«ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ КОМБИНИРОВАННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ БИХРОМАТА КАЛИЯ И БЕНЗОЛА НА ОРГАНИЗМ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) ...»

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего

профессионального образования «Оренбургская государственная

медицинская академия» Министерства здравоохранения

Российской Федерации

На правах рукописи

МИХАЙЛОВА Ирина Валерьевна

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ КОМБИНИРОВАННОГО

ВОЗДЕЙСТВИЯ БИХРОМАТА КАЛИЯ И БЕНЗОЛА НА ОРГАНИЗМ

(ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научные консультанты:

Смолягин Александр Иванович доктор медицинских наук, профессор Боев Виктор Михайлович Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Оренбург –

ОГЛАВЛЕНИЕ

Оглавление…………………………………………………………………………... Список основных сокращений……………………………………………………... Введение……………………………………………………………………………... Глава 1. Современные представления о воздействии органических и неорганических веществ на организм…………………………... Распространенность бензола и хрома в окружающей среде и 1.1.

механизмы их действия…………………………………………... Пути преобразования бензола и хрома в организме…………… 1.2.

Влияние бензола и хрома на иммунологические параметры 1.3.

организма в эксперименте и клинике…………………………… 1.3.1. Воздействие бензола и хрома на показатели периферической крови и костный мозг…………………. 1.3.2. Воздействие бензола и хрома на факторы неспецифической резистентности………………………. 1.3.3. Воздействие бензола и хрома на Т- и В-систему иммунитета………………………………………….......... Влияние бензола и хрома на апоптоз …………………………… 1.4.

Влияние бензола и хрома на процессы СРО и ПОЛ………….... 1.5.

Влияние микроэлементного статуса организма на параметры 1.6.

иммунной системы ……………………………………………… Глава 2. Материалы и методы исследований…………………………………… Иммунологические методы исследования……………………… 2. Биохимические методы исследования…………………………... 2. Исследование микроэлементов в биосредах……………………. 2. Статистические методы…

2.4 Глава 3. Влияние бензола и бихромата калия и их комбинации на показатели периферической крови крыс Вистар и мышей (СВАХС57ВL6)F1……………………………………………………….. Влияние бензола, бихромата калия и их комбинации на 3.1.

клеточный состав периферической крови крыс Вистар и мышей (СВАхС57Вl6)F1……………..…………………...…..….. Влияние бензола, бихромата калия и их комбинации на 3.2.

фагоцитарную и метаболическую активность сегментоядерных нейтрофилов периферической крови и перитонеальных макрофагов крыс Вистар и мышей (СВАхС57Вl6)F1………………………………………...………... Влияние бензола, бихромата калия и их комбинации на уровень лизоцима в сыворотке крови крыс Вистар и мышей (СВАхС57Вl6)F1…………………………….……………………. Влияние бензола, бихромата калия и их комбинации на параметры хемилюминесценции в сыворотке крови крыс Вистар …………………..………………………………................ Влияние бензола, бихромата калия и их комбинации на активность антиоксидантных ферментов в эритроцитах крыс Вистар и мышей (СВАхС57Вl6)F1……………………………… Влияние бензола, бихромата калия и их комбинации на содержание микроэлементов в крови крыс Вистар ……………. Глава 4. Влияние бензола, бихромата калия и их комбинации на лимфоидные (СВАхС57Вl6)F1……………………………………………………….... Влияние бихромата калия на количество клеток и морфологические показатели лимфоидных органов крыс Вистар и мышей (СВАхС57Вl6)F1……………………………… Влияние бензола, бихромата калия и их комбинации на параметры хемилюминесценции в селезенке, печени крыс Вистар и мышей (СВАхС57Вl6)F1……………………………… Влияние бензола, бихромата калия и их комбинации на интенсивность образования диеновых конъюгатов и малонового диальдегида в селезенке и печени крыс Вистар …. Влияние бихромата калия, бензола и их комбинации на содержание микроэлементов в селезенке крыс Вистар ……….. Влияние бихромата калия, бензола и их комбинации на содержание микроэлементов в печени крыс Вистар………….... Влияние бензола, бихромата калия и их комбинации на митотическую активность и апоптоз лимфоцитов селезенки крыс Вистар……………………………………………………….. Связи между уровнем микроэлементов и значениями иммунологических и биохимических показателей крыс Вистар……………………………………………………………... Глава 5. Влияние бензола, бихромата калия и их комбинации на клеточный и гуморальный иммунный ответ крыс Вистар и мышей (СВАхС57Вl6)F1…………………….…………………………………... Влияние бихромата калия, бензола и их комбинации на (СВАхС57Вl6)F1…………………………………..…………….... Влияние бихромата калия, бензола и их комбинации на гуморальный иммунный ответ крыс Вистар и мышей (СВАхС57Вl6)F1…………………….…………………..……...… Влияние бихромата калия, бензола и их комбинации на продукцию цитокинов спленоцитами крыс Вистар и мышей Маркеры ответа иммунной системы на воздействие бензола, Заключение…………………………………………………………………………... Выводы………………………………………………………………………………. Литературный указатель……………………………………………………….…... АсАТ – аспартатаминотрансфераза АлАТ- аланинаминотрансфераза АОК – антителообразующие клетки АТ – антитела АФК – активные формы кислорода ГГАКС – гипотоламо-гипофизарно-адренокортикальная система ГГТ - глутамилтранспептидаза ГЗТ – гиперчувствительность замедленного типа ДК – диеновые конъюгаты ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ИФА – иммуноферментный анализ КОЕ – колониеобразующая единица Кон А – конканавалин А МДА – малоновый диальдегид МЭ - микроэлементы НСТ сп – спонтанный НСТ – тест НСТ ст – стимулированный НСТ – тест НСТ – тест восстановления нитросинего тетразолия ОХ - общий холестерин ПДК – предельно допустимая концентрация ПОЛ – перекисное окисление липидов П/Я нейтрофилы – палочкоядерные нейтрофилы РНК - рибонуклеиновая кислота СРО – свободно-радикальное окисление С/Я нейтрофилы – сегментоядерные нейтрофилы ТГ = триглицериды ФИ – фагоцитарный индекс ФП – фагоцитарный показатель ЭБ – эритроциты барана CD - кластер дифференцировки (cluster of differentiation) СYP 450 – цитохром Р450-зависимые монооксигеназы IL-4 - интерлейкин – Ig A, M, G - иммуноглобулины сыворотки крови А, M, G IFN – интерферон-гамма FR-4 - подтип фолатных рецепторов Th1 – Т хелперы 1 типа Th2 – Т хелперы 2 типа Cu - медь Cr - хром Fe - железо Ni - никель Mg - магний Mn - марганец Zn – цинк

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования и степень ее разработанности многокомпонентную систему из быстро делящихся и покоящихся клеток, поэтому она является высокочувствительной к воздействию различных антропогенных факторов, что является одной из причин существенного роста заболеваемости, связанной с нарушением иммунитета, и в первую очередь с нарушением иммунорегуляторных процессов. Снижение функций иммунной системы под влиянием токсичных веществ вызывает индуцированный вариант вторичных иммунодефицитных состояний [116,75,94]. В качестве химических загрязнителей могут выступать различные органические соединения (толуол, бенз[а]пирен, бензол, формальдегид, хлорорганические, фосфорорганические соединения) и неорганические соединения (ртуть, мышьяк, бериллий, цинк, медь, никель, хром, свинец, кадмий и др.) [60,9,188,228]. При любом пути воздействия данных веществ возникает их непосредственный контакт с клетками иммунной системы и формируется системная реакция с соответствующими клиникоиммунологическими и гематологическими проявлениями.

К одним из наиболее распространенных химических поллютантов относятся соединения хрома и бензола, основными источниками загрязнения которыми [7,40,187,152,209,283]. В литературе имеются немногочисленные работы о влиянии бензола и хрома на отдельные иммунологические параметры [31,40,66,284,232].

комбинированное действие факторов производственной среды [14,85,103], то несомненный интерес может представлять проведение модельного эксперимента по изучению влияния изолированного и комбинированного действия хрома и бензола на иммунную систему экспериментальных животных.

Независимо от природы химических факторов, первым патогенетическим детоксикации и элиминации патогенного начала [78,47,267,256,288]. Одним из последствий воздействия антропогенных факторов на организм является активация процессов свободного радикального окисления, приводящая к развитию в организме окислительного стресса с одновременным угнетением естественных механизмов антирадикальной защиты [35,98,304,232,201].

комплексному воздействию хрома и бензола на состояние свободнорадикального представлялось актуальным в условиях модельного эксперимента изучение влияния указанных веществ на процессы СРО и активность антиокислительных ферментов эритроцитов крови при их раздельном и комплексном воздействии.

В последние годы в литературе появилось большое количество сообщений о влиянии микроэлементов на клеточные и гуморальные параметры иммунной системы [87,166,176]. Показано, что уровень различных иммунологических параметров зависит от содержания эссенциальных и токсичных МЭ в объектах окружающей среды и, соответственно, в питьевой воде и продуктах питания [13,14,121,10]. В связи с данными литературы [57,65,140,216], изменения концентрации МЭ рассматривается в качестве одного из механизмов изменений иммунологических параметров при воздействии химических факторов. Вместе с тем, до начала данной работы отсутствовали работы по комбинированному воздействию бензола и хрома на уровень МЭ лимфоидных органов.

В настоящее время ведется поиск связей между факторами химической природы и последующими морфо-функциональными изменениями в организме. В связи с чем, представляло интерес исследование механизмов действия и выявление приоритетных маркеров ответа на комбинированное воздействие бензола и хрома в условиях модельного эксперимента.

Актуальность настоящей работы определяется тем, что до начала наших исследований в условиях модельного эксперимента не была проведена комплексная оценка сдвигов иммунологических параметров млекопитающих при влиянии бензола, бихромата калия и их комбинации; не были четко сформулированы представления о механизмах, определяющих формирование особенностей этих сдвигов; не были установлены приоритетные маркеры воздействия бихромата калия, бензола, их комбинации на организм. Все вышеизложенное послужило основанием для проведения данного исследования.

Цель исследования Целью настоящего исследования явилась комплексная оценка воздействия бензола, бихромата калия и комбинации этих веществ на иммунную систему экспериментальных животных с определением механизмов и маркеров данного воздействия.

Задачи исследования Определить воздействие бензола, бихромата калия и их комбинации на показатели периферической крови крыс Вистар и мышей (СВАхС57Вl6)F на 45, 90 и 135-е сутки экспозиции.

Оценить влияние бензола, бихромата калия и их комбинации на лимфоидные органы крыс Вистар и мышей (СВАхС57Вl6)F1 на 45, 90 и 135-е сутки эксперимента.

В эти же сроки исследовать воздействие бензола, бихромата калия и их комбинации на клеточный и гуморальный иммунный ответ крыс Вистар и мышей (СВАхС57Вl6)F1.

Определить маркеры ответа раздельного и комбинированного влияния бензола и бихромата калия на иммунологические параметры крыс и мышей и механизмы, определяющие морфо-функциональную перестройку иммунной системы при данном воздействии.

Методология и методы исследования Экспериментальные исследования по изучению влияния бензола, бихромата калия и их комбинации проведены на 772-х здоровых половозрелых крысахсамцах линии Вистар массой 250-300 г и 604-х мышах (CBAxC57B16) F1 массой 20-25 г. Перед началом эксперимента животные содержались в карантине (1 мес.) с выбраковкой подозрительных на заболевание особей. Дозы токсикантов соответствовали одной ПДК [1,2].

