«РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ ФИКСАЦИИ ДНК НА РАЗЛИЧНЫХ ПОВЕРХНОСТЯХ И ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ СФОРМИРОВАННЫХ СТРУКТУР. ...»

Федеральное государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего профессионального образования

«Санкт-Петербургский государственный университет»

ФИЗИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Кафедра молекулярной биофизики

На правах рукописи

СОКОЛОВ Петр Александрович

РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ ФИКСАЦИИ ДНК НА РАЗЛИЧНЫХ

ПОВЕРХНОСТЯХ И ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ

СФОРМИРОВАННЫХ СТРУКТУР.

02.00.06 – высокомолекулярные соединения Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Научный руководитель:

д.ф.-м.н, профессор Касьяненко Н.А.

Санкт-Петербург – Оглавление Введение

ГЛАВА 1

1.1. Сопряжение ДНК с твердотельной электроникой

1.1.1. Подготовка поверхности кремния

1.1.2. Взаимодействие протравленной поверхности кремния с компонентами раствора

1.1.3. Поверхностные электронные состояния монокристаллов кремния................ 1.1.4. Исследования электронных свойств интерфейса ДНК-кремний с помощью контактов металл-полупроводник

1.2. Соединения фенантролина и их свойства

1.2.1. Противоопухолевая активность фенантролиновых соединений

1.2.2. Хемосенсоры на основе фенантролина

1.2.3. Потенциальное применение соединений фенантролина

1.2.4. Взаимодействие фенантролиновых соединений с различными поверхностями

1.3. Иммобилизация ДНК на различных поверхностях

1.3.1. Иммобилизация ДНК на подложке из кремния в присутствии ионов магния

1.3.2. Фиксация ДНК на поверхность слюды

1.3.3. Ориентация ДНК на поверхности подложки

1.3.4. Фиксация ДНК на поверхность золота

ГЛАВА 2

2.1. Материалы

2.2. Методика фиксации ДНК на подложки

2.3. Создание диодов Шоттки

2.4. Метод поверхностного плазмонного резонанса

2.5. Метод атомной силовой микроскопии

2.6. Исследование электрофизических свойств интерфейса ДНК-кремний................. 2.6.1. Обоснование методики эксперимента

2.6.2. Идеальный шоттки-контакт

2.6.3. Вольт-амперная характеристика барьера Шоттки

2.6.4. Вольт-фарадная характеристика барьера Шоттки

2.7. Вискозиметрия

2.8. Программное обеспечение

ГЛАВА 3

3.1. Светоуправляемая фиксация ДНК на поверхность кремния

3.2. Исследование электрофизических свойств интерфейса ДНК-кремний............... 3.2.1. Результаты измерений вольт-амперных характеристик (ВАХ)

3.2.2. Результаты измерений вольт-фарадных характеристики (ВФХ)

3.3. Фиксация ДНК при помощи серосодержащего производного фенантролина... 3.3.1. Фиксация на золотую поверхность

3.3.2. Фиксация на поверхность слюды

3.3.3. Фиксация на поверхность кремния

3.3.4. Взаимодействие соединения фенантролина с молекулой ДНК в растворе.. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Список литературы

Введение Актуальность темы исследования и степень ее разработанности.

Уменьшение размеров электрических схем до нанометрового масштаба ставит перед исследователями задачу по поиску новых способов создания их различных элементов.

В частности, для производства миниатюрных контактов некоторое время назад было предложено использовать ДНК [1, 2]. Благодаря способности этой макромолекулы к самоорганизации, стало возможным создавать наноструктуры с заранее определенной геометрией и разрешением до 6 нм, которые можно использовать как составные части электрических наносхем [3]. Исследование проводимости ДНК проводится достаточно широко [4], хотя в этом вопросе остается еще много неясного. Возможность сопряжения ДНК с твердотельной электроникой позволяет создавать различные полупроводниковые устройства, в том числе биодатчики [5-7]. Перспектива электрических схем и биосенсоров требует более тщательного изучения вопросов фиксации макромолекулы на поверхность кремния, который является основой современных электрических микросхем. В частности, необходимо найти способы размещения ДНК в определенном месте наносхемы [8] и установить условия, при которых полимер образует различные упорядоченные структуры на поверхности полупроводника.

Одной из важных задач является изучение влияния заряженной молекулы ДНК при ее фиксации на электрические свойства приповерхностной области полупроводниковой подложки [9, 10]. Это позволит создавать воспроизводимые элементы схем, а также управлять их электрическими свойствами. Собственный заряд биополимера и захват носителей из полупроводника на поверхностные состояния, обусловленные присутствием молекулы, будут менять потенциал поверхности полупроводника, что приведёт к изменению проводимости приповерхностного слоя кристалла кремния. Это может повлечь за собой нарушение работы электронных компонентов (транзисторов и диодов), которые были включены в схему посредством ДНК. С другой сторон, с помощью изменения заряда молекулы, являющейся соединительным проводником, может быть осуществлено управление режимом работы активных компонентов схемы. В связи с этим возникает задача исследований как электронных свойств собственно молекулы, зафиксированной на поверхности, так и свойств интерфейса структуры ДНК-кремний.

Зондовая микроскопия дает возможность визуализации и изучения конформации, механических и электрических свойств, упругости [11, 12], проводимости [4] отдельных молекул ДНК и ее комплексов с разными лигандами. В связи с этим актуален вопрос о степени возмущения, которое претерпевает макромолекула в процессе иммобилизации на поверхности при проведении измерений [13]. Ответ на данный вопрос позволит экстраполировать данные эксперимента на случай невозмущенной конформации макромолекулы в растворе, что имеет особое значение для биофизических исследований. Поиск способа фиксации, при котором биологический полимер испытывает минимальные возмущения, является важной задачей зондовой микроскопии.

С развитием в последние годы метода поверхностного плазмонного резонанса (ППР) применительно к исследованию взаимодействия ДНК с белками [14, 15] и различными лигандами [16, 17] возникла потребность в простом и надежном способе подготовки чипов, содержащих на золотой поверхности ДНК. Зафиксировать ДНК на золотой поверхности было предложено с помощью 11-меркаптоундекановой кислоты в присутствии двухвалентных ионов [18], которые, однако, затрудняют интерпретацию данных об интеркаляции [19]. Альтернативный способ – фиксация путем химической модификации олигонуклеотидов различными группами [20]. Вместе с тем, такой способ не годится для решения целого ряда задач. Кроме того, это удорожает и усложняет эксперимент, в то время как методы фиксации высокомолекулярной ДНК на золотую поверхность практически не развиты. Похожие затруднения возникают при создании биочипов [21, 22] и подготовке образцов ДНК для микроскопии на поверхности слюды, стекла, кремния [23]. При этом исследования позволили бы осознанно подойти к созданию и проектированию новых биосенсоров [24, 25] и управляемых супрамолекулярных структур на основе ДНК-оригами [26, 27] в будущем.

Сказанное выше свидетельствует об актуальности проведенных в работе исследований и практической значимости полученных результатов.

Цели и задачи работы. Целью диссертационной работы является разработка новых способов фиксации высокомолекулярной ДНК на поверхности слюды, кремния и золота, а также изучение сформированных на подложке структур.

В диссертации решаются следующие задачи:

1. Подбор оптимального способа фиксации ДНК на поверхности кремния для дальнейшей металлизации.

2. Осуществление металлизации зафиксированных молекул ДНК на слюде, стекле, кремнии.

3. Изучение электрофизических свойств интерфейса ДНК-кремний (вольтамперные и амплитудно-частотные характеристики).

4. Рассмотрение взаимодействия ДНК с серосодержащим производным фенантролина.

5. Исследование процесса адсорбции серосодержащего производного фенантролина на поверхность золота, кремния, слюды и стекла.

6. Разработка способа фиксации молекул ДНК на модифицированные серосодержащим производным фенантролина поверхности золота, кремния, 7. Подобор условий для исследования формируемых систем методом плазмонного резонанса.

8. Сравнительный анализ различных способов фиксации ДНК на поверхности.

Научная новизна. В работе впервые предложены способы фиксации ДНК на поверхность кремния в зависимости от облучения. Впервые показана возможность формирования протяженных упорядоченных фибрилл ДНК на поверхности кремния и проведена их металлизация. Впервые проведена оценка плотности поверхностных состояний кремния после фиксации ДНК. Предложен новый способ размещения на поверхности золота, кремния, слюды серосодержащего производного фенантролина, обеспечивающий последующую фиксацию ДНК на модифицированные поверхности.

Положения, выносимые на защиту:

• Характер фиксации ДНК из раствора на поверхность кремния в присутствии ионов магния зависит от облучения образца.

• Участие ДНК в формировании интерфейса Au-кремний существенно изменяет его электрофизические свойства.

• Качество металлизации ДНК на подложке зависит от свойств сформированных биополимером структур.

• Адсорбционные свойства фенантролина на поверхности золота, кремния, слюды могут быть значительно улучшены путем введения серосодержащей группы.

• Модифицированные серосодержащим фенантролином поверхности слюды, золота и кремния способны фиксировать ДНК.

полученных результатов подтверждается согласованностью данных, полученных различными методами и воспроизводимостью результатов.

Результаты работы были доложены на всероссийских и международных конференциях:

• X International Conference on “Nanostructured Materials”, 2011.

• 11th Internatioal Conference on Atomically Controlled Surfaces, Interfaces and Nanostructures, 2009.

• 17th IUPAB International Biophysics Congress, 2013.

• The 8-th International Symposium “Molecular Order and Mobility in Polymer Systems”, 2014.

• 6 Всероссийская Каргинская конференция «Полимеры — 2014», 2014.

Основные результаты диссертации опубликованы в статьях:

• N.V. Bazlov, O.F. Vyvenko, P.A. Sokolov, N.A. Kas’yanenko, Yu V. Petrov Chargecontrolled fixation of DNA molecules on silicon surface and electro-physical properties of Au–DNA–Si interface // Applied Surface Science. 2013. Volume 267. PP. 224–228.

• V. N. Demidov, N. A. Kas’yanenko, V. S. Antonov, I. L. Volkov, P. A. Sokolov, T. B.

Pakhomova, S. A. Simanova Reaction with DNA and pharmacologic activity of 1,10phenanthroline and electron-rich 1,10-phenanthrocyanine complexes of d-elements // Russian Journal of General Chemistry. 2012. Volume 82, Issue 3. PP. 602-620.

• P. A. Sokolov, N. V. Bazlov, A. O.Puchkova, O. F. Vyvenko, and N.A. Kasyanenko DNA Immobilization on n-Type Silicon Surface and Electrophysical Properties of Au/DNA/ (n-Si) Structures // Protection of metals and physical chemistry of surfaces. 2011. Volume 47. Issue 5. PP. 566-571.

• Puchkova A. O., Sokolov P. A., Kasyanenko N. A. Metallization of DNA on the surface // Journal of Structural Chemistry. 2011. Volume 52. Issue 6. PP. 1195-1201.

• Puchkova A. O., Sokolov P. A., Petrov. Y. V., Kasyanenko N. A. Metallization of DNA on silicon surface // Journal of Nanoparticle Research. 2011. Volume 13. Issue 9. PP.

3633-3641.

• Пучкова А. О., Соколов П. А., Лопатько К. Г., Касьяненко Н. А. Фиксация ДНК на нанопроволок // Труды МФТИ. 2011. Том 3. № 2. стр. 43-47.

