ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ДОПОЛНИТЕЛЬНОГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«ПЕНЗЕНСКИЙ ИНСТИТУТ УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ВРАЧЕЙ»

МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

АЩИНА ЛЮДМИЛА АНДРЕЕВНА

ОЦЕНКА ЦИТОКИН-ПРОДУЦИРУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ КЛЕТОК

ИММУННОЙ СИСТЕМЫ У БОЛЬНЫХ С АУТОИММУННОЙ ФОРМОЙ

ХРОНИЧЕСКОЙ КРАПИВНИЦЫ

14.03.09. – клиническая иммунология, аллергология 14.03.10. – клиническая лабораторная диагностика

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, Баранова Надежда Ивановна

Научный консультант:

кандидат медицинских наук, Кулюцина Елена Романовна Пенза,

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………... ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………. 1.1. Этиологические факторы хронической крапивницы……………………… 1.2. Патогенетические механизмы хронической крапивницы…………………. 1.2.1. Патогенетические механизмы хронической аутоимммунной крапивницы………………………………………………………………………... 1.3. Иммунные нарушения у больных хронической крапивницей……………. 1.3.1.Нарушения цитокиновой регуляции при хронической крапивнице…….. 1.4. Применение тестов in vitro для изучения иммунологических нарушений. 1.5. Лечение больных хронической аутоиммунной крапивницей……………..

ГЛАВА 2. ПРИМЕНЕНИЕ ТЕСТА EX VIVO ДЛЯ ОЦЕНКИ ЦИТОКИНПРОДУЦИРУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ КЛЕТОК ИММУННОЙ

СИСТЕМЫ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКОЙ АУТОИММУННОЙ

КРАПИВНИЦЕЙ………………………………………………………………….. 2.1. Оценка спонтанной и ФГА-индуцированной продукции цитокинов клетками иммунной системы в тесте ex vivo у больных хронической аутоиммунной крапивницей…………………………………………………….. 2.2. Влияние препарата «Габриглобин-IgG» на цитокинпродуцирующую способность клеток иммунной системы в тесте еx vivo у больных хронической аутоиммунной крапивницей…………………………… 2.2.1. Результаты отработки диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG» в тесте ex vivo на клетках иммунной системы здоровых людей……………………………………………...……………………………….. 2.2.2. Показатели продукции цитокинов клетками иммунной системы под действием препарата «Габриглобин-IgG» в тесте ex vivo у больных хронической аутоиммунной крапивницей………………………………………

ГЛАВА 3. ХАРАКТЕРИСТИКА ИММУННОГО СТАТУСА У БОЛЬНЫХ

ХРОНИЧЕСКОЙ АУТОИММУННОЙ КРАПИВНИЦЕЙ…………………….. 3.1. Характеристика основных иммунологических показателей у больных хронической аутоиммунной крапивницей……………………………………… 3.2. Характеристика уровня цитокинов в сыворотке крови у больных хронической аутоиммунной крапивницей……………………….……………...

ГЛАВА 4. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКОЙ АУТОИММУННОЙ

КРАПИВНИЦЕЙ И ХРОНИЧЕСКОЙ ИДИОПАТИЧЕСКОЙ

КРАПИВНИЦЕЙ…………………………………………………………………..

ГЛАВА 5. ХАРАКТЕРИСТИКА ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ

У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКОЙ АУТОИММУННОЙ КРАПИВНИЦЕЙ

ПОСЛЕ ПРОВЕДЕНИЯ ЛЕЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОМ

«ГАБРИГЛОБИН-IGG»………………………………………………………… 5.1. Характеристика спонтанной и ФГА-индуцированной продукции цитокинов клетками иммунной системы в тесте ex vivo у больных хронической аутоиммунной крапивницей после лечения препаратом «Габриглобин-IgG»………………………………………………………………. Характеристика цитокин-продуцирующей способности клеток 5.2.