Все животные, включенные в исследование, содержались на стандартном пищевом рационе и были разделены на 4 группы. Животные первой группы (контроль) содержались в том же виварии и получали воду. Животные 2, 3, групп вместе с питьевой водой, перорально получали следующие химические вещества: животные второй группы - бензол («Полихим», Россия) из расчта 0, мл/кг, третьей группы - бихромат калия («Полихим», Россия) из расчта 20 мг/кг, четвертой группы - смесь бихромата калия (из расчта 20 мг/кг) и бензола (из расчта 0,6 мл/кг). Через 45, 90 и 135 суток животные выводились из эксперимента летальной дозой эфирного наркоза.

Результаты, полученные у животных первой группы в каждой серии экспериментов, достоверно не отличались между собой, что позволило объединить их и использовать в качестве контроля.

Эксперименты проведены в соответствии с этическими нормами и рекомендациями по гуманизации работы с лабораторными животными, отраженными в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей» (Страсбург, 1985).

Исследование параметров иммунитета проводилось в соответствии с методами экспериментальной иммунологии [26,61,6,22,81].

Изучение биохимических показателей проводили в соответствии с биохимическими методами исследования [319,243,99,110].

Содержание МЭ (Fe2+, Cu2+, Zn2+, Cr3+, Ni2+) в крови и органах (печень, селезенка) крыс Вистар определялось атомно-адсорбционным методом [68] на спектрометре «КВАНТ-2А» (ООО «Корчек», Москва) в лаборатории ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Оренбургской области».

Результаты проведенных исследований обработаны методами вариационной статистики с использованием пакета программ для ПК Microsoft Excel 7.0, STATISTICА 10.0, включая методы параметрического (критерий Стьюдента), непараметрического (критерий Манна-Уитни) анализов. Корреляционный анализ выполнен в рамках программы «Statistica for Windows 10.0». Для выделения значимых коэффициентов корреляции был выбран уровень значимости, принятый для медико-биологических исследований (р < 0,05). Результаты исследования представлены в виде медианы (Ме) и интерквартильного размаха (25-й и 75-й процентиль), а также в виде среднеарифметического значения (M±m).

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора Научные положения и выводы диссертации основаны на анализе достаточного объема экспериментального материала, адекватном подборе экспериментальных групп животных и применении современных методов экспериментальных условиях. Для статистической оценки результатов в работе использовались современные методики сбора и обработки исходных количественных данных.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на региональной научнопрактической конференции «Молодые ученые - здравоохранению» (Оренбург, 2005); IV научной конференции иммунологов Урала (Уфа, 2005); V конференции иммунологов Урала (Оренбург, 2006); Объединенном Иммунологическом Форуме (С.-Петербург, 2008); Российской конференции иммунологов Урала (Челябинск, 2011); Российской научно-практической конференции с международным участием «Медико-социальные аспекты формирования вторичных иммунодефицитных состояний у жителей Южно-Уральского региона»

(Оренбург, 2011); X конференции иммунологов Урала с международным участием (Тюмень, 2012); Объединенном Иммунологическом Форуме (Нижний Новгород, 2013).

Автором проведен аналитический сбор отечественных и зарубежных источников литературы по изучаемой проблеме за последние 20 лет и предложен план выполнения работы с последующим набором фактического материала. Доля участия автора в накоплении материала – 75%, а в обобщении и анализе материала – до 90%. Автор лично участвовал в планировании и проведении экспериментов, статистической обработке, анализе, интерпретации и обсуждении полученных данных, подготовке к публикации основных результатов диссертационной работы в журнальных статьях и тезисах конференций.

Положения, выносимые на защиту Хроническое воздействие комбинации бензола и хрома в организм крыс Вистар и мышей (CBAxC57B16) F1 приводило к угнетению клеточного (снижение числа клеток лимфоидного ряда и плазматических клеток, CD3+-, CD4+-, CD8+- лимфоцитов в селезенке, ослабление интенсивности реакции ГЗТ) и гуморального иммунного ответа (снижение абсолютного числа АОК на селезенку).

В основе выявленных сдвигов параметров иммунной системы лежит повышение интенсивности процессов СРО у крыс (сыворотка крови, селезенка, печень) и мышей (селезенка, печень), ПОЛ (селезенка, печень крыс) на фоне снижения активности СОД, каталазы (крысы, мыши) и изменение уровня МЭ (снижение концентрации меди, никеля, железа (кровь, печень), повышение содержания хрома (кровь, селезенка, печень)).

Маркерами биологического ответа организма на изолированное действие бензола являются число клеток миелоидного и лимфоидного ряда в костном мозге; хрома - количество клеток миелоидного и эритроидного ряда в селезенке; на комбинированное воздействие бензола и хрома - число клеток лимфоидного ряда и плазматических клеток в селезенке.

Научная новизна В условиях модельного эксперимента впервые проведена оценка сдвигов иммунологических параметров крыс Вистар и мышей (СВАхС57Вl6)F1 при комбинированном воздействии бензола и хрома на 45, 90, 135-е сутки.

Комбинированное влияние бензола и хрома приводило к однонаправленным изменениям, носившим закономерный характер вне зависимости от видовых особенностей животных – крысы и мыши.

Впервые проведено иммунофенотипирование клеток селезенки у крыс и мышей, длительно получавших комбинацию бензола и хрома, которое установило снижение относительного и абсолютного числа CD3+-, CD4+-, CD8+- лимфоцитов у животных обоих видов.

Впервые исследовано комбинированное влияние бензола и хрома на уровень цитокинов, продуцируемых спленоцитами крыс и мышей. Установлено увеличение уровня противовоспалительного ИЛ-4 (крысы, мыши), снижение концентрации ИЛ-6, при этом содержание ИЛ-10 существенно не изменялось (крысы).

В условиях комбинированного влияния бензола и хрома у крыс обнаружено угнетение клеточного и гуморального иммунного ответа, которое выражалось в ослаблении интенсивности реакции ГЗТ, снижении абсолютного числа АОК на селезенку.

Получены новые сведения о механизмах, определяющих морфофункциональную перестройку иммунной системы крыс и мышей, в основе которой лежит: активация процессов СРО у крыс (сыворотка крови, селезенка, печень) и мышей (селезенка, печень) и ПОЛ (селезенка, печень крыс) на фоне снижения активности СОД, каталазы (крысы, мыши) и изменение уровня МЭ (снижение концентрации меди, никеля, железа (кровь, печень), повышение содержания хрома (кровь, селезенка, печень)).

Теоретическая и практическая значимость работы Анализ полученных данных позволил установить иммунологические показатели, свидетельствующие о развитии индуцированного варианта вторичного иммунодефицитного состояния при комбинированном влиянии бензола и хрома на иммунную систему экспериментальных животных.

Полученные данные позволили оценить роль комбинированного воздействия бензола и хрома в изменении параметров иммунной системы, содержания микроэлементов в биосредах, активности антиоксидантных ферментов, интенсивности СРО и ПОЛ.

Определены маркеры биологического ответа организма комбинированного воздействия бензола и хрома: число клеток лимфоидного ряда и плазматических клеток в селезенке.

Выявленные механизмы, лежащие в основе нарушений иммунологических показателей, являются экспериментальным обоснованием для разработки подходов к предупреждению отрицательных последствий комбинированного воздействия бензола и хрома.

Внедрение результатов исследования в практику Полученные данные используются в учебном процессе для студентов медико-профилактического и лечебного факультетов Оренбургской государственной медицинской академии.

По данным работы издано утвержденное Министерством здравоохранения Оренбургской области информационное письмо «Морфофункциональная характеристика гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной и иммунной систем организма экспериментальных животных при воздействии хрома и бензола». – Оренбург, 2013. – 18 с.

Публикации Соискатель имеет 85 работ, из них по теме диссертации опубликовано 32 работы общим объемом 7,2 печатных листа, в том числе 24 публикации в научных журналах, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертации, 6 работ в материалах всероссийских, международных конференций, съездов, пленумов, 1 статья в региональном издании, подготовлено информационное письмо «Морфофункциональная характеристика гипоталамогипофизарно-адренокортикальной и иммунной систем организма экспериментальных животных при воздействии хрома и бензола», утвержденное Министерством здравоохранения Оренбургской области.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 192 страницах машинописного текста, иллюстрирована 37 таблицами и 8 рисунками. Работа состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов. Библиография включает 324 литературных источников, из них 125 на русском языке.

ГЛАВА 1. Современные представления о воздействии органических и 1.1 Распространенность бензола и хрома в окружающей среде В настоящее время многообразие химических веществ, обращающихся в среде обитания, различие их химической структуры и физико-химических свойств, трудности управления риском химических воздействий превратили химические соединения в реальную угрозу выживания человека и живой природы [77]. В качестве химических загрязнителей могут выступать соединения металлов [121,188,195,129,304], различные органические соединения [56,79,13].

Из всех классов неорганических соединений, поступающих в биосферу в результате человеческой деятельности, наибольшее внимание привлекают тяжелые металлы (Pb, Cd, Hg, Ni, Co, Cr, Cu, Zn, As, Sb, Se) [38,91,46,7], которые относятся к числу важнейших факторов, обуславливающих загрязнение водных объектов.

Среди тяжелых металлов хром занимает одно из приоритетных мест, так как, во-первых, достаточно широко используется в промышленности (горнодобывающие, машиностроительные, металлообрабатывающие, текстильные и др.), а также поступает в атмосферу при сжигании бурых каменных углей [76,31,40,166,192]. Во-вторых, необходим для нормального протекания биохимических процессов и, в-третьих, являясь металлом с переменной валентностью, в степени окисления +6 проявляет металл–индуцированную токсичность и канцерогенность в основе которой лежит генерация и роль активных форм кислорода [304], в результате чего в организме реализуется так называемый «окислительный стресс» [96,11,160,167,204], который является одним из центральных звеньев в патогенезе большинства неинфекционных заболеваний.

Среди многочисленных загрязнителей окружающей среды органического происхождения бензол и его производные относятся к категории наиболее распространенных [27,8,60,7,232]. Бензол применяется как растворитель и разбавитель красок, лаков, смол, жиров, каучука, в качестве добавки к автомобильному топливу, что способствует повсеместному распространению бензола в воздухе [209,283].

процессов при наличии экологически неблагоприятных факторов и отбор информативных тестов и показателей для оценки действия этих хрома и бензола.

Вместе с тем, важность решения проблем, связанных с влиянием химических веществ на организм определяется еще и тем, что в связи с развитием промышленности и нарастанием процессов урбанизации, создаются условия поступления в организм человека одновременно нескольких или многих вредных комбинированное действие химических веществ на организм.

взаимодействий можно разделить на две группы: 1 группа - связанные с химическим взаимодействием токсикантов, 2 группа – не связанные с химическим взаимодействием токсикантов.

Первая группа взаимодействия химических веществ связана: а) с веществами, чаще такое взаимодействие ослабляет токсический эффект тяжелых металлов, делая их менее доступными для связывания с биологическими макромолекулами; б) с образованием гидрофобных хелатных комплексов, что может способствовать проникновению металлов внутрь клетки, резко увеличивая проницаемость мембран для их ионов (механизм потенцирования).

торможением одним веществом процессов обезвреживания или выведения другого (например, за счет угнетения ферментной системы, обеспечивающей детоксикацию); б) активацией одним из веществ ферментных систем, осуществляющих метаболизм второго вещества с образованием более токсичного продукта (так называемый «летальный синтез»); в) образованием дополнительных повреждений за счет взаимодействия субповреждений, индуцируемых каждым из веществ в отдельности, но не являющихся значимыми при раздельном воздействии каждого из них, в частности это характерно для токсикантов, действие которых связано с повреждением генетического материала клетки, то есть для канцерогенных и мутагенных веществ.

