацветания, этот ген не всегда обнаруживают среди QTLs признаков времени перехода к цветению (табл. 1) (Brachi et al., 2010, Brachi et al.,2013a; Grillo et al., 2013).

Grillo и соавторы (Grillo et al.,2013) не обнаружили связи гена FRIGIDA с QTL времени перехода к цветению, хотя c этим QTL была ассоциирован ген FLOWERING LOCUS C, на уровень экспрессии которого, как известно, влияют аллельные формы гена FRIGIDA. В исследованиях Brachi и соавторов (Brachi et al., 2010, Brachi et al.,2013a) среди популяций A. thaliana, распространенных по всему миру, большинство найденных генов, ассоциированных с изменениями во времени перехода к цветению, относились к регуляторам циркадных часов, а корреляция с генами FRIGIDA и FLOWERING LOCUS C отсутствовала.

Возникает вопрос, почему ген FRIGIDA не всегда попадает в QTLs признаков времени перехода к цветению?

Существует много факторов, которые могут повлиять на процесс обнаружения QTLs. Главными из них являются генетические свойства QTLs, контролирующих признак, факторы окружающей среды, размер популяции и экспериментальные ошибки (Churchill et al., 1994). Для QTL анализа очень важно четкое проявление исследуемого признака. Как говорилось выше, процесс цветения находится под контролем сложной сети генов, которую запускают каскады сигналов внешней среды. Пути, по которым передаются эти сигналы, перекрываются и сложным образом взаимодействуют. Таким образом, факторы окружающей среды и их изменение определяют выбор пути передачи сигнала, запускающего определенные стадии процесса цветения. Главными источниками экспериментальных ошибок являются ошибки при генотипировании растений с помощью маркеров и/или фенотипические изменения. Ошибки генотипирования или недостаток маркеров могут повлиять на расположение маркеров на карте сцепления.

Полиморфные маркеры не всегда равномерно распределены вдоль хромосомы, они часто образуют кластеры в одних местах и отсутствуют в других. В дополнение к неравномерному распределению маркеров, частота рекомбинаций неодинакова вдоль хромосом. Недостаток маркеров или высокая гетерогенность исследуемых геномов могут привести к тому, что гены, связанные с QTLs исследуемого признака, не обнаруживаются при этом анализе. Особенности регистрации фенотипического изменения исследуемого признака имеют наибольшее значение для точного картирования QTLs. В целом, разрешение при картировании исследуемого признака определяется тремя показателями: плотностью маркеров, размером популяции и точностью оценки количественного признака (Collard et. al., 2005).

В работах, указанных в табл. 1, условия проведения экспериментов с растениями арабидопсиса были различными: одни проводились в искусственных условиях климатических камер и теплиц, другие в естественных природных условиях. Кроме того, в этих опытах исследовали экотипы из разных климатических зон произрастания. Лабораторные условия, в которых обычно выращивают растения Arabidopsis, могут не соответствовать тем условиям, в которых исследуемые экотипы находятся в привычных местах их обитания и, скорее, соответствуют крайнему положению на шкале вариации – в отличие от нормальных мест обитания, которые обычно гораздо прохладнее и суше (Hoffmann, 2002). Это сильно влияет на интерпретацию фенотипических различий между результатами, полученными в теплице, климатических камерах и на открытых площадках.

Кроме того, когда растения выращивают в климатических камерах или теплицах, воспроизводя там природные условия роста, а затем пересаживают на открытые площадки, можно обнаружить QTLs, которые не были найдены, когда растения выращивали при постоянных условиях внешней среды (Weigel, 2012). Например, различные популяции A. lyrata зацветали в разное время в климатических камерах, однако после вернализации они зацветали одинаково рано. Вероятно, в естественных природных условиях растения подвергаются вернализации во время зимы, и разнообразие по времени зацветания, которое наблюдается в климатических камерах без вернализации, может не проявляться в природных условиях после первого

FRIGIDA

плейотропное воздействие на другие признаки. Как известно, у растений A.

thaliana FRIGIDA влияет не только на требование в вернализации, но и на эффективность использования воды (Kuittinen et al., 2008; McKay et al. 2003).

