«МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ИММУННОГО ОТВЕТА ПРИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ОРГАНОВ ЖЕНСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ ...»

Федеральное государственное бюджетное учреждение

«Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии

имени академика В.И. Кулакова»

Министерства здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

Бурменская Ольга Владимировна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ИММУННОГО

ОТВЕТА ПРИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ОРГАНОВ

ЖЕНСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ

03.03.03 – иммунология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАН Сухих Геннадий Тихонович;

доктор биологических наук Трофимов Дмитрий Юрьевич Москва -

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1. ВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ ОРГАНОВ ЖЕНСКОЙ

РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ

МАРКЕРЫ В ДИАГНОСТИКЕ ВАГИНИТОВ И ХРОНИЧЕСКОГО

ЭНДОМЕТРИТА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1 КЛИНИКО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ СЛИЗИСТОЙ ВЛАГАЛИЩА И

ЭНДОМЕТРИЯ

1.1.1 Воспалительные заболевания слизистой влагалища: распространение, симптомы, этиология и факторы риска развития заболевания

1.1.2 Современные представления о микробиоценозе влагалища у женщин репродуктивного возраста

1.1.3 Хронический эндометрит: распространение, патогенез и факторы риска развития заболевания

1.2 МЕХАНИЗМЫ ИММУННОЙ ЗАЩИТЫ ПОЛОВЫХ ПУТЕЙ ЖЕНЩИН

1.3 КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВУЛЬВОВАГИНИТОВ

И ХРОНИЧЕСКОГО ЭНДОМЕТРИТА

1.3.1 Диагностика воспалительных заболеваний нижних отделов органов женской репродуктивной системы

1.3.2 Клинико-лабораторная диагностика хронического эндометрита...........

1.4 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МАРКЕРОВ ЛОКАЛЬНЫХ

ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ

1.4.1 Микроскопия мазков с подсчетом числа лейкоцитов

1.4.2 Метод лазерной проточной цитометрии с применением моноклональных антител

1.4.3 Метод иммуноферментного анализа.

1.4.4 Технология мультиплексного иммуноанализа для исследования цитокинового профиля генов иммунного ответа

1.4.5 Методы иммуногистохимического исследования

1.4.6 Определение транскрипционных профилей генов

1.4.7 Полиморфизмы генов иммунной системы и современные методы их идентификации

1.4.8 Ассоциация полиморфизмов генов иммунной системы с предрасположенностью к развитию инфекционно-воспалительных заболеваний нижних отделов органов женской репродуктивной системы.... Резюме

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Материалы исследования

2.2 Объем исследования

2.3 Методы исследования

2.3.1 Определение состава микрофлоры влагалища

2.3.2 Определение транскрипционного профиля генов иммунного ответа.... 2.3.3 Определение замен одиночных нуклеотидов

2.3.4 Дополнительные клинико-лабораторные методы

2.4 Параметры, используемые для описания ПЦР в реальном времени......... 2.5 Нормировка

2.6 Статистика

2.7 Метод бинарной логистической регрессии

2.8 ROC-анализ

2.9 Характеристики диагностических тестов

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Разработка систем для оценки профиля экспрессии мРНК генов иммунной системы

Подбор праймеров и флуоресцентно-меченных проб

3.1. Проверка праймеров и зондов

3.1. Выбор референсных генов и разработка алгоритмов нормировки, 3.1. оптимальных для оценки уровней экспрессии мРНК генов человека в тканях эндометрия и влагалища

Апробация метода исследования транскрипционных профилей на 3.1. образцах тканей эндометрия двух стадий менструального цикла................. Прикладные аспекты идентификации молекулярно-генетических 3. маркеров с использованием ПЦР в реальном времени

Воспалительные заболевания нижних отделов половых путей........ 3.2. 3.2.1.1 Характеристика состава микробиоценоза влагалища небеременных женщин

Характеристика состава микробиоценоза влагалища беременных 3.2.1. женщин

Типирование и количественная оценка лактобактерий.................. 3.2.1. Транскрипционные профили генов иммунного ответа в соскобах 3.2.1. отделяемого слизистой влагалища

Характеристика уровней представленности транскриптов генов 3.2.1. иммунного ответа в соскобах отделяемого слизистой влагалища................ Зависимость транскрипционных профилей от стадии 3.2.1. менструального цикла

Сравнение транскрипционных профилей генов иммунной системы в 3.2.1. клетках вагинальных соскобов у беременных и небеременных женщин..... Особенности экспрессии мРНК генов иммунной системы в клетках 3.2.1. вагинальных соскобов в норме, при вагините и БВ

Корреляция Lactobacilus iners с уровенем экспрессии генов......... 3.2.1. Разработка способа оценки локальной воспалительной 3.2.1. реакции

Преимущества использования индексов и интегральной оценки 3.2.1. локального воспаления

Сравнение предложенного способа оценки локальной 3.2.1. воспалительной реакции с клиническими данными

Сравнение предложенного способа оценки локальной 3.2.1. воспалительной реакции с методом подсчета числа лейкоцитов в мазке.... Осложнения родов и послеродового периода у пациенток с 3.2. вагинитами и Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/мл

Определение ассоциаций полимофизмов генов цитокинов с 3.2. предрасположенностью к развитию вагинитов

Хронический эндометрит

3.2. 3.2.4.1 Идентификация микроорганизмов в полости матки

эндометрите

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1. Молекулярно-генетические маркеры при вагинитах

4.1.1. Транскрипционный профиль генов иммунного ответа в норме и его зависимость от фазы менструального цикла в тканях эндометрия............... 4.1.2. Зависимость транскрипционных профилей генов иммунного ответа в клетках соскобов из влагалища от беременности

4.1.3. Доминирование в составе биоценозов влагалища лактобактерий – механизм защиты плода и новорожденного от условно-патогенных микроорганизмов

4.1.4. Ассоциация L.iners и L.gasseri с дисбиотическими и воспалительными процессами во влагалище

4.1.5. Транскрипционные профили в клетках соскобов слизистой влагалища при вагинитах

4.1.6. TNF, TLR4, GATA3 и IL18 – маркеры объективной интегральной оценки локальной воспалительной реакции во влагалище

4.1.7. Актуальность определения дисбиотических и воспалительных процессов во влагалище для прогнозирования и предупреждения акушерских осложнений

4.1.8. Генетически обусловленная пониженная экспрессия TNF- и TGF- – фактор предрасположенности к развитию вагинитов

4.2. Молекулярно-генетические маркеры при хроническом эндометрите

4.2.1. Особенности транскрипционного профиля генов иммунного ответа при фиброзе стромы эндометрия

4.2.2. Роль инфекционных агентов в патогенезе хронического эндометрита

4.2.3. Особенности транскрипционных профилей при полном симптомокомплексе хронического эндометрита и лимфоидной инфильтрации стромы

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ – антиген АПК - антигенпрезентирующие клетки АТ - антитело БВ – бактериальный вагиноз ВАК – Высшая аттестационная комиссия ВИЧ – вирус иммунодефицита человека ВВК – вульвовагинальный кандидоз ВМС – внутриматочная спираль ГЭ – геном-эквивалент ДИ (СI) – доверительный интервал (confidence interval) ДК – дендритные клетки ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ИППП – инфекции, передаваемые половым путем кДНК – комплементарная ДНК КОЕ – колониеобразующие единицы ЛВ – локальное воспаление ЛВР – локальная воспалительная реакция ЛРС (СLR) - лектиновые рецепторы С- типа (C-type lectin receptor) МКА – моноклональные антитела мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота МФ - макрофаг НВ – неспецифический вагинит НК – натуральные киллеры НЛР (NLR) - нод-лайк рецепторы (nucleotide oligomerization domain (NOD)like receptor) ОБМ – общая бактериальная масса ОТ-ПЦР – обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция ПАМП (PAMP) – патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (pathogen-associated molecular patterns) ПРР (PRR) - паттерн-распознающие рецепторы (pathogen recognition receptors) ПЦОР (NPV)- прогностическая ценность отрицательного результата (negative predictive value) ПЦПР (PPV) - прогностическая ценность положительного результата (positive predictive value) ПЦР – полимеразная цепная реакция РВВК – рецидивирующий вульвовагинальный кандидоз РНК – рибонуклеиновая кислота РФ – Российская Федерация США – Соединенные Штаты Америки ТУ – технические условия УПМ – условно-патогенные микроорганизмы ФСГ - фолликулостимулирующий гормон ХЭ - хронический эндометрит ЭКО – экстракорпоральное оплодотворение СD – cluster of differentiation, дифференцировочные антигены cut off – порог отсечки положительного результата HLA - Human Leucocyte Antigens, группа антигенов гистосовместимости IgA – иммуноглобуллины класса А IgG – иммуноглобуллины класса G ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay, метод твердофазного иммуноферментного анализа IUSTI - International Union against Sexually Transmitted Infections (Европейский передаваемыми половым путем) MHCI - major histocompatibility complex class I, главный комплекс гистосовместимости I класса MHCII - major histocompatibility complex class II, главный комплекс гистосовместимости II класса Me – медиана NCBI - National Center for Biotechnology Information OR - odds ratio, отношение шансов (ОШ) ROC - Receiver Operator Characteristic SNP – single-nucleotide polymorphism, замены одиночных нуклеотидов WHO (ВОЗ) - World Health Organization (Всемирная организация здравоохранения) Маркеры ACTB – референсный ген -актин B2M – референсный ген -2-микроглобулин CD45 (PTPRC) – ген кодирующий общий лейкоцитарный антиген CD68 – ген, кодирующий трансмембранный белок CD CD69 – ген, кодирующий транмембранный белок СD ESR - ген эстрогенового рецептора Foxp3 – ген, кодирующий транскрипционный фактор скурфин GAPDH – референсный ген глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа GATA3 – ген, кодирующий транскрипционный фактор GATA-связывающий протеин GNLY - ген гранулизина GUSB – референсный ген -глюкоронидаза HPRT1 – референсный ген гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансфераза IFNG – ген, кодирующий интерферон гамма (IFN-) IL1A – ген интерлейкина 1 альфа (IL-1) IL1B – ген интерлейкина 1 бета (IL-1) IL1RN – ген, кодирующий антагонист рецептора интерлейкина-1 (IL-1RA) IL2 - ген интерлейкина 2 (IL-2) IL2R – ген, кодирующий -цепь рецептора интерлейкина 2 (IL-2R) IL4 - ген интерлейкина 4 (IL-4) IL6 - ген интерлейкина 6 (IL-6) IL8 - ген интерлейкина 8 (IL-8) IL10 - ген интерлейкина 10 (IL-10) IL12A- ген, кодирующий субъединицу р35 интерлейкина 12 (IL-12) IL12B - ген, кодирующий субъединицу р40 IL-12 и IL- IL15- ген интерлейкина 15 (IL-15) IL18- ген интерлейкина 18 (IL-18) IL23- ген, кодирующий субъединицу р19 интерлейкина 23 (IL-23) LIF – ген, кодирующий лейкемия-ингибирующий фактор (LIF) PGR – ген прогестеронового рецептора RORC – ген, кодирующий транскрипционный фактор RORC ТВР – референсный ген TATA-связывающий протеин TBX21 - ген, кодирующий транскрипционный фактор TBX TGFB1 – ген, кодирующий трансформирующий ростовой фактор бета (TGF-1) TLR2 - ген, кодирующий толл-подобный рецептор (TLR-2) TLR4- ген, кодирующий толл-подобный рецептор (TLR-4) TLR9 - ген, кодирующий толл-подобный рецептор (TLR-9) TNF - ген фактора некроза опухоли альфа (TNF-) VEGFA – ген, кодирующий сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF-A) 18SrRNA – референсный ген 18S рибосомальной РНК

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность Открытие и внедрение в практику в конце 80 годов метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) внесло огромный вклад в развитие современной биологии и медицины. В течение следующих 20 лет были разработаны способы флуоресцентной детекции результатов амплификации.