Таким образом, изучение комбинированного действия химических веществ различной природы в условиях современного промышленного производства чрезвычайно актуально, поскольку имеющиеся в настоящее время сведения о характере действия отдельных химических веществ, в том числе о хроме и бензоле, не позволяют в полной мере дать оценку опасности совместного поступления их в организм.

1.2 Пути преобразования бензола и хрома в организме Бензол легко вступает в связь с белками крови и растворяется в липидах плазмы. В основном он вызывает хронические отравления в результате поступления через легкие, кожу и слизистые оболочки небольших доз в течение длительного времени. При этом на фоне нервных нарушений доминируют выраженные изменения в системе крови, в основном в костномозговом кроветворении (резкое угнетение продукции лейкоцитов, тромбоцитов и эритроцитов, т. е. всех трех основных типов форменных элементов крови) [27,54,170,246,235].

В то время как общепринятым признанием является тот факт, что бензол вызывает токсические эффекты через метаболизм, особенно токсические метаболиты, до конца понимание этого феномена остается неясным [282,286]. В печени бензол метаболизируется CYP2E1 в фенол, который подвергается последующему гидроксилированию в гидрохинон, катехин и 1,2,4-бензотриол [288]. Так, [287] было показано, что частичная гепатоэктомия защищает животных от вредного действия бензола, это свидетельствует о том, что токсичность бензола связана с его биотрансформацией в печени под действием цитохрома Р- [35,181,287,209,283].

CYP2E1-зависимый метаболизм является необходимым условием для цитотоксического и генотоксического действия бензола [261,232], так как преобразование генерируемых CYP2E1 метаболитов в органах-мишенях считается основным механизмом для местного образования токсичных молекул [180].

Итак, метаболизм бензола начинается в печени, где происходит его микросомальное окисление ферментами цитохрома Р-450 (преимущественно CYP2E1) макромолекулами и является источником всех других метаболитов [256,131].

Рисунок 1.2.1 Основные пути метаболизма бензола [209,232].

Далее основные пути метаболизма бензола, через которые реализуется повреждающее действие данного вещества, учитывая данные [209,283,232], можно разделить следующим образом.

Во-первых, это радикальные механизмы, которые заканчиваются образованием активных форм кислорода (АФК), в результате активируются процессы СРО, приводящие в конечном итоге к гибели клетки. В данном случае, реактивными метаболитами являются гидрохиноны и катехолы (рис. 2), которые образуются из оксида бензола в результате его спонтанной перегруппировки в фенол [287,209,232], который при последующем окислении CYP2E преобразуется в гидрохинон [211,261]. Катехол образуется в результате гидролиза оксида бензола эпоксид гидролазой, что приводит к образованию бензол дегидродиола, который может быть преобразован в катехол через дегидродиол дегидрогеназу или бензолдиолэпоксид через окисление Р-450 (CYP) [142].

Гидрохинон и катехол могут окисляться до 1,4 бензохинона и 1,2 бензохинона, которые также связываются с макромолекулами [229,139,307,256], при этом из всех метаболитов бензола 1,4-бензохинон наиболее часто связан с токсическими эффектами в организме человека и животных [280,285,286,197].

Наряду с этим, реактивными метаболитами, которые также могут приводить к образованию АФК, являются - S-фенилмеркаптопуриновая кислота, которая образуется в результате реакции оксида бензола с глутатионом и фермента Sтрансферазы [145,260] и 1,2,4-тригидроксибензол, образующийся через CYP окисление гидрохинона [271,267].

Во-вторых, это безрадикальные механизмы, которые заканчиваются образованием реактивных метаболитов – мукональдегида и Е,Е-муконовой кислоты (рис. 2.), которые обладают токсичностью и способны связываться с макромолекулами [215,180,134,244]. Образование мукональдегида происходит в результате окисления окзепина Р-450, которое приводит к открытию кольца [312,283]. При последующем окислении мукональдегида, он преобразуется в Е,Емуконовую кислоту [230,282,273].

Еще одним принципиальным моментом, является тот факт, что образование реактивных метаболитов (гидрохинона, катехола) происходит в органах и клетках, которые содержат значительное количество пероксидаз (миелопероксидаз) – костный мозг. Это подтверждается установленным фактом того, что гидрохинон и катехол далее метаболизируются под воздействием миелопероксидазы или простагландин Н синтетазы в семихиноны или [175,252,276,290,249]. Учитывая то обстоятельство, что костный мозг наиболее богат миелопероксидазой по сравнению с печенью, активация гидрохинонов и катехолов, как токсичных хинонов, будет более вероятна в костном мозге, чем в неблагоприятного воздействия бензола на костный мозг и может приводить к развитию токсичности и канцерогенности [283].

Доминирование изменений в системе крови, в основном в костномозговом кроветворении (резкое угнетение продукции лейкоцитов, тромбоцитов и эритроцитов, т. е. всех трех основных типов форменных элементов крови) можно объяснить предложенными в настоящее время, механизмами индуцированной бензолом гематотоксичности. Во-первых, это прямое цитотоксические действие реактивных метаболитов бензола на клетки-предшественники [150,189,316], вовторых, нарушение стромального микроокружения клеток костного мозга [173,143] и, в-третьих, ингибирование или подавление продукции цитокинов клетками костного мозга [158,205,148].

Кроме того, необходимо отметить, что независимо каким образом были образованы метаболиты бензола, свое негативное действие они реализуют через повреждение ДНК, хромосом [249,171,300,284,209].

Предполагают, что метаболит бензола 1,4 бензохинон иначе связывает гуанин или аденин и ингибирует мРНК [271], а также Е,Е – мукональдегид, метаболит бензола с открытым циклом, может связываться с ДНК, образует поперечные ДНК-белок связи [278]. Вместе с тем, воздействие бензола вызывает хромосомные аберрации [171], которые важны в развитии бензол индуцированной лейкемии [316]. Механизмы лейкемогенеза и бензол индуцированной токсичности до конца не изучены, тем не менее, учитывая, тот факт, что метаболиты бензола могут вызывать повреждение ДНК или другие изменения (например, связанные с ингибированием топоизомеразы II), они могут являться определенными инициаторами развития лейкемии [285,286]. Один из механизмов бензол индуцированной лейкемии предложен на рисунке 1.2.2:

Рисунок 1.2.2 Происходящие изменения при бензол стимулированной лейкемии [286,209].

Таким образом, основные метаболические пути бензола через которые реализуется повреждающее действие данного вещества, это радикальные механизмы, которые заканчиваются образованием активных форм кислорода, в результате активируются процессы СРО, приводящие в конечном итоге к гибели клетки и безрадикальные механизмы. Кроме того, необходимо отметить, что независимо каким образом были образованы метаболиты бензола, свое негативное действие они реализуют через повреждение ДНК, хромосом. Еще одним принципиальным моментом, является тот факт, что образование реактивных метаболитов (гидрохинона, катехола) происходит в органах и клетках, которые содержат значительное количество пероксидаз (миелопероксидаз) – костный мозг, лимфоидные органы, этим объясняется доминирование изменений в системе крови, в основном в костномозговом кроветворении (резкое угнетение продукции лейкоцитов, тромбоцитов и эритроцитов, т. е. всех трех основных типов форменных элементов крови).

Рассматривая роль хрома, необходимо отметить, что в организм соединения хрома поступают с пищей, водой и воздухом. Всасывание хрома происходит преимущественно в тощей кишке, при этом не усвоенный хром выводится с калом. В тканях органов содержание хрома в десятки раз выше, чем в крови.

Наибольшее количество хрома присутствует в печени и почках, кишечнике, щитовидной железе, селезенке [100]. Механизм превращения бихромата калия в организме начинается с процесса проникновения в клетку. Так показано, что все хроматы Cr(VI) способны активно проникать в клетки через каналы для транспорта изоэлектрических или изоструктурных анионов, к примеру, через каналы для SO4- и HPO42- [291,304]. Нерастворимые хроматы абсорбируются клетками путем экзоцитоза. До настоящего времени доказано, что транспорт через клеточную мембрану осуществляется только для соединений Cr(VI) (рис.

1.2.3). Однако последние исследования показали возможность поступления соединений восстановленного хрома, образованных внеклеточными механизмами [182]. Некоторые внеклеточно образованные комплексы Cr(III) и Cr(VI) также обладают высокой проницаемостью через клеточную мембрану [240,304].

Рисунок 1.2.3 Проникновение и повреждение ДНК Cr(VI) [204].

Далее в организме Cr(VI) превращается в Cr(III) под действием под действием аутомикрофлоры кишечника и дыхательных путей [108].

трансферрином, белком-транспортером железа. Cr(VI) после абсорбции сразу же захватывается эритроцитами и восстанавливается в Cr(III) уже внутриклеточно низкомолекулярных антиоксидантов, таких как глютатион и витамин С [177,293].

Процесс восстановления Cr(VI) в Cr(III) происходит по следующей схеме:

На первом этапе, бихромат ион при одноэлектронном восстановлении одномоментно распадается с образованием хромат-иона (VI) – CrО42— (1) и аниона, содержащего восстановленный хром (V) – CrО3— (2), который затем восстанавливается до четырх (CrО32—) и трхвалентного (Cr3+) [157,177,169,293].

Восстановление происходит за счт внутриклеточных низкомолекулярных антиоксидантов, таких как глютатион и витамин С [177,293], в результате чего их запас в клетке уменьшается Таким образом, несмотря на то, что токсические свойства бензола и хрома известны [178,144,213,147,153], исследований, посвященных комбинированному влиянию бензола и хрома на иммунную систему и механизмы, через которые оно реализуется, остаются нерешенными. В связи с этим становится очевидным необходимость изучения действия вещества на параметры иммунитета, микроэлементный статус организма и биохимические показатели экспериментальных животных, с последующим отбором информативных тестов и показателей для оценки действия этих веществ.

1.3. Влияние бензола и хрома на иммунологические параметры организма в 1.3.1 Воздействие бензола и хрома на показатели периферической крови и Бензол и его метаболиты оказывают выраженное гематотоксическое действие, при этом в наибольшей степени страдает лимфоидная линия клеток, так как полигидроокисленные метаболиты бензола аккумулируются в костном мозге и лимфоидных органах, вызывая гипоплазию центральных и периферических органов иммунитета. Видимый признак такого явления – это уменьшение клеточности в органах кроветворения и лимфоидных органах (селезенка, тимус) [21,44,287,77,60].

Причинами этого могут быть уменьшение количества полипотентных стволовых клеток или клеток-родоначальников (предшественников всех видов клеточных элементов крови в органах кроветворения), что обусловлено, с одной стороны, прямым цитотоксическим действием на них бензола (или его метаболитов, в частности 1,4 – бензохинона) [77,280,285,286,197].

Повреждающее действие бензола на кровь сопровождается снижением продукции клеточных элементов органами кроветворения и уменьшением количества клеток в периферической крови, что определяется термином «депрессия кроветворения» [105]. Бензол известен и как агент, вызывающий апластическую анемию, но обращается внимание и на лейкемогенное действие бензола [281]. При достаточных по интенсивности и времени уровнях воздействия бензола на кровь в конечном итоге определяется тремя последовательно развивающимися синдромами: лейко-, тромбоцито- и эритроцитопенией.