иммунной системы под действием препарата «Габриглобин-IgG» в тесте ex vivo у больных хронической аутоиммунной крапивницей после лечения... 5.3. Оценка иммунологических показателей у больных хронической аутоиммунной крапивницей после лечения препаратом «Габриглобин-IgG»……………………………………………………………….. 5.4. Критерии отбора больных хронической аутоиммунной крапивницей на лечение препаратом «Габриглобин-IgG»……………………………………….. ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………………… СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ………………………………………………………..

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы В современной аллергологии крапивница представляет серьезную проблему. По распространенности хроническая крапивница (ХК) занимает третье место после поллиноза и бронхиальной астмы [34]. Ранее считалось, что ХК в 80-95% многочисленными исследованиями в данной области процент хронической идиопатической крапивницы (ХИК) заметно сократился и составляет 55%, и около 45% в структуре ХК составляет хроническая аутоиммунная крапивница (ХАК) [111]. Наиболее тяжелой фомой ХК является ХАК. Ввиду сложности и малой изученности иммунных механизмов в патогенезе ХАК, терапевтическая тактика лечения таких пациентов является малоэффективной.

Известно, что в основе патогенетических механизмов ХАК лежит образование аутоантител к высокоафинному IgE рецептору и молекуле IgE, которые способны стимулировать выброс медиаторов из базофилов и тучных клеток, результатом чего является развитие уртикарной реакции [124]. Однако причина образования аутоантител у больных ХАК на сегодняшний день остается неизвестной. Также отмечено, что при ХАК развиваются различные дефекты иммунной системы, которые могут выражаться в гиперактивации Т- и В-систем иммунитета, активации систем свертывания крови, компонентов комплемента, дисбалансе системы цитокинов [73,97,98,165,170]. Доказано, что ключевую роль в патогенезе ХАК играют ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFN [7,122,164,182]. Но немногочисленные данные по этому вопросу являются противоречивыми и не дают полного представления о цитокиновой регуляции при ХАК, в связи с чем, изучение иммунологических механизмов с участием цитокинов является особенно актуальным.

В последнее время одним из перспективных методов изучения цитокинов является исследование их продукции клетками иммунной системы в тестах ex vivo. Данные тесты создают своего рода модельные системы, наиболее приближенные к реальным условиям, исследовать которые можно вне организма.

Кроме того, они позволяют дать оценку не только цитокин-продуцирующей способности клеток иммунной системы, но и использовать их для изучения влияния фармакологических препаратов, с целью назначения терапии больным [52].

Одним из наиболее эффективных методов в лечении больных ХАК является применение внутривенных иммуноглобулинов (ВВИГ). В нашей стране в МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского (Москва) был разработан ВВИГ четвертого поколения – препарат «Габриглобин-IgG», высокая эффективность которого была доказана в ряде работ [13,41]. Однако механизмы действия данного препарата при ХАК до сих пор остаются малоизученными. Также, несмотря на большой процент пациентов с хорошими результатами от терапии, сохраняется процент с неудовлетворительными результатами. В связи с вышеизложенным для оптимизации терапии актуальным является разработка иммунологических критериев отбора больных ХАК на лечение препаратом «Габриглобин-IgG».

Степень разработанности темы исследования ХАК была открыта в 1993 году M.Greaves и M.Hide [119]. Было показано, что в основе данной формы ХК лежит образование аутоантител, которые способны активировать тучные клетки и базофилы и вызывать их дегрануляцию [155]. Однако до сих пор причина их образования остается неясной. Большой вклад в изучение патогенетических механизмов ХАК внесли зарубежные ученые.

Так, Boguniewicz M., Cugno M. доказали роль активации коагуляционного каскада [84,95]. Kasperska-Zajac A. и соавторы изучали роль гормональных нарушений в патогенезе данного заболевания [126]. Santos J. C. и соавторы исследовали цитокиновую регуляцию и роль хемокинов [165,166]. Кроме того, известны работы Caproni M. и соавторов, в которых рассматриваются вопросы нарушения цитокиновой регуляции и клеток иммунной системы при ХАК [86,88,89].