ГЛАВА 1.1. Сопряжение ДНК с твердотельной электроникой микроскопии или электроники его поверхность необходимо очистить, чтобы убрать как образовавшийся в процессе хранения оксид кремния, так и адсорбировавшиеся из окружающей среды соединения. Таким образом можно исключить появление артефактов. В работе [28] описан процесс травления кремния в плавиковой кислоте.

Контроль поверхности проводили с помощью методов фотоэлектронной спектроскопии и дифракции электронов низкой энергии (LEED). Авторы использовали пластины кремния p- и n-типа проводимости с ориентаций (100), (111) и (211).

Сопротивление образцов варьировалось от 0.005 до 35 Ом·см. В работе отмечается, что после травления проводить сушку образцов не требуется, так как их поверхность становится абсолютно гидрофобной. Независимо от конкретных условий травления в HF и типа образцов, формируется H-терминированная поверхность. Как видно из рис.

1.1.1, после травления образцов с естественным слоем окисла образуется Hтерминированная поверхность с примесями углерода, фтора и кислорода. Авторы отмечают, что фтор быстро замещается на OH-группу, последующие превращения которой приводят к образованию оксида. Количество кислорода можно уменьшить, если использовать смесь плавиковой кислоты с этанолом. С течением времени при выдержке на воздухе или в воде, как следует из рис. 1.1.2, поверхность окисляется до нескольких монослоев оксида кремния. При окислении в воде также образуется слой субоксида, которой впоследствии переходит непосредственно в оксид.

загрязнения подложки кислородом, протравленной поверхности на углеродом и фтором от концентрации воздухе и в бидистиллированной воде Авторы работы [29] предлагают новый способ измерения концентрации силанольных групп (Si-OH) на поверхности кремния при помощи вещества tridecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrooctyl dimethylchlorosilane (FOCS), растворенного в хлороформе. Этим соединением обрабатывали образцы перед проведением рентгеноструктурного анализа, при помощи которого определяли концентрацию фтора на поверхности, которая, по мнению авторов, пропорциональна концентрации Si-OH (рис. 1.1.3).

Рис. 1.1.3. Концентрация фтора на соответствующих подложках кремния, содержащих Н, Н/ОН и ОН группы на поверхности [29].

Для приготовления H-терминированной поверхности пластинки кремния с ориентацией (100) были протравлены в 0.5% водном растворе HF. В дальнейшем эти образцы использовали для создания H/OH-терминированной поверхности путем непродолжительной выдержки в воде и OH-терминированной поверхности при травлении в H2SO 4:H2O2 (1:4), при этом обеспечивается высокая степень окисления.

Надо отметить, что авторы [29] не приводят данных о температуре, при которой осуществляли подготовку поверхности. Так, например, в работе [30] показано, что при температуре выше 200o C происходит полное замещение OH групп на используемый в работе реагент (характерное время замещения порядка 20 минут).

На реактивность поверхности кремния можно влиять светом подходящей длины волны. Авторы работы [31] использовали образцы кремния n-типа проводимости с ориентацией (111) и сопротивлением порядка 30 Ом·см. Подложки были предварительно очищены и протравлены в течение 15 минут в 40% NH 4F для получения H-терминированной поверхности. Образцы облучали светом с длиной волны 800 нм. Измерение скорости роста оксида проводили при помощи метода генерации второй гармоники - Second harmonic generation-RA (RA-SHG). Было показано (рис. 1.1.4), что скорость окисления изменялась на порядок при облучении.

Авторы отмечают, что в воде оксид растёт быстрее, чем на воздухе. В работе предполагается, что изменение скорости роста оксида связано с генерацией светом электрон-дырочных пар. Под действием поля в ОПЗ электроны попадают на поверхность полупроводника, где реагируют с кислородом или водой, катализируя рост оксида.

Рис. 1.1.4. Зависимость начальной скорости окисления от освещения (в количестве В работе [32] использовали кремний n-типа проводимости с ориентацией (111) и (100) с сопротивлением от 1 до 10 Ом·см. Изначально образцы были очищены в 30% H2O2:H2SO4 (1:2) в течение 15 минут при температуре 80 oC, потом промыты водой и помещены во взвешенный в аргоне 40% раствор NH 4F на 15 минут, после чего снова промыты. Измерения при облучении образцов различными длинами волн проводили методом рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии. По приведенным в работе графикам (рис. 1.1.5) нельзя сделать вывод о степени окисления образцов в темноте без облучения. Результат свидетельствует только о том, что некоторое количество кислорода присутствует на поверхности. Найденный максимум степени окисления при использовании облучении с длиной волны 250 нм во влажном и сухом воздухе авторы связывают с двухэтапным процессом окисления поверхности кристалла. На первом этапе за счёт энергии фотонов связь Si-H дестабилизируется или разрушается, что приводит к реакции атомов кремния с кислородом. Второй этап соответствует росту на этой части поверхности оксида за счет поступления неравновесных носителей заряда из объема полупроводника.

Рис 1.1.5. Светоиндуцированное окисление поверхности, выраженное в отношении O(1s)/Si(2p) для Hx-Si(100) и H-Si(111)(1X1). Энергия падающего света составляла 2KJ.

Опыт проводили при разных длинах волн при сухом и влажном воздухе [32].

1.1.2. Взаимодействие протравленной поверхности кремния с В литературе присутствуют данные о взаимодействии поверхности кремния с различными соединениями. Нас интересуют, в первую очередь, MgCl 2, NaCl, HCl, ДНК, H2O, используемые в настоящей работе.

В работе [33] было исследовано взаимодействие поверхности кремния с водой.

Еще раз подчеркнем, что без специальной обработки поверхность кремния, покрытая слоем окисла, проявляет гидрофильные свойства. После травления в HF и терминирования поверхности водородом поверхность становится гидрофобной.

Последующее окисление приводит к появлению на поверхности кислорода, что переводит ее в гидрофильное состояние, способствующее взаимодействию поверхности с водой. При помощи метода FTIR- спектроскопии ("frustrated" total internal reflection) было показано, что вблизи поверхности кремния вода организуется в структуру, сходную со структурой льда, которая разрушается по мере удаления от поверхности.

Таким образом, вода координируется поверхностью кремния.

Авторы работы [34] провели опыты по определению степени загрязнения натрием поверхности кристалла кремния и поиску способов ее очистки. Использовали p-тип кремния с ориентацией (100), поверхность которого была покрыта окислом после травления в H2O2:H2SO4. В работе показано, что в присутствии калия или смеси калия и алюминия (а также при повышении температуры с 20 до 80 o C) сорбция натрия из раствора на поверхность понижается на порядок. Также было установлено, что концентрация натрия на поверхности выходит на стационарный уровень через секунд после начала экспозиции. Наличие в растворе 0.01% HCl приводит к значительному снижению сорбции натрия (рис. 1.1.6), а выдержка поверхности с сорбированным натрием в 0.01% HCl приводит к снижению его концентрации на порядок.

Рис. 1.1.6 а. Сорбция натрия при выдержке подложки в водном растворе и в растворе, содержащем 0.01% HCl [34].

Методом компьютерного моделирования [35] было показано, что NaCl может взаимодействовать с кремнием с образованием структуры, представленной на рис. 1.1.7.

Авторы работы [36] изучали взаимодействие H-терминированной поверхности кремния n-типа с ориентацией (111) и сопротивлением 500 и 10-15 Ом·см c кислотами типа HX, где X= Cl, Br, или I. Используемые вещества были взвешены в естественной атмосфере. Перед проведением измерений была проведена чистка поверхности по методике RCA [37] с последующей обработкой в 5% HF, а затем 40% NH 4F в течение 5 и 1 минуты соответственно для получения H-терминированной поверхности. При помощи FTIR и рентгеновской спектроскопии было показано, что присутствие таких оксидантов, как кислород, способствует замене водорода в группе Si-H на X. Без оксидантов связь Si-H практически не разрушалась, и ее концентрация на поверхности за 10 минут падала лишь на 6%. Возможно, подобные реакции может катализировать и ДНК. Авторы работы отмечают также, что промывание водой исследуемых образцов после реакции с HCl приводит к замещению хлора на OH-группу. Подобные данные по взаимодействию кремния с HCl можно найти и в работе [38].

В работе [39] представлены результаты исследования взаимодействия ДНК с кристаллическим кварцем (min-U-sil 5 a-quartz) чистотой свыше 99%, представляющим собой частицы от 0.5 до 3 мкм, растворенные в буфере. На основе данных FTIS (FourierTransform Infrared Spectroscopy) была предложена модель их взаимодействия. Модель предполагает, что молекула ДНК связывается с силанольными группами на поверхности кварца путем образования водородной связи (Рис. 1.1.8). Эти данные требуют уточнения. До настоящего времени они не подтверждены.

Рис 1.1.8. Возможная модель связывания ДНК с силанольными группами на Остановимся на рассмотрении роли магния в процессе фиксации ДНК. Ранее методами дифракции рентгеновских лучей, ЯМР и рамановской спектроскопии было показано, что гидратированные ионы магния в водном растворе представляют собой октаэдрические комплексы с шестью молекулами воды [40].

Взаимодействие водного раствора хлорида магния с окисленной поверхностью кремния изучалось в работе [41]. Использовали кремний p-типа проводимости, очищенный в смеси H2O–H2O2–NH4OH (5:1:1) при 80o C. Для повышения концентрации гидроксильных групп на поверхности кристалла образцы были обработаны в кипящей воде. Водный 0.05 M раствор MgCl 2·6H2O (pH=6) наносили на подложки методом «spin-coating method», после чего был проведен XPS анализ (X-ray Photoelectron Spectroscopy). Измерения показали, что на отрицательно заряженной за счёт гидроксильных групп поверхности оксида кремния присутствуют положительно заряженные комплексы магния (MgCl) + и [MgCl(H2O)m]+.

В работе [42] была предложена модель взаимодействия гидратированного иона магния с молекулой ДНК. В процессе связывания в результате электростатического притяжения происходит образование водородной связи между молекулой воды из гидратной сферы иона и атомом кислорода фосфатной группы, рис. 1.1.9. Комплексы ионов магния с фосфатными группами ДНК, образованные без промежуточной молекулы воды, составляют не более 6%.

Рис. 1.1.9. Связывание гидратированного иона магния с фосфатными группами ДНК с участием молекул воды (А, С) и с образованием солевой связи (В) [42].

Авторы работы [43] провели исследование по фиксации ДНК на поверхность кремния p-типа проводимости с ориентацией (111) в присутствии ионов магния. В эксперименте использовали окисленную до диоксида кремния и неокисленную (Hтерминированную) поверхность. Слой SiO 2 толщиной около 50 нм был получен отжигом образца кремния в среде кислорода при температуре 800С. Другая часть образца, подвергшегося термическому окислению, была обработана методом активного ионного травления (reactive ion etching) и выдержана затем в 3% растворе HF для получения H-терминированной поверхности. Для приготовления образцов авторы использовали растворы poly(dG–dC)·poly(dG–dC) с длиной фрагментов около 600 пар оснований (около 200 нм); концентрация MgCl2 в зависимости от условий эксперимента составляла 0.1 мМ, 1.0 мМ или 5.0 мМ. Капля приготовленного раствора наносилась на образец и через 1, 5 или 10 минут в зависимости от условий опыта сдувалась с него. Таким образом, промывка образца водой после процедуры фиксации не проводилась. Результат фиксации контролировался методом АСМ, а также методом флюоресцентной микроскопии. Было показано, что ДНК преимущественно фиксируется на поверхности SiO2. При этом увеличение концентрации MgCl 2 может приводить к «слипанию» ДНК (рис. 1.1.10 c, e). На поверхности H-Si молекулы ДНК были обнаружены при концентрациях соли магния более 1 mM (рис. 1.1.10 d, f ). При этом данные флюоресцентной микроскопии показывают, что плотность молекул ДНК, зафиксированных на H-терминированной поверхности, гораздо меньше, чем на окисленной поверхности кремниевой подложки (рис. 1.1.11). По мнению авторов, представленные различия в эффективности фиксации макромолекул объясняются различием в химических свойствах поверхностей SiO 2 и H-Si и не связаны с влиянием времени экспозиции. Так, авторы полагают, что фиксация ДНК на поверхность диоксида кремния происходит за счет координации связанного с макромолекулой магния с атомом кислорода на поверхности кремния. Координационная связь между магнием и водородом образоваться не может, что является причиной слабой фиксации на H-терминированной поверхности кремния. На данный момент известно, что поверхность кремния быстро окисляется в водном растворе, поэтому авторы ошибочно считают, что поверхность H-терминирована в процессе фиксации. Поэтому представленные в работе [43] выводы требуют дополнительного экспериментального подтверждения и анализа.