Помимо этого модификация и совершенствование методики шло по пути автоматизации процесса, уменьшения объема реакционных смесей и возможности амплификации в одной пробирке нескольких фрагментов ДНК (мультиплексирование), что способствовало широкому внедрению данного метода в рутинную практику.

В настоящее время метод ПЦР широко используется для решения целого ряда фундаментальных и прикладных задач, включающих в себя определение генетических заболеваний, вариантов полиморфизма генов, функциональной активности генома, а также изучение воздействия на организм человека биотических факторов окружающей среды (бактерий, грибов, вирусов). Следует отметить, что каждая из выше перечисленных задач может решаться как самостоятельно, так и в составе комплексного исследования. В данной работе комплексный подход предложен для решения фундаментальных и прикладных задач современной иммунологии на примере исследования воспалительных процессов, сопровождающих заболевания органов женской репродуктивной системы.

Воспалительные заболевания органов женской репродуктивной системы занимают лидирующие позиции в акушерско-гинекологической практике. Воспалительные заболевания нижних отделов половых путей (вульвиты, вагиниты) являются одной из наиболее распространенных причин обращения женщин к врачу акушеру-гинекологу [142]. От неспецифического вагинита (НВ) страдает почти каждая пятая пациентка гинекологической практики (19,2%), а среди пациенток с патологическими белями частота его выявления возрастает в 4 раза [4]. Известно, что в основе репродуктивных неудач (трубно-перитонеальный фактор бесплодия, самопроизвольные выкидыши), акушерских осложнений родов и послеродового периода, таких как преждевременное излитие околоплодных вод, внутриутробное и интранатальное инфицирование плода и новорожденного, мертворождение, хориоамнионит в родах, послеродовые гнойно-септические осложнения, также лежат те или иные воспалительные заболевания половых органов [21].

Воспаление чаще всего вызвано действием патогенных и условнопатогенных микроорганизмов, идентификация которых чрезвычайно важна инфекционного процесса определяется состоянием локального (мукозального) иммунитета и зависит от иммунологической реактивности макроорганизма. В патогенезе заболевания микробный фактор играет такую же роль, как и состояние макроорганизма, и те обстоятельства, которые изменяют его иммунобиологические свойства [48]. Поэтому изучение мукозального иммунитета представляет чрезвычайный интерес. В то же время, спектр методов исследования мукозального иммунитета остается весьма ограниченным из-за малого количества материала и наличия слизи в образцах. В ходе исследования возникают вопросы, связанные с нормировкой материала, способов его взятия и транспортировки. Вследствие этого существующие знания об изменении при вагинитах различных иммунологических показателей (цитокинов, дефензинов, иммуноглобулинов, рецепторов иммунокомпетентных клеток и др.) не получили должного применения в клинической практике. Основным, и зачастую, единственным методом оценки состояния локального иммунитета в настоящее время остается микроскопия мазка с подсчетом числа лейкоцитов. Альтернативой подсчету числа лейкоцитов может служить оценка иммунологических показателей (как пример, транскрипционный профиль генов цитокинов).

В настоящее время накоплены многочисленные данные о зависимости экспрессии цитокинов не только от влияния патогенных факторов, но и от генетической вариабельности кодирующих их генов. В частности, получены данные об ассоциациях отдельных полиморфизмов генов цитокинов с такими нозологическими формами как вульвовагинальный кандидоз [166] и бактериальный вагиноз [93; 127; 132; 134; 257]. Оригинальность настоящего исследования состоит в том, что различные нозологические формы неспецифических вагинитов были исследованы в совокупности, включая случаи воспаления неустановленной этиологии. Использование такого подхода обосновано тем, что зачастую воспалительная реакция является неспецифической в отношении инициирующего патологического агента, поскольку иммунном ответе в первую очередь задействованы механизмы врожденного иммунитета.

Кроме того, большое внимание исследователей привлечено к проблеме воспалительных заболеваний органов малого таза, среди которых хронический эндометрит (ХЭ) является наиболее распространенным. Он выявляется примерно у 10% женщин репродуктивного возраста, но у пациенток с нарушениями генеративной функции частота его обнаружения увеличивается до 23–57% [33]. Среди женщин с ХЭ 80–90% составляют женщины детородного возраста. ХЭ обуславливает у них нарушения менструальной и репродуктивной функций, приводя, в конечном итоге, к развитию бесплодия, неудачам в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), невынашиванию беременности и осложненному течению гестационного процесса и родов [55].

Все предложенные в данной работе молекулярно-генетические маркеры (транскрипты генов иммунной системы, полиморфизмы генов, а идентифицированы в одном и том же образце с использованием одного универсального метода – полимеразной цепной реакцией, что сокращает время для проведения исследований. Учитывая преимущества метода ПЦР (его быстроту, высокую чувствительность и специфичность, объективность, возможность автоматизации и одновременного исследования большого количества образцов), можно прогнозировать широкое внедрение данного метода в систему диагностики воспалительных заболеваний органов женской репродуктивной системы. Помимо традиционного исследования инфекционных агентов чрезвычайно перспективными являются исследования факторов генетической предрасположенности к развитию заболевания и транскрипционных профилей маркеров воспаления.

Цель и задачи работы Цель работы:

Разработать комплексный подход к характеристике воспалительных процессов органов женской репродуктивной системы на основе молекулярно-генетических маркеров, включающих количественную идентификацию инфекционных агентов, определение транскрипционного профиля генов иммунной системы и генетических особенностей организма.

1. Для оценки профиля экспрессии генов иммунного ответа разработать тест-системы на основе метода количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

2. Выявить особенности экспрессии мРНК генов иммунного ответа (цитокины, рецепторы, транскрипционные факторы и др.) при вагинитах и хроническом эндометрите.

3. Установить распределение аллельных вариантов генов иммунного ответа, ассоциированных с предрасположенностью к развитию вагинитов у женщин репродуктивного возраста.

4. Провести характеристику состава микроорганизмов, способствующих развитию воспалительных заболеваний органов женской репродуктивной системы (вагиниты, хронический эндометрит).

5. Разработать способы идентификации локальной воспалительной реакции при вагинитах и хроническом эндометрите на основе интегральной оценки транскрипционных профилей генов иммунного ответа.

6. Определить наиболее важные молекулярно-генетические маркеры воспалительного процесса, позволяющие одновременно получать информацию о полиморфизмах и активности генов иммунной системы, а также вирусологическом и бактериологическом фоне.

Научная новизна исследования Впервые разработан и апробирован метод комплексной оценки клинического биоматериала на молекулярно-генетическом уровне при воспалительных заболеваниях органов женской репродуктивной системы, позволяющий одновременно получать информацию о вирусологическом и бактериологическом фоне, а также полиморфизмах и активности генов иммунной системы.

репродуктивной системы на основе метода ОТ-ПЦР проведено исследование представленности транскриптов широкого спектра генов иммунного ответа (цитокины IL1B, IL2, IL4, IL6, IL8, IL10, IL12A, IL12B, IL15, IL18, IL23, TNF, TGFB1, IFNG, LIF, VEGFA изоформы 121, 165, 189), транскрипционные факторы (TBX21, GATA3, RORC, Foxp3), толл-подобные-рецепторы (TLR2, TLR4, TLR9), клеточные маркеры иммунной системы (IL2R, CD45, CD68, СD69), а также гранулизин GNLY). Выбраны наиболее информативные маркеры воспалительного процесса при вагините (TNF, IL18, TLR4, GATA3) и хроническом эндометрите (IL1B, IL2, IL10, Foxp3, TLR9, IL2Ra).

Впервые применен способ интегральной оценки представленности транскриптов генов иммунного ответа при вагинитах и хроническом эндометрите, позволивший охарактеризовать состояние локального иммунитета и предложить новый молекулярно-генетический метод определения воспалительных процессов слизистой влагалища и эндометрия.

Впервые при исследовании транскрипционных профилей использован метод определения индекса соотношения уровня экспрессии генов, позволяющий осуществлять анализ без нормировки на референсные гены, что существенно упрощает и снижает стоимость исследования, делает его доступным для рутинной диагностики.

Впервые получены данные об ассоциации Lactobacillus iners с состоянием локального иммунитета: у условно здоровых женщин доминирование L. iners в составе лактофлоры приводит к повышению уровня экспрессии мРНК генов IL8, TLR4, IL10, CD69, CD45 и снижению уровня экспрессии мРНК IL18 по сравнению с образцами, в которых доминирует L. crispatus.

обусловленная генотипом GG локуса TNF –238 G>A и генотипом СС локуса TGFB1 -509 C>T, является фактором риска развития вагинита.

Научно-практическая значимость Представленная работа является фундаментально-прикладным исследованием, результаты которого имеют важное значение для развития молекулярной биологи и медицины.

Созданный в ходе работы методический подход позволяет получить более полную информацию об активности генов иммунной системы при воздействии на организм женщин биотических факторов (бактерий, грибов, вирусов) при вагинитах и хроническом эндометрите.

Определены перспективы использования комплексного подхода к диагностике воспалительных заболеваний органов женской репродуктивной системы в гинекологической практике для объективной оценки локальных воспалительных реакций, индивидуального прогноза развития заболевания, для количественного определения микроорганизмов с целью выбора оптимальных схем терапии. В акушерской практике предлагаемый подход может быть использован для предупреждения и профилактики родовых и послеродовых осложнений.