Известен ряд ученых, включая Samia A.I., Tedeschi A., Ying S., работы которых посвящены изучению цитокинов у больных с данной патологией [164,173,182].

Однако до сих пор нет единого мнения о цитокиновой регуляции при ХАК.

Из отечественных ученных, которые занимаются проблемой ХАК, известны Борзова Е.Ю., Гервазиева В.Б., Груздева М.С. Голубчикова Р.Н., Горячкина Л.А., Данилычева И.В., Калимолдаева С.Б., Молотилов Б.А., Орлова Е.А., Сигбатуллина Н.А. и другие. Но работы данных авторов посвящены, в основном, проблеме диагностики и лечения заболевания, а также исследованию отдельных немногочисленных иммунологических параметров.

При этом остаются малоизученными вопросы, связанные с иммунными нарушениями у больных ХАК. Кроме того, до сих пор не было проведено комплексной оценки показателей клеточного, гуморального иммунитета, системы комплемента и цитокинов. В перечисленных выше работах по изучению цитокинов при ХАК, представлены результаты исследований, которые проводились в сыворотке крови, и до сих пор не было проведено изучения спонтанной и стимулированной продукции цитокинов клетками иммунной системы. Исследование цитокин-продуцирующей способности клеток иммунной системы у больных с данной патологией является новым направлением в изучении патогенеза ХАК.

Цель исследования Оценить цитокин-продуцирующую способность клеток иммунной системы у больных с аутоиммунной формой хронической крапивницы и определить ее роль в оптимизации лечения.

Задачи исследования 1. Оценить выработку ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFN в спонтанном и ФГА-индуцированном супернатанте в тесте ex vivo у больных хронической аутоиммунной крапивницей.

«Габриглобин-IgG» на клетках иммунной системы здоровых доноров.

3. Определить влияние диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG» на показатели выработки ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFN клетками иммунной системы в тесте ex vivo у больных хронической аутоиммунной крапивницей.

4. Провести сравнительную оценку иммунологических показателей у больных хронической аутоиммунной крапивницей и хронической идиопатической крапивницей.

5. Дать оценку влияния лечения препаратом «Габриглобин-IgG» на цитокин-продуцирующую способность клеток иммунной системы, а также иммунологические показатели у больных хронической аутоиммунной крапивницей.

6. На основе показателей продукции цитокинов клетками иммунной системы в тесте ex vivo разработать критерии отбора больных хронической «Габриглобин-IgG».

Научная новизна Впервые проведена оценка продукции ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFN клетками иммунной системы в спонтанном и ФГА-индуцированном супернатанте методом ex vivo у больных ХАК.

«Габриглобин-IgG» для использования в тесте ex vivo с клетками иммунной системы больных ХАК.

Впервые изучено влияние диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG» на продукцию ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFN клетками в тесте ex vivo у больных ХАК.

Проведена комплексная сравнительная оценка показателей клеточного, гуморального иммунитета, системы комплемента, а также показателей ключевых цитокинов в сыворотке крови у больных ХАК и ХИК.

Выявлено влияние препарата «Габриглобин-IgG» на цитокинпродуцирующую способность клеток иммунной системы у больных ХАК, а также показатели иммунитета.

проведению лечения препаратом «Габриглобин-IgG».

Теоретическая и практическая значимость работы Результаты, полученные при изучении иммунологических показателей и цитокин-продуцирующей способности клеток иммунной системы больных ХАК, а также влияния на них препарата «Габриглобин-IgG», будут способствовать пониманию иммунологических механизмов в патогенезе ХАК и механизмов действия данного препарата.

Различия в основных иммунологических параметрах между больными ХАК и ХИК могут указывать на различие патогенетических механизмов данных форм ХК.