В работе [44] из анализа изображений, полученных методом зонда Кельвина, было высказано мнение, что молекула ДНК сохраняет при фиксации на кремний шубу из противоионов. В работе плазмидную линеаризованную ДНК (3 kbp) фиксировали на поверхность кремния, рис. 1.1.12. Хотя авторы не описывают сам способ фиксации, из рисунков видно, что молекулы вытягиваются в процессе иммобилизации и собираются вместе.

Рис. 1.1.10. АСМ изображения ДНК на поверхности SiO 2 (a, c, e) и на поверхности HSi (b, d, f). Концентрация MgCl2 0.1 мМ (a, b), 1.0 мМ (c, d), 5.0 мМ (e, f) [43].

Рис. 1.1.11. Данные флюоресцентной микроскопии образца с ДНК на подложке SiO и H-Si. Фотография образца (2000) в флюоресцентном режиме. Свечение ДНК происходит за счет обработки молекул красителем Yo-Pro (1 mM) после процесса фиксации (a). Фотография этого же места образца в оптическом режиме микроскопа Рис. 1.1.12. Результаты исследования плазмидной ДНК на кремниевой подложке методом зонда Кельвина. АСМ топография (a) и соответствующее KPFM сканирование той же поверхности (b). Увеличенные АСМ (c) и KFPM (d) изображения, на рисунках (e) - AFM и (f) - KPFM видна цепь ДНК с отрицательным потенциалом и обнаруживается присутствие соли, располагающейся вокруг цепи (положительный потенциал). Ниже 1.1.3. Поверхностные электронные состояния монокристаллов кремния.

Фиксация макромолекулы на поверхности кристалла обуславливается ее взаимодействием с поверхностью. Со стороны полупроводника это взаимодействие определяется поверхностными электронными состояниями.

Одной из причин возникновения поверхностных состояний является обрыв периодического потенциала кристалла на поверхности (поверхностные состояния Тамма), другая причина - наличие оборванных связей на поверхности из-за обрыва решетки (поверхностные состояния Шокли). Кроме того, естественные поверхности полупроводников всегда покрыты слоем окисла с адсорбированными на нем из окружающей среды молекулами различных веществ, что также создает дополнительные поверхностные электронные уровни энергии [45]. Наличие локальных поверхностных уровней энергии приводит к тому, что электроны и дырки могут «прилипать» к поверхности, образуя поверхностный электрический заряд. В зависимости от знака поверхностного заряда свободные носители в полупроводнике притягиваются к поверхности или отталкиваются от нее, образуя обогащенные или обедненные слои и, тем самым, изменяя величину проводимости приповерхностной области кристалла.

Исследованию поверхностных электронных состояний монокристаллов кремния посвящено огромное количество работ, выполненных за последние десятилетия.

Остановимся на результатах работы [46], где изучались поверхности подложек, полученных в условиях, подобных условиям наших экспериментов. Исследовались поверхностные состояния кремния c ориентацией (111) и (100). Изначально была проведена RCA очистка образцов. Для придания поверхности гидрофобных свойств одна часть образцов была протравлена в 40% NH 4F (pH=7.8) в течение 6.5 минут, затем в 48% HF в течение 3 минут. Для получения естественного окисного слоя другая часть подложек выдерживалась на воздухе при влажности 50% и температуре 25С.

На рис. 1.1.15а представлены результаты эллипсометрических измерений величины диэлектрической проницаемости образцов, которые были протравлены в H2SO4:H2O2, затем выдержаны в воде и обработаны в NH 4F. После проведения измерений образцы были протравлены в HF и снова подвергнуты анализу.

Рис. 1.1.15. Мнимая составляющая эффективной диэлектрической проницаемости (a) и энергетическое распределение плотности поверхностных состояний (b) для Hтерминированной, NH4F- и HF-обработанной поверхности Si(111) и Si(100) [46].

Величина мнимой компоненты диэлектрической проницаемости отражает шероховатость поверхности подложки [46]. Как следует из графиков, неровность поверхности после применения указанных процедур не превышает 10А. На рис. 1.1.15b приведены энергетические распределения плотности состояний H-терминированной поверхности образцов Ds в зависимости от способа ее получения. Величина Ds рассчитывалась из измерений величины поверхностной фото-эдс. Как видно из рисунка, плотность поверхностных состояний имеет U-образную форму с минимумом в центре запрещенной зоны кремния. В зависимости от используемого при обработке поверхности вещества (NH4F или HF) ее величина может изменяться от 10 10 до 1013 смэВ-1.

На рис. 1.1.16a приведены графики зависимости относительного количества Si-H связей на поверхности подложек в зависимости от времени выдержки на воздухе.

Оценки сделаны из эллипсометрических измерений, проведенных в инфракрасном диапазоне. Рис. 1.1.16b показывает изменение толщины естественного окисла на тех же образцах. Как следует из этих данных, быстрый рост окисного слоя на поверхности (100) начинается при временах экспозиции, превышающих 200 минут, а для поверхности (111) – при временах больших 2000 минут. Важный вывод из результатов этих экспериментов состоит в том, что в любом случае толщина естественного окисного слоя на поверхности кремния не превышает 1нм.

Рис. 1.1.16. Относительное число Si-H связей (a) и толщина естественного окисного слоя (b) в зависимости от времени экспозиции H-терминированной поверхности на Авторы работы [6] провели эксперимент по модификации H-терминированной поверхности кремния p- и n-типа проводимости с ориентациями (111), (001) и сопротивлением от 1 до 25 Ом·см одноцепочечными молекулами ДНК с последующей гибридизацией комплементарными цепочками. Олигонуклеотиды 12bp с линкерной акрилатной группой прикреплялись к поверхности кремния, модифицированной соединением 3-mercaptopropyl-trimethoxysilane. Для оценки изменения заряда поверхности использовался метод поверхностной фото-эдс, рис. 1.1.17.

Рис. 1.1.17. Эксперимент с ДНК. SPV сигнал для кремния, терминированного ОНгруппами (а), с функциональными группами после модификации 3-mercaptopropyltrimethoxysilane (b), поверхность кремния с 12-мерными олигонуклеотидами (c), та же поверхность после прикрепления комплементарных цепочек (d), тот же эксперимент с использованием некомплементарных цепочек – несовпадение одной пары (e) [6].

Как следует из рис. 1.1.17, в присутствии ДНК величина сигнала фото-эдс уменьшается (d) по сравнению с исходным образцом (a), что может быть вызвано уменьшением абсолютной величины потенциала поверхности вследствие размещения на ней дополнительного заряда при фиксации молекул. Гибридизация с комплементарной цепочкой приводит к увеличению заряда молекулы (e), благодаря чему сигнал усиливается. Последнее свойство может быть использовано при создании биосенсора для определения нужной последовательности ДНК.

1.1.4. Исследования электронных свойств интерфейса ДНК-кремний с Для исследования электронных свойств интерфейсов ДНК-полупроводник можно формировать контакты металл-полупроводник (диоды Шоттки) с использованием модифицированных подложек с предварительно зафиксированными макромолекулами.

В работе [47] изучались вольт-фарадные и вольт-амперные характеристики шоттки-диодов Al/p-InP, на интерфейсе которых находилась пленка ДНК. Толщина пленки, определенная из вольт-фарадных (CV) характеристик, составляла величину порядка 60 нм. Оптический спектр поглощения пленки А (рис. 1.1.18, врезка) авторы работы анализировали, используя следующее соотношение:

где B – постоянная, Eg – предполагаемая ширина запрещенной зоны материала, m – показатель степени, зависящий от природы оптического перехода: m = 1/2, 2, 3/2 или 3 для разрешенного прямого, разрешенного непрямого, запрещенного прямого и запрещенного непрямого переходов соответственно.

Рис. 1.1.18. График ( Ah ) (h ), полученный обработкой спектра поглощения пленки Как показали полученные данные, участок резкого роста величины поглощения спрямлялся в координатах ( Ah ), h, что авторы связали с наличием запрещенной зоны и прямых оптических переходов в пленке. Ширина запрещенной зоны, определенная по отсечке прямой на оси абсцисс, составила 3.95эВ.

На рис. 1.1.19 приведены вольт-амперные характеристики шотки-диодов, измеренные авторами обсуждаемой работы. Из обработки представленных данных авторы находят, что величина барьера шоттки-диода, равная для контрольного образца b = 0.60 eV, в случае наличия пленки ДНК на интерфейсе диода возрастает до величины b = 0.76 eV. Коэффициент неидеальности модифицированного диода равен n = 2,86.

Рис. 1.1.19. Вольт-амперные характеристики диода, содержащего пленку ДНК на На рис. 1.1.20 представлены вольт-фарадные (CV) характеристики шоттки-диода, содержащего пленку ДНК на интерфейсном слое, полученные при различных частотах тестирующего сигнала [47]. Из графиков видно, что величина емкости для прямых напряжений смещения возрастает в десятки раз с понижением частоты тестирующего сигнала и приближается к насыщению при частотах выше 100 кГц. Такое поведение емкости характерно для структуры с большой плотностью поверхностных состояний на интерфейсе [48].

Рис. 1.1.20. Вольт-фарадные (CV) характеристики шоттки-диода, содержащего пленку ДНК на интерфейсном слое, полученные при различных частотах В работе [10] исследовалось влияние на электрические свойства интерфейса Au/ДНК/n-Si толщины пленки из ДНК и степени покрытия ею поверхности исследуемых образцов для кремния n-типа проводимости с ориентацией (100) и сопротивлением 2.00 Ом·см. Образцы были очищены последовательно в кипящих трихлороэтилене, ацетоне и этаноле в течение 10 минут. Потом в H2SO4, H2O2, HF: H2O (1:20), HNO3:HF:H2O (6:1:35) и HF:H2O (1:20). До и после каждой стадии очистки образцы промывали в воде. Исходный водный раствор ДНК из спермы лосося ( mg/L) был приготовлен и заморожен. Последующие растворы готовились в 0.05 M ацетатном буфере, содержащим 20 mM NaCl (ABS, pH 4.80). Растворы ДНК различной концентрации наносили на образцы при помощи метода «drop casting method», после чего высушивали в течение 12 часов. В результате были получены пленки толщиной и 4 нм, причём 40% и 96% процентов поверхности занято ДНК соответственно. Золотой контакт толщиной порядка 200 нм был создан путем термического напыления металла поверх пленки. Было показано, что толщина пленки ДНК и степень покрытия биополимером поверхности подложек существенно влияют на плотность поверхностных состояний, величина которой составляла порядка и падала при уменьшении толщины пленки.