В работе использована отечественная приборная и технологическая база с целью импортозамещения в области инновационных прикладных молекулярно-генетических исследований.

По результатам диссертационной работы поданы 2 заявки на патент и на регистрационное удостоверение:

Патент на изобретение № 201147924 от 25.11.2011 г.: «Способ диагностики неспецифических вагинитов у беременных женщин по уровню экспрессии мРНК генов интерлейкинов во влагалищных мазках». Авторы:

Бурменская О.В., Меджидова М.К., Непша О.С., Донников А.Е., Трофимов Д.Ю., Сухих Г.Т.

Патент на изобретение № 2013145241 от 9.10.2013 г.: «Способ определения локальной воспалительной реакции у женщин репродуктивного возраста по уровню экспрессии мРНК генов цитокинов во влагалищных мазках». Авторы: Бурменская О.В., Байрамова Г.Р., Непша О.С., Тютюнник В.Л., Трофимов Д.Ю., Сухих Г.Т.

Регистрационное удостоверение № 3756 от 7.02.2014 г. на Набор реагентов для оценки локальной воспалительной реакции влагалища методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени (Экспрессия генов. Воспаление влагалища) по ТУ производства ООО «Научно-производственного объединение ДНК-Технология».

Положения, выносимые на защиту Для исследования функциональной активности генов иммунного ответа при воспалительных заболеваниях органов женской репродуктивной системы разработаны 32 тест-системы на основе количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

Воспалительные процессы слизистой влагалища сопровождаются изменением транскрипционного профиля иммунокомпетентных клеток:

повышается экспрессия мРНК генов IL1B, IL8, IL10, СD45, CD69, TLR2, TLR4, TNF, снижается экспрессия мРНК генов GATA3, CD68, IL12A, IL18, TGFB1, RORC.

Установлена генетическая предрасположенность к развитию воспалительных заболеваний нижних отделов половых путей у носителей аллеля С локуса TGFB1 -509 C>T и протективная роль аллеля А локуса TNF –238 G>A в развитии вагинитов.

Профиль экспрессии генов иммунного ответа в эндометрии зависит от фазы менструального цикла и наличия воспаления. При полном симптомокомплексе хронического эндометрита и лимфоидной инфильтрации стромы эндометрия повышена экспрессия мРНК генов IL1В, IL6, IL8, IL10, Склерозирование сосудов и фиброз стромы эндометрия сопровождаются более выраженным изменением цитокинового каскада: повышается экспрессия мРНК генов IL1B, IL6, IL8, IL12А, TGFB1, Foxр3, IL2Ra, LIF, TLR9, VEGFА, TLR2, IL18, IFNG и TLR4.

Определены ассоциации различных видов лактобактерий с состоянием микробиоты влагалища и местного иммунитета: у условно здоровых женщин доминирование L. iners в составе лактофлоры приводит к повышению уровня экспрессии мРНК генов IL8, TLR4, IL10, CD69, СD45 и снижению IL18.

При хроническом эндометрите в полости матки определена ведущая роль бактериального фона, обусловленного условно-патогенными микроорганизмами (Enterobacteriaceae, Gardnerella vaginalis/ Prevotella spp./ Porphyromonas spp., Ureaplasma spp).

7. Предложены способы оценки функционального состояния местного иммунитета при вагинитах и хроническом эндометрите с фиброзом стромы эндометрия по транскрипционному профилю генов иммунного ответа, основанные на методах многофакторного анализа.

Апробация работы Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на Всероссийских и Международных конгрессах, конференциях, съездах и симпозиумах: итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы»

(Москва, 2007 г.); XI и XII Всероссийские научные форумы «Мать и дитя»

(Москва, 2010 г., 2011 г.); VI Региональный научный форум «Мать и дитя»

(Ростов-на-Дону, 2012 г.); Всероссийский конгресс «Амбулаторнополиклиническая практика: проблемы и перспективы» (Москва, 2011 г.); III и «Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье: клиниколабораторная диагностика и терапия» (Санкт-Петербург, 2010 г.; Москва, 2011 г.); 54 научная конференция МФТИ «Проблемы фундаментальных и информационном обществе. Молекулярная и биологическая физика».

(Москва, 2011 г.); XXIV Международный Конгресс c курсом эндоскопии (Москва, 2011 г.); V и VI Международный конгресс по репродуктивной медицине «Репродуктивное здоровье семьи» (Москва, 2011 г., 2012 г.); V Российская конференция "Иммунология репродукции. Теоретические и клинические аспекты" (Иваново, 2012 г.); 7 и 8 Европейские конгрессы по иммунологии репродукции (Афины, Греция, 2009 г.; Мюнхен, Германия, 2010 г.); 14 Всемирный конгресс по репродукции человека (Aвстрия, 2011 г.);

4 Международный конгресс IVI-клиник (Валенсия, Испания, 2011 г.); I Конференция по биомаркерам в репродуктивной медицине: возникновение нового направления исследования (Валенсия, Испания, 2012 г.); Всемирный конгресс по гинекологии, бесплодию и перинатологии (Барселона, Испания, 2012 г.).

Диссертация частично выполнена в рамках работ по Государственному контракту Министерства образования и науки РФ №16.522.12.2009 от сентября 2011 года и Государственному контракту Министерства образования и науки РФ №16.512.11.2093 от 22 февраля 2011 года.

Публикации По теме диссертации опубликованы 54 печатные работы, в том числе 30 статей в 11 рецензируемых научных изданиях, 3 патента, 21 публикация в материалах отечественных и международных конференций и конгрессов.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 249 страницах машинописного текста, содержит 32 таблицы, 46 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, описания результатов исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Библиография включает 336 источников, из них 60 – на русском, 276 - на иностранных языках.

Личный вклад автора Личный вклад автора состоит во включенном участии на всех этапах процесса, непосредственном участии соискателя в получении исходных данных и научных экспериментах, личном участии в апробации результатов исследования, обработке и интерпретации экспериментальных данных, выполненных лично автором, подготовке основных публикаций по выполненной работе.

1. ВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ ОРГАНОВ ЖЕНСКОЙ

РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ И МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ В ДИАГНОСТИКЕ ВАГИНИТОВ И

ХРОНИЧЕСКОГО ЭНДОМЕТРИТА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

КЛИНИКО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ СЛИЗИСТОЙ ВЛАГАЛИЩА И

ЭНДОМЕТРИЯ

распространение, симптомы, этиология и факторы риска развития заболевания Воспалительные заболевания нижних отделов репродуктивной системы женщин (вагиниты - воспаление слизистой оболочки влагалища, вульвиты – воспаление наружных половых органов, вульвовагиниты) широко распространены среди женщин. Неспецифичекские вагиниты составляют, по мнению ряда авторов, до 40% случаев обращения к гинекологам [21; 22] К характерным симптомам вагинита относят: зуд и жжение в области половых органов; обильные выделения с неприятным запахом (гнойные, молочные, творожистые, пенистые, в осложненных случаях - кровяные);

гиперемия и отечность наружных половых органов; ноющие боли внизу живота, болезненные ощущения во время полового акта; дизуретические расстройства; диспареуния; иногда увеличение температуры тела.

Различают острую и хроническую форму течения заболевания. Острая форма заболевания отличается ярко выраженными, а хроническая форма обладает менее явными, слабо выраженными симптомами.

К основным этиологическим факторам возникновения вагинита относят [68; 118]:

• аллергические реакции, в том числе на латекс, спермициды, антисептические препараты для местного применения (свечи, таблетки);

• атрофические изменения, обусловленные дефицитом эстрогенов в перименопаузальном и постменопаузальном возрасте;

• химические агенты (применение концентрированных растворов при спринцевании);

• физические факторы (инородное тело);

• анатомические (выпадение стенок влагалища или матки).

Среди инфекционных вагинитов выделяют специфические вагиниты, вызванные патогенами (Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Treponema pallidum, Mycobacterium tuberculosis и Chlamydia trachomatis), и неспецифические, обусловленные условно-патогенными микроорганизмами (УПМ), такими как грибы, стрептококки, стафилококки, кишечная палочка и др. Иногда вагиниты, обусловленные Candida spp., также относят к специфическим.

Согласно данным Европейского Международного союза по борьбе с инфекциями, передаваемыми половым путем (IUSTI - International Union against Sexually Transmitted Infections) 2011 года анализ зарубежных исследований, опубликованных в период между 1966 и 2003, показал, что у женщин с симптомами вагинита основными причинами заболевания являются бактериальный вагиноз (БВ) - в 22-50%, вульвовагинальный кандидоз - (ВВК) в 17-39%, трихомониаз в - 4-35% случаев [277].

Бактериальный вагиноз клинический полимикробный синдром, (перекись водорода-продуцирующие виды Lactobacillus spp.) на анаэробные микроорганизмы: Bacteroides/Prevotella spp., Mobiluncus spp., Veillonella spp., Gargenerella vaginalis, Atopobium vaginalis и другие.

БВ встречается в различных популяциях женщин от 16 до 65%, у 15– 37% беременных женщин, а при патологических белях – до 87% [40].

Вульвовагинальный кандидоз - инфекционное поражение слизистой оболочки вульвы и влагалища, вызываемое дрожжеподобными грибами рода Candida. Доминирующим видом является Candida albicans, составляя до 90% среди встречающихся видов. Реже встречаются грибы Candida non-albicans:

C.glabrata, C.tropicalis, C.krusei, C.рarapsilosis, C.famata, C.lipolytica, C.norvegensis, C.rugosa, C.zeylanoides.

75% женщин репродуктивного возраста переносят по меньшей мере один эпизод неосложненного острого ВВК [121; 184]. 10–20% здоровых женщин являются бессимптомными носителями: грибы рода Candida spp.

присутствуют на слизистой оболочке влагалища и вульвы, но клинические проявления инфекции отсутствуют; бессимптомное носительство Candida spp. среди беременных женщин достигает 40% [277]. На долю неосложненного острого ВВК приходится 90-95% случаев, на долю рецидивирующего ВВК (РВВК) – 5-10% [184].

Трихомониаз инфекционное заболевание мочеполовых органов, передаваемое половым путем, вызываемое простейшим одноклеточным паразитом Trichomonas vaginalis.

Заболеваемость в мире по данным WHO 2001 года составляет 86 млн.