Установлено, что тест ex vivo дает более полную информацию о цитокиновой продукции, в связи с чем, изучение уровня цитокинов у больных ХАК целесообразнее проводить в супернатанте клеток, а не в сыворотке крови.

Определены диагностически значимые разведения препарата «ГабриглобинIgG» для использования в тесте ex vivo с клетками иммунной системы больных ХАК.

На основании данных по продукции ключевых цитокинов, полученных в целесообразно назначать терапию препаратом внутривенного иммуноглобулина «Габриглобин-IgG».

Методология и методы исследования поставленной цели. Предметом исследования стала цитокин-продуцирующая способность клеток иммунной системы и основные иммунологические показатели у больных ХАК, а также их изменения после лечения препаратом «Габриглобин-IgG». Научная литература, посвященная проблеме ХАК, была проанализирована формально-логическими методами исследования.

Планирование и проведение исследований, направленных на решение поставленных задач, осуществлялось на основе общенаучных и специфических методов. Основным объектом исследования являлась венозная кровь больных ХАК.

Проведено клиническое, открытое, проспективное, рандомизированное исследование. Критериями включения пациентов в исследование явились:

наличие аутоиммунной формы хронической крапивницы, возраст 18-60 лет, информированное согласие на участие в исследовании. Критерии исключения:

острая крапивница, психические заболевания, туберкулез любой локализации в активной фазе, онкологические заболевания, беременность и период лактации.

Материалы исследованиия Исследования проводились на базе аллергологического отделения ГБУЗ Пензенской городской клинической больницы № 4 (Пенза, Россия), кафедре аллергологии и иммунологии и ЦНИЛ Государственного бюджетного образовательного учреждения дополнительного профессионального образования «Пензенский институт усовершенствования врачей» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ДПО ПИУВ МЗ РФ) с сентября 2011 года по ноябрь 2013 года.

При выполнении данной работы было проведено комплексное аллергоиммунологическое обследование 120 пациентов с ХК в возрасте от 18 до 60 лет, из которых пациенты с ХАК составили 100 человек (основная группа) и пациенты с ХИК – 20 человек (группа сравнения). В качестве контрольной группы было обследовано 30 практически здоровых лиц, сопоставимые по полу и возрасту с основной группой.

Средний возраст больных ХАК составил 41+12 лет. Распределение больных ХАК по полу и возрасту представлено в таблице 1.

Таблица 1 – Распределение больных ХАК по полу и возрасту Возраст (лет):

В группе сравнения средний возраст пациентов составил 41+12 лет, среди которых было 14 женщин и 6 мужчин, что соответствовало группе больных ХАК.

В контрольной группе возраст здоровых людей составил от 23 до 56 лет (средний возраст составил 34+9 лет) и среди них было 24 женщины и 6 мужчин, что также было сопоставимо с группой больных ХАК.

Клинический раздел работы был проведен сотрудниками кафедры аллергологии и иммунологии ГБОУ ДПО ПИУВ МЗ РФ (заведующий кафедрой – д.м.н., профессор Б.А. Молотилов).

Диагноз ХАК устанавливался на этапе предварительного обследования на основании клинических проявлений болезни, анамнестических данных, а также результатов аллерго-иммунологического обследования.

В дальнейшем из 100 пациентов с диагнозом ХАК 27 пациентам было проведено лечение препаратом «Габриглобин-IgG». Лечение препаратом проводилось по следующей схеме: в дозе 2,5 грамма в сутки (0,03-0,04 г/кг веса) в течение 4 дней. Данная терапия проводилась дополнительно к базисному лечению.

Клиническую эффективность лечения оценивали по разработанной 4-х бальной шкале [13]. При этом у всех пациентов определяли следующие параметры: проба с аутосывороткой, динамика количества высыпаний и изменение интенсивности зуда. О клинической эффективности терапии препаратом «Габриглобин-IgG» у пациентов с ХАК судили по динамике клинических проявлений заболевания и длительности ремиссии после лечения.