В работе [9] предложен новый способ фиксации ДНК на поверхность кремния pтипа с ориентацией (100) в присутствии ионов магния. Перед иммобилизацией поверхность кристалла протравливалась в 10% HF в течение 1 минуты, после чего выдерживалась в течение 25 минут в вакууме. Фиксация проходила либо в темноте, либо при освещении светом с длиной волны 890 нм. Было показано, что свет способствует фиксации ДНК преимущественно в виде отдельных нитей. Фиксация молекул в темноте приводит к образованию «жгутов», состоящих из нескольких молекул ДНК. Так же в работе были проведены измерения вольт-амперных и вольтфарадных характеристик шоттки-диода с ДНК на интерфейсе (Ti/ДНК/p-Si). Авторами установлено, что присутствие молекул ДНК на интерфейсе контакта Ti-(p-Si) приводит к изменению вольт-амперных характеристик диодов и увеличению величины барьера примерно на 0.15 В, независимо от способа приготовления образцов (с освещением в процессе фиксации или без него). Оценка величины плотности поверхностных состояний для шоттки-диода с молекулами ДНК на интерфейсе, полученная из прямой ветви вольт-амперной характеристики, составляла 7·10 12 см-2 и примерно соответствовала оценке, полученной по AFM-изображениям поверхности образца с учетом плотности фосфатных групп ДНК, 5·1012 см-2 [9].

Надо отметить, что молекула ДНК содержит мономеры, отличающиеся по своим электрофизическим характеристикам. Благодаря этому, например, была секвинирована одноцепочечная ДНК [49]. При интерпретации данных измерений поверхностных состояний стоит учитывать тот факт, что разные азотистые основания могут создавать различные электронные состояния на поверхности кремния.

Рис. 1.1.21. АСМ (слева) и СТМ изображения ДНК на поверхности меди. Гуанин имеет отличные от других оснований электронные состояния (он появляется как яркие Приведенные выше результаты исследований разных авторов показывают, что вопросу сопряжения ДНК с твердотельной электроникой в последнее время уделяется повышенное внимание.

В рамках совместных исследований, проводимых кафедрами биофизики и кафедры электроники твердого тела физического факультета СПбГУ, были исследованы особенности фиксации молекул на поверхности кремния p-типа проводимости и электрофизические свойства интерфейса структуры Ti-(ДНК)-(p-Si) [9]. Настоящая работа частично является продолжением этих исследований на подложках n-типа проводимости.

Решение поставленных в работе задач подбора оптимальных условий фиксации ДНК на поверхности кремния n-типа и исследования электрофизических свойств сформированного интерфейса требует привлечения как биофизических методов исследования (для изучения условий фиксации молекул на поверхности подложки), так и методов, развитых в физике твердого тела (для изучения электронных свойств получаемых структур).

1.2.1. Противоопухолевая активность фенантролиновых соединений По данным Федеральной Службы Государственной Статистики в 2012 году от злокачественных новообразований в России умерло 309 226 человек [50], что делает этот вид заболеваний одним из самых опасных. На сегодняшний день во всем мире разрабатывается и проходит испытания огромное количество различных противоопухолевых препаратов. При этом лечебные свойства последних не отвечают современным требованиям, причиняя большой вред организму в целом. Так, один из наиболее активных препаратов циплатин обладает нефротоксичностью, вызывает миелодепрессию и ряд других побочных эффектов, что ограничивает его широкое использование. В связи с наличием серьезных побочных эффектов у современных препаратов в настоящее время ведутся поиски новых более эффективных и менее опасных соединений. Среди них есть препараты, содержащие производные фенантролина. Структура фенантролина показана на рис. 1.2.1.

В работе [51] было показано, что производные ванадия с координированными молекулами 4,7-диметил-1,10-фенантролина оказывают более сильное биологическое воздействие по сравнению 1,10-фенантролином, 2-2*-бипуридином и 5'-бромо-2'гидроксиацетофеноном. При этом лучшие результаты показало соединение бис-(4,7диметил-1,10-фенантролин)сульфатооксованадиум (IV), которое имеет следующие показатели IC50 (мкМ): для клеток лейкемии (NALM-6, MOL Т-3 и HL-60) — 0.2, 0.19, 0.98; для лимфомы Ходжкина (HS445) — 0.5; для множественной миеломы (U266BL, ARH77 и УГ-Султан) — 0.5, 0.81, 0.8; для рака яичка (833K, 64cp, TERA-2, и NT2D1) — 0.85,0.75,19.5, 10.8; для глиобластомы (U373) — 1.8; для рака молочной железы (BT-20) — 1.4; для рака предстательной железы (PC3) — 1.7. Это превосходит показатели некоторых современных лекарств.

В работе [52] был проведен сравнительный анализ препаратов, структура которых изображена на рис. 1.2.2. Они показали себя как перспективные противоопухолевые агенты (см. рис. 1.2.3). При этом препарат L1 оказался самым лучшим из известных на тот момент антибиотиков против бактерий streptomyces coelicolor.

Рис. 1.2.2. Структура препаратов, изучаемых в работе [52].

Рис. 1.2.3. Таблица, приведенная в работе [52] для значений IC 50 in vitro для лигандов и комплексов платины по отношению к нескольким опухолевым клеточных линиям.

В работе [53] было проведено сравнение действия препаратов на основе 1,10фенантролина и используемых в медицине противораковых препаратов. Эксперимент показал высокую эффективность соединения под номером 7 (рис. 1.2.4).

Рис. 1.2.4. Таблица из работы [53]. Цитотоксическая активность производных 2,4диарил-5,6-дигидро-1,10-фенантролина с фурилом или тиенилом в 4-позиции против различных линий раковых клеток в сравнении с другими препаратами. Приведена структура соединения под номером 7.

Оценка противоопухолевой активности 1,10-фенантролина и его комплексов с лорноксикамом (противовоспалительный препарат LOR) и различными металлами по отношению к клеткам рака молочной железы MCF7 показала интересный результат [54]. Эффект 1,10-фенантролина по показателю IC50 (мкг/мл) оказался в несколько раз выше: 4.73 против 13.7 для [Cr(LOR)(Phen).Cl 2]Cl.2H2O, 12.7 для [Mn(LOR)2(Phen)]Cl2·2H2O, 17.2 для [Fe(LOR)2(Phen).]Cl3, 17.2 для [Fe(LOR)(Phen).2H2O] (BF4)2, 23.1 для [Ni(LOR)(Phen).Cl2].H2O и 9 для [Zn(LOR)(Phen)(H2O)2](BF4)2. Это указывает на самостоятельную роль этого соединения в механизме цитооксичности.

Таким образом, можно говорить о том, что препараты на основе 1,10фенантролина являются перспективными и востребованными в терапевтической практике. К сожалению, биологическая активность противораковых соединений на основе фенантролина изучена недостаточно.

Условно можно выделить три основных механизма действия противоопухолевых препаратов, содержащих металлы (это типично и для препаратов, содержащих 1,10фенантролин): генерация реактивных форм кислорода (например, H 2O2, ОН•, O2•-), которые повреждают хромосомную ДНК, изменение метаболизма и гомеостаза ионов металлов (таких, как Fe, Cu и Zn), и, наконец, ингибирование синтеза ДНК [55].

Последнее дает возможность исследовать потенциальные противоопухолевые препараты на уровне простых систем — водно-солевых растворов ДНК с изучаемым препаратом. Действительно, практически любые соединения, связывающиеся с данным биополимером (по азотистым основаниям), могут нарушать процессы транскрипции и трансляции ДНК в раковой клетке. В качестве примера можно привести работу [56], где была показана не только цитооксичность препарата цис хлородиметилсульфоксид-S-би(1,10-фенантролин) рутения (II), но и определено наличие взаимодействия препарата с ДНК тимуса теленка in vitro методами спектрофотометрии, флуоресценции и гель-электрофореза. Множество статей посвящено данной тематике. В целом отмечается, что 1,10-фенантролин в составе комплексов металлов может частично интеркалировать в ДНК, при определенных условиях вызывая ее расщепление [57]. Последнее нашло применение в изучении взаимодействия белков с ДНК методом футпринтинга [58]. Метод основан на расщеплении ДНК в местах, где она не связана с белком. Что дает возможность определить участки ДНК, взаимодействующие с белком. За последние годы было синтезировано множество производных 1,10-фенантролина для повышения выхода реакций расщепления ДНК.

Стоит остановиться работах, посвященных синтезу нуклеаз на основе 1,10фенантролина, проявляющих специфичность к определенным последовательностям ДНК. Так, было предложено модифицировать по 5'-позиции последовательность d(TTTCCTCCTCT) 1,10-фенантролином. В эксперименте использовалась ДНК вируса, содержащая лишь один комплементарный к модифицированной фенантролином последовательности участок. В присутствии ионов меди и восстановителя при температуре 20o С эффективность расщепления составила более 70%. При более низких температурах происходило неспецифичное расщепление, связанное с образованием частично некомплементарного дуплекса.

Другой подход к разработке специфических нуклеаз был предложен в работе [59]. Используя сложные комплексы родия, авторам работы удалось добиться расщепления ДНК по определенным последовательностям. Фоторасщепительные реакции под действием облучения с длиной волны 313 нм проводились с использованием 5'-меченых 76/77-мерных олигонуклеотидов. Результаты представлены на рис. 1.2.5.

Рис. 1.2.5. Относительная интенсивность фоторасщепления на различных участках ДНК комплексами родия. Самый сильный участок фоторасщепления нормализован до 100, а остальные интенсивности приведены по отношению к нему.

1.2.2. Хемосенсоры на основе фенантролина Хемосенсоры — это соединения, измеряемые характеристики которых значительно меняются в присутствии определенных веществ. Являясь классическим хелатным бидентантным лигандом для ионов переходных металлов [60, 61], 1,10фенантролин обладает свойством значительно изменять свои оптические и химические свойства при координации различными металлами. Самым известным окислительно-восстановительным индикатором химических растворов на основе 1,10фенантролина является ферроин, химическая формула которого [Fe(1,10-phen)3]SO4.

Но потенциал данного уникального соединения существенно шире. Так, в работе [62] производное 1,10-фенантролина (рис. 1.2.6) было использовано в качестве универсального детектора ионов в ацетонитриле (MeCN). Детектирование осуществляется при помощи набора взаимодополняющих методов, карта которых представлена на рис. 1.2.7. Такие металлы, как Pb2+,Hg2+,Cu2+,Ca2+ регистрируются однозначно, а чтобы отличить Cd2+ от K+ или Mg2+ от Na+ придется прибегнуть к дополнительным исследованиям.

Рис.1.2.7. График относительных изменений в УФ спектрах, при измерении окислительно-восстановительного потнециала, электрохемилюминесценции и люминесценции соединения [Ru(phen) 2 (phenрис. 1.2.6)]2+ в присутствии ионов различных предложены для детектирования ионов Hg 2+ и Pb2+ [63, 64]. Как видно из рис. 1.2.8, «короны» сильно меняют оптические свойства 1,10-фенантролина, позволяя комплементарных методов электрохемилюминесценции и люминесценции, предложенных предыдущими авторами.

В работе [65] были проведены не только эксперименты, показывающие специфическую реакцию производного 1,10-фенантролина на ионы Co 2+ (рис. 1.2.9)., но и исследования, которые показали, что добавление к комплесу Co2Phen4+ EDTA полностью восстанавливает падение флюоресценции и поглощения, вызванное добавлением Co2+ к исследуемому соединению. Это позволяет в будущем создать многоразовый хемосенсор.