Так, при воздействии бензола отмечается резкое уменьшение эритроцитов и нейтрофилов, при этом изменения коррелируют с применяемой дозой и концентрацией бензола в моче [303,186]. Неспецифические изменения в периферической крови проявляются нейтрофильным лейкоцитозом на фоне лимфо- и эозинопении, ретикулоцитоза с качественными изменениями форменных элементов крови. Последние выражаются макроцитозом эритроцитов, повышением процентного содержания дегенеративно измененных лейкоцитов, их цитотоксическими изменениями. В тоже время, в эксперименте на мышах линии СВА установлено, что бензольная интоксикация сопровождалась снижением числа лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов в периферической крови [4]. При обследовании работников, контактирующих с бензолом (нефтяников и маляров) показано, что хроническая интоксикация характеризуется уменьшением количества лейкоцитов, тромбоцитов и эритроцитов в периферической крови [54,184,207]. Выявляемое снижение числа лейкоцитов в периферической крови можно объяснить прямым цитотоксическим действием бензола, в частности, лейкопения может являться следствием торможения процессов деления в основном на уровне миелоцита и депонированием бензола, помимо костного мозга, и в крови, а именно в лейкоцитах, которые окисляют бензол, что было доказано в модельных опытах с лейкоцитарной взвесью [72]. [210] показали, что бензол уменьшает количество моноцитов/макрофагов в периферической крови.

Отрицательное влияние на гемопоэз выражается в нарушении клеточного цикла гемопоэтических клеток, что приводит к динамическому нарушению продукции кроветворных клеток [315].

Токсическое действие бензола и его гомологов на кроветворную систему отражается также на количественных и качественных изменениях клеток нейтрофильного ряда. Нейтропения является частым гематологическим признаком, который выявляется у людей, подвергшихся воздействию бензола, и у лабораторных животных, затравливаемых бензолом и его гомологами. При этом механизм бензольной нейтропении может быть связан, во-первых, с торможением образования и пролиферации колонии материнских клеток нейтрофильного ряда, во-вторых, с сокращением продолжительности жизни этих клеток, обусловленное, уменьшением осмотической резистентности [72].

Аналогичное явление токсического действия органических растворителей наблюдали в отношении лимфоцитов [234].

Следует отметить, что на фоне уменьшения числа форменных элементов в крови, выявляется гиперплазия костного мозга с признаками задержки созревания клеточных элементов эритроидного и миелоидного ряда [8,77].

Бензол действует на клетки костного мозга, находящиеся в фазе G2 митоза, однако в сублетальных дозах возможно действие хинольных метаболитов на клетки в период клеточного деления [159]. Эти данные подтверждаются другими исследованиями, показывающими, что низкие концентрации фолатов могут предотвращать повреждения ДНК, вызванные бензолом [222].

При введении мышам С57BL/J внутрибрюшинно бензола в дозе 600 мг/кг раза в сутки в течение 2 дней в костном мозге на 3-и сутки снижается число клеток, особенно лимфоцитарного и эритроцитарного ростков кроветворения, а число предшественников и зрелых клеток гранулоцитарного ряда возрастает. Это происходит вследствие неспособности стромальных фибробластов синтезировать колониестимулирующий фактор, необходимый для стволовых клеток и клетокпредшественников [36]. [54] обследуя лиц, контактирующих с бензолом, установили, что хроническая интоксикация приводила к последовательному поражению сначала лейкопоэтической, затем мегакариоцитарной и в последнюю очередь эритропоэтической функции костно-мозгового кроветворения. При хроническом действии на мышей паров стирола отмечали увеличение вариабельности количества эритроидных колониеобразующих клеток с тенденцией к снижению их числа в селезенке. При этом число гранулоцитарных колониеобразующих клеток не изменялось [77].

1.3.2 Воздействие бензола и хрома на факторы неспецифической Химические вещества, как правило, в той или иной степени угнетают неспецифическую резистентность организма, гуморальный иммунитет и клеточный иммунитет [36,232].

постинтоксикационных) иммунодефицитных состояний может быть повреждение структуры ДНК лимфоцитов и (или) процессов репарации ДНК под влиянием эндогенных метаболитов или лекарств, а нарушения функционирования иммунокомпетентных клеток могут быть обусловлены неполноценностью процессов реанжировки генов иммуноглобулинов, так как в этих процессах участвуют те же ферменты, что и в репарации ДНК [71,77]. Кроме того, необходимо учитывать, что реализация иммунотропных эффектов ксенобиотиков происходит на различных стадиях иммуногенеза, а также в процессе кооперации клеток при индуцировании гуморального или клеточного иммунных ответов.

Данные литературы в целом определенно свидетельствуют о снижении неспецифических факторов защиты организма под действием химических агентов [60]. Так, при хроническом воздействии сернистого ангидрида, ФОС, фенола, акролеина, окиси углерода, неорганических соединений фтора, стирола, бензола установлено уменьшение лизоцимной активности. [36,77,245]. Поскольку лизоцим синтезируется и секретируется гранулоцитами, моноцитами и макрофагами [30], число которых снижается при воздействии бензола [210], то снижение концентрации лизоцима сыворотки крови будет результатом этого воздействия. Также было показано, что у детей, проживающих в загрязненном районе, отмечается пониженный уровень лизоцима в слюне [29].

Cr (VI) уменьшал содержание в макрофагах глютатиона и подавлял активность глютатионпероксидазы, фагоцитарную активность макрофагов и продукцию интерлейкинов [155].

1.3.3 Воздействие бензола и хрома на Т- и В-систему иммунитета Как правило, угнетение функции моноцитарно-фагоцитарной системы сопровождается Т- и В-иммунодефицитными состояниями [115,114,125].

Известно, что бензол и его метаболиты оказывают выраженное гематотоксическое действие, при этом в наибольшей степени страдает лимфоидная линия клеток [21,44]. Причины столь высокой чувствительности лимфоидной ткани к бензолу кроются в слишком большой длительности клеточного цикла, аэробном виде обмена и высокой скорости окислительного фосфорилирования лимфоидной ткани, кроме того, установлена способность бензола блокировать клеточное деление на стадии G2/М (клеткам, находящимися в фазе синтеза ДНК и митотическом цикле), угнетая формирование клеточного веретена – это объясняют действием бензола на сульфгидрильные группы тубулина [45].

Среди лимфоидных органов наибольшей чувствительностью к бензолу обладает тимус. Доказано, что клеточность тимуса снижается уже тогда, когда клеточность лимфатических узлов и селезенки еще не изменяется. В селезенке клеточность уменьшается за счет малых лимфоцитов при снижении соотношения В/Т – лимфоцитов, в лимфатических узлах – за счет равномерного снижения Т- и В-лимфоцитов [77]. [27] на мышах было показано, что при хронической ингаляционной затравке бензолом в концентрациях 3, 14, 30 мг/м 3 в течение месяцев с увеличением длительности экспозиции и концентрации бензола усиливалась атрофия тимуса (истощение тимоцитов в корковой и мозговой зоне) и селезенки., при этом не зависимо от концентрации бензол вызывал лейкопению.

Первой страдает Т-система иммунитета, это, возможно, связано с тем, что Т-лимфоциты характеризуются наиболее высоким содержанием в них микросомальных цитохромов Р-450, которые участвуют в биотрансформации ксенобиотиков, а в частности, бензола, однако при выраженных формах интоксикации угнетается и В-система иммунитета. При этом нарушается баланс, как среди лимфоцитов различной природы, так и между иммунокомпетентными и кроветворными клетками. В результате это приводит к нарушению как иммуногенеза (угнетение антителогенеза), так и миелопоэза. Дисбаланс клеточных коопераций лимфоидной системы ослабляет иммунологический контроль за антигенраспознающими свойствами лимфоцитов, что ведет к появлению «запрещенных клонов» и как следствие усилению аутоиммунных процессов [77].

Влияние метаболитов бензола на функции клеток иммунной системы может варьировать и зависит от типа клеток и стимула, инициируемого иммунный ответ [232]. Установлено, что воздействие бензола приводит к снижению циркулирующих Т- и В-лимфоцитов [206,270,135,127,164] и торможению митоген-стимулированной пролиферации лимфоцитов [248,247,269].

Так, выявлено снижение CD4+- клеток, на фоне увеличения моноцитов и CD8+ лимфоцитов [193]; снижение уровня CD3+ клеток, лимфопения, нейтропения и моноцитопения. Снижение функции CD3+ клеток предполагает связь с уменьшенной сопротивляемостью к инфекционным болезням [163].

Хроническое воздействие бензола в высоких концентрациях приводило к быстрому и стойкому сокращению В-клеток в селезенке и Т-клеток в тимусе [164]. Растворители подобные бензолу стимулировали В-клетки в лимфоузлах и были причиной хромосомных изменений, коррелировавших с отрицательной экспрессией CD-25(IL-2R) и CD4+ и CD8+ лимфоцитов [223]. Примечательно, что различные субпопуляции лимфоидной ткани, отличающиеся гетерогенностью, неодинаково чувствительны к бензолу [77].

Приведенные выше данные косвенно свидетельствуют о том, что бензол является иммунодепрессантом, подтверждением чего могут быть работы в которых было показано, что обработка мышей бензолом приводит к снижению числа антителобразующих клеток и угнетению бласттрансформации Т- и Вклеток, индуцированной соответствующими митогенами [311,269,268]. [21] в эксперименте на мышах, показали, что иммуносупрессивный эффект бензола находился в зависимости от функционального состояния иммунокомпетентных клеток. В наибольшей степени иммуносупрессия проявлялась в период, когда предшественники антителопродуцентов находились в состоянии покоя или в индуктивной фазе иммунного ответа. Кроме того, бензол модулировал процесс антителообразования, сдвигая его пик и активируя на короткий период секрецию антител. В тоже время в зависимости от сроков введения бензола относительно антигенного стимула он вызывает стимуляцию или подавление антителообразования [21,44].

Клинические исследования иммунологической реактивности рабочих хромового производства с большим стажем работы (более 10 лет) выявило снижение количества Т-клеток и дисбаланс Т- и В-клеточных популяций, ослабление противоинфекционного иммунитета за счет снижения уровня IgG и IgM [15].

В настоящее время признано, что типы иммунного ответа связаны с одним из вариантов активации лимфоцитов с преимущественным участием клонов Тлимфоцитов хелперов I (Th1) или II (Th2) типа, которые различаются спектрами продуцируемых цитокинов и ролью в стимулировании развития иммунного ответа по клеточному или гуморальному типу [266,118]. Активация Th1, секретирующих ИЛ-2 и ИФН, ведет к стимуляции главным образом функций Тлимфоцитов и макрофагов и к развитию клеточного типа ответа, тогда как синтез Th2-клетками ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10, ИЛ-13 и ИЛ-25 стимулирует преимущественно гуморальное звено иммунитета [302,120,118].

Показано, что гидрохинон ингибирует, стимулированный фитогемагглютинином, бластогенез клеток селезенки и костного мозга крыс [202] и блокирует производство ИЛ-2 и ИФН лимфоцитами и клетками селезенки у мышей [258]. Также выявлено, что метаболиты бензола могут приводить к ингибированию Th1-ответа, и активировать Th2-фенотипа [232]. Так, метаболиты бензола вызывали увеличение секреции мононуклеарными клетками цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-5 [191] и способствовали Th2-ответу в LPS-активированных макрофагах [190,208]. Показано, что внутрибрюшинное введение высоких доз гидрохинона антиген сенсибилизированным мышам приводило к значительному увеличению в сыворотке крови уровня ИЛ-4 и антиген-специфических IgE.