Динамика клинических проявлений заболевания оценивалась в баллах от - до 2, где -1 – это увеличение количества высыпаний, усиление зуда и увеличение размеров пробы с аутосывороткой, 0 – это отсутствие изменений после курса лечения, 1 – уменьшение размеров пробы с аутосывороткой и количества аутосывороткой, полная клиническая ремиссия заболевания.

Длительность ремиссии оценивалась по шкале от 0 до 3 баллов, где 0 – отсутствие ремиссии после курса лечения, 1 – длительность ремиссии менее месяцев, 2 – длительность ремиссии более 6 месяцев и 3 – длительность ремиссии более 12 месяцев.

Затем полученные баллы суммировались и эффект от терапии препаратом «Габриглобин-IgG» у пациентов с ХАК оценивали по таблице 2.

Таблица 2 – Метод учета результатов иммунотерапии Оценка результатов Баллы Критерии эффективности иммунотерапии иммунотерапии Неудовлетворительный менее 4 Лечение прекращено из-за отсутствия эффекта Методы исследования Аллергологические методы исследования Аллергологическое обследование включало постановку кожных проб с аутосывороткой и определение общего IgЕ.

аллергологического отделения ГБУЗ Пензенской городской клинической больницы № 4 (Пенза, Россия) по методу M. Hide [119].

Для выполнения постановки пробы с аутосывороткой у пациентов был осуществлен забор крови натощак из локтевой вены в стеклянные пробирки без катализатора свертывания в объеме 5 мл. Кровь оставляли для свертывания при комнатной температуре в течение 30 минут. Далее кровь центрифугировании для получения сыворотки при 500 g в течении 15 минут. Сыворотку использовали для постановки внутрикожной пробы в день забора крови. Постановку пробы с аутосывороткой осуществляли путем внутрикожного введения 50 мкл неразведенной сыворотки во внутреннюю поверхность предплечья пациента.

Положительным контролем являлся раствор гистамина (5 мг/мл, 0,02 мл), отрицательным – физиологический раствор (0,9% раствора NaCl, 0,02 мл).

Расстояние между каждой внутрикожной инъекцией составляло не менее 5 см.

Оценку реакции проводили через 30 и 60 минут. Внутрикожная проба с аутосывороткой оценивалась по размеру волдыря в месте инъекции по сравнению с отрицательным контролем. Пациентам с диаметром пробы 7 мм и более ставили аутосывороткой, относили в группу с ХИК [13].

Определение уровня общего IgE в сыворотке крови проводилось методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) коммерческими наборами фирмы «АлкорБио» (Россия) на кафедре аллергологии и иммунологии ГБОУ ДПО ПИУВ МЗ РФ. Концентрацию определяли на иммуноферментном анализаторе «Stat Fax» 3200.

Иммунологические методы исследования Иммунологические методы исследования являются очень важными и информативными при заболеваниях, сопровождающихся иммунными нарушениями. Так как иммунная система играет главную роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний, то данные методы позволяют дать количественную и функциональную оценку основным иммунологическим параметрам и установить характер иммунопатологических изменений. В нашей работе иммунологические методы исследования позволили оценить роль иммунопатологических механизмов в патогенезе ХАК.

Для оценки клеточного иммунитета было проведено исследование уровней основных популяций Т-лимфоцитов, а также вычисление соотношения CD4/CD – иммунорегуляторного индекса (ИРИ). Иммунофенотипирование субпопуляций Т-лимфоцитов проводили методом непрямой мембранной иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител (МКА) серии ИКО производства ООО «Сорбент» (Россия). На поверхности лимфоцитов выделялись следующие дифференцировочные антигены:

CD4 – дифференцировочный антиген Т-хелперов, выполняющий роль рецептора для антигенов HLA 2-го класса;

CD8 – дифференцировочный антиген цитотоксических Т-лимфоцитов, участвующих в распознавании молекул HLA 1 класса.