Рис. 1.2.8. Различия в эмиссионных спектрах [Ru(bpy)2(Phenслева)]2+ (a) [63] и [Re(CO)3(Phenсправа)(py)]+ (py = pyridine) (b) [64] при добавлении ионов различных Рис. 1.2.9. Влияние различных ионов металлов (5x10-5 М) на интенсивность флуоресценции производного 1,10-фенантролина (5x10-6 М).

1.2.3. Потенциальное применение соединений фенантролина хемосенсорике 1,10-фенантролин может быть востребован и в других областях. Так, в работе [66] был применен метод циклических вольтамперограмм для регистрации гибридизации пришитых к cтеклоуглеродным электродам олигомеров с комплементарными цепочками. Суть идеи состоит в том, что комплекс Co(phen) 33+ обратимо электроактивен, то есть его присутствие на поверхности электрода значительно увеличивает ток через электроды. В свою очередь, Co(phen)33+ сам не связывается с поверхностью электродов, и может это делать только через ассоциацию с двойной спиралью ДНК. Таким образом, значительное увеличение тока наблюдается только при добавлении комплекса 1,10-фенантролина при гибридизации проб ДНК, пришитых к электродам, с исследуемыми цепочками. Это позволяет определить наличие нужной последовательности оснований в ДНК по последовательности пришитых проб.

Идею подхватили другие ученые [67], которые успешно провели эксперимент по определению наличия в растворе ДНК вируса гепатита B (HBV), см. рис. 1.2.10. Таким образом, комплементарная последовательность в присутствии Co(phen) 33+ увеличивает сигнал, в то время как некомплементарная — уменьшает.

Рис. 1.2.10. Дифференциально-импульсные вольтамперограммы для Co(phen)33+ как электроиндикатора активности 10 пропромилле 21-мерной пробы ДНК HBV (последовательность В, пунктирная линия) с использованием а) 15 пропромилле 21-мерной комплементарной ДНК HBV (последовательность A) и б) 15 пропромилле 21-мерной некомплементарных ДНК HBV (последовательность С).

Уникальный подход к созданию биосенсоров для распознавания ДНК-мутаций был разработан на основе влияния окружения на флуоресценцию 1,10-фенантролина [68] путем модификации 19-мерного олигомера, изображенного на рис. 1.2.11 под номером 9. Также были синтезированы полностью комплементарный олигомер (номер 10) и олигомеры с одной ошибкой (номера 11, 12 и 13).

Рис. 1.2.11. Последовательности олигомеров, использованные для создания биосенсоров на основе свойств фененатролина [68].

Далее производилась гибридизация последовательностей 9+10, 9+11, 9+12 и 9+13. Затем каждая пара подвергалась тепловой денатурации, в течение которой снимался спектр эмиссии (рис. 1.2.12). Спектры показали, что каждое из оснований, находящееся напротив модифицированного урацила, по-разному влияет на оптические свойства 1,10-фенантролина. Благодаря чему стало возможно определить не только наличие мутации в последовательности, но и определить ошибочное основание.

Рис. 1.2.12. Зависимость отношения интенсивности флюоресценции на длинах волн 407 нм и 387 нм от температуры (изучение тепловой денатурации). Комплементарные последовательности: 9,10 (зеленый треугольники), ошибочный G: 9,11 (черные круги), ошибочный Т: 9,12 (синие квадраты) и ошибочный С: 9,13 (красные ромбы).

Позже был предложен аналогичный способ определения мутации в геноме [69], но в нем применялся несколько другой механизм изменения окружения 1,10фенантролина. Были синтезированы 2 последовательности ДНК WT27 и Mut27, различающиеся одной мутацией. К ним были синтезированы комплементарные последовательности Cwt7, Cmut7 и S20, как это показано на рис. 1.2.13. К растворам Cwt7 и Cmut7 были добавлены ионы Tb3+ и Eu3+ соответственно. Потом эти растворы были смешаны (смесь Cwt7+Tb3+ с Cmut7+Ue3+ обозначена как Mix).

Рис. 1.2.13 Модифицированные последовательности ДНК, использованные для Уникальность метода заключается в том, что после смешивания Mix, S20 и WT полученный раствор начинал флюоресцировать на длине волны 546 нм, что было видно невооруженным глазом (зеленый цвет). Аналогично после смешивания Mix, S и Mut27 наблюдалась флюоресценция на 617.5 нм (красный цвет). Таким образом, были разработаны пробы, позволяющие без специальных приборов в клинических условиях диагностировать наличие мутации в геноме.

В последние большой интерес вызывает так называемая супромолекулярная организация ДНК [70]. При этом используют соединение 1,10-фенантролин (dpp), структура которого изображена на рис. 1.2.14 слева. В работе [26] ученые модифицировали короткие комплементарные последовательности ДНК по 3' и 5' позициям данным соединением. Далее провели гибридизацию, получив дуплексы, которые исследовали методами тепловой денатурации, спектроскопии УФ/В и кругового дихроизма и гель-электрофореза в присутствии ионов Cu, Ag, Zn, Cu, Co и Fe.

Исследования показали, что атомы металлов координируются 1,10-фенатролином, как это показано на рис. 1.2.14 справа,что позволяет использовать такие структуры в качестве контейнеров для металлов. Это также расширяет набор средств для создания различных наноустройств.

Для создания наноструктур к молекулам dpp были пришиты две разные пары олигонуклеотидов [27], как это показано на рис. 1.2.15, а. В результате при добавлении ионов CuI образуются определенные наноструктуры, формой которых можно управлять путем добавления комплементарных цепочек ДНК. В итоге получается «четырехрукая»

структура, из которой можно собирать трехмерные образования, как это показано на рис. 1.2.15, б.

Рис. 1.2.15. Самосборка последовательностей ДНК в супрамолекулярные структуры с использованием координационных свойств фенантролина [27].

Такие системы можно использовать как контейнеры для переноса лекарств, которые будут раскрываться при наличии определенных ионов металлов или комплементарных цепочек ДНК, к примеру, вирусных. Следующая работа [71] посвящена применению придуманной технологии и различных интеркаляторов для контроля сборки ДНК-оригами. Было показано, что этидиум бромид значительно улучшает качество и выход самосборки за счет стабилизации дуплекса.

Хочется отметить, что способность к самоорганизации производных 1,10фенантролина в присутствии ионов металлов нашла применение безотносительно ДНК. Так, в работе [72] были синтезированы соединения, образующие после самосборки структуры размером 4 нм на 5 нм, сходные с молекулой ДНК, см. рис.

1.2.16. Авторы работы предлагают использовать данные образования как контейнеры для различных соединений, а также в качестве блоков для создания наноустройств.

Рис. 1.2.16. ДНК-подобные супрамолекулярные структуры на основе производных Управляемая ионами Zn2+ и Cu+ самоорганизующаяся система была создана на основе соединения 1, изображенного на рис. 1.2.17 вместе с соединениями 4, 5, 6 и [73]. Используя тот факт, что Cu + координирует соединения 4, 5 и 6, в то время как Zn2+ связывает преимущественно соединения 7 и 6, можно управлять в растворе образованием различных структур. Так, исследователи показали, что соединение 1 при добавлении ионов Cu+ образует треугольные структуры T1 (рис. 1.2.18). При добавлении же ионов Zn2+ к раствору соединения 1 образуются структуры треугольные и четырехугольные (T2 и S2 соответственно, в пропорции 2:1). Было установлено, что система переходит из состояния T1 в состояние T2 + S2 при добавлении ионов Zn 2+ к T1.

Обратный переход можно осуществить, добавив соединение 7, которое вытесняет из координационной сферы Zn2+ соединение 1. Такие системы могут найти применение при создании как биосенсоров, так и супрамолекулярных устройств.

Рис. 1.2.18 Управляемая ионами Zn2+ и Cu+ самосборка производных фенантролина в квадратные и треугольные супрамолекулярные структуры [73].

1.2.4. Взаимодействие фенантролиновых соединений с различными Самоорганизованный рост и самосборка различных соединений на поверхности может служить эффективным и универсальным подходом к созданию двумерных наноустройств. Преимуществами такого подхода являются контроль над размером, варьируемым от атомных до мезоскопических масштабов длины, и возможность обеспечения высокой плотности структур на поверхности, что важно для нанофабрикации, которая направлена на миниатюризацию в микроэлектронике и других областях [74, 75]. Самоорганизация производных 1,10-фенантролина на различных поверхностях была исследована, частности, в работе [76]. Исследовалась самоорганизация молекул 1,10-фенантролина на поверхности Au (111).Было показано, что молекулы соединения при адсорбции на поверхность золота из NaClO 4 в течение нескольких минут в зависимости от потенциала, поданного на поверхность, могут образовывать упорядоченные и неупорядоченные структуры. Надо отметить, что измерения при помощи СТМ проводились прямо в растворе, из которого шла адсорбция. При этом подвижность молекул на поверхности сохранялась и, изменяя потенциал, можно было переводить систему из упорядоченного состояния в неупорядоченное и обратно, как это показано на рис. 1.2.19. Молекулы 1,10фенантролина, взаимодействуя азотами с поверхностью, образуют стопки, уложенные набок. Упорядочивание достигается за счет ориентации молекул вдоль полос реконструкции атомов на поверхности золота.

В работе [77], посвященной аналогичным измерениям производного 1,10фенантролина в присутствии ионов Eu3+, было проведено сравнение адсорбции на поверхности графита (HOPG) и Au (111). Оказалось, что соединение и его комплекс с европием по-разному адсорбируется на поверхность графита и одинаково - на поверхность золота. Предполагая сходную с предложенной в работе [76] модель взаимодействия соединения с золотой поверхностью через атомы азота, авторами работы было высказано предположение, что золото вытесняет евпропий из координационной сферы 1,10-фенантролина, а графит - нет. Это объясняет одинаковые результаты на золоте (рис. 1.2.20) и разные на графите.

Рис. 1.2.19. Индуцированный потенциалом обратимый фазовый переход беспорядок-порядок в монослоях 1,10-фенантролина на Au (111) в 0.02 mM растворе 1,10-фенантролина и 0,1 М NaClO4. Изображения (A-F) были получены при потенциалах 0,11 V (A), 0,04 V (B), - 0,14 V (C), -0,16 V (D), -0,17 V (E), 0,08 V (F), 0,13 V (G) и 0,23 V (H). Каждое изображение было получено через ~1 минуту после перехода на новое значение потенциала.

Надо отметить, что координационные комплексы производного 1,10-фенатролина с Cu+ напротив оказались настолько прочны, что стало возможным их нанесение на Au (111) методом вакуумного напыления [78]. Сродство золота к 1,10-фенантролину было успешно применено в экспериментах по фиксации фулерена [79]. Подробно процесс адсорбции 1,10-фенантролина на поверхность Au(111) в зависимости от ее состояния и типа растворителя был разобран в работе [80].Было высказано предположение, что существует два типа адсорбции. Первый тип подразумевает взаимодействие соединения с планарной золотой поверхностью как целого. Второй и наиболее стабильный во времени — координацию отдельным атомом золота на поверхности 1,10-фенантролина по азотам. Роль растворителя оказалась не столь критичной.