женщин в год, из них в США – около 4 млн., в Западной Европе – около 5,5 млн., Восточной Европе и Центральной Азии – 6,8 млн [325]. В РФ за последние 5 лет отмечено снижение уровня заболеваемости с 199,5 на 100 тысяч населения в 2006 г. до 112,2 на 100 тысяч населения в 2011 г. [43].

К факторам риска развития вагинита относят:

- при вагините, обусловленном бактериальным вагинозом: низкий социально-экономический статус, спринцевание влагалища, курение, использование внутриматочных контрацептивных средств, частую смену или несколько половых партнеров, незащищенный половой акт, гомосексуальные отношения, частое использование высоких доз спермицида ноноксинол- [86; 115; 227; 268; 271];

несколько половых партнеров, высокая сексуальная активность, другие ИППП, незащищенный секс, использование противозачаточных средств, употребление наркотиков, курение [118];

- при ВВК: вагинальное или системное применения антибиотиков, избыточное потребление рафинированного сахара, сахарный диабет [86; 118;

321];

- при атрофическом вагините: менопауза и другие состояния, связанные с дефицитом эстрогенов, овариэктомия, лучевая терапия, химиотерапия, иммунологические расстройства, преждевременное угасание функции яичников, эндокринные расстройства, лечение антиэстрогенами [138];

- при аллергическом вагините: сперма, спринцевание, латексные презервативы или диафрагмы, тампоны, лекарства, одежда, атопия в анамнезе [118].

1.1.2 Современные представления о микробиоценозе влагалища у женщин репродуктивного возраста У здоровых женщин репродуктивного возраста общее количество микроорганизмов во влагалищном отделяемом составляет 106–108,5 КОЕ/мл.

В состав микрофлоры влагалища входит свыше 400 видов микроорганизмов, включая бактерии, вирусы и грибы [34]. Микробиоценоз влагалища в норме состоит из постоянно обитающих микроорганизмов (индигенная или автохтонная микрофлора) и транзиторных (аллохтонная или случайная микрофлора). Автохтонная микрофлора представлена в основном Lactobacillus spp., она составляет до 95-100% численности микроорганизмов в составе микробиоценоза влагалища [31]. Общая численность транзиторных микроорганизмов [5; 107; 134; 326] Доминирование лактобактерий в составе микробиоценоза влагалища определяется высоким фоном эстрогенов, которые индуцируют накопление в вагинальном эпителии гликогена, являющегося идеальным субстратом для роста лактобактерий. Лактобактерии расщепляют гликоген с образованием молочной кислоты, которая поддерживает рН среды на низком уровне (3,8что ограничивает рост условно-патогенных микроорганизмов. Помимо молочной кислоты защитные механизмы лактобактерий обусловлены выработкой бактериоцинов и перекиси водорода [182]. Исследования последних лет показали, что лактобактерии выделяют во внеклеточную среду экзополисахариды, способствующие их адгезии на слизистом эпителии, обеспечивающие стабильность мукозального слоя слизистых и резистентность к УПМ [124].

Описано свыше 120 видов лактобактерий, входящих в состав микробиоценозов; из них только 20 видов колонизируют слизистую влагалища, такие как L.crispatus, L.iners, L.jensenii, L.gasseri, L.acidophilus, L.johnsoni, L.vaginalis, L.amylolyticus, L.amylovorus, L.gallinarium, L.fermentum, L.brevis, L.rhamnosus, L.salivarius и другие [182]. При этом чаще всего основу микробиоты влагалища здоровых женщин репродуктивного возраста составляют 4 вида: Lactobacillus crispatus, L.iners, L.gasseri и L.jensenii [42; 327]. Несмотря на то, что L.iners в норме присутствует в составе микробиоты влагалища достаточно часто, ее протективное значение остается спорным, а некоторые авторы даже полагают, что L.iners играет негативную роль и участвует в патогенезе бактериального вагиноза [327].

Сдвиг баланса в сторону условно-патогенных микроорганизмов приводит к дисбиотическим состояниям. В свою очередь дисбиозы могут протекать как без видимых клинических проявлений, так и сопровождаться такими симптомами, как обильные выделения из половых путей с неприятным запахом, зуд, жжение, диспареуния, т.е. сопровождаются признаками вагинитов.

В случае преобладания в составе микрофлоры облигатно-анаэробных микроорганизмов, таких как Gargenerella vaginalis, Mobiluncus spp., Atopobium vaginalis, Bacteroides spp., Fusobacterium spp., Prevotella spp., Prophyromanas spp., Peptostreptococcus spp., речь идет о бактериальном вагинозе. В мазках при микроскопии обнаруживаются грамвариабильные палочки и «ключевые клетки», образующиеся в результате адгезии анаэробов на десквамированном эпителии. Распространенность БВ составляет до процентов [64].

БВ в зарубежной печати рассматривается в качестве одной из наиболее распространенных причин воспалительных заболеваний влагалища. В противоположность зарубежным исследованиям большинство отечественных ученых традиционно считает БВ инфекционным полимикробным невоспалительным синдромом, характеризующимся резким снижением или отсутствием лактофлоры и ее заменой на полимикробные ассоциации строгих анаэробов [8; 40].

Бактериальный вагиноз является самой распространенной причиной патологических выделений из влагалища и неприятного запаха из половых путей. Рыбный запах, обусловленный производством анаэробными бактериями аминов, является наиболее патогномоничным признаком БВ.

Характерный запах становится наиболее выраженным при увеличении рН после полового акта или во время менструации при наличии крови [193].

В половине случаев бактериальный вагиноз протекает бессимптомно, не вызывает воспаление слизистой оболочки вульвы и влагалища, редко вызывает зуд вульвы [281].

По данным литературы сам по себе бактериальный вагиноз не связан с риском развития воспалительных заболеваний органов малого таза, однако, даже при бессимптомном носительстве наличие БВ ассоциировано с высоким риском возникновения эндометрита и воспалительных заболеваний органов малого таза после инвазивных гинекологических процедур и абортов [228].

Как симптоматические так и бессимптомные формы бактериального вагиноза ассоциированы с повышенном риском заражения возбудителями ИППП [94; 199; 319], в частности вирусом иммунодефицита человека ВИЧ - (OR= 1,89, 95% ДИ от 1,46 до 2,43 ) [199].

Бактериальный вагиноз может стать причиной преждевременных родов [187; 260; 291], преждевременного разрыва плодных оболочек [180] и послеродового эндометрита [163]. В патогенезе преждевременных родов при инфекции существенное влияние может иметь повышение TNF-, который стимулирует синтез простагландинов [259], металлопротеиназ [123; 311] и апоптотических каспаз [206], которые в свою очередь оказывают влияние на разрыв плодных оболочек и преждевременное «созревание» шейки матки.

Как полагают, в основе механизмов срочных и преждевременных родов может быть повышенный синтез провоспалительных цитокинов IL-1, IL-6, IL-8 и TNF- в плаценте [238; 265; 332]. Родовая деятельность находится под контролем нескольких медиаторов: окситоцина, простагландинов, гистамина, прогестерона, кортизола и активно взаимодействиующих с ними цитокинов.

В норме началу родов предшествует инфильтрация плаценты лейкоцитами (макрофагами, тучными клетками и гранулоцитами). Все эти клетки начинают активно вырабатывать провоспалительные цитокины, которые увеличивают синтез простагландинов Е2 и F, стимулирующих сокращение мускулатуры матки. Помимо этого IL-1 и IL-6 вызывают усиление синтеза экспрессии окситоцина и рецепторов окситоцина в миометрии [126; 254]. Именно окситоцин служит одним из основных медиаторов родовой деятельности, вызывая стимуляцию сокращения гладкой мускулатуры миометрия матки.

Преждевременные роды ассоциированы с увеличением уровня провоспалительных цитокинов - одной из причин необычно раннего повышения цитокинов может быть наличие инфекции. Патогены могут проникать в матку в силу несостоятельности защитных механизмов, в норме предохраняющих плод от инфицирования. Патогены активируют TLR и запускают развитие локальной воспалительной реакции, сопровождающейся синтезом провоспалительных цитокинов, которые, в свою очередь, усиливают синтез простагландина Е2, вызывающего сокращение гладкой мускулатуры матки. Внутриматочные инфекции обычно затрагивают амнион провоспалительных цитокинов. По данным Hagberg H. и соав. почти у амниотической жидкости были повышены уровни IL-1, IL-6, IL-8 и они коррелировали с микробной колонизацией и клинической картиной воспаления у матери [140]. Маркером риска преждевременных родов также является повышение концентрации IL-6 в цервикальном канале у матери, как правило повышение IL-6 ассоциировано с дисбиотическими процессами во влагалище [131].

микроорганизмов, таких как Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus spp.), Staphylococcus aureus, S.epidermidis, Streptococcus agalactiae, Enterococcus spp. обычно развивается воспалительная реакция (аэробный подразумевают исключительно аэробый вагинит. Полагают, что патогенный потенциал аэробных микроорганизмов может быть реализован при дисбалансе дефицит лактобактерий может быть умеренным, «ключевые»

клетки отсутствуют, но достаточно много клеток десквамированного эпителия влагалища и нейтрофилов, повышен рН, флора представлена кокками [4; 5; 20; 181; 296].

Считается, что аэробный вагинит тоже может стать причиной преждевременных родов. В 1998 году Donders G.G. и соавт. наблюдали и впервые описали случай преждевременных родов, обусловленный аэробным цервиковагинальной жидкости IL-1, LIF и IL-8 [108; 109].

Вульвовагинальный кандидоз в виде моноинфекции в отличие от других форм дисбиозов протекает на фоне сохраненой нормофлоры. Для грибов характерен тропизм к тканям, богатым гликогеном. Грибы являются аэробами, оптимальная среда для роста рН=6-6,5, однако они выживают и в более кислой среде до рН=2,5-3,0 [39; 57; 241; 282; 336]. Выделяют три формы ВВК:

Бессимптомное носительство без клинических проявлений. Эта форма ВВК достаточно широко распространена и составляет до 15-20% случаев у небеременных женщин и до 40% случаев у беременных женщин при выявлении грибов [277].

Кандидозный вульвовагинит.

Сочетание ВВК с бактерильным вагинозом или аэробными микроорганизмами.

1.1.3 Хронический эндометрит: распространение, патогенез и факторы риска развития заболевания нозологическая форма в Международной статистической классификации болезней, травм и причин смерти IX пересмотра в 1975 г. Хронический эндометрит определяется как клинико-морфологический синдром, характеризующийся комплексом морфофункциональных изменений эндометрия воспалительного генеза, приводящих к нарушению нормальной циклической трансформации и рецептивности ткани [11]. Частота его распространения в общей популяции женского населения по различным оценкам составляет от 0,8 % до 19,0 % [246]. Заболевание может протекать, проявлениями, как перименструальные кровянистые выделения, обильные менструации, ациклические маточные кровотечения, боль в малом тазу, гноевидного характера, а также бесплодие, привычное невынашивание беременности, преждевременные роды [95; 96]. Большинство исследователей перименструальные кровянистые выделения из половых путей [58; 95; 96].