По мнению Brachi et al. (2010), проведение экспериментов, связанных с вернализацией, осложняется тремя причинами: (1) различные экотипы могут предъявлять разные требования к таким условиям вернализации, как температура, продолжительность воздействия холодом и стадия развития, на которой произошла вернализация; (2) возможен перезапуск экспрессии FLOWERING LOCUS C, когда во время вернализации в природных условиях происходят скачки температур; (3) на уровень экспрессии FLOWERING LOCUS C влияют гены автономного пути. В естественных условиях, в которых проводились эксперименты Brachi и соавторов (2010), температура зимой не была постоянной. Возникают сложности при GWA анализе, если наблюдается высокая гетерогенность исследуемого гена в популяций.

FRIGIDA является классическим примером аллельной гетерогенности в популяциях A. thaliana (Atwell et al., 2010). При всех своих преимуществах, GWA картирование генов, лежащих в основе изменения фенотипа, имеет существенные ограничения, когда сравниваются популяции из географически отдаленных регионов. Во-первых, сильное смешение в ложноотрицательным результатам (Brachi et al., 2010). Во-вторых, при этом трудно обнаружить редкие аллели, потенциально важные для локальной адаптации (Atwell et al., 2010). В-третьих, притом что в природных популяциях один и тот же фенотипический признак может быть вызван разными аллелями одного и того же гена, аллельный полиморфизм может затруднить обнаружение геномных областей, связанных с фенотипической природной изменчивостью (Brachi et al., 2013b).

Несмотря на описание 13 нефункциональных аллелей FRIGIDA в популяциях A. thaliana, собранных во Франции (Le Corre et al., 2002; Le Corre 2005), в последующих исследованиях Brachi и соавторов ген FRIGIDA соответствовал QTL признака цветения среди французских картирующих популяций и местных французских природных популяций A. thaliana.

Существует две гипотезы, с помощью которых можно объяснить этот результат. Первая гипотеза предполагает, что один из нефункциональных аллелей может доминировать над другим, нефункциональным аллелем Вторая, полиморфизмы FRIGIDA могут быть разделены между несколькими нефункциональными аллелями (Brachi et al., 2013b). Точно так же в опытах с рапсом (Raman et al., 2013), QTL анализ показал, что время перехода к цветению – это сложный признак, который контролируется, по меньшей мере Таблица 1. Анализ связи гена FRIGIDA cо временем перехода растений Arabidopsis к цветению Koornneef et al. Johanson et al, Shindo et al., Stinchcombe et al., Stinchcombe et al., Le Corre et al., Kuittinen et al., Brachi et al., 2010:

Brachi et al., 2013a Brachi et al., 2013b Grillo et al., 20 различными локусами, локализованными на десяти хромосомах. И тем не менее, на эти локусы приходится не более 30% дисперсии по признакам начало цветения и ответ на вернализацию. Некоторые QTLs для времени зацветания несут хорошо известные гены вернализации VERNALISATION INSENSITIVE 3 и FLOWERING LOCUS C, однако среди их не найден ген FRIGIDA, расположенный на той же хромосоме A3.

Помимо полиморфизма последовательностей генов, существует эпигенетический полиморфизм FRIGIDA и FLOWERING LOCUS C. Для A.

thaliana показано наличие дифференциально метилированных регионов (differentially methylated regions, DMRs), которые выступают в качестве эпигенетических локусов количественных признаков (QTLepi) и составляют 60-90% от наследования для двух сложны признаков, время перехода к цветению и длина первичного корня. Такие DMRs также определяют природное разнообразие популяций A. thaliana по признаку времени зацветания, независимо от изменений последовательностей ДНК (Cortijo et.

al., 2014). Несмотря на несомненно важную роль в регуляции перехода к цветению, ген FRIGIDA, в силу всех вышеописанных причин, может не обнаруживаться в QTLs признака времени цветения.