Рис. 1.2.20. СТМ-изображения соединения (a - 42 нм 42 нм, b - 73 нм 73 нм, и c нм 47 нм) и его комплекса с европием (d - 81 нм 81 нм) в растворе н-тетрадекана на Au (111). Туннельный ток составил 15 пкА, смещение 800 мВ для (a, b, d) и 19 пкА и 600 мВ для (c). Изображения были сняты после ~18 ч экспозиции подложек в Упорядоченные структуры возможно получать не только на Au(111), но и на HOPG, что продемонстрировано в следующей работе [81]. Используя производное 1,10фенантролина и его комплекс с рением, который показан на рис. 1.2.21, авторами была показана возможность формирования упорядоченных линейных структур на поверхности HOPG в 1,2,4-трихлорбензоле и октановой кислоте. В работе отмечается, что наноструктуры, полученные из производных 1,10-фенантролина, под действием температуры становятся менее стабильными по сравнению с аналогичными комплексами c рением.

Рис. 1.2.21. Комплекс рения с производным фенантролина [81].

Способность соединений фенантролина играть определенную роль при образовании наноструктур в растворе была исследована в работе [82]. Указанное на рис. 1.2.22 (а) соединение, растворенное в метаноле с соотношении вода/метанол, образовывало нитевидные структуры при соотношении 1:1 и кристаллы при соотношении 9:1, что было установлено методом дифракции электронов с выбранной области (SAED).

Далее авторам удалось декорировать данные структуры золотыми наночастицами диаметром порядка 15 нм, TEM изображения которых даны на рис. 1.2.22 (b — нити, c — кристаллы).

самоорганизации другие производные 1,10фенантролина, структура которых показана на рис.

1.2.23 [83]. Было показано, что сам 1,10-фенантролин не может при соотношении 9:1 образовывать подобные наноструктуры, в то время как соединение 1 имеет тенденцию к образованию нитевидных структур, а соединение 2 их образует при соотношении 9:1.

Рис. 1.2.22. Соединение фенантролина (a), образующее нитевидные (b) и кристаллические (с) структуры, декарированные наночастицами.

Рис. 1.2.23. Серия производных фенанролина [83].

Обращаясь к теме хемосенсоров, стоит обратить внимание на работу по модификации cтеклоуглеродных (GC) электродов путем приложения положительного напряжения [84], как это показано на рис. 1.2.24. В результате атомы азота могут свободно координировать ионы металлов, что было продемонстрировано авторами на примере Zn2+ и Cu2+ методом циклических вольтамперограмм.

Рис. 1.2.24. Модификация стеклоуглеродных контактов производным фенанролина В последние годы набирает популярность метод усиленной рамановской спектроскопии (SERS) для исследования процессов адсорбции на подходящие поверхности различных молекул и изучения их свойств [85]. Метод позволяет также исследовать наноструктуры и создавать сенсоры различных веществ [86].

интерпретированы [87]. В том числе проведены теоретические расчеты методом функционала плотности [88], которые хорошо согласуются с экспериментальными данными.

Существует несколько способов получения эффекта усиления рамановских спектров. Так, в работе [89] был использован раствор коллоидного серебра, в котором наблюдался SERS. В качестве возбуждающего излучателя использовали аргоновый лазер (длина волны излучения 476.5 nm, 514.5 nm) и криптоновый лазер (длина волны излучения 514.5 nm, с мощностью 20 mW). Спектры были сняты с использованием коллоидного раствора серебра возрастом 2 дня и 2 месяца, см. рис. 1.2.25. Оказалось, что старый коллоид вызывает разрушение молекулы 1,10-фенантролина по позициям азотов с образованием связи с серебром, что было установлено по исчезновению спектральной полосы с волновым числом 3076 см-1.

Рис. 1.2.25. 2-й, 50-й, 100-й, 150-й и 200-й спектры SERS 1,10-фенантролина, адсорбированного на двухмесячном коллоиде серебра. Номера спектров отвечают разному времени облучения систем лазером: 3.48 10 -5, 2.09 10-3, Надо отметить, что в другой работе [90] фотодиссоциации не наблюдалось при использовании лазера мощностью 50 mW, при этом данные по перпендикулярной ориентации плоскости молекулы к поверхности серебра согласуются.

В другой работе авторы исследовали методом SERS адсорбцию 1,10фенантролина на поверхность кристалла меди, предварительно протравленную в растворе 0.2 M CuSO4 + 0.4 M H2SO4 при приложенном напряжении +0.5 В в течение секунд [91]. Такие измерения были проведены впервые. Было установлено взаимодействие фенантролина с поверхностью по атомам азота и показано, что при изменении pH раствора для соединений со 2 до 7 плоскость 1,10-фенантролина начинает ориентироваться, образуя угол с поверхностью электрода.

Исследования SERS 1,10-фенантролина на поликристаллическом золотом электроде, протравленном в водном растворе 2 M HCl при напряжении 0.92 V в течение 85 секунд, показали сильное изменение спектров соединения в растворе 0.1 M KСl, 0.1 M HClO4 или 0.1 M KBr по сравнению с кристаллическим состоянием [92].

Авторы предполагают, что на поверхности может идти образование комплексов 1,10phenAu2X6 (X = Cl-, Br-) с участием атомов азота.

Так же были проведены измерения 1,10-фенантролина методом SERS на железном, кобальтовом и никелевых электродах, а также его комплексов с Fe, Co и Ni на серебряном [93]. Было установлено, что рамановские спектры Fe(phen 3)2+ на серебряном электроде схожи со спектрами 1,10 -фенантролина на железном электроде, и отличаются от спектров 1,10 -фенантролина на серебряном электроде. Откуда авторы заключили, что адсорбция соединения на поверхность железа похожа на процесс образования комплекса Fe(phen3)2+, то есть происходит координация 1,10фенантролина по азотам атомом железа на поверхности.

Новый способ получения усиления рамановского сигнала был предложен в работе [94], а также [95]. Суть метода заключается в обработке ровной поверхности, не вызывающей усиления сигнала, 1,10-фенантролином с последующим осаждением на поверхность коллоидного серебра, как это показано на рис. 1.2.26.

Рис. 1.2.26. Схема системы для получения SERS фенантролина [94, 95].

Преимуществами метода является то, что нет необходимости смешивать растворы коллоидного серебра и исследуемого соединения, что поможет избежать образования побочных комплексов. Известно, что слой соединения может быть нанесен на любую поверхность, и, вместе с тем, защищен от разрушительного воздействия лазера частицами серебра, что предотвращает фотодиссоциацию.

Интерес научного сообщества к данному кругу вопросов говорит о том, что развитие методик модификации поверхностей фенантролином и исследование его взаимодействия с ДНК может быть востребовано для решения широкого круга задач.

1.3. Иммобилизация ДНК на различных поверхностях 1.3.1. Иммобилизация ДНК на подложке из кремния в присутствии ионов За последние годы был накоплен огромный материал по способам фиксации ДНК на подложки из различных материалов. Для каждой технологии иммобилизации характерна различная сила сцепления биополимера с поверхностью, на которую происходит фиксация. Существуют способы фиксации, при которых биополимер настолько прочно связывается с подложкой, что дальнейшие его конформационные изменения под действием внешних сил (сила трения, центробежная сила или поверхностное натяжение) становятся невозможными. При других способах фиксации макромолекула остается относительно подвижной и может менять размеры и форму на поверхности после иммобилизации. Надо отметить, что в процессе фиксации биополимер претерпевает различного рода воздействия, которые могут привести к изменению конформации, диаметра, длины, проводимости полимера и т.д. Для решения различных задач используют разные способы фиксации. Так, для биофизических исследований важно, чтобы ДНК испытывала минимальные бионаноструктуры или создать условия для их сборки прямо на поверхности полупроводника.

Постоянно растущий инструментарий современных супрамолекулярных нанотехнологий на основе ДНК [1, 96] и РНК [97, 98] требует многостороннего изучения явлений, связанных с предполагаемыми областями их применения. В пространственным разрешением до 6 нм могут быть применены как части электрических наносхем [98, 99]. Таким образом, встают вопросы об электрических свойствах данных структур, а также о характере их взаимодействия с различными поверхностями, на которых эти схемы будут располагаться. Исследование электрофизических свойств ДНК проводится с высокой интенсивностью, при этом проводимость этого биополимера претерпевает значительные изменения в зависимости от условий эксперимента [100]. Таким образом, вопрос фундаментальных механизмах электропроводности остается открытым.

Взаимодействие ДНК и РНК с поверхностями можно рассматривать в разрезе методик фиксации биополимеров на подложки различных типов. Это актуально при исследовании нуклеиновых кислот и их комплексов с различными лигандами методами микроскопии [101, 102], а также при изготовлении биочипов [103]. С развитием в последние годы метода поверхностного плазмонного резонанса (ППР) применительно к исследованию взаимодействия ДНК с белками [104, 105] и различными лигандами [106, 107] также возникла потребность в простом и надежном способе подготовки чипов, содержащих ДНК на золотой поверхности. Развитие методик фиксации позволили бы осознанно подойти к созданию и проектированию новых биосенсоров [108, 109] и управляемых супрамолекулярных структур на основе ДНК-оригами [110, 111] в будущем.

Существует целый ряд способов химической модификации поверхностей и фиксируемых на них олигонуклеотидов группами, которые могут образовывать прочные связи между собой [112-114]. Часто используемые схемы фиксации олигомеров на стекле изображены на рис. 1.3.1. Надо отметить, что модификация ДНК тиоловой группой является универсальным способом и подходит не только для стекла, но и для практически любой поверхности.

Рис. 1.3.1. Таблица различных способов иммобилизации ДНК на поверхность стекла [113], которые подходят и для кремния, а часть из них для золота.

Отметим, что данные методики подходят для узкого круга задач, таких как создание биосенсоров или определенных наноструктур. Они являются частным решением задачи по фиксации ДНК, зачастую приводящей к дорогостоящим манипуляциям, усложняющим эксперимент. Поэтому обратимся к более универсальным подходам.

Первые изображения ДНК на поверхности слюды были получены при помощи ионов Mg2+[115, 116]. Слюду скалывали при помощи лезвия или липкой ленты, далее подложки выдерживали в течение ночи в растворе 33 mM ацетата магния. После чего подложки промывали и наносили раствор 10-100 мкг/мл ДНК на 2 минуты, затем еще раз промывали водой. Это позволяло получить хорошо воспроизводимые изображения ДНК при помощи АСМ, см. рис. 1.3.2.

Рис. 1.3.2. АСМ-изображение слюды с зафиксированной при помощи ионов магния После чего были проделаны эксперименты по возможности фиксации ДНК при помощи Ca2+, Ba2+, Co2+, Ni2+, Zn2+, Cr2+, La3+ и Zr+4, которые оказались успешными [117].

При этом разные ионы с разной силой связывают ДНК с поверхностью. Например, для измерения ДНК методом АСМ в жидкости используют Ni 2+, так как Mg2+ в растворе фиксирует ДНК недостаточно статично [101]. Так, авторы работы [117] связывают силу фиксации ДНК с ионным радиусом металлов. На рис. 1.3.3 приведены АСМизображения раствора ДНК, высаженной из раствора 0.5 нг/мкл, содержащего 1 mM MCl2 (M — соответствующий металл). Было показано, что чем больше ионный радиус используемого металла, тем хуже он подходит для фиксации ДНК и сканирования методом АСМ в жидкости. Магний является исключением: имея ионный радиус 0.65 А, он все же плохо подходит для жидкостных измерений Рис. 1.3.3. АСМ-изображения молекул ДНК в растворе, содержащем ионы разных Следует отметить, что, помимо выполнения функции иммобилизации ДНК, ионы металлов взаимодействуют с этим биополимером, вызывая изменения его конформации. Обратили на это внимание следующие авторы [118]. Ими были проведены исследования по измерению расстояния между концами цепи ДНК и ее контурной длины в зависимости от используемых для фиксации ионов. Образцы готовили путем экспозиции свежесколотой слюды в течение 3 минут в растворе, содержащем 0.75 нг/мкл ДНК pBR322 и 2 mM ионов Sr2+, Ba2+, Ca2+ или Mg2+ и 0,10 или 20% этанола с последующим промыванием и высушиванием. Измерения показали, см.