Полагают, что существенная роль в развитии ХЭ принадлежит инфекционным поражениям органов репродуктивного тракта. Ведущая роль в патогенезе ХЭ принадлежит УПМ, которые выявляют в полости матки в 60-70% случаев при ХЭ [28; 96; 226], при этом только у 5% пациентов микроорганизмы выявляются в полости матки при отсутствии признаков ХЭ [96]. Гомболевская Н.А. и соавт. при культуральном исследовании аспиратов эндометрия идентифицировали микроорганизмы в полости матки в 55% случаев. Основными возбудителями ХЭ были Gardnerella vaginalis в 29,4% случаев, Enterococcus faecalis – 17,6%, Escherichia сoli – 11,8%. При этом авторы отмечают сильную корреляционную связь между спектрами микроорганизмов, выявляемых во влагалище и в полости матки [12].

Сложности интерпретации результатов идентификации микроорганизмов в полости матки состоят в технике взятия биоматериала.

Полагают, что «загрязнения» внутриматочных проб содержимым влагалища и эндоцервикса при трансцервикальном заборе материала, трудно избежать.

Duff P. и соавт. при трансцервикальном взятии материала получили частоту 72,2% положительных эндометриальных культур, в то время как у этой же категории больных при трансфудальном взятии материала частота положительных эндометриальных культур составила 38,8% [112]. В настоящее время при использовании современных методов взятия материала с помощью эндобраншей трансцервикальным путем контаминация флорой влагалища составляет 4,1-7,5% [69; 70]. Только в 32 % случаев одни и те же виды микроорганизмов были найдены и во влагалище, и в полости матки, в то время как приблизительно в 20% случаев определенные виды бактерий были выделены лишь из эндометрия [96].

Вопрос о присутствии бактерий в полости матки у здоровых женщин до сих пор остается открытым. Существует точка зрения, что в норме полость матки стерильна, что микробное проникновение в полость матки происходит только при восходящем инфицировании в результате многократных хирургических вмешательств в слизистую оболочку матки, а также при использовании внутриматочных противозачаточных средств [141;

175]. Однако, трудно представить, что слизистая оболочка матки может быть стерильна при наличии вероятности восходящей инфекции из нижних отделов половых путей, и при половом контакте, когда сперма проникает через слизистую пробку цервикального канала в матку и маточные трубы [114].

Факторами риска развития хронического эндометрита являются инвазивные вмешательства в полость матки (гистероскопия, диагностические выскабливания, аспирационная биопсия эндометрия, аборты, гистеросальпингография, инсеминации, экстракорпоральное оплодотворение – ЭКО и др.), инфекционно-воспалительные осложнения после родов, использование внутриматочных спиралей (ВМС), инфекции влагалища и шейки матки, стеноз шейки матки, деформации полости матки, лучевая терапия органов малого таза [27; 218].

Основой для понимания биологических процессов, происходящих на слизистых оболочках половых путей женщин, является концепция взаимодействия макро- и микроорганизмов. Условно-патогенные микроорганизмы могут при определенных условиях начать проявлять свои патогенные свойства. Оппортунистические инфекции можно рассматривать, как своеобразный маркер дефекта защитных механизмов макроорганизма [35]. Макроорганизм обладает целым рядом системных и локальных механизмов защиты, препятствующих микробной инвазии.

Защита от потенциально патогенных микроорганизмов осуществляется компонентами врожденного и приобретенного иммунитета, которые будут рассмотрены в следующем разделе.

1.2 МЕХАНИЗМЫ ИММУННОЙ ЗАЩИТЫ ПОЛОВЫХ ПУТЕЙ

ЖЕНЩИН

Иммунитет слизистых оболочек половых путей женщин представляет собой уникальную систему, которая эффективно распознает патогенные микроорганизмы и препятствует их размножению, но в то же время, сохраняет и защищает аллогенно чужеродный плод. Основные функции иммунной системы половых путей женщины состоят в обеспечении условий для успешного прохождения сперматозоидов, оплодотворения, имплантации и развития эмбриона и плода.

Гормональные изменения. Гормональные изменения в течение менструального цикла регулируют иммунную систему на всем протяжении слизистых оболочек половых путей [217; 324]. Гормональные изменения являются циклическими и носят двухфазный характер (рис.1). Первая фолликулярная фаза овариального цикла характеризуется созреванием и развитием в яичнике под влиянием ФСГ примордиальных фолликулов, один из которых становится доминирующим. Далее происходит выход яйцеклетки из фолликула – овуляция, она приходится примерно на середину цикла.

Вторая лютеиновая фаза связана с образованием желтого тела на месте созревшего фолликула под влиянием ЛГ. В соответствии со сменой фаз цикла регенерация и пролиферация функционального слоя в эндометрии сменяется секреторной активностью его желез. В фазу развития и селекции фолликулов осуществляется возрастающая секреция эстрогенов; желтое тело, формирующиеся после овуляции на месте созревшего фолликула, синтезирует прогестерон и эстрогены (рис.1). Изменения в эндометрии заканчиваются десквамацией функционального слоя (менструация).

Под влиянием гормонов яичников (эстрогенов и прогестерона) циклическим изменениям подвергается как эндометрий (менструальный цикл), так и слизистая оболочка маточных труб, цервикального канала и влагалища. В каждом цикле эндометрий проходит менструальную, пролиферативную и секреторную фазу.

Рисунок 1. Циклические изменения в эндометрии и соответствуюший им гормональный фон.

В пролиферативную фазу цикла под влиянием эстрогенов происходит пролиферация клеток базального слоя и восстановление функционального слоя эндометрия. Эпителиальные клетки желез базального слоя мигрируют на поверхность, пролиферируют и образуют новую эпителиальную выстилку эндометрия, происходит формирование новых маточных желез и врастание спиральных артерий из базального слоя.

В секреторную фазу эпителиальные клетки прекращают деление, маточные железы становятся более разветвленными, железистые клетки начинают секретировать гликоген, гликопротеины, липиды, муцин и выделяют секрет в просвет матки. Спиральные артерии приближаются к поверхности слизистой оболочки матки и приобретают более извитой характер. В поверхностных частях функционального слоя увеличивается количество соединительнотканных клеток, в цитоплазме которых коллагеновые и ретикулиновые волокна, образованные коллагеном I и плаценты. У человека в отличие от мышей децидуализация клеток стромы осуществляется в каждом цикле вне зависимости от инвазии эмбриона [252].

Функциональный слой эндометрия высокочувствителен к половым гормонам яичника эстрогенам и прогестерону. Однако есть мнение, что решающую роль в имплантации играет не столько абсолютное содержание количество функционально полноценных рецепторов к соответствующим стероидным гормонам в ткани эндометрия [37]. Эстрогеновый рецептор кодируется двумя генами ESR1 (или ESR-) и ESR2 (или ESR-), прогестероновый одним геном PGR, но имеет две изоформы ( и ) [316].

Продукт гена ESR1 является доминирующей формой в матке, он лучше исследован, т.к. открыт был раньше, чем ESR2.

физиологическим регулятором экспрессии ядерных рецепторов внутри клеток-мишеней является уровень циркулирующих свободных гормонов.

Эстрогены усиливают синтез собственных рецепторов, рецепторов прогестерона и андрогенов. Прогестерон не только не усиливает синтез собственных рецепторов, но, напротив, подавляет его, а также синтез рецепторов эстрадиола [59].

Данные литературы по экспрессии эстрогенового и прогестеронового рецепторов являются противоречивыми. Согласно данным Nikas G. в период имплантации содержание ESR1 в эндометрии повышается, при этом наибольшая концентрация ядерных рецепторов к эстрогенам характерна для конца поздней пролиферативной и начала секреторной фазы [231].

Овуляторный всплеск эстрогенов способствует наиболее высокой экспрессии ESR1 в эпителиальных клетках эндометрия в период имплантационного окна [293], что приводит к активной пролиферации эпителия [88] и способствует инвазии эмбриона.

Прогестерон является ключевым гормоном имплантации и элонгации беременности. Помимо участия в процессе инвазии эмбриона он участвует в процессах децидуализации фибробластов эндометрия и формировании железистого эпителия [316]. Экспрессия прогестероновых рецепторов в эпителии резко понижается в эпителии в период имплантационного окна [293] и резко возрастает в строме эндометрия при децидуализации фибробластов [316].

В значительной степени результаты исследования могут зависеть от локуса взятия материала, в норме наиболее высокая концентрация рецепторов, обладающих сродством к стероидным гормонам, отмечается в эндометрии в области «дна» матки (верхняя стенка) и трубных углов.

Количество рецепторов к гормонам уменьшается от «дна» к шейке матки [230].

прогестероновых рецепторов было изучено Tibbetts T.A. и соавт. на мышах с удаленными яичниками, которым экзогенно вводили гормоны [298]. В отсутствии гормональной стимуляции высокий уровень экспрессии ESR отмечался в железистом эпителии и стороме, высокий уровень экспрессии PGR – в люминальном и железистом эпителии. При введении эстрогенов экспрессия ESR1 увеличивалась в люминальном эпителии и миометрии и затухала в строме, экспрессия PGR увеличивалась в строме, железистом эпителии и миометрии, но затухала в люминальном эпителии. Прогестерон снижал экспрессию прогестероновых рецепторов. При одновременном введении эстрогенов и прогестерона экспрессия ESR1 увеличивалась в железистом эпителии и подавлялась в миометрии.

К периоду овуляции происходят не только изменения в структуре стромы, желез и спиральных артерий эндометрия, но формируется комплекс иммунологических механизмов, которые, с одной стороны, должны поддержать имплантацию и развитие эмбриона, а с другой стороны, обеспечить защиту от микроорганизмов, которые могут проникнуть из нижних отделов половых путей.

Иммунная защита от биотических факторов (бактерий, грибов, вирусов) включает целый комплекс реакций взаимодействия между клетками и механизмов активации различных компонентов системы.

Существует несколько уровней защиты, включая физиологический и иммунологический барьер в виде эпителиальных клеток и слоя муцина.

Далее защиту обеспечивают компоненты врожденного и приобретенного (или адаптивного) иммунитета (рис.2).