Производство мощного противовоспалительного цитокина ИЛ-10 полностью подавлялось гидрохиноном и катехином [191]. Увеличение производства противовоспалительных цитокинов может способствовать развитию атопических заболеваний [232].

Результаты изучения воздействия метаболитов бензола на моноциты и макрофаги, противоречивы и, вероятно, связаны с различными методами исследования, используемые для воспроизведения экспозиции бензола. Одни исследователи установили, что воздействие бензола на макрофаги костного мозга приводило к увеличению продукции ФНОа, оксида азота, перекиси водорода [214,225,224], тогда как другие показали, что метаболиты бензола ингибируют функции перитонеальных макрофагов [217,210,227]. [245] показал, что предварительная обработка моноцитов периферической крови гидрохиноном подавляет производство ИЛ-1, ИЛ-2, ИФН и ФНОа без существенной потери жизнеспособности клеток. В тоже время, [191] установили, что после обработки катехином и бензохиноном периферических мононуклеарных клеток, продукция ИЛ-6 и ФНОа была увеличена. Таким образом, анализ литературы показал, что метаболиты бензола оказывают сложные и, зачастую, противоположные эффекты на продукцию цитокинов в зависимости от типа метаболита, дозы, длительности экспозиции.

Изучение влияния биологических добавок на иммуногенез при длительном контакте с выбросами нефтеперерабатывающего производства показало, что у животных происходило угнетение иммунного ответа к ЭБ и развитие глубокого вторичного иммунодефицита [95].

Исследование функций Тh1- и Th2-лимфоцитов по уровню продуцируемых или интерлейкинов при подостром отравлении токсичными химикатами (зарин, сернистый иприт, люизит) установило, что под влиянием токсичных веществ происходит снижение гуморального иммунного ответа к тимус-зависимому антигену, характеризующему синтез IgМ и функцию Тh1 лимфоцитов через суток, через 7 суток отмечалась супрессия продукции IgG, отражающих преимущественно функцию Th2-лимфоцитов. Содержание ИЛ-2 и ИЛ-4 в периферической крови крыс уменьшалось на всех сроках воздействия [75].

Таким образом, учитывая сложный и неоднозначный характер изменений иммунореактивности организма в условиях воздействия химических веществ, который обусловлен комплексом функциональных сдвигов, проявляющихся как на клеточном, так и на органном уровнях иммунной системы, и недостаточной изученностью механизмов, определяющих реализацию клеточного и гуморального иммунного ответа значительный интерес могут представлять данные по исследованию функциональных изменений иммунной системы при длительном, как раздельном, так и при комплексном воздействии бензола и хрома на организм.

Важнейшим механизмом иммунорегуляции от момента созревания и дифференцировки иммунокомпетентных клеток до этапа реализации механизмов врожденного и адаптивного иммунитета является апоптоз [81]. Наиболее распространен апоптоз при развитии и функционировании клеток иммунной системы [123]. На сегодняшний день накоплен фактический материал, свидетельствующий о роли нарушений апоптотической регуляции в развитии иммунопатологии [117]. Так, «дефицит апоптоза» активированных лимфоцитов является важным звеном патогенеза многих аутоиммунных заболеваний [63,52,81,299]. Показано, что у мышей с генетическим дефектом FasR или FasL, «нокаутом» генов проапоптогенных белков, развивается тяжелый аутоиммунный синдром, напоминающий красную волчанку [117]. Напротив, усиление апоптоза лимфоцитов является причиной формирования иммунологической недостаточности, например, при ВИЧ-инфекции, вирусных инфекциях, чрезмерных физических нагрузках [123,124,117].

интенсификацию свободно-радикальных процессов, дефицит антиоксидантной защиты, гиперпродукцию провоспалительных цитокнов (ФНО) и.т.д. [52,81,117], а также МЭ (Cr6+, Са2+, Ni2+) [63,301,259,154,305].

Так, согласно гипотезе программы клеточной гибели, ионы Zn2+ и цитокины (ИЛ-2, ИЛ-4, ИНФ), выполняют роль «факторов выживания», отсутствие которых в микроокружении приводит клетки к гибели [179,289,198]. Цинк блокирует апоптоз клеток различного происхождения и его эффект связан опубликовали данные о ингибиции этого фермента в изолированных из мышиных эндонуклеазы (NUC18), выделенной из ядер крысиных тимоцитов [174]. [221] получали апоптоз гепатоцитов телят или тимоцитов после инкубации клеток в течение 1 ч. с Са2+, повреждение ДНК удавалось частично подавить в присутствии Zn2+, добавляемого в культуральную среду. [168] продемонстрировали, что Zn2+ неселективно блокирует не только Са2+/Мg2+-эндонуклеазу, но и ДНК-азу II, которая активируется при снижении внутриклеточного рН. Однако [138] не получили ингибиции ДНК-азы II ионами Zn2+. В целом, несмотря на противоречивость имеющихся данных, следует отметить, что Zn2+ играет роль в подавлении апоптоза, что подтверждается экспериментами in vitro и in vivo на клетках различного происхождения (лимфоидной, опухолевой, печеночной и т.д.). Эффект Zn2+ имеет место на стадии активации ядерных эндонуклеаз и не сказывается на этапе «пре-апоптоза». Очевидно, что именно внутриклеточный лабильный пул Zn2+ модулирует активность эндонуклеаз. Наиболее чувствительны к отсутствию ионов Zn2+ и «факторов выживания» незрелые клетки, особенно предшественники Т-лимфоцитов, которые погибают из-за дефицита факторов роста, в частности, ИНФ. Предшественники В-лимфоцитов менее уязвимы благодаря сохранению специфичного для них ростового фактора ИЛ-4 [185]. Во многих работах обсуждаются возможные механизмы цинкзависимой депрессии Т-системы апоптозопосредованном влиянии дефицита цинка на иммунную систему. В экспериментах на животных и исследованиях in vitro показано, что дефицит цинка индуцирует Fas/Apo1 – опосредованный апоптоз многих линий клеток, в то время как восполнение недостатка цинка ингибирует этот механизм программированной гибели клеток [48,295,238].

Реализация апоптогенного эффекта Ni2+ происходит также вследствие индукции ПОЛ и многочисленных одиночных разрывов ДНК, а также за счет усиления синтеза про-апоптогенного цитокина-ФНО-а [226]. Однако эффекты Ni2+ являются дозозависимыми. У крыс дефицит никеля провоцировал развитие дефицита цинка, что проявлялось уменьшением размера органов вследствие атрофии [194]. Апоптогенный эффект Cr6+ также реализуется через активацию СРО и ПОЛ [45,304].

Таким образом, различные химические вещества способны влиять на апоптоз, который является ключевым механизмом иммунорегуляции, а его нарушения имеют патогенетическую значимость в развитии многих заболеваний.

Вместе с тем, исследование апоптоза, как одного из механизмов комбинированного действия бензола и хрома на показатели иммунной системы остается недостаточно изученным.

1.5. Влияние бензола и хрома на процессы СРО и ПОЛ Известно, что изучаемые вещества способны индуцировать оксидативный стресс и активацию СРО [45,77,43,304]. Так, активация процессов СРО является результатом воздействия хрома, как металла переменной валентности [292,204], а также - бензола, биотрансформация которого осуществляется с участием механизмов СРО [209,283,232].

В основе оксидативного стресса лежит генерация в клетке активных форм кислорода (АФК), представляющих собой продукты неполного восстановления его молекул: свободные радикалы, перекиси и другие метаболиты, обладающие высокой реакционной способностью [109,32,306].

реакционноспособные промежуточные продукты, причем некоторые из них нестабильны и подвергаются дальнейшему превращению, другие достаточно устойчивы. Так бензол в ходе I фазы метаболизма при участии цитохрома Р-450 и флавопротеинредуктазы, окисляется в хинон, продукты превращения которого могут переносить электроны на молекулярный кислород, что сопровождается регенерацией исходного субстрата и инициацией образования каскада кислородных радикалов. Образование свободных радикалов — один из общих механизмов цитотоксичности (рис. 1.5.1).

Рисунок 1.5.1 Образование кислородных радикалов в результате окислительно-восстановительного цикла хинона [60].

Установлено, что образование всех метаболитов бензола (фенолов, гидрохинонов, катехола, бензохинонов, транс, трансмукональдегида) происходит через стадию образования ареноксидов [35,181]. В данном случае активной окисляющей частицей в реакциях, катализируемых мооксигеназами, является атомарный кислород [35,232]. Это согласуется с высокой активностью кислорода в основном триплетном и возбужденном синглетном состояниях по отношению к таким типичным субстратам цитохрома Р-450, как ароматические, ненасыщенные и насыщенные углеводороды.

интермедиатов с промежуточными неустойчивыми степенями окисления может сопровождаться появлением активных форм кислорода (гидроксильных радикалов). Другими словами, включаясь в процесс одноэлектронного восстановления, хром активирует процессы свободнорадикального окисления.

Генерация активных форм кислорода, возможно, происходит при взаимодействии Crn+ (6 n 3) с перекисью водорода по реакциям Хабера-Вейса и Фентона [200,220,172,204].

Соединения хрома не только индуцируют генерацию свободных радикалов, но и способствуют истощению внутриклеточного пула антиоксидантов (глутатиона, аскорбиновой кислоты, селена и т д.) [239,241]. В этих условиях возникают многочисленные одиночные разрывы ДНК, перекрестные связи, что запускает программированную смерть клетки [149,136,137,310]. Cr3+ и Cr6+ индуцированном апоптозе играет генерация свободных радикалов, под действием которых возникает значительное количество потенциально нерепарируемых повреждений ДНК [45,272,314,233].

Негативные результаты нарушения окислительно-восстановительного баланса клетки реализуются, прежде всего, через усиление процесса ПОЛ, в который вовлекаются полиненасыщенные жирные кислоты в составе клеточных мембран. В состав фосфолипидов мембран входят в большом количестве полиненасыщенные жирные кислоты: линолевая, линоленовая, арахидоновая.

Наиболее легко подвергается ПОЛ арахидоновая кислота, имеющая в свом составе четыре двойных связи [97]. Отрыв атома водорода от молекулы жирной кислоты в -положении приводит к перемещению двойной связи с образованием сопряженного диена или диенового коньюгата.

В настоящее время наиболее изучены три прямых следствия такого усиления ПОЛ [18,17,19,16]. Во-первых, окисление тиоловых (сульфгидрильных групп) мембранных белков, приводящее к появлению дефектов в мембране клеток повреждению клетки. Во-вторых, накопление продуктов липопероксидации, повышающих проницаемость липидной фазы мембран, что обуславливает, в частности, утрату способности митохондрий к синтезу АТФ и, соответственно, приводит к развитию энергетического дефицита. Третьим результатом избыточной активации ПОЛ, возможно, самым важным, является уменьшение стабильности липидного слоя, что может привести к электрическому пробою мембраны под действием разницы потенциалов, создаваемой самой мембраной.

Для клеток иммунной системы подобные нарушения могут реализовываться путем ограничения пространственного перемещения Т-клеточного рецептора в процессе формирования иммунного синапса [133], или через изменение структуры липидных микродоменных рафт на плазматической мембране – своеобразных кластеров, отвечающих за сборку сигнальных комплексов и передачу сигналов с поверхности внутрь клетки [111].