SCAR маркеры как инструмент для выявления полиморфизма, 1.9.

различения и идентификации геномов Brassica ДНК маркеры являются генетическими инструментами, позволяющими решать самые разнообразные задачи. Их используют для генотипирования, установления родства и эволюционных связей между организмами и их таксонами, картирования генов и признаков. ДНК маркеры широко применяются при межвидовой гибридизации и интрогрессивной селекции для создания новых сортов рапса, сурепицы и капусты. Эффективность селекции значительно возрастает при использовании ДНК маркеров, позволяющих следить за интрогрессией фрагментов генома и оценивать внутривидовой полиморфизм для идентификации ценных аллелей и локусов.

В качестве таких ДНК маркеров на сегодняшний день наиболее часто используются SCAR маркеры (Sequence Characterised Amplified Region).

SCAR маркеры – фрагменты ДНК, амплифицируемые со специфичными ПЦР праймерами, сконструированными на основе клонированных фрагментов целевого гена с известной нуклеотидной последовательностью.

Основными преимуществами SCAR маркеров являются простота тестирования, наличие единственного фрагмента, а, следовательно, однозначность интерпретации, возможность автоматизации протокола.

Недостатком SCAR маркеров является сложная процедура создания маркеров, включающая этапы клонирования и секвенирования генов или других фрагментов генома, особенно в тех случаях, когда в базах данных нет достаточного количества нуклеотидных последовательностей целевых фрагментов ДНК.

1.10. Обзор патентов, связанных с практическим использованием генов развития Активное изучение генов, контролирующих процессы развития, у разных видов растений, позволило использовать эти гены для создания трансгенных форм культурных растений с улучшенными свойствами.

Постоянно появляются новые технологии создания генетических конструкций, векторов, молекулярных маркеров, пригодных для использования при трансформации растений с целью улучшения их хозяйственно ценных характеристик. Эти сорта и технологии их получения имеют коммерческую ценность, и поэтому авторы стремятся защитить их от несанкционированного использования при помощи патентования. Растущее число патентов, выданных на такие объекты, свидетельствует о практической значимости исследований, направленных на изучение генов развития. Ниже приведены примеры патентов, полученных за последние десять лет в области, связанной с генно-инженерными применениями генов развития растений (табл. 2).

Таблица 2. Патенты на изобретения, связанные с практическим использованием генов развития растений.

1.11. Заключение и постановка задач диссертационной работы Значительный прогресс в изучении генетики цветения растений достигнут преимущественно на основании исследований модельных Охарактеризовано множество генов, контролирующих процесс цветения, и показаны пути их взаимодействия. Несмотря на несомненные успехи в исследовании генетических путей, контролирующих переход растений от вегетативного к репродуктивному развитию, многие стороны этого процесса остаются еще недостаточно изученными. Информация о молекулярных механизмах регуляции цветения растений постоянно пополняется новыми данными. Так, структурные гомологи генов цветения A. thaliana были найдены и у многих других видов растений, однако сведения об их функциях по большей части носят отрывочный характер. Для сельскохозяйственных культур изучение полиморфизма генов цветения и связи этого полиморфизма с фенотипическими характеристиками может оказаться важным с практической точки зрения, поскольку признаки, связанные с временем перехода к цветению у различных жизненных форм растений, являются одной из важнейших точек приложения селекции.

Исходя из концепции генов-кандидатов, мы выбрали в качестве основной задачи нашего исследования анализ гомологов гена FRIGIDA, во многом определяющего разнообразие во времени цветения у A. thaliana. и провели выделение и сравнительный анализ последовательностей FRIGIDA из геномов шести культурных видов Brassica. Несмотря на большое недостаточно изучен у этих растений. В работах Wang et al. (2011) и Irwin et al. (2012), опубликованных в период выполнения нашего исследования, были охарактеризованы последовательности гена FRIGIDA у B. oleracea и B. napus, ассоциированные со временем перехода к цветению. С учетом этих публикаций, нашими первоочередными задачами было исследование представленных в треугольнике U, прежде всего, у B. rapa, и сопоставление наших результатов с данными Wang et al. (2011) и Irwin et al. (2012) в более широком контекста эволюции рода Brassica и эколого-географических особенностей регуляции перехода к цветению у этих растений.