рис. 1.3.4, что конформация ДНК значительно изменяется в присутствии различных ионов. Авторы связывают это с изменением персистентной длины цепи и A-B переходом, индуцированным этанолом.

Рис. 1.3.4. Расстояние между концами цепи и контурная длина молекулы ДНК, измеренная по АСМ-изображениям, в зависимости от типов ионов, используемых для Подобные измерения показывают, что подходить к интерпретации результатов микроскопических измерений надо с осторожностью, учитывая взаимодействие ионов с молекулой ДНК. Метод иммобилизации ДНК при помощи магния подходит также для поверхности кремния [119], что связано с наличием на его поверхности кислорода, способного связывать ионы данного металла, который уже, в свою очередь, связывается с ДНК. Минусом такого способа является то, что молекулы биополимера не прочно крепятся к поверхности и могут двигаться вдоль нее, что вызывает их агрегацию.

Чтобы добиться более стабильных результатов при сканировании и исключить возможное взаимодействие ионов металлов с ДНК в растворе, был предложен метод химической модификации поверхности слюды 3-аминопропилтриэтоксисиланом (APTES) [120]. Данный метод отличается тем, что позволяет проводить измерения при pH вплоть до 10, а также при различных ионных силах, сохраняя суперспиральную структуру ДНК, что затруднительно при использовании катионов металлов [101].

Минусами данного метода является полимеризация APTES, приводящая к частичному загрязнению подложки. Стоит отметить, что многие способы модификации слюды подходят для стекла и кремния, так как подразумевают реакцию силанольных групп, которые есть на этих типах поверхностей, с модифицирующими реагентами.

Вместе с тем, помимо большого количество реактивов для модификации поверхности, которые были разработаны за последнее время, и которые имеют свои плюсы и минусы, существует возможность не использовать их вовсе. Так, было предложено высушивать каплю ДНК на подложке в потоке азота [121]. Такой способ сильно деформирует конформацию ДНК, что хорошо видно на рис. 1.3.5. При этом авторы утверждают, что контурная длина молекул составляет 89% от ожидаемой, что сопоставимо с контурной длиной, полученной при использовании стандартных методик фиксации ДНК. Изменение видимой длины молекул ученые связывают с недостаточной разрешающей способностью микроскопа.

Рис. 1.3.5. АСМ-изображения ДНК, растянутой в потоке газа, как это показано сверху.

1.3.3. Ориентация ДНК на поверхности подложки.

Методы растягивания ДНК были предложены несколькими группами ученых и получили названия «Air-flowing method» [122], «Spin-stretching method»[123] и «Moving interface technique»[124]. В них используется воздух, центробежная сила или мениск капли наносимого на подложку раствора для растягивания молекул.

Формирование ориентированных цепей ДНК на поверхности подложки является важной задачей. Используется несколько способов вытягивания макромолекул на подложке. Одним из способов является метод свободного потока «Free-flowing method»

[125, 126]. В этом методе один конец макромолекулы закрепляется на подложке, после чего ДНК растягивается потоком буфера в одном направлении. В результате полимер фиксируется в виде отдельных вытянутых в одном направлении молекул (рис. 1.3.6).

Рис. 1.3.6. Изображения фиксируют растяжение ДНК в ламинарном потоке на покрытом полилизином стекле. Между изображениями B и C прошло 33 мс, между C и D- 66 мс Альтернативный метод воздушного потока («аir-flowing method»)[122] позволяет создавать двумерные сетки из ДНК. На подложку наносится раствор ДНК. Затем капля сдувается потоком азота в одном направлении, потом наносится новый раствор ДНК, молекулы которого аналогично вытягиваются потоком газа в поперечном направлении (рис. 1.3.7). После растяжения и фиксации молекула прочно связывается с поверхностью и не меняет свою конформацию при повторном продувании, что отмечается также авторами работы [126].

Рис. 1.3.7. АСМ изображения сетки ДНК, полученной методом «аir-flowing method»

Следующий метод - «Spin-stretching method» [123] состоит в том, что закрепленные на поверхности макромолекулы ориентируются под действием центрифуги. Этот способ очень удобен, так как, подбирая подходящую скорость вращения, можно ориентировать как длинные, так и короткие молекулы ДНК, а также учитывать различные силы сцепления ДНК с подложкой.

В работе [13] рассматривается еще один метод - «Moving interface technique». Это способ вытягивания макромолекул в заданном направлении, причём подразумевается, что растягивание происходит за счёт движения границы раздела раствор-воздухподложка. Авторами было установлено, что молекула ДНК при иммобилизации претерпевает конформационные изменения, которые приводят к изменению длины одного витка спирали на 0.72 нм.

Отдельно стоит отметить уникальную технологию контроля положения макромолекул ДНК -фага длиной 16.5 мкм и T4 длиной 56.4 мкм на чипе, изготовленном методом трехступенчатой литографии [127]. Исследователи изготовили на кварцевой подложке туннель глубиной 50/100 нм, на дне которого располагаются квадратные ямки глубиной 100 нм со стороной от 100 до 500 нм, расположенные в виде матрицы, см. рис. 1.3.8. Таким образом, получено устройство, позволяющее закреплять ДНК на подложке в заранее известных местах с высокой степенью воспроизводимости и не требующее модификации ДНК или подложки.

Рис. 1.3.8. A) Схема подвода каналов к туннелю для обеспечения протока раствора ДНК B) увеличенная схема туннеля C) СЭМ-изображения ямок на дне туннеля D-G) Флуоресцентные изображения ДНК, окрашенной YOYO-1, попавшей в ямки (риска В следствие гидрофобности золотых поверхностей, иммобилизация гидрофильной ДНК на них представляет определенную трудность. Основной стратегий является модификация золота при помощи соединений, содержащих тиоловые группы, которые образует прочную связь с поверхностью [128]. Впервые подобные эксперименты при помощи 11-меркаптоундекановой кислоты (MUDA) провели в работе [129]. Поверхность золота сначала была обработана MUDA, а затем раствором нг/мкл ДНК, содержащим 2 mM Mg(OAc)2, Zn(OAc)2 или Cu(OAc)2, как это показано на рис. 1.3.9. Результаты фиксации приведены на риc. 1.3.10. Они показывают принципиальную возможность данного метода фиксации ДНК.

Рис. 1.3.9. Протокол фиксации ДНК на поверхность кристаллического золота [129].

взаимодействие производного этидиума с ДНК, как это показано на рис. 1.3.11.

Рис. 1.3.11. Модель иммобилизации ДНК за счет интеркалляционного Визуализация фиксации проводилась косвенным методом: синтетические олигонуклеотиды модифицировали наночастицами, потом ими обрабатывалась подложка, которую затем изучали при помощи СЭМ. Однако это не позволило сделать выводов о характере фиксации.

При приготовлении чипов для измерения методом плазмонного резонанса используются методы ковалентной пришивки ДНК к поверхности золота. Одним из широко применяемых подходов является применение коммерчески доступных модифицированных декстраном чипов и специально модифицированных олигонукледтидов, рис. 1.3.12 [131]. В частности, такой способ позволяет использовать связывание биотин-стрептавидин, при котором поверхность модифицируется стрептавидином, а ДНК - биотином. Кроме роли химического реагента, декстран представляет собой барьер между исследуемым соединением и золотой поверхностью, так как, к примеру, белки могут денатурировать при таком взаимодействии.

Альтернативой является стандартная методика иммобилизации олигонуклеотидов, содержащих тиоловую группу (-SH) в 5' или 3' позиции. Также было показано, что использование модификации фосфатной группы ДНК серой лучше подходит для измерений. Такие олигонуклеотиды менее подвержены ферментативному разложению эндонуклеазами и не окисляются, а также не образуют дисульфидных связей, хотя при этом дают более слабый ППР-сигнал в некоторых случаях [132]. Таким образом, исследователям необходимо приобретать либо специальные чипы, либо модифицированные олигонуклеотиды, что оставляет вопрос поиска альтернативных путей иммобилизации ДНК открытым.

Рис. 1.3.12. Примеры методов иммобилизации на основе амино- и тиоловой химии с использованием чипов, покрытых карбоксиметилированным слоем декстрина. (a):

аминофункционализированные лиганды, (b): альдегидные лиганды, (c):

дисульфидный обмен, (d): пришивка тиоловых производных к малеимидами, (e):

ГЛАВА Во всех экспериментах использовалась бидистиллированная вода. Использовали коммерческий препарат ДНК тимуса теленка фирмы «Sigma», молекулярная масса которой M = 10·106 Да была определена по значению характеристической вязкости в 0.15 M NaCl. Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически по разнице поглощения гидролизованных в 6% HClO4 растворов при длинах волн 270 и 290 нм.

Нативность ДНК контролировали по величине коэффициента молярной экстинкции на длине волны 260 нм. В зависимости от условий эксперимента растворы ДНК содержали от 5·10-4 до 5·10-3 M NaCl и от 5·10-4 до 5·10-2 M MgCl2.

В работе использовали неокупроин (Neo) фирмы «Sigma» и серосодержащее соединение 1,10-фенантролина (PhenSH), синтезированное Демидовым В. Н. Структура соединений приводится в соответствующем разделе.

В качестве подложек использовали:

слюду (мусковит).

монокрисалллы кремния n-/p-типа проводимости, выращенные по методу Чихральского с ориентацией (100) и концентрацией свободных носителей порядка 71014 cм-3.

Термонапыленное на поверхность стекла золото, толщина слоя - 45 нм.

Все подложки из слюды предварительно скалывали с помощью липкой ленты.

Подложки из монокристаллов кремния изначально промывали 3 мкл воды, потом часть протравливали в смеси H 2O2 + H2SO4 в течение 1 минуты при комнатной температуре для удаления с поверхности окисла и снова промывали 3 мкл воды. Часть приготовленных таким образом подложек подвергали химическому окислению в кипящем растворе (1:1) в течение 20 секунд с последующим промыванием в воде.

Подложки из стекла и золота не подвергались дополнительной очистке перед использованием.

В экспериментах использовались как необработанные подложки, так и подложки, выдержанные некоторое время в растворах MgCl 2, PhenSH или Neo. Далее на подложки наносился раствор ДНК различной концентрации объемом ~15 мкл. Время экспозиции подложек в растворах ДНК варьировалось от 1 минуты до 1 часа. Удалялись растворы ДНК с поверхности путем промывания в воде или потоком воздуха. Процесс иммобилизации ДНК проводился в темноте, при естественном освещении или при направленном облучении. В качестве источника света использовали светодиод TSHA5200 с длиной волны 890 нм и током 40мА. Светодиод располагали на расстоянии 5 мм от поверхности непосредственно над каплей раствора. Для получения плёнки ДНК на поверхность кремния наносили раствор ДНК объёмом ~50 мкл. После чего образец выдерживали 1 сутки при комнатных условиях до полного высыхания раствора.

Для создания шоттки-диодовов на модифицированную поверхность кремния термическим напылением в вакууме наносили металлические золотые контакты.

Толщина напыления составляла 30 нм, диаметр — 1.5 мм. Омические контакты на тыльной стороне создавались втиранием галлия.

2.4. Метод поверхностного плазмонного резонанса.