В клетке оксидативные процессы находятся под строгим и чрезвычайно разнообразным контролем ферментативных и неферментативных антиоксидантных систем, которые регулируют уровень АФК, первичных продуктов перекисного окисления липидов [58,3]. Избыточная генерация АФК нарушает баланс между продукцией АФК и механизмами антиоксидантного контроля за их содержанием, и, в конечном итоге, приводит к истощению эндогенного антиоксидантного потенциала и развития «окислительного стресса», который оказывает негативное влияние на иммунокомпетентные клетки, нарушая их способность к пролиферации и изменяя соотношение регуляторных субпопуляций лимфоцитов, нарушая синтез ДНК и белка в лимфоцитах и, как следствие этого, приводя к подавлению иммунных реакций [125,272,314,166,232].

Экспериментальное исследование процессов антиоксидантной защиты при интоксикации 2,6-диизопропилфенилизоцианатом установило активацию процессов ПОЛ и недостаточность антиоксидантной системы [74].

Изучение состояния окислительного метаболизма экспериментальных животных при интоксикации несимметричным диметилгидразином (НДМГ) выявило, независимо от дозы и срока экспозиции, накопление вторичных и конечных продуктов ПОЛ в эритроцитах крыс (диеновых конъюгатов, кетодиенов, суммарных первичных и вторичных продуктов, оснований Шиффа [106]. Аналогичные результаты по накоплению продуктов ПОЛ были выявлены при влиянии хлорида кадмия на крыс Вистар, которые выражались в повышении содержания МДА и ДК в сыворотке крови [82] отравление хлорированными углеводородами приводило к активации ПОЛ, которая характеризовалась редукцией активности каталазы, пероксидазы и увеличением в крови крыс МДА [37].

полициклические ароматические углеводороды, нитрозамины, металлы в количествах, соответствующих количествам в воздухе вблизи оживленных автомагистралей и в накуренных помещениях приводило к активации процессов ПОЛ [88].

Хроническая ингаляция толуолом и диоксаном приводила к нарушению интенсивности свободнорадикального окисления в ткани яичников и больших глутатионпероксидазы в ткани мозга, уровня хемилюминесценции. В ткани глутатионпероксидазы, каталазы и интенсивности перекисного окисления белков [73].

Таким образом, хром, являясь металлом переменной валентности, и бензол, биотрансформация которого осуществляется с участием механизмов СРО, способны вызывать активацию свободно-радикальных процессов, генерируя образование свободных радикалов и могут приводить к активации ПОЛ. В связи с этим становится очевидным необходимость исследования процессов СРО и ПОЛ, для понимания механизмов комбинированного действия бензола и хрома на параметры иммунной системы и микроэлементный статуса организма.

В последнее десятилетие активизировалось внимание широкого круга исследователей к оценке содержания макро- и микроэлементов (МЭ) в биосубстратах при различных патологических состояниях, в разнообразных экологических условиях проживания. Это связано с тем, что большинство химических элементов являются структурными компонентами неживой и живой природы и, входя в состав биологически активных веществ (ферментов, гормонов, витаминов), участвуют во всех обменных процессах организма [87,59,100,204]. В настоящий момент нет достаточно полного представления о том, как реализуются в организме взаимодействие микроэлементов между собой и как это взаимодействие отражается на функции иммунной системы.

Учитывая факт, что МЭ не являются антигенами, а способны выступать лишь в роли гаптенов, то есть индуцировать иммунный ответ, будучи в модифицированном состоянии (соединения с белками, пептидами, аминокислотами, нуклеиновыми кислотами или синтетическими полимерами, [45] предположили, что дискретность действия МЭ более неспецифична, чем специфических антигенов, таких, как, например, белки. МЭ реализуют свое действие в меньшей степени на уровне распознавания антигена, а, в гораздо более значительной степени, на уровне активации, пролиферации и дифференцировки, регуляции продукции цитокинов. Другим важным их выводом является предположение, что МЭ могут оказывать важную кофакторную роль в регуляции иммунных ответов на другие, более специфичные вещества, способные выступать в качестве полноценных антигенов [57,100].

Согласно данным [45] и [59], существуют следующие механизмы действия МЭ в иммунной системе: 1) влияние на специфические рецепторы (Fe, Zn, Mn, Se, Al, Hg, Cr, Ni и др.); 2) влияние на активность ферментов, так как многие МЭ являются компонентом каталитического центра ряда ферментов (Zn — важнейшая часть многочисленных белков, регулирующих уровень транскрипции других внутриклеточных белков), а также через участие в конкурентном ингибировании или активации металлоэнзимов (например, Zn — конкурентный ингибитор Ca, Mg-зависимой эндонуклеазы, что определило его ведущую роль в иммунной системе как антиапоптотического фактора); 3) влияние на активность гормонов: а) как составная часть гормонов (например, Zn — компонент тимозина, реализующего эффекты тимуса на Т-клеточное звено иммунной системы); б) через влияние на депонирование гормонов (Zn, Cr участвуют в депонировании и стабилизации молекулы инсулина, оказывающего мультимодулирующее воздействие на все инсулинозависимые клетки организма, в том числе иммуноциты; 4) физико-химическое действие МЭ на мембраны иммуноцитов через посредничество ферментативных и неферментативных механизмов системы перекисного окисления липидов — антиоксидантная защита (Se, Cu, Zn, Mn, Fe);

5) воздействие на презентацию, внутриклеточный процессинг и деградацию антигенов (через влияние на соответствующие рецепторы); 6) воздействие на формирование иммунологической памяти (Zn, Se и др.); 7) воздействие на продукцию иммуноглобулинов (Zn, Be); 8) влияние на процессы хемотаксиса, адгезии и фагоцитоза (Mn, Hg, Zn).

Показано, что дефицит МЭ приводит к выраженным расстройствам нормального функционирования иммунной системы, а введение извне в период иммунной реакции может значительно изменять интенсивность последней [53,40]. Так, дефицит меди в питании ингибирует иммунный ответ, при этом страдают функции главным образом Т-хелперов [30] и Т-киллеров [218,126,255].

Цинк нормализует соотношение основных субпопуляций Т-хелперов [317], индуцирует синтез интерферона [165], его дефицит сопровождается иммунодефицитом с атрофией лимфоидной ткани, уменьшением содержания лимфоцитов (прежде всего Т-хелперов), снижением их пролиферативной активности, подавлением продукции ИЛ – 1, ИЛ – 2 [30,45]. Цинк стимулирует внутритимусное развитие Т-клеток, созревание В-лимфоцитов в Igсекретирующие клетки, созревание CD4+ и CD8+ клеток в культуре in vitro, нормализует соотношение основных субпопуляций Т-хелперов, индуцирует синтез интерферона, защищает клетки от апоптоза, может модулировать активность естественных киллеров и участвовать в Ca-зависимых процессах (клеточной активации). Другими словами, цинк незаменим для любого звена иммунитета. Недостаток Zn ведет к развитию вторичного иммунодефицита, противоопухолевого иммунитета, и его недостаток вызывает развитие некоторых опухолей (болезнь Ходжкина, лимфомы и др.). Экспериментально показано, что цинк в низких концентрациях (10-6—10-8 моль) стимулирует антителогенез, а в более высоких (5х10-5 моль) — тормозит его [101,100,92,250,317,254,264].

Медь в составе Cu - Zn-СОД обеспечивает защиту макрофагов и моноцитов от собственных свободных радикалов [304,257,176]. Экспериментальный недостаток Cu у животных характеризовался снижением активности макрофагов, субпопуляции CD4+, подавлением функциональной активности Т- и Влимфоцитов. Хронический дефицит Cu вызывал атрофию тимуса. В целом этот МЭ оказывает легкое иммуностимулирующее действие, а его недостаток в организме приводит к угнетению иммунного ответа, снижению антителогенеза [69,59].

В адекватном иммунном ответе организма принимает участие также железо.

Установлено, что низкое содержание железа в организме ведет к ослаблению функции иммунной системы: уменьшается концентрация в тканях макрофагов и гранулоцитов, угнетается фагоцитоз, ответ лимфоцитов на стимуляцию антигенами и образование антител, резко угнетается цитотоксическая функция клеток-киллеров, снижается продукция макрофагами интерферона, выработка цитокинов. Основная причина иммунной недостаточности при дефиците железа заключается в низкой активности ферментов, белков, рецепторного аппарата клеток, в состав которых входит железо [87,45]. С другой стороны, перегрузка ингибируются функции цитотоксических Т-лимфоцитов, угнетается популяция Тхелперов и наблюдается ее дефицит, что способствует возникновению предрасположенности к опухолям и инфекциям [308,146,304,140,216].

Никель также как и железо способен стимулировать гемопоэз, а его недостаточность сопровождается анемиями [87]. Известно, что Ni способен подавлять ЕК-активность и Т-клеточный ответ, вызывает сенсибилизацию определенных клонов Т-клеток и аутоиммунные процессы, уменьшает жизнеспособность альвеолярных макрофагов, способствует снижению содержания лизоцима, вырабатываемого макрофагами и трахеобронхиальными слизистыми железами, замедлению колебательных движений ресничек мерцательных клеток респираторного эпителия [92,100,236,298]. Двухвалентные ионы никеля способны стимулировать, как и другие двухвалентные ионы металлов, синтез ДНК в тимоцитах и лимфоцитах иной локализации у морских свинок, а также стимулировать митогенез В-лимфоцитов в ответ на полисахарид.

Стимуляция ионами никеля опосредуется Т-лимфоцитами, так как на чистые популяции В-лимфоцитов соли никеля не действуют. В тоже время, введение в организм животным солей никеля выражено ингибирует иммунную реакцию [45,194].

В последнее время отмечается значительный вклад различных МЭ (Hg, Cr, Ni, I, Zn, Se, Sb и др.) в развитие аутоиммунных и аллергических заболеваний (бронхиальная астма, контактные аллергические дерматиты, экзема, аутоиммунный тироидит, инсулинзависимый диабет и т. д.). Как правило, элементы вызывают гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ). Рост распространенности индуцированных МЭ-металлами аутоиммунных и аллергических заболеваний связывают с экологическим неблагополучием, а также с широким применением металлов [33,49,39,65,161,141].

Поражение механизмов антителогенеза по действием Сr, Ni, Hg, Pt, Au происходит с выраженным дисбалансом продукции цитокинов популяциями Тхелперов I и II типов (ИЛ-2, ИНФ-, ИЛ-4 и ИЛ-6) [196,212]. По данным литературы при интоксикации металлами имеет место чередование фаз ГЗТ и гуморальной фазы иммунного ответа с постепенной диссоциацией Т-хелперовиндукторов ГЗТ, либо В-лимфоцитов, а эти процессы связаны с массовой гибелью (апоптозом) лимфоцитов [23]. Таким образом, если эссенциальные МЭ оказывают нормализующее действие на антителогенез, то потенциально токсичные МЭ (Сr, Ni, Hg, Pt) вызывают поликлональную активацию В-лимфоцитов, обусловленную дисбалансом цитокинов, транскрипционного фактора NF-kB и его ингибитора, процессов апоптоза и выживания В-лимфоцитов. Вместе с тем, известно, что микроэлементы способны как индуцировать, так и подавлять апоптоз. Так, металлы, как индукторы СРО являются индуцирующими агентами, приводящие к разрывам ДНК, в то время как микроэлементы, подавляющие радикалиндуцированный апоптоз (Se, Mn, Zn, Cu), способствуют стабилизации генома и предупреждению гибели клеток [45].

Таким образом, почти все иммунные процессы в организме реализуются с участием МЭ и целый ряд иммунопатологий может быть связан с нарушением их баланса в организме. Вместе с тем, выявление новых причинно-следственных связей, составляющих механизм развития патологического процесса при наличии экологически неблагоприятных факторов, к которым относятся бензол и хром, открывает перспективы исследования взаимосвязи между содержанием МЭ в организме, изменением биохимических, иммунологических параметров и развитием экологически обусловленных заболеваний.