Верхние отделы половых путей представлены эндоцервиксом, эндометрием и фаллопиевыми трубами. Они выстланы однослойным цилиндрическим эпителием с плотными контактами между клетками. В проницаемость слизистых оболочек может изменяться [116; 324]. Кроме того, клетки стромы эндометрия влияют на проницаемость эпителиального слоя посредством синтеза цитокинов и ростовых факторов, экспрессия которых регулируется гормонами [137]. Например, высокий уровень TNF- в строме эндометрия понижает экспрессию в эпителии клаудина - основного белка плотных контактов. Это способствует успешной инвазии эмбриона, но приводит к увеличению проницаемости для микроорганизмов [87; 136; 225].

Рисунок 2. Основные компоненты иммунной системы слизистых половых путей женщин (модифицировано) [149].

экзоцерквикса, выстланы неороговевающим многослойным плоскоклеточным эпителием, прикрепленным к подслизистой оболочке (lamina propria). Многослойный эпителий защищает основную ткань от микротравм во время полового акта. Эпителий влагалища состоит из четырех слоев: базального, парабазального, промежуточного и поверхностного.

Поверхностные клетки постоянно слущиваются, вследствие чего гликоген, содержащийся в этих клетках, создает питательную среду для резидентных бактерий [249]. Между клетками эпителиального слоя отсутствуют плотные контакты, что способствует проникновению мелких микрооорганизмов, в частности вирусов, в эпителий. В слое эпителия происходит взаимодействие патогенов с диффузно расположенными клетками Лангерганса, либо CD4+ лимфоцитами [152].

Эпителиальные клетки формируют не только физический барьер, но и содержат паттерн-распознающие рецепторы (ПРР, PRR- pattern-recognition receptor), которые воспринимают патоген-ассоциированные молекулярные паттерны микроорганизмов (PAMP - pathogen-associated molecular pattern, ПАМП или «образы патогенности»), при этом запускается целый каскад реакций, результатом которых является синтез цитокинов, хемокинов и противомикробных пептидов этими клетками.

От прямого контакта с патогенами эпителий частично защищает слизь.

Слизь состоит из гликозилированных белков, так называемых муцинов.

Помимо этого в водной фазе муцинов содержатся иммуноглобулины и противомикробные пептиды, которые тоже предохраняют эпителий от поражения Состав шеечно-вагинальной слизи зависит от гормонального фона. При действии эстрадиола в пролиферативную фазу и во время овуляции она жидкая, водянистая, с низкой плотностью, что способствует продвижению сперматозоидов. Под действием прогестерона в секреторную, раннюю пролиферативную фазу и во время менструации слизь становится более концентрированной [310]. Важной составляющей шеечновлагалищной слизи является кислая среда рН=4-5, которая препятствует размножению УПМ.

Врожденный иммунитет. Врожденный иммунитет обеспечивает первую линию обороны и лежит в основе большинства воспалительных реакций. К клеткам врожденного иммунитета относятся макрофаги (МФ), дендритные клетки (ДК), натуральные киллеры (НК-клетки), нейтрофилы.

Макрофаги и дендритные клетки. Макрофаги и дендритные клетки осуществляют фагоцитоз и уничтожение микроорганизмов посредством ферментативного расщепления. Процесс фагоцитоза сопровождается синтезом целого ряда провоспалительных цитокинов (TNF-, IL-1, IL-6 и др.), сигнализирующих о внедрении чужеродных микроорганизмов и обеспечивающих привлечение других иммунокомпетентных клеток в очаг воспаления: нейтрофилов, НК-клеток, моноцитов и плазмоцитоидных ДК из крови [162].

Макрофаги составляют около 10% субпопуляции лейкоцитов в составе органов половых путей, их число выше в строме эндометрия и миометрия.

Количество макрофагов зависит от фазы менструального цикла. Наибольшее их количество содержится в эндометрии накануне менструации [287].

Напротив, число влагалищных макрофагов остается постоянным на протяжении всего менструального цикла [323]. Макрофаги слизистых оболочек половых путей отличаются от кишечных, в частности в них выше содержание CD4, хемокинов CCR5 и CXCR4 [89].

Дендритные клетки локализованы в строме эндометрия. Во влагалище они присутствуют и в эпителиальных слоях [158]. Ochiel D.O. было установлено, что эпителиальные клетки секретируют в строму растворимые медиаторы, которые влияют на фенотип ДК с пониженной экспрессией костимулирующих молекул CD83и CD86, а также менее выраженным ответом на стимуляцию TLR-3 и TLR-4 [237].

Как профессиональные антигенпредставляющие клетки, МФ и ДК являются важными посредниками запуска адаптивного иммунитета во время инфекционного процесса. Процессы фагоцитоза инициируют в МФ и ДК процессы созревания и презентации антигенов в составе молекул главного комплекса гистосовместимости I или II класса (HLA-I и HLA-II).

Презентация антигена наивным Т-лимфоцитам (Th0) приводит к запуску патоген-специфичного адаптивного иммунитета [266].

Натуральные киллеры. НК-клетки обладают цитотоксической активностью, выполняют защитные функции, обеспечивают имплантацию и поддержание беременности [219; 323]. В отличие от НК-клеток крови содержат уникальный маркер CD9 [219]. НК-клетки эндометрия и эндоцервикса содержат такие маркеры, как CD96, CD94 [219]. Количество НК-клеток в эндометрии зависит от стадии цикла и достигает 70% в популяции лейкоцитов в секреторную фазу [323]. В других отделах половых путей количество НК клеток не зависит от стадии цикла и составляет 10-30% в общем пуле лейкоцитов. Наименьшее количество НК клеток содержится в фаллопиевых трубах.

Подобно НК-клеткам крови маточные НК-клетки (uNK) продуцируют GM-CSF, IL-10, IL-8 и IFN-, тем самым поддерживают воспалительную реакцию, активируя макрофаги и цитотоксические Т-лимфоциты. Маточные НК-клетки в отличие от кровяных, продуцируют LIF и другие ангиогенные ростовые факторы, которые необходимы для формирования сосудов.

Нейтрофилы. Меньше всего нейтрофилов содержится в фаллопиевых трубах, их число постепенно повышается по направлению к нижним отделам половых путей, достигая максимума во влагалище. Количество нейтрофилов практически не зависит от стадии цикла, однако повышается во время менструации, чему способствует «выброс» IL-8 в тканях эндометрия. Во время менструации нейтрофилы выполняют две важные функции: во-первых, способствуют разрушению тканей эндометрия посредством синтеза эластазы, активирующей матричные металлопротеазы; во-вторых, обеспечивают иммунную защиту в условиях неполноценного эпителиального барьера.

микроорганизмы посредством фагоцитоза, синтеза антимикробных пептидов и окислительных соединений. Нейтрофилы продуцируют также ингибиторы протеаз (траппин-2/элафин), альфа-дефензины, фосфолипазы и цитокины [274].

Распознавание «образов патогенности». Все клетки врожденного иммунитета и эпителий содержат ПРР, которые воспринимают патогенассоциированные молекулярные паттерны микроорганизмов. Общие повторяющиеся инвариантные молекулярные структуры патогенов и рецепторы к ним впервые были описаны Janeway C. A. в 1992 году [164].

В роли ПАМП могут выступать различные структурные компоненты клеточной стенки вирусов, бактерий или грибов, которые одинаковы у многих патогенов, но не встречаются у человека и, таким образом, опознаются иммунной системой хозяина как «чужое».

многочисленные ПРР. Они могут быть разделены на 3 большие группы:

1) толл-лайк рецепторы ТЛР (TLR- toll-like receptor, toll – диал., амер.

завлекать, заманивать в ловушку); 2) нод-лайк рецепторы, НЛР (NLR – nucleotide oligomerization domain (NOD)-like receptor);

рецепторы С- типа ЛРС (СLR-C-type lectin receptor) [155].

Наиболее хорошо изучены в настоящее время TLR. У человека их десять, девять из них встречаются в органах половых путей женщин [224].

TLRs 1, 2, 4, 5 и 6 экспрессируются в основном на поверхности клеток и распознают компоненты жгутиков простейших и клеточных стенок бактерий и грибов. TLR 3, 7, 8,9 - фрагменты нуклеиновых кислот микроорганизмов и взаимодействует с липополисахаридами (LPS) клеточных стенок грамотрицательных бактерий и маннаном кандид, TLR-9 – с неметилированными CpG-мотивами бактериальной и вирусной ДНК, TLR-1 и TLR-2 – с широким спектром паттернов, включая липопротеины и пептидогликаны клеточных стенок грам-положительных и грам-отрицательных бактерий, а также зимозаном и фосфолипоманом грибов [170].

В неактивном состоянии толл-подобные рецепторы находятся в мембране в мономерном состоянии, а при активации они димеризуются.

Большинство рецепторов образуют гомодимеры, а TLR-2 - гетеродимеры с TLR-1 либо с TLR-6 в зависимости от лиганда. После активации рецептора происходит передача сигнала внутрь клетки через адаптерные молекулы и синтез определенных цитокинов в зависимости от типа сигнального пути.

Известны два сигнальных ответа. Первый путь связан с включением адаптерного белка MyD88, который активирует транскрипционный фактор инициирующий транскрипцию провоспалительных цитокинов NF-kB, (TNF-, IL-6 и др). Второй путь осуществляется через активацию интерферон-регулирующего фактора 3 (IRF3), инициирующего выработку IFN I типа и последующую активацию интерферон-регулируемых генов [196;

224].

Преимущества распознавания микроорганизмов посредством ПРР заключается в возможности изменения экспрессии ряда генов, включая гены цитокинов, и модулировании адаптивного иммунного ответа [303]. В частности, важное значение в инициации иммунного ответа в отношении грибов имеют TLR-1, -2,, -4, -6, лектиновые рецепторы С-типа, такие как дектин-1, -2; рецептор маннозы и др. [184]. В качестве лигандов у кандид выступают компоненты клеточной стенки. Клеточная стенка Candida albicans состоит из -глюкана (60%), маннопротеинов (35–40%) и хитина (1–5%).

Наружный слой клеточной стенки обогащен маннопротеинами, внутренний составляют преимущественно хитин и -глюкан. -глюкан является доминирующим компонентом клеточной стенки, но он располагается во внутреннем слое, и доступен только во время почкования дрожжевых клеток или гибели патогена [174]. На разных стадиях жизненного цикла (бластоспоры и гифы) кандид могут связываться с различными TLR.

Бластоспоры активируют как TLR-2, так и TLR-4 рецепторы, гифы только TLR-2 рецепторы [304]. Взаимодействие маннопротеинов кандид с TLR- стимулирует Th1-ответ и продукцию IL-12, IFN-, TNF- и IFN I типа [229], что в конечном счете приводит к эффективной ликвидации кандид.