Для выявления фиксированных на лимфоцитах МКА добавляли меченую ФИТЦ кроличью сыворотку против иммуноглобулинов (Ig) мыши. Препараты изучались на люминесцентном микроскопе МИКМЕД-2.

Для оценки гуморального иммунитета было проведено исследование уровней сывороточных иммуноглобулинов классов А, M, G и циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Определение уровней IgА, IgM, IgG проводили в сыворотке крови с помощью метода Mancini [143] – простой радиальной иммунодиффузии с использованием моноспецифических антисывороток к соответствующим иммуноглобулинам производства ФГУП НПО «Микроген»

(Россия).

Уровень ЦИК определяли методом осаждения полиэтиленгликолем (ПЭГ) по методу V. Haskova [116]. Использовали 3 и 4 % растворы ПЭГ «Panreac Sintesis» (Испания).

Также было проведено исследование системы комплемента, которое включало в себя определение уровней С3- и С4-компонентов. Уровни данных показателей исследовали в сыворотке крови имунотурбидиметрическим методом наборами ЗАО «DiaSys» (Германия). Концентрацию исследуемых показателей измеряли на фотометрическом анализаторе АБ ФК-02-«НПП-ТМ» фирмы «Колибри».

Дополнительно к исследованию основных иммунологических параметров было проведено изучение уровня антител к нативной ДНК, которое проводилось в сыворотке крови методом твердофазного ИФА наборами ЗАО «Вектор-Бест»

(Россия).

Оценка цитокинового профиля включала определение цитокинов в сыворотке крови, а также супернатанте спонтанной и ФГА-индуцированной продукции клеток иммунной системы. Кроме того, была проведена оценка цитокиновой продукции под действием диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG».

Определение цитокинов в сыворотке крови отражает текущее состояние иммунной системы. В нашем исследование было проведено изучение уровней ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFN в сыворотке крови методом твердофазного ИФА и наборами ЗАО «Вектор-Бест» (Россия). Концентрацию измеряли на иммуноферментном анализаторе «Stat Fax» 3200.

Кроме исследования уровня цитокинов в сыворотке крови было проведено изучение продукции цитокинов клетками иммунной системы методом ex vivo.

Данный метод является наиболее перспективным методом лабораторной диагностики и позволяет дать оценку спонтанной продукции цитокинов клетками иммунной системы и их резервных возможностей в условиях, сопряженных с дефицитом или дисбалансом регуляторных факторов. Также метод ex vivo позволяет провести оценку влияния лекарственных препаратов на клетки иммунной системы больных. Для определения цитокинов в супернатанте клеток иммунной системы проводилась постановка, основанная на тесте в модификации Е.Г. Исаченко [31].

Методика постановки теста ex vivo для определения спонтанной и ФГАиндуцированной продукции клеток иммунной системы осуществлялась по следующей схеме. Забор крови производился натощак, из локтевой вены в стерильные стеклянные пробирки с гепарином. Полученную кровь разбавляли до концентрации 1:5 стерильной средой 199 с солями Хэнкса и глутамином производства «ПанЭко» (Россия), которая содержала 50 мкг/мл гентамицина.

Далее для постановки спонтанной продукции клеток в пробирку добавляли мкл разбавленной крови (1:5) и 75 мкл стерильной среды 199. Для постановки индуцированной продукции клеток использовали ФГА. Данный митоген был выбран в качестве стимулятора клеток иммунной системы из-за избирательной способности активировать Т-клетки, которые продуцируют изучаемые нами цитокины [66]. При постановке индуцированной продукции клеток иммунной системы использовали ФГА производства «ПанЭко» (Россия), с концентрацией мг/мл, из которого готовили рабочий раствор путем разбавления его в 100 раз физиологическим раствором 0,9% NaCl до концентрации 0,1 мг/мл. В пробирку добавляли 675 мкл разбавленной крови (1:5) и 75 мкл ФГА с концентрацией 0, мг/мл (конечная концентрация ФГА в пробирке составила 0,01 мг/мл). Далее проводилась инкубация в течение 6 часов при 37°С. Пробирки охлаждали, центрифугировали 5 минут при 800g, супернатант отбирали и замораживали.