В целом, проблема длительного комбинированного действия в условиях современного промышленного производства чрезвычайно актуальна, поскольку имеющиеся в настоящее время сведения о характере действия отдельных химических веществ, в том числе хрома и бензола, не позволяют в полной мере дать оценку опасности совместного поступления их в организм, поскольку комбинированный эффект, хотя и может сохранять некоторое черты специфического действия составляющих компонентов, в принципе приобретает новую количественную и качественную окраску. Следует также отметить и тот факт, что работ, посвященных изучению хронического комбинированного влияния хрома и бензола, ранее не проводилось. Также отсутствуют работы, посвященные изучению корреляционных связей между иммунологическими, биохимическими параметрами и содержанием микроэлементов в биосредах экспериментальных животных при воздействии бензола, бихромата калия и их комбинации. В связи с этим, исследование длительного комбинированного действия хрома и бензола на организм экспериментальных животных могло позволить выявить некоторые закономерности действия металлов и органических веществ при выяснении закономерностей и механизмов развития данного действия с последующим определением маркеров совместного присутствия данных веществ в окружающей среде. Вышеизложенные материалы послужили основанием для проведения данного диссертационного исследования.

Экспериментальные исследования по изучению влияния бензола, бихромата калия и их комбинации проведены на 772-х здоровых половозрелых крысахсамцах линии Вистар массой 250-300 г и 604-х мышах (CBAxC57B16) F1 массой 20-25 г. Перед началом эксперимента животные содержались в карантине (1 мес.) с выбраковкой подозрительных на заболевание особей. Дозы токсикантов соответствовали одной ПДК [1,2].

Все животные, включенные в исследование, содержались на стандартном пищевом рационе и были разделены на 4 группы. Животные первой группы (контроль) содержались в том же виварии и получали воду. Животные 2, 3, групп вместе с питьевой водой, перорально получали следующие химические вещества: животные второй группы - бензол («Полихим», Россия) из расчта 0, мл/кг, третьей группы - бихромат калия («Полихим», Россия) из расчта 20 мг/кг, четвертой группы - смесь бихромата калия (из расчта 20 мг/кг) и бензола (из расчта 0,6 мл/кг). Через 45, 90 и 135 суток животные выводились из эксперимента летальной дозой эфирного наркоза. Результаты, полученные у животных первой группы в каждой серии экспериментов, достоверно не отличались между собой, что позволило объединить их и использовать в качестве контроля.

Эксперименты проведены в соответствии с этическими нормами и рекомендациями по гуманизации работы с лабораторными животными, отраженными в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей» (Страсбург, 1985).

2.1. Иммунологические методы исследования У всех животных в соответствии с рекомендациями [26] и [22] определяли: в крови содержание лейкоцитов и подсчитывали лейкоформулу; исследовали массу тимуса и селезенки, а также количество ядросодержащих клеток в тимусе, селезенке и костном мозге; оценивали клеточный состав селезенки и костного мозга.

Количество лейкоцитов в периферической крови определяли в камере Горяева. Лейкоформулу периферической крови изучали в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимза, подсчитывая в каждом мазке не менее 200 клеток.

Выделенный тимус взвешивали на торсионных весах и после гомогенизации определяли в камере Горяева общее количество ядросодержащих клеток в органе.

гомогенизации определяли в камере Горяева общее количество ядросодержащих клеток в органе. Клеточный состав селезенки изучали в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимза, подсчитывая в каждом мазке не менее 200 клеток.

Для изучения клеточного состава красного костного мозга получали суспензию миелокариоцитов, путем вымывания из бедренной кости средой 199, затем подсчитывали количество клеток на бедро и готовили мазки, окрашенные по Паппенгейму. Анализ мазков проводили в иммерсионной системе, оценивая относительное содержание клеток различных ростков кроветворения, подсчитывая в каждом препарате не менее 500 кариоцитов.

При оценке корректности подсчета клеточных популяций костного мозга, селезенки и периферической крови животных в качестве эталона использовали данные [26], [25], [89], [22].

Определение фагоцитарной активности сегментоядерных нейтрофилов периферической крови и перитониальных макрофагов крыс и мышей проводили по методике [55]. Для оценки фагоцитарной активности сегментоядерных нейтрофилов периферической крови и перитониальных макрофагов в мазках определяли процентное содержание фагоцитирующих клеток – фагоцитарный показатель (ФП) и поглотительную способность нейтрофилов - фагоцитарный индекс (ФИ) в отношении тесткультуры золотистого стафилококка (штамм 209-Р, ГКИ им. Л.А. Тарасевича) [61].

Перитонеальные макрофаги получали путем промывания брюшной полости мышей охлажденной средой 199 с гепарином (5 ЕД/мл), последующим наслаиванием на пластиковые чашки диаметром 40 мм и культивированием в течение 1 часа в среде RPMI 1640 с добавлением 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки («Sigma», США). С этой целью к 0,5 мл взвеси перитониальных макрофагов добавляли 0,5 мл 250 млн. взвеси бактерий и после 30 - минутной инкубации при 37°С готовили мазки, которые фиксировали в смеси Никифорова и окрашивали синькой Мансона. В каждом мазке подсчитывали количество фагоцитирующих нейтрофилов и макрофагов на сосчитанных клеток (ФП) и определяли среднее число микробных клеток, поглощенных одним активным фагоцитом (ФИ) [61].

Интенсивность кислородзависимых механизмов фагоцитоза у нейтрофилов периферической крови и перитонеальных макрофагов оценивали по способности восстанавливать спонтанно и при стимуляции зимозаном A («Sigma», США), опсонизированным пуловой мышиной сывороткой, нитросиний тетразолий («Sigma», США) (НСТ-тест). С этой целью в пробирки с 0,05 мл взвеси клеток добавляли 0,05 мл 0,2% раствора НСТ и 0,05 мл физиологического раствора.

После часовой инкубации при температуре 37°С делали мазки. После сушки препараты фиксировали и окрашивали метиленовым-синим. Учет реакции производили с помощью иммерсионной микроскопии, определяя процент клеток, восстанавливающих НСТ на 100 сосчитанных клеток. Параллельно с помощью НСТ-теста определяли способность нейтрофилов периферической крови и перитонеальных макрофагов отвечать повышением метаболической активности на стимуляцию зимозаном [6].

Изучение особенностей формирования клеточного иммунитета проводили на модели локальной реакции гиперчувствительности замедленного типа к эритроцитам барана [84]. Для этого животным каждой группы проводили иммунизацию путем внутрибрюшинного введения 10% взвеси ЭБ в объеме 1 мл на 100г массы тела – для крыс и в объеме 0,5 мл для мышей. Через 4 суток после иммунизации вводили разрешающую дозу ЭБ (107 клеток на 1 г массы тела для крыс в объеме 0,1 мл, для мышей – в объеме 0,05 мл) в подошвенную поверхность стопы, в другую стопу вводили 0,1 мл (крысы) и 0,05 мл (мыши) физраствора.

Тестирование реакции проводили через 24 часа путем взвешивания стоп опытной и контрольной лапок [22].

Иммунофенотипирование спленоцитов проводили с использованием моноклональных антител ("eBioscience", США) к рецепторам CD3, CD4, CD8.

Клетки отмывали холодным фосфатно-солевым буфером и окрашивали FITC- и РЕ-меченными антителами согласно инструкции производителя. Процентное содержание CD3+-, CD4+-, CD8+- лимфоцитов селезенки определяли на проточном двухлазерном цитофлюориметре "FACS Canto II" ("Becton Dickinson", США).

Математический анализ (сбор и обработка данных) проводили с применением программного обеспечения "CellQuest Pro". В каждой пробе анализировали не менее 10000 лимфоцитов.

Продукцию цитокинов (ИФН, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10) определяли в супернатантах культур спленоцитов после 24-часовой инкубации клеток при 37°C в атмосфере 5% CO2 в полной культуральной среде (RPMI–1640 с добавлением 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 2мМ глутамина и мкг/мл гентамицина). Оценивали спонтанную и индуцированную конканавалином А (Кон А) в конечной концентрации 5 мкг/мл секрецию спленоцитами ИФН, ИЛИЛ-6, ИЛ-10. Уровень цитокинов исследовали в культуральной жидкости методом ИФА (тест–системы "Bender MedSystems", Австрия). Регистрацию результатов проводили на фотометре Multiskan ("Labsystems", Финляндия).

Гуморальный иммунный ответ исследовали путем определения прямых антителообразующих клеток (АОК) в селезенке иммунизированных животных по методу [203]. Для этого животных иммунизировали путем внутрибрюшинного введения 10% взвеси ЭБ в объеме 1 мл на 100г массы тела – для крыс и 2,5% взвеси ЭБ в объеме 0,5 мл для мышей. Через 5 суток с момента введения ЭБ животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом (крысы) и дислокацией шейных позвонков (мыши), после чего проводили выделение селезенки и получение клеточной суспензии в гомогенизаторе Потера-Эвельгейма с тефлоновым пестиком в среде 199. Подсчет спленоцитов проводили в камере Горяева. Далее спленоциты отмывали (1000 об/мин, 5 минут), просчитывали повторно и их концентрацию доводили средой 199 до 1 млн/мл. Последующая схема эксперимента была традиционной с использованием 0,8 % агара "Difco", приготовленного на концентрате среды 199 и содержащего эритроциты барана (50 млн/мл). После инкубации чашек с комплементом морской свинки осуществляли учет количества зон гемолиза по всей площади чашек.

Результаты выражали в показателях, характеризующих относительное количество антителообразующих клеток на 1 млн спленоцитов и их абсолютное содержание на всю селезенку.

В сыворотке крови крыс и мышей определяли концентрацию лизоцима турбидиметрическим методом [12]. В качестве тест-культуры использовали эталонный ацетонированный штамм Micrococcus lysodeicticus (2665 ГКИ им.

Тарасевича).

Для определения титра антител к эритроцитам барана проводили реакцию геммаглютинации (РГА). Для этого сыворотку животных инактивировали при 56С и затем раститровывали следующим образом: во все лунки, кроме первой (в нее вносили цельную сыворотку), вносили 0,1 мл изотонического раствора хлорида натрия и столько же сыворотки, тщательно перемешивали и забирали 0, мл, перенося его в следующую лунку и т.п., получали разведения 1:2, 1:4, 1:8 и т.д. После раститровки в каждую лунку вносили такое же количество (0,1 мл) 2,5% раствора эритроцитов барана и инкубировали в термостате 1 час при температуре 37С. После окончания инкубации учитывали результаты РГА по характеру осадка эритроцитов. Полученные титры антител переводили в десятичные логарифмы.

Анализ клеточного цикла и апоптоза спленоцитов, тимоцитов и меелоцитов осуществляли методом окрашивания йодистым пропидием с последующей цитофлюометрией на проточном цитометре FAСS Calibur ("Becton Dickinson", США) в лаборатории иммунофармакологии и иммунотоксикологии института иммунологии и физиологии УроРАН (Уфа) под руководством профессора Сибиряка С.В.

Для этого клеточную взвесь фиксировали в ледяном 70 % этаноле из расчета 1 часть взвеси клеток и 9 частей этанола и центрифугировали в течение мин (150g), супернатат удаляли и клетки ресуспендировали в гипотоническом растворе йодистого пропидия (Applechem) (0,1% цитрат натрия, 0,1% Triton Xйодистый пропидий 50 мкг/мл). Далее клетки инкубировали при комнатной температуре 30 мин и анализировали на проточном цитофлюориметре.