Напротив, связывание кандид с TLR-2 приводит к экспрессии TGF-1 и которые поддерживают иммуносупрессию и обеспечивают IL-10, толерантность к антигенам кандид [304]. Однако, при активации -глюканом кандид TLR-2 в гетеродимере с дектином-1 запускается сигнальный каскад, который способствует синтезу провоспалительных цитокинов.

Таким образом, Candida albicans теоретически может вызывать несколько типов иммунного ответа в зависимости от стадии жизненного цикла возбудителя и активации различных комплексов TLR. В этом случае цитокины будут своего рода маркерами типа иммунного ответа: от толерантности к антигенам кандид до резко выраженной воспалительной реакции.

Одним из основных типов клеток во влагалище являются нейтрофилы, они экспрессируют все TLR, за исключением TLR-3, и таким образом могут реагировать на широкий спектр «образов патогенности [147]. Эпителиальные клетки влагалища и шейки матки экспрессируют TLR-1, 2, 3, 5, 6, но экспрессия TLR-4 – низкая [245].

Адаптивный иммунитет. Механизмы приобретенного иммунитета основаны на специфическом распознавании антигена, также способствуют уничтожению чужеродных микроорганизмов, но помимо этого обеспечивают иммунологическую память и развитие таких осложнений, как аутоиммунные процессы и аллергическая реакция.

Адаптивный иммунитет реализуется после взаимодействия наивных Ти В-лимфоцитов с АПК. Антигены презентуются лимфоцитам в комплексе с молекулами HLA. В качестве АПК выступают макрофаги, ДК, клетки Лангерганса, а также эпителиальные клетки цервикса и эндометрия. Наивные Т-лимфоциты (Th0) могут диференцироваться в 4 направлениях:

Th1-лимфоциты (фактор дифференцировки TBX-21) участвуют в клеточно-опосредованном иммунитете и характеризуются синтезом таких цитокинов, как IFN-, IL-2, TNF-;

Th2 – лимфоциты (фактор дифференцировки GATA-3) участвуют в гуморальном ответе, т.е. синтезе АТ, а также защите от паразитарных инфекции и развитии аллергических реакций; характеризуются синтезом таких цитокинов, как IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-13;

транскрипционный фактор Foxp3 и участвуют в супрессии иммунного ответа;

Th17-клетки (фактор дифференцировки RORC) участвуют в воспалительных реакциях.

уничтожение внутриклеточных патогенов и обеспечивается Т-лимфоцитами.

цитотоксические эффекторные Т-клетки взаимодействуют с CD8+ инфицированными клетками посредством связывания с молекулами HLA I класса, запускают процесс апоптоза через перфорин и гранзимопосредованный цитолиз [190]. CD4+ Т-клетки секретируют высокий уровень IFN-, поддерживая цитотоксические Т-лимфоциты, а также непосредственно блокируют вирусную репликацию [158; 222]. Т-клетки расположены в строме влагалища, шейки матки и эндометрия, а также среди эпителиальных клеток влагалища и известны, как интраэпителиальные лимфоциты [165].

В эндометрии СD8+ клеток больше (35-50%), чем CD4+ лимфоцитов (около 25%). Слизистая оболочка матки содержит уникальные лимфоидные скопления клеток, представленные большим количеством CD8+ лимфоцитов, расположенных вокруг клеточного центра, состоящего из В-клеток и инкапсулированных макрофагами. Лимфоидные скопления начинают развиваться в пролиферативную фазу менструального цикла, достигая максимальных размеров в секреторную фазу [330]. Образование скоплений лимфоцитов регулируется эстрадиолом и прогестероном. У женщин в постменопаузе подобные скопления не образуются.

Гуморальный иммунитет направлен на образование антител, которые связываясь с антигенами микроорганизмов, способствуют их нейтрализации.

После связывания АТ с АГ элиминация возбудителя осуществляется за счет фагоцитарной активности МФ или активации комплимента. Th2-клетки способствуют превращению наивных В-лимфоцитов в плазматические клетки, продуцирующие АТ [177]. В отличие от других слизистых поверхностей: респираторного и желудочно-кишечного тракта, где доминирующим изотипом являются IgA, секреты слизистых половых путей в равной степени содержат как IgG, так и секреторные sIgA.

Исследование соотношения IgG/IgA антител показало, что оно составляет 2:1 и 6:1 в цервикальной слизи и цервико-вагинальном лаваже соответственно [169]. Относительно соотношения IgG/IgA в маточном секрете данных нет. Транспортировка IgA-АТ из стромы эндометрия через эпителий осуществляется через рецепторы pIgR. Показано, что экспрессия этих рецепторов зависит от стадии менструального цикла: высокая - в секреторную фазу, уменьшается в пролиферативную фазу, самая низкая – во время менструации [292]. На моделях крыс было показано, что секреция IgAАТ, IgG-АТ рецепторов pIgR повышается при стимуляции эстрадиолом [322].

Хотя секреция IgA-АТ регулируется гормонами в течение менструального цикла, но в значительной степени определяется и опосредуется процессами антигенной стимуляции.

На момент оплодотворения иммунная система должна обеспечить условия для успешной имплантации и поддержания беременности. Под действием эстрадиола в пролиферативную фазу происходит накопление CD4 + CD25 + Foxp3 + регуляторных Т-клеток (Treg) в строме эндометрия [75]. Treg являются иммуносупрессорами. Механизм их действия может быть либо прямым (непосредственный контакт между клетками), либо опосредованным через выработку иммуносупрессорных факторов Foxp3 и TGF-1. Мишенями действия Тreg-клеток являются Т-эффекторные клетки (Т-хелперы и Т-цитотоксические лимфоциты) и дендритные клетки, ответственные за презентацию антигена и активацию Т-клеток. При прямой супрессии Treg взаимодействуют с эффекторными Т-клетками, выделяют гранзим B, который вызывает апоптоз в этих клетках, тем самым элиминируя активные Т-клетки. Тreg клетки, взаимодействуя с рецептором CD86 на дендритных клетках при помощи CTLA-4, блокируют активацию Т-клеток дендритными клетками. При опосредованном действии транскрипционный фактор Foxp3 регулирует транскрипцию генов, а TGF-1 связывается со своими рецепторами на поверхности Т-эффекторных клеток и ингибирует их активацию. Важным механизмом также служит захват IL-2 при помощи CD25high и секвестрация рецептора у эффекторных Т-клеток [294; 295]. Как известно, IL-2 является основным аутокринным стимулирующим фактором, поддерживающим дифференцировку и клональную пролиферацию Т-клеток.

Помимо накопления Treg в эндометрии на момент оплодотворения происходит снижение цитолитической активности CD8+цитотоксических лимфоцитов [317]. Большое число внутриэпителиальных T – лимфоцитов тоже подавляют отторжение эмбриона посредством синтеза TGF-1 [232].

представлять T – лимфоциты. Они расположены в непосредственной близости к эпителию. Полагают, что T – лимфоциты одними из первых реагируют на внедрение патогенов в эпителий, активируются и дифференцируются либо в направлении Т-хелперов, либо в направлении Ткиллеров [60]. Не исключают, что хронизация инфекционных процессов может быть обусловлена несостоятельностью T – лимфоцитов.

В присутствии провоспалительных цитокинов, таких как IL-6, происходит дифференцировка Т-лимфоцитов в Th17-клетки, которые участвуют в воспалительной реакции. Было показано, что Th17 регулируют миграцию нейтрофилов при гонорее [119], хламидийной инфекции [273] и на поздних стадиях самопроизвольных выкидышей [223]. Участие Th17 клеток в воспалительном процессе мало изучено и требует дальнейших исследований.

условно-патогенными микроорганизмами. Полагают, что вещества, вырабатываемые УПМ, снижают защитные функции иммуннокомпетентных клеток и факторов локального иммунитета. Ряд исследователей полагает, что анаэробные бактерии, ассоциированные с БВ, выделяют вещества, которые ингибируют миграцию нейтрофилов во влагалище [92; 212; 286].

Установлено, что сукцинат, выделяемый бактероидами, ингибирует функции нейтрофилов [262]. Сиалидазы, продуцируемые гарденереллой и некоторыми другими анаэробами стимулируют некоторые клетки иммунной системы и ингибируют фагоцитоз [151], помимо этого способствуют разрушению муцина [320]. Ureaplasma urealyticum может продуцировать протеазы, которые расщепляют IgA [171; 258].

Роль цитокинов во взаимодействии иммунокомпетентных клеток.

Одной из важнейших функций системы цитокинов является обеспечение согласованного действия иммунной, эндокринной и нервной систем в развитии реакции воспаления. Цитокиновая сеть представлена множеством протеинов или гликопротеинов, вырабатываемых лимфоцитами, макрофагами и другими типами лейкоцитов, а также фибробластами, эндотелиальными, эпителиальными и другими соматическими клетками.

Далее рассмотрены функции основных цитокинов и медиаторов иммунного ответа, которые исследованы в работе в качестве маркеров локальных воспалительных реакций.

CD45 – общий лейкоцитарный антиген (тирозиновая протеинфосфатаза C рецепторного типа).

CD68 – макросиалин - трансмембранный белок, используется в качестве маркера макрофагов, экспрессируется также дендритными клетками.

СD69 – транмембранный гликопротеин, относится к лектинам C типа – ранний маркер пролиферации Т-лимфоцитов, экспрессируется также на поверхности активированных В-лимфоцитов, натуральных киллеров, нейтрофилов, эозинофилов, эпидермальных клеток Лангерганса (ДК) и тромбоцитов.

Foxp3 – транскрипционный фактор скурфин, регулирует транскрипцию генов, ответственных за дифференцировку Т-клеток и экспрессию цитокинов и других факторов, участвует в супрессии иммунного ответа, один из основных маркеров естественных Т-регуляторных клеток.

GATA3 – транскрипционный фактор GATA-связывающий протеин 3, ключевой фактор дифференцировки Т-хелперов II типа.

GNLY - гранулизин, компонент гранул цитотоксических Т-лимфоцитов и НК-клеток, обладающий антимикробной активностью IFN- (ИФН-) – интерферон гамма обладает иммунорегулирующими функциями: активация макрофагов, усиление Th1-ответа, индукция экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости типа II на антигенпрезентирующих и других клетках, проявляет противовирусную и антипролиферативную активность.