Мы ожидали, что сравнительный анализ последовательностей гена FRIGIDA из геномов и субгеномов A, B и C у культурных видов Brassica позволит выявить локус- и геном-специфичные полиморфизмы. Изучение полиморфизмов FRIGIDA необходимо для создания специфичных маркеров, которые могут использоваться для уточнения связи этого гена с QTL времени перехода к цветению и для интрогрессивной селекции культурных видов Brassica, в том числе на время зацветания и скороспелость.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Растительный материал Семена растений Brassica были получены из коллекций Centre for Genetic Resources, Вагенинген, Нидерланды (CGN), Warwick Horticulture Research International, Уеллесборн, Великобритания (GK) и ВНИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова, С. Петербург (ВИР). Семена проращивали два дня на влажной фильтровальной бумаге и затем высаживали в почву. Растения выращивали при комнатой температуре при постоянном освещении под лампами OSRAM Circolux EL (24W).

2.2. Методы исследования 2.2.1. Выделение геномной ДНК из тканей растений Геномную ДНК выделяли из свежесобранных листьев с помощью набора AxyPrep Multisourse Genomic DNA Miniprep kit (Axygen, США) согласно протоколу фирмы-производителя.

2.2.2. Выделение плазмидной ДНК Для выделения плазмидной ДНК использовали набор AxyPrep Plasmid Miniprep Kit (Axygen, США) согласно протоколу фирмы-производителя.

2.2.3. Определение концентрации нуклеиновых кислот Концентрацию нуклеиновых кислот измеряли при 260 нм на NanoPhotometer P 300 (IMPLEN, Germany). Качество выделения и чистоту нуклеиновых кислот определяли по отношению OD260/OD280. Оптимальное отношение должно равняться 1.8 – 2.0.

2.2.4. Амплификация фрагментов геномной ДНК Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в амплификаторе DNA Engine PTC 200 (Bio-Rad, США) по следующим программам.

Амплификацию полноразмерных последовательностей гена FRIGIDA осуществляли по программе: 1 цикл 30 с при 94°С; 30 циклов 30 с при 62°C, 3 мин 30 с при 72°C; один цикл 15 мин при 72°C. Для амплификации специфичных фрагментов гена FRI использовали следующую программу: цикл 30 с при 94°С; 30 циклов 30 с при 58°C, 2 мин при 72°C; один цикл мин при 72°C. Реакционная смесь объёмом 10 мкл содержала: 10x PCR буфер, 2 мM MgCl2, 100 нг геномной ДНК, 0.2 мM dNTP, 1 мM прямого and мM обратного праймеров, и 1 U Taq-ДНК полимеразы (Fermentas, Germany) или 2,5 U Pfu-полимеразы (Fermentas).

При анализе большого числа образцов готовили общую реакционную смесь, включающую все компоненты, кроме ДНК. Для каждой ПЦР реакции составлялся протокол, в котором указывалось общее количество всех компонентов реакционной смеси, исходя из расчета на одну реакцию (образец). Количество праймера, идущего на одну реакцию рассчитывали исходя из его концентрации (пмоль/мл). Для проверки чистоты компонентов реакционной смеси ставили контроль, в который вместо ДНК добавляли воду (отрицательный контроль). Далее помещали пробирку в амплификатор и проводили ПЦР по заданной программе в зависимости от условий проведения реакции (температуры отжига праймеров и времени элонгации).