Полученные результаты анализировали в рамках программного обеспечения CellQuest. Оценивали величину гиподиплоидного пика (М1) (рисунок 2.1), что соответствовало апоптотирующим клеткам, величину G1/G0 - пика (М2), что соответствовало покоящимся клеткам, и клеткам находящимся в пресинтетической фазе и величину SG2M – пика (М3), что соответствовало клеткам, находящимися в фазе синтеза ДНК и митотическом цикле [231].

Рисунок 2.1. Цитофлюорограмма окрашенных иодистым пропидием Интенсивность процессов перекисного окисления липидов оценивали по величине спонтанной и железоиндуцированной хемилюминесценции (ХЛ) в сыворотке крови и гомогенатах печени и селезенки [110].

Кровь отбирали в пробирки («Venosafe», Бельгия) без ЭДТА, выдерживали минут, после чего центрифугировали в течение 15 минут при 1500 об/мин. Для приготовления гомогената навеску исследуемой ткани (1г) гомогенизировали в мл фосфатного буфера и доводили содержание белка до 1 мг на 1 мл дальнейшим разведением.

0,5 мл сыворотки или гомогената разводили в 20 мл фосфатного буфера и помещали в кюветную камеру прибора. После регистрации спонтанной светимости индуцировали свечение добавлением 1 мл 50 мл раствора FeSO4•7H2O, ускоряющего процессы перекисного окисления липидов.

Наблюдалась вспышка хемилюминесценции (рис.2.2.), в которой можно выделить несколько основных параметров: h - высоту быстрой вспышки, зависящую от содержания в изучаемой системе гидроперекисей липидов; Н - высоту медленной вспышки, отражающую способность липидов к перекисному окислению, максимальную интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) после введения Fe2+; S - светосумму медленной вспышки, определяемую как площадь под кривой от начала медленной вспышки до достижения ею максимального значения, оценивающую число боковых цепей разветвления, т.е. сколько на 1 ион Fe2+ приходится образовавшихся перекисных радикалов (RОО); tg – тангенс угла наклона медленной вспышки, определяет скорость окисления липидов; – латентный период (в с) от момента введения Fe2+ до достижения концентрации Fe2+ критической величины, латентный период зависит от соотношения в системе про- и антиоксидантов.

Рис. 2.2. Кривая хемилюминесценции апо-В липопротеинов сыворотки крови по основным параметрам.

Для определения активности антиоксидантных ферментов кровь помещали в пробирки с К3-ЭДТА, затем центрифугировали для разделения на плазму и форменные элементы. Выделенные эритроциты трижды отмывали физиологическим раствором, а отмытую таким образом эритроцитарную массу разводили 1:100. Для полного гемолиза пробы подвергали замораживанию с последующим размораживанием. В полученном лизате определяли активность ферментов. Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли по скорости аутоокисления адреналина в адренохром в щелочной среде [99]. Скорость окисления адреналина оценивали по кинетике изменения оптической плотности пробы при 347 нм.

Для определения активности каталазы, исходный гемолизат разводили Na/K-фосфатным буфером (рН=7,2; концентрация 0,2 г/л) (1:100). Определение активности каталазы проводили кинетическим спектрофотометрическим методом прямой регистрации разложения субстрата фермента - перекиси водорода [319].

За единицу активности каталазы принимали такое количество фермента, которое вызывает падение оптической плотности с 0,45 до 0,4 за 17 секунд.

Концентрацию малонового диальдегида (МДА) в гомогенатах печени и селезенки определяли по методу [243], основанному на тесте с 2тиобарбитуровой кислотой (ТБК) («Химреактивснаб», Россия). При этом образуется окрашенный триметиновый комплекс, содержащий одну молекулу МДА и две молекулы тиобарбитуровой кислоты [297,107]. Интенсивность развивающегося розового окрашивания регистрировали на спектрофотометре при 532 нм [253]. Оптическую плотность экстинции измеряли относительно контрольной пробы, которая вместо гомогената содержала среду выделения.

Перед проведением ТБК-теста гомогенат разводили средой выделения (0, М Na-фосфатный буфер, приготовленный на 0,9% растворе NaCl (pH=7,4)) до конечной концентрации порядка 1% (вес:объем). 2 мл этого разведения депротеинизировали добавлением 1 мл 28% ТХУ. Безбелковый экстракт отделяли 10-минутным центрифугированием при 3000 об/мин. 2 мл депротеината смешивали с 1 мл раствора ТБК и затем помещали в кипящую водяную баню на 15 минут, при этом пробирки на этом этапе следует оставлять открытыми [22].

Динамику нарастания концентрации МДА в печени и селезенке определяли посредством стимуляции ПОЛ с помощью Fe2+. Для этого в каждую пробу отбирали по 0,2 мл смеси гомогенат-буфер (соотношение компонентов составляет 3,8:0,2), процесс перекисного окисления инициировали 0,2 мл сернокислого железа. Фотометрию проб проводили при длине волны равной 532 нм относительно контрольной пробы (в контрольной пробе вместо 0,2 мл смеси гомогенат-буфер используют 0,2 мл фосфатного буфера).

Концентрацию диеновых конъюгатов (ДК) в гомогенатах печени и селезенке определяли по характерному для диеновых конъюгатов максимуму поглощения раствора липидов в системе изопропанол-гептан (1:1) при длине волны 233 нм [251,86]. Для этого 0,5 мл гомогената помещали в 4,5 мл гептан-изопропаноловой смеси. Инкубировали при комнатной температуре в течение 15-20 минут. После центрифугирования при 3000 об/мин. отбирали гептановую фазу. Содержание ДК определяли спектрофотометрически при длине волны 233 нм.

Все показатели рассчитывали на грамм белка, определяемого по методу Lowry O.H. (1951) в основу которого положена способность медных производных белка восстанавливать реактив Фолина («Panreac Quimica», Испания) с образованием окрашенных продуктов реакции.

Интенсивность хемилюминесценции регистрировали на приборе «Хемилюминомер ХЛ-003» (Россия), оптическую плотность проб измеряли на спектрофотометре «Genesys 5» (США).

2.3. Исследование микроэлементов в биосредах Содержание МЭ (Fe2+, Cu2+, Zn2+, Cr3+, Ni2+) в крови и органах (печень, селезенка) крыс Вистар определялось атомно-адсорбционным методом [68] на спектрометре «КВАНТ-2А» (ООО «Корчек», Москва) в лаборатории ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Оренбургской области». Измерение концентрации металлов в крови производили следующим образом. Отобранные пробы крови - не менее 1 см3 и органов - не менее 5 г, помещали в тигель и высушивали в течении 1,5 часов при температуре 110С в сушильном шкафу, затем в течение 1,5 часов при температуре 250 С. После чего к пробе добавляли сульфат аммония (на кончике шпателя) и при температуре 450 - 500 С пробу озоляли в муфельной печи. После охлаждения в эксикаторе к пробе добавляли 0, – 0,5 см3 концентрированной азотной кислоты и выпаривали до «влажных солей».

Затем к охлажденному остатку приливали 5 см3 1 %-ной азотной кислоты и оставляли на 30 – 40 минут, отфильтровывали и переносили в пробирку с пришлифованной пробкой.

Результаты измерений концентраций металлов в крови и органах регистрировали по показаниям прибора с цифровой индикацией, откалиброванного согласно концентрациям рабочих стандартных растворов определяемого металла. Расчет концентраций (С) содержания металлов в крови и органах проводили по формуле:

a – концентрация, определяемая по калибровочному графику, мкг/см3, V – общий объем анализируемой пробы, см3, V1 – объем минерализованной пробы, взятой для анализа, см3, С – концентрация металла в пробе, мкг/г.

Результаты проведенных исследований обработаны методами вариационной статистики с использованием пакета программ для ПК Microsoft Excel 7.0, STATISTICА 10.0, включая методы параметрического (критерий Стьюдента), непараметрического (критерий Манна-Уитни) анализов. Корреляционный анализ выполнен в рамках программы «Statistica for Windows 10.0». Для выделения значимых коэффициентов корреляции был выбран уровень значимости, принятый для медико-биологических исследований (р < 0,05). Результаты исследования представлены в виде медианы (Ме) и интерквартильного размаха (25-й и 75-й процентиль), а также в виде среднеарифметического значения (M±m).

ГЛАВА 3. Влияние бензола, бихромата калия и их комбинации на показатели периферической крови крыс Вистар и мышей В условиях целостного организма практически всегда неспецифические и иммунологические защитные реакции протекают сочетанно, они взаимосвязаны не только во времени, но и по существу [125,113,114,51,122]. В связи с этим представлялось важным исследование периферической крови и факторов естественной резистентности в условиях длительного влияния бензола, бихромата калия и их комбинации.

В настоящей работе использовался подход по применению количественных методов оценки одновременных изменений клеточных популяций в крови при воздействии указанных веществ [26,22].

В таблицах 3.1.1. и 3.1.1.1. представлена динамика клеточного состава периферической крови (число лейкоцитов, лейкоцитарный состав и показатели красной крови) крыс Вистар и мышей (СВАхС57Вl6)F1, подвергшихся воздействию бензола, бихромата калия и их комбинации в течение 45, 90 и 135-и дней.

3.1 Влияние бензола, бихромата калия и их комбинации на клеточный состав Для крыс, подвергшихся воздействию бензола (табл. 3.1.1.), по отношению к уровню показателей контрольной группы характерно снижение количества лейкоцитов, относительного и абсолютного числа лимфоцитов и эозинофилов.

Максимальное уменьшение числа лейкоцитов и абсолютного числа лимфоцитов приходилось на 90-е сутки, относительного количества лимфоцитов – на 45-е сутки, абсолютного и относительного уровня эозинофилов – на 135-е сутки эксперимента.

Влияние бензола, бихромата калия и их комбинации на число лейкоцитов и П/Я – нейтрофилы С/Я – нейтрофилы Моноциты Эозинофилы Лимфоциты Примечание: здесь и далее в таблицах 3.1.1.– 3.6.1.: 1 группа – интактная (контроль), 2 группа – животные, получавшие бензол, 3 группа – животные, получавшие бихромат калия, 4 группа – животные, получавшие комбинацию бензола и бихромата калия; обозначены достоверные отличия (р < 0,05):

жирным – по отношению к контролю; - 45 и 90, 45 и 135-и дней; # - 90 и 135-и дней.

В группе животных, подвергшихся влиянию бихромата калия, не установлено выраженных изменений числа лейкоцитов и лейкоцитарной формулы.

Исследование влияния комбинации бензола и бихромата калия на уменьшение числа лейкоцитов и абсолютного числа лимфоцитов приходилось на эксперимента.

Таким образом, воздействие бензола, бихромата калия и их комбинации на показатели лейкоцитарной формулы крыс Вистар выражалось в снижении количества лейкоцитов и относительного и абсолютного числа лимфоцитов, которое приходилось, преимущественно, на 90-е и 135-е сутки экспозиции у животных, получавших бензол и комбинацию веществ.

Анализ данных таблицы 3.1.1.1 показал, что по отношению к контролю у крыс, подвергшихся воздействию бензола, не выявлено существенных изменений показателей красной крови.

Влияние бензола, бихромата калия и их комбинации на показатели красной крови Ретикулоциты, % У животных, подвергшихся влиянию бихромата калия, установлено снижение количества ретикулоцитов с минимумом на 135-е сутки и, напротив, увеличение числа эритроцитов с максимумом на 90-е сутки и повышение уровня гемоглобина на 135-е сутки.