Установка NanoSPR8-481, которая использовалась для измерения поверхностного плазмонного резонанса (ППР), изображена на рис. 2.4.1. Линейно поляризованный свет лазера проходит через призму, отражается от золотой поверхности чипа, затем от стенки призмы и попадает на фотодетектор. Призма может вращаться, изменяя угол падения луча лазера на золотую поверхность. В процессе эксперимента измеряется зависимость интенсивности отраженного света от угла поворота призмы.

Рис. 2.4.1. Установка для измерения ППР состоит из лазера (1) и фотодитектора (5), призмы (2), золотого чипа (3) и механизма для поворота призмы (6). На поверхность Явление поверхностного плазмонного резонанса заключается в том, что при определенном угле падения луча лазера на золотую поверхность свет перестает отражаться, рис. 2.4.2. Это обуславливается тем, что коллективные колебания электронов вдоль поверхности золота имеют собственную частоту, по аналогии с плазменной частотой продольных колебания пространственного заряда в однородной плазме. Таким образом, вдоль поверхности могут распространяться поперечные колебания электронной плотности с определенным волновым числом. Когда последнее совпадает с проекцией волнового вектора падающей линейно поляризованной волны (плоскость поляризации перпендикулярна поверхности), энергия световой волны переходит в коллективные колебания электронов, и вдоль поверхности начинает распространяться описанная выше волна. Соответственно, возникает поверхностный плазмонный резонанс, энергия отраженного света значительно снижается, что регистрируется прибором.

Рис. 2.4.2. Зависимость интенсивности отраженного света от угла поворота призмы.

Электромагнитные колебания света проникают внутрь золотой поверхности на незначительную глубину порядка нескольких сот нм (так называемый скин-эффект). В приборе используются чипы с толщиной золотого слоя 45 нм, что приводит к тому, что свет лазера частично проходит через него. В то же время, такая толщина позволяет вовлечь в коллективные колебания все электроны с обоих сторон слоя. Таким образом, изменяя подвижность электронов на любой из поверхностей слоя, можно значительно повлиять на волновое число распространяющейся вдоль поверхности возбужденной светом лазера волны. Так, при нанесении на поверхность золота исследуемого раствора подвижность электронов меняется, что приводит к изменению угла, на котором наблюдается ППР. Сдвиг угла пропорционален массе вещества, находящегося на расстоянии до 150 нм от поверхности, и его оптическим свойствам (показателю преломления). Используемый прибор NanoSPR8-481 работал в двух режимах.

«Multiple mode» - угол ППР определятся путем поворота призмы для определения минимума интенсивности для каждой точки во времени. Данный режим позволяет следить за формой сигнала, но поворот призмы занимает значительное время. Для измерений с высоким временным разрешением используется режим «Slope mode», при котором снимается интенсивность при одном положении призмы, а угол, соответствующий минимуму интенсивности, определяется численно по предварительно снятой форме кривой ППР.

Главное назначение атомно-силового микроскопа (АСМ) — получение топографических изображений поверхностей различного рода: металлов, керамики, полимеров, биомолекул и живых клеток. Кроме того, АСМ дает возможность изучать механические, магнитные и электрические свойства материалов.

Для создания изображений поверхности образца в методе АСМ используют острую иглу, которая может быть сделана из различных материалов. В данной работе использовались, в основном, иглы SCANASYST-AIR треугольной формы, сделанные из нитрида кремния с радиусом 2-12 нм. Игла прикреплена к гибкому кантилеверу — планке с известной константой жесткости (в нашем случае порядка 0.4 Н/м). При помощи пьезоманипулятора игла приводится в контакт с поверхностью образца и двигается вдоль нее. АСМ могут работать в различных режимах, которые разделяют на контактные, полуконтактные и бесконтактные. В большинстве случаев в данной работе использовали полуконтактный режим SCANASYST, суть которого состоит в следующем.

Как и для других режимов, поверхность разбивается на ячейки и представляет собой матрицу (например, 512x512 или 256x256). Далее, в каждой ячейке матрицы иголка подводится и отводится от поверхности, при этом изгиб иголки в результате взаимодействия с поверхностью регистрируется прибором. Сигнал обратной связи настроен так, что как только при сближении с поверхностью иголка перестает притягиваться к поверхности и начинает отталкиваться, иголка отводиться от поверхности. Сигнал фиксирует, на какой высоте это происходит. Это и будет нести информацию о топографии поверхности. В большинстве атомных силовых микроскопов для фиксации силы, как правило, используют оптические датчики изгиба кантилевера, реализованные по следующей схеме (рис. 2.5.1): луч лазерного диода четырехсекционного фотодиода; при изгибе кантилевера в нормальном или торсионном направлении возникает разница между сигналами соответствующих участков фотодиода: верхний/нижний сегменты или правый/левый сегменты соответственно.

Разностный сигнал правых и левых сегментов фотодиода, отображающий величину тангенциальных сил (сил трения), действующих на зонд при сканировании, выводится в компьютер и отображается на экране монитора. Разностный сигнал верхних и нижних сегментов фотодиода используется для определения изгиба иглы.

Рис. 2.5.1. Основные узлы механической части атомного силового микроскопа и Для обеспечения высокой разрешающей способности прибора интенсивность взаимодействия между зондом и образцом должна достаточно сильно зависеть от расстояния между ними. В случае исследования незаряженных поверхностей силовое взаимодействие образца и зонда состоит из электростатического отталкивания и Вандер-Ваальсова притяжения, капиллярных сил и сил трения. Диапазон возникающих в АСМ сил: 10-7 Н для кулоновских сил и 10-11 Н для сил Ван-дер-Ваальса.

В работе измерения проводили с помощью атомного силового микроскопа NanoScope V (Veeco).

2.6. Исследование электрофизических свойств интерфейса ДНК-кремний Заряд молекул ДНК, зафиксированных на поверхности кремния, оказывает влияние на электрический потенциал поверхности кристалла и электрическое поле в приповерхностной области кристалла. Как следствие, в зависимости от величины и знака заряда молекул будет изменяться величина концентрации свободных носителей заряда в приповерхностной области. Изменение проводимости поверхностного слоя непосредственно может проявляться в величине сквозного тока через поверхность. Для осуществления возможности токовых измерений поверх осажденных на поверхности кристалла молекул может быть нанесена пленка металла. При соответствующем выборе металла получаемый контакт металл-полупроводник может обладать вентильными (диодными) свойствами. В таком случае количественные оценки величины плотности электронных состояний на интерфейсе и их энергетическое распределение могут быть получены из измерений вольт-амперных и вольт-фарадных характеристик структуры.

Контакт металл-полупроводник, обладающий диодными свойствами, называется контактом Шоттки. Рассмотрим процесс образования идеального шотткиконтакта (барьера Шоттки) золота с кремнием n-типа проводимости. Работой выхода называется разность энергий между уровнем вакуума и уровнем Ферми. Ток термоэлектронной эмиссии с поверхности любого твердого тела определяется уравнением Ричардсона:

, где Ф — работа выхода электрона, T — абсолюная температура, k — константа Больцмана и A — постоянная Ричардсона.

Работа выхода из кремния Фп/п меньше, чем работа выхода из золота ФМе. В этом случае, согласно уравнению (1), ток термоэлектронной эмиссии с поверхности полупроводника jп/п будет больше, чем ток термоэлектронной эмиссии с поверхности металла jме. В начальный момент времени соприкосновения материалов ток из полупроводника в металл будет превышать обратный ток из металла в полупроводник, и в приповерхностных областях полупроводника и металла будут накапливаться объемные заряды – отрицательные в металле и положительные в полупроводнике, рис. 2.6.2.1. В области контакта возникнет электрическое поле, в результате чего произойдет изгиб энергетических зон.

Термодинамическая работа выхода на поверхности полупроводника будет расти.

Этот процесс будет проходить до тех пор, пока в области контакта не сравняются токи термоэлектронной эмиссии и, соответственно, значения термодинамических работ термоэлектронной эмиссии выравниваются. Вследствие перераспределения зарядов возникает потенциальный барьер, высота которого равна разности термодинамических работ выхода:

Рис 2.6.2.1. Зонная диаграмма, иллюстрирующая образование барьера Шоттки для контакта Au/n-Si. Ec — дно зоны проводимоти, Ev — верхняя граница валентной зоны, Ei энергия середины запрещенной зоны, Fме и Fп/п — уровни Ферми металла и кремния соответственно, W — ширина области пространственного заряда (ОПЗ).

Рассмотрим, как меняется зонная диаграмма контакта металл – полупроводник при приложении внешнего напряжения VG, знак которого соответствует знаку напряжения на металлическом электроде. На рис. 2.6.2.2 приведены соответствующие зонные диаграммы при положительном и отрицательном напряжениях на металлическом электроде барьеров Шоттки. Из приведенного рисунка видно, что роль внешнего напряжения в барьере Шоттки сводится только к регулированию высоты потенциального барьера и величины электрического поля в ОПЗ полупроводника.

Знак поверхностного потенциала на всех зонных диаграммах – отрицательный. На рисунках указана величина потенциального барьера (изгиба энергетических зон), соответствующая модулю значения поверхностного потенциала s = ms – VG.

Рис 2.6.2.2. Зонная диаграмма барьера Шоттки при различных напряжениях на затворе: а) VG = 0; б) VG > 0, прямое смещение; в) VG < 0, обратное смещение.

Вне зависимости от полярности напряжения для барьерных структур все внешнее напряжение будет приложено к области пространственного заряда, поскольку в этой области концентрация свободных носителей существенно меньше, чем в других частях структуры.

пространственно-распределенным объемным зарядом описывается уравнением Пуассона. В одномерном приближении это уравнение имеет вид:

, где (x) – зависимость потенциала от координаты, (x) – плотность объемного заряда, – диэлектрическая проницаемость полупроводника, 0 – диэлектрическая постоянная.

Заряд в области пространственного заряда барьера Шоттки для полупроводника n-типа обусловлен зарядом ионизованных доноров с плотностью N D. Поэтому:

, где e - заряд электрона.

При интегрировании уравнения Пуассона учтем, что величина электрического константу интегрирования из расчета, что при x = W электрическое поле E равно нулю, как следствие, получим:

Необходимо заметить, что слой объемного заряда противоположного знака возникает и в приповерхностной области металла. Но из-за высокой концентрации свободных электронов его толщина оказывается очень малой (менее 10 ). Такой туннельно-прозрачный слой обладает низким сопротивлением протекающему току и не оказывает заметного влияния на электрические характеристики контакта.

2.6.3. Вольт-амперная характеристика барьера Шоттки Вольт-амперная характеристика идеального контакта металл-полупроводник напряжение на контакте, k - постоянная Больцмана, T - абсолютная температура, J 0 ток насыщения.

Рис. 2.6.3.1 Вольт-амперная характеристика барьера Шоттки.

Вольт-амперная характеристика имеет ярко выраженный несимметричный вид, рис.2.6.3.1. В области прямых смещений ток экспоненциально растет с ростом приложенного напряжения. В области обратных смещений ток от напряжения не зависит. В обоих случаях при прямом и обратном смещении ток в барьере Шоттки обусловлен основными носителями – электронами. По этой причине диоды на основе барьера Шоттки являются быстродействующими приборами, поскольку в них отсутствуют рекомбинационные и диффузионные процессы. Несимметричность вольтамперной характеристики барьера Шоттки типична для барьерных структур.

Зависимость тока от напряжения в таких структурах обусловлена изменением числа носителей, принимающих участие в процессах переноса заряда. Роль внешнего напряжения заключается в изменении числа электронов, переходящих из одной части барьерной структуры в другую.