2.2.5. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК Для разделения продуктов амплификации использовали электрофорез в 0,8 % агарозном геле в присутствии бромистого этидия: в гели объёмом мл добавляли 1 мкл раствора бромистого этидия (10 мг/мл). Длину амплифицированных фрагментов ДНК определяли с помощью маркеров Gene Ruler 1kb DNA Ladder (“Promega”, США) и Gene Ruler 1kb plus DNA Ladder (“Promega”, США).

Pages: |

| 2 |

Главная >> Диссертации - все темы

[ СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА .pdf ]

Похожие работы:

«Андреев Александр Александрович СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ОТХОДОВ ЛЕСОПИЛЕНИЯ КАК СЫРЬЯ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДРЕВЕСНО-ЦЕМЕНТНЫХ МАТЕРИАЛОВ Специальность 05.21.01 – Технология и машины лесозаготовок и лесного хозяйства Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель доктор...»

«УДК: 616.379-008.64-577.17.049.053.5 БАДАЛОВА СИТОРА ИЛЬХОМОВНА СОДЕРЖАНИЕ ЭССЕНЦИАЛЬНЫХ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ У ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ, БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 1ТИПА И ОЦЕНКА ИХ ФИЗИЧЕСКОГО РАЗВИТИЯ 5А 510102 - Эндокринология Магистерская диссертация на соискание академической степени магистра Научный руководитель Доктор медицинских наук, профессор ХАМРАЕВ Х.Т. Самарканд ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«ИЗ ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Туча, Николай Александрович Повышение безопасности труда работников горнодобывающих отраслей на основе профотбора и текущего контроля психофизиологического потенциала организма Москва Российская государственная библиотека diss.rsl.ru 2006 Туча, Николай Александрович Повышение безопасности труда работников горнодобывающих отраслей на основе профотбора и текущего контроля психофизиологического потенциала...»

«ЛЕДНЕВ Олег Андреевич ОЦЕНКА ХРОНОФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ФОЗИНОПРИЛА И ЕГО КОМБИНАЦИИ С МЕЛАТОНИНОМ У ПОЖИЛЫХ БОЛЬНЫХ ПРИ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ И ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА 14.03.06 – Фармакология, клиническая фармакология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель...»

«Касаткин Алексей Александрович Симметрии и точные решения уравнений с производными дробного порядка типа Римана-Лиувилля 01.01.02 – Дифференциальные уравнения, динамические системы и оптимальное управление Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Научный руководитель : доктор...»

«Браилов Юрий Андреевич УДК 513:944 Геометрия особенностей интегрируемых систем на алгебрах Ли 01.01.04. – геометрия и топология Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Научные руководители академик А. Т. Фоменко, д. ф.-м. н. А. В. Болсинов МОСКВА – 2003 Оглавление 0 Введение 3 1 Cдвиги инвариантов на алгебре su(3) 10 1.1 Уравнения движения.......»

«Жданов Андрей Геннадьевич ПОВЫШЕНИЕ НАДЕЖНОСТИ АНАЛИЗА ДАННЫХ ВИХРЕТОКОВОГО КОНТРОЛЯ ТЕПЛООБМЕННЫХ ТРУБ ПАРОГЕНЕРАТОРОВ АЭС Специальность 05.11.13 – Приборы и методы контроля природной среды, веществ, материалов и изделий Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Москва – 2014 Оглавление Основные обозначения и сокращения Введение АНАЛИЗ СОВРЕМЕННОГО СОСТОЯНИЯ НЕРАЗРУШАЮЩЕГО КОНТРОЛЯ ТРУБ 1 ПАРОГЕНЕРАТОРОВ АЭС Структура и принцип действия ПГ 1....»

«Богомолова Наталья Николаевна ГЕОДЕЗИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ ТРАНСПОРТНЫХ ТОННЕЛЕЙ, СООРУЖАЕМЫХ ГОРНЫМ СПОСОБОМ Специальность 25.00.32 – Геодезия Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель : кандидат технических наук, доцент Брынь...»