Определение концентрации ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFN в супернатанте спонтанной и ФГА-индуцированной продукции клеток иммунной системы осуществлялось методом твердофазного ИФА наборами ЗАО «Вектор-Бест»

(Россия).

Методика проведения теста ex vivo с препаратом «Габриглобин-IgG»

Методика постановки теста ex vivo для определения продукции цитокинов клетками иммунной системы под действием диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG» проводилась по следующей схеме:

забор крови производился натощак из локтевой вены в стерильные стеклянные пробирки с гепарином. Полученную кровь разбавляли до концентрации 1: стерильной средой 199 с солями Хэнкса и глутамином производства «ПанЭко»

(Россия), которая содержала 50 мкг/мл гентамицина. Далее к 675 мкл разбавленной крови (1:5) добавляли 75 мкл препарата «Габриглобин-IgG» в диагностически значимых разведениях. Пробирки инкубировали в термостате в течение 6 часов при 37°С. Затем охлаждали и центрифугировали 5 минут при концентрации ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFN в супернатанте производилось методом твердофазного ИФА наборами ЗАО «Вектор-Бест» (Россия).

Диагностически значимые разведения препарата «Габриглобин-IgG»

подбирались на клетках иммунной системы 30 здоровых доноров методом ex vivo. Критерием подбора был максимальный процент здоровых людей, у которых наблюдалась высокая выработка изучаемых цитокинов. При постановке теста ex vivo были использованы разведения препарата 1:1, 1:3, 1:10. Данные разведения готовили путем разбавления препарата «Габриглобин-IgG» производства ЗАО «Иммуно-Гем» (Россия) стерильной средой 199. Учитывая, что концентрация иммуноглобулина в препарате была равна 0,05 г/мл, то при разведениях препарата она составила:

Разведение 1:1 – концентрация иммуноглобулина 0,025 г/мл;

Разведение 1:3 – концентрация иммуноглобулина 0,0125 г/мл;

Разведение 1:10 – концентрация иммуноглобулина 0,0045 г/мл.

Конечные концентрации иммуноглобулина препарата «Габриглобин-IgG» в пробирке с кровью составили (разведение в 10 раз):

Разведение 1:1 – концентрация иммуноглобулина 0,0025 г/мл=2,5 г/мкл;

Разведение 1:3 – концентрация иммуноглобулина 0,00125 г/мл=1,25 г/мкл;

Разведение 1:10 – концентрация иммуноглобулина 0,00045 г/мл=0,45 г/мкл.

Методы статистической обработки результатов Для информационной конфиденциальности использовался персональный компьютер с созданием базы данных. Статистический анализ полученных результатов проводился с помощью пакета прикладных программ «STATISTICA 6.0», а также с применением программы SPSS для ROC-анализа.

При обработке полученных результатов аллерго-иммунологических исследований были использованы традиционные методы статистического анализа [67].

1. Для проверки на нормальность распределения по выборке проводился тест Колмогорова-Смирнова, который считается значимым при уровне p < 0,05.

Так как большинство иммунологических параметров имело ненормальное распределение, были использованы методы непараметрической статистики.

2. Для каждого параметра Х определяли следующие показатели: медиана (Ме) и интерквартильный размах 25% и 75%.

3. Сравнение количественных признаков в независимых группах проводили по методу Манна-Уитни. Проверялась гипотеза о равенстве средних рангов.

Также применялся метод Вальд-Вольфовица, для проверки гипотезы о том, что исследуемые группы получены из одной генеральной совокупности, а также