«ЗЫКОВА ИРИНА ВЛАДИМИРОВНА РОЛЬ КОНЦЕПТОСФЕРЫ КУЛЬТУРЫ В ФОРМИРОВАНИИ ФРАЗЕОЛОГИЗМОВ КАК КУЛЬТУРНО-ЯЗЫКОВЫХ ЗНАКОВ Специальность: 10.02.19 – Теория языка (филологические наук и) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора филологических наук Научный консультант : доктор филологических наук, профессор Телия Вероника Николаевна доктор филологических наук, профессор Беляевская...»

«Кикин Андрей Борисович РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ И СРЕДСТВ ДЛЯ СТРУКТУРНОКИНЕМАТИЧЕСКОГО ПРОЕКТИРОВАНИЯ РЫЧАЖНЫХ МЕХАНИЗМОВ МАШИН ЛЕГКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ Специальность 05.02.13 - Машины, агрегаты и процессы (легкая промышленность) Диссертация на соискание ученой степени доктора технических наук V ;г, 7 Г.^ТЗ ~ \ Научный консультант ^' '^-^•'-^зн(->,1\^/1\. 1 и1'^А, 5 д.т.н. проф. Э.Е. Пейсах „, Наук...»

«СОКОЛОВА Ольга Владимировна БЫТИЕ ПОЛА В СОЦИАЛЬНОЙ ДИСКУРСИВНОСТИ 09.00.11 – социальная философия Диссертация на соискание ученой степени кандидата философских наук Научный руководитель : доктор философских наук, профессор О.Н. Бушмакина Ижевск-2009 г. Содержание Введение.. Глава I. Онтология предела в дискурсе пола. §1...»

«Моторина Наталья Валерьевна Лингвокультурные скрипты традиционного коммуникативного поведения в России и Англии 10.02.20 – сравнительно-историческое, типологическое и сопоставительное языкознание Диссертация на соискание ученой степени кандидата филологических наук Научный руководитель : доктор филологических...»

«Чехович Евгений Александрович ЯДЕРНЫЕ СПИНОВЫЕ ЭФФЕКТЫ В ПОЛУПРОВОДНИКОВЫХ КВАНТОВЫХ ТОЧКАХ ПРИ ОПТИЧЕСКОМ ВОЗБУЖДЕНИИ 01.04.07 - физика конденсированного состояния Диссертация на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук Научный руководитель доктор физико-математических наук Кулаковский В. Д. Черноголовка 2010 Оглавление Введение 1. Литературный обзор 1.1. Ядерная спиновая система в твердом теле......»

«Спирина Людмила Викторовна РОЛЬ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ СИСТЕМ В ФОРМИРОВАНИИ СОСУДИСТЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ САХАРНОГО ДИАБЕТА 1 ТИПА У ДЕТЕЙ 14.00.16 - патологическая физиология 14.00.09 - педиатрия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Суханова Г.А. Научный консультант : доктор медицинских наук...»

«ЗАКЛЮЧЕНИЕ ДИССЕРТАЦИОЛННОГО СОВЕТА Д 212.198.06 НА БАЗЕ ФЕДЕРАЛЬНОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО БЮДЖЕТНОГО ОБРАЗОВАТЕЛЬНОГО УЧРЕЖДЕНИЯ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ГУМАНИТАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ В СООТВЕТСТВИИ С ПРИКАЗОМ МИНОБРНАУКИ РОССИИ №428/НК ОТ 12 АВГУСТА 2013 Г. ПО ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА НАУК, аттестационное дело №_ решение диссертационного совета от 16 июня 2014 г., протокол № 8 О присуждении САМБУР МАРИНЕ ВЛАДИМИРОВНЕ, ГР. РФ степени...»

«Браганец Семен Александрович АДАПТИВНАЯ СИСТЕМА УПРАВЛЕНИЯ ОТКРЫТИЕМ НАПРАВЛЯЮЩЕГО АППАРАТА ГИДРОАГРЕГАТА С ПОВОРОТНОЛОПАСТНОЙ ТУРБИНОЙ 05.11.16. – Информационно-измерительные и управляющие системы...»

«Оселедец Иван Валерьевич УДК 519.6 Нелинейные аппроксимации матриц 01.01.07 Вычислительная математика ДИССЕРТАЦИЯ На соискание учёной степени кандидата физико-математических наук Научный руководитель чл.-корр. РАН, проф. Тыртышников Е. Е. Москва 2007 1 Содержание Введение 2 i.1 Нелинейные аппроксимации матриц: зачем и как.... 3 i.2 Основные результаты работы................ i.3 Содержание работы...»

«Кравцова Мария Владимировна МЕЖСТРАНОВОЙ АНАЛИЗ РЫНОЧНОЙ И СЕТЕВОЙ КОРРУПЦИИ: ФАКТОРЫ, ПОСЛЕДСТВИЯ, ВЗАИМОСВЯЗЬ Специальность 22.00.03 Экономическая социология и демография Диссертация на соискание ученой степени кандидата социологических наук Научный руководитель д.э.н. Косалс Л.Я. Москва - 2014 1 Оглавление Введение.. Глава 1: Классификация коррупции. 1.1. Обоснование необходимости учета качественного...»

«ДЕМЕХИН Филипп Владимирович ФОРМИРОВАНИЕ И РАСПАД РЕЗОНАНСНЫХ СОСТОЯНИЙ АТОМОВ И ПРОСТЫХ МОЛЕКУЛ, ВОЗБУЖДЕННЫХ МЯГКИМ РЕНТГЕНОВСКИМ И УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫМ ИЗЛУЧЕНИЕМ 01.04.05 — оптика Диссертация на соискание ученой степени доктора физико-математических наук Воронеж – 2007 2. Список сокращений АО атомная орбиталь ВПТВ второй порядок теории возмущений ВУ вековое (секулярное) уравнение ДЛП спектроскопия двойной лазерной плазмы...»

«УДК 539.196 Ермолова Екатерина Владимировна ДИНАМИКА ПРОЦЕССОВ ПРЯМОЙ ТРЕХТЕЛЬНОЙ РЕКОМБИНАЦИИ ТЯЖЕЛЫХ ИОНОВ Специальность 01.04.17 — Химическая физика, горение и взрыв, физика экстремальных состояний вещества Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Научный руководитель — д.ф.-м.н. Л.Ю. Русин Москва – ОГЛАВЛЕНИЕ...»

наверх

<< ГЛАВНАЯ | КОНТАКТЫ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА (Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

«СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ГЕНА FRIGIDA У ВИДОВ BRASSICA ...»

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ РОССИЙЧКОЙ АКАДЕМИИ

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ГЕНА FRIGIDA У ВИДОВ

BRASSICA

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

FLC - FLOWERING LOCUS C

FLX - FLOWERING LOCUS C EXPRESSOR

FT - FLOWERING LOCUS T

SOC1 - SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS

SUF4 - SUPPRESSOR OF FRIGIDA

SVP – SHORT VEGETATIVE PHASE

VIN3 - VERNALIZATION INSENSITIVE

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ (ВВЕДЕНИЕ)

LOCUS T

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

FLOWERING LOCUS C (FLC), FLOWERING LOCUS T (FT), SUPPRESSOR OF

T, SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1 и FLOWERING

FLOWERING LOCUS C,

FLOWERING LOCUS T и SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF

FLOWERING LOCUS T (FT), SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO

VERNALIZATION

FLOWERING LOCUS C

FLOWERING LOCUS C.

FLOWERING LOCUS C,

ARABIDOPSIS TRITHORAX-RELATED7 (ATXR7) и ARABIDOPSIS

HOMOLOG OF TRITHORAX1/ ARABIDOPSIS HOMOLOG OF TRITHORAX

(SWN), FERTILIZATION-INDEPENDENT ENDOSPERM (FIE) и MUSASHI

FLOWERING LOCUS C.

FLOWERING LOCUS C.

FLOWERING LOCUS C

FRIGIDA

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)