IL-1 (ИЛ-1) – интерлейкин 1 альфа - провоспалительный цитокин, один из важных медиаторов воспалительного ответа, функции аналогичны IL-1;

главным образом является медиатором местных защитных реакций, в окружающую среду экспрессируется в незначительном количестве, в основном представлен мембранной формой, в то время как IL- представляет собой секреторный цитокин и осуществляет свои функции как на локальном, так и на системном уровне.

IL-1 (ИЛ-1) – интерлейкин 1 бета - провоспалительный цитокин, один из основных медиаторов воспалительного процесса, активирует лимфоциты и макрофаги, вызывает усиление клеточной адгезии, является одним из медиаторов реакций острой фазы воспаления, в том числе на системном острофазовых белков в печени. Помимо этого IL-1 оказывает влияние на метаболизм соединительной ткани: стимулирует пролиферацию фибробластов, увеличивает продукцию ими простагландинов, ростовых факторов и ряда цитокинов. Под влиянием IL-1 в клетках соединительной ткани увеличивается синтез коллагена и металлопротеиназ. Роль IL- заключается в стимуляции общего процесса перестройки соединительной ткани после повреждения, что необходимо для регенерации тканей и восстановления их целостности.

IL-1RA - антагонист интерлейкина-1, взаимодействует с рецептором IL-1 и препятствует активации внутриклеточного сигнального каскада, запускаемого IL-1.

IL-2 (ИЛ-2) - интерлейкин 2 - фактор роста и созревания Т-лимфоцитов, основными продуцентами являются активированными Т-хелперы I типа после взаимодействия антигена с Т-клеточным антигенным рецептором. IL- вызывает функциональную активацию многих клеточных типов: в Тлимфоцитах усиливает цитотоксические свойства и синтез самого IL-2, в Вклетках – продукцию антител, в НК-клетках – противоопухолевую активность, в моноцитах и макрофагах – продукцию провоспалительных цитокинов, бактерицидность и фагоцитоз. Полагают, что IL-2 участвует в формировании нормального числа Т-регуляторных клеток на периферии.

IL-2R – -цепь рецептора IL-2, трансмембранный белок, представляет собой одну из субъединиц рецептора IL-2. Помимо этого в состав рецептора входят и субъединицы. В комплексе все три субъединицы образуют высоко аффинный рецептор IL-2 – CD25high, который является маркером активированных Т-лимфоцитов и естественных Т-регуляторных клеток.

IL-4 (ИЛ-4) - интерлейкин 4 – фактор роста Т- и В-лимфоцитов, промотор IgE-опосредованных реакций и роста тучных клеток, синтезируется Тхелперами II типа.

IL-6 (ИЛ-6) - интерлейкин 6 – фактор роста и дифференцировки Влимфоцитов, активатор поликлональной продукции иммуноглобулинов, поддерживает пролиферацию Т-клеток, является одним из медиаторов реакций острой фазы воспаления.

IL-8 (ИЛ-8) - интерлейкин 8 – хемокин семейства CXC, обеспечивает хемотаксис нейтрофилов и Т-лимфоцитов, активирует нейтрофилы, способствует ангиогенезу, ингибирует выброс гистамина базофилами, регулирует синтез IgE В-клетками.

IL-10 (ИЛ-10) - интерлейкин 10 – противовоспалительный цитокин, обладает иммуносупрессорной активностью в отношении Т-хелперов I типа и антигенпрезентующих клеток, подавляет продукцию провоспалительных цитокинов, однако костимулирует пролиферацию, дифференцировку и функциональную активность В-лимфоцитов.

IL-12 (ИЛ-12) - интерлейкин 12 – провоспалительный цитокин, состоит из двух субъединиц (р35 и р40), активирует и стимулирует дифференцировку Тхелперов I типа и НК-клеток, тем самым способствует синтезу IFN-, является фактором созревания цитотоксических лимфоцитов.

IL-15 (ИЛ-15) - интерлейкин 15 – провоспалительный цитокин, регулирует активацию и пролиферацию Т-лимфоцитов и НК-клеток. По биологическим свойстам похож на IL-2. Однако роль IL-2 больше связана с регуляцией Тлимфоцитов, тогда как IL-15 более важен для поддержания функций НКклеток, интраэпителиальных Т-лимфоцитов и цитотоксических Тлимфоцитов.

IL-18 (ИЛ-18) – интерлейкин 18 – провоспалительный цитокин, один из основных индукторов синтеза IFN- Т-лимфоцитами и НК- клетками.

Обладает провоспалительными свойствами за счет активации различных типов лейкоцитов и НК–клеток, в том числе в макрофагах происходит индукция синтеза циклооксигеназы и NO-синтазы, провоспалительных цитокинов и хемокинов. В присутствии IL-12 является избирательным активатором Th1-лимфоцитов. Однако в отсутствии IL-12 вызывает аллергическую сенсибилизацию, повышает синтез IL-4 и IgE [331].

IL-23 (ИЛ-23) – интерлейкин 23 является одним из ключевых цитокинов воспалительного процесса, вместе с IL-6 и TGF-1 способствует дифференцировке наивных Т-лимфоцитов в Th17-клетки, состоит из двух субъединиц (р19 и р40), р 40 является общей субъединицей с IL-12.

LIF (ЛИФ) – лейкемия-ингибирующий фактор тормозит пролиферацию моноцитов и макрофагов, является одним из факторов ангиогенеза, обладает свойствами провоспалительного и гемопоэтического цитокина, напоминая по биологическим свойствам IL-6 [143]. LIF считается одним из ключевых регуляторов имплантации [172].

RORC – транскрипционный фактор дифференцировки Th17-лимфоцитов.

TBX21 - транскрипционный фактор дифференцировки Т-хелперов I типа, индуцирует экспрессию рецептора IL-12R2 и направляет ремодулирование хроматина в индивидуальных аллелях гена IFN- [220].

свойствами: изменение пролиферации клеток, в большинстве случаев – подавление (в том числе подавляет пролиферативную и функциональную активность Т-лимфоцитов и НК-клеток); усиление формирования внеклеточного матрикса; иммуносупрессивное действие.

TLR-2 (ТЛР-2) - толл-подобный рецептор 2 распознает компоненты клеточных стенок грам-положительных бактерий и грибов.

TLR-4 (ТЛР-4) - толл-подобный рецептор 4 распознает липополисахариды клеточных стенок грам-отрицательных бактерий.

TLR-9 (ТЛР-9) - толл-подобный рецептор 9 распознает неметилированные CpG-динуклеотиды бактериальной ДНК.

TNF- (ФНО-) - фактор некроза опухоли альфа – провоспалительный цитокин, один из основных медиаторов воспалительного процесса и активации лейкоцитов, индуцирует экспрессию молекул адгезии и хемокинов на эндотелии, стимулирует продукцию IL-1, IL-6, IL-8, IFN-, является одним из важных факторов защиты от внутриклеточных паразитов и вирусов, может индуцировать апоптоз клеток-мишеней.

VEGF-A (СЭФР) - сосудистый эндотелиальный фактор роста - один из ключевых факторов ангиогенеза, который оказывает выраженное митогенное воздействие на эндотелиальные клетки сосудов, влияет на развитие новых кровеносных сосудов и выживание незрелых кровеносных сосудов, обеспечивая сосудистую поддержку, увеличивает проницаемость микрососудов и первоначально идентифицирован, как «сосудистый фактор проницаемости». Он связывается с двумя близкими по строению мембранными тирозинкиназными рецепторами (VEGFR1 и VEGFR2).

Полагают, что VEGFR2 запускает сигнальный каскад, который в конечном итоге стимулирует рост эндотелиальных клеток сосудов, их выживание и пролиферацию. Функции рецептора VEGFR1 исследованы меньше, но полагают, что он модулирует сигналы VEGFR2, в том числе он может выступать как «ловушка», которая изолирует белок VEGF от рецептора VEGFR2. Белок VEGFA представлен 5 изоформами, состоящими из 121, 145, 165, 189 и 206 аминокислот. Разные изоформы отличаются по митогенному потенциалу, хемотактическим свойствам, переносу белка, сигнальной трансдукции, сродству к гепарину, взаимодействию с фактором роста, по характеристикам связывания рецепторов и тканеспецифичности экспрессии.

Наиболее хорошо изучены изоформы VEGF-121 и VEGF-165. Известно, что VEGF-121 обладают в сто раз меньшим митогенным потенциалом для эндотелиальных клеток, чем VEGF-165.

КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА

ВУЛЬВОВАГИНИТОВ И ХРОНИЧЕСКОГО ЭНДОМЕТРИТА

1.3.1 Диагностика воспалительных заболеваний нижних отделов органов женской репродуктивной системы Традиционно в рутинной диагностике вульвовагинитов используют комбинацию признаков: анализ жалоб и результатов осмотра пациентки (табл.1), микроскопия мазков, наличие запаха (аминный тест), определение рН вагинальной жидкости. При такой оценке приблизительно у 30 процентов женщин с симптомами заболевания этиологический фактор остается неустановленным [68].

Таблица 1. Общие причины, симптомы и признаки вагинита.

Тип вагинита этиология Клинические симптомы Ассоциированный с Gardnerella Однородные Не основной Не основной Вульвовагинальный Candida albicans, Белые, Жжение, Часто Аллергический Аллергическая Не обильные Не основной Возможен *Составлено по Anderson M.R. [68] и Farage M.A. [118] По данным литературы в сочетании эти тесты имеют чувствительность и специфичность 81 и 70% соответственно при БВ, 84 и 85% при ВВК и 85 и 100% при трихомониазе по сравнению с ДНК-тестами определения микроорганизмов [194].

В отечественной рутинной практике основное внимание уделяется микроскопии мазка, рН-тест и аминный тест используются редко, часто врач руководствуется личным субъективным опытом. Для лучшей идентификации заболевания используют окраску мазков по Граму. При анализе мазков учитывают лейкоцитарную реакцию, анализируют особенности эпителия и состав микрофлоры. При наличии воспалительной реакции количество лейкоцитов увеличено (более 10 в поле зрения, более 20 для беременных женщин), эпителий влагалища представлен клетками поверхностного и промежуточного слоев, а при выраженном воспалительном процессе и парабазального слоя [31].

оригинальную классификацию Кира Е. Ф. микроскопической характеристики [18; 19]. В ней отражены 4 типа состояния микробиоценоза влагалища на основе микроскопической картины (табл. 2):

Промежуточный тип микробиоценоза влагалища Для диагностики БВ чаще всего используют критерии Амсела [66]:

• однородные, гомогенные, прозрачные, белые или серые выделения из влагалища;

•вагинальный рН выше 4,5;

• КОН-тест (или аминный тест) – положительный: при добавлении 10процентного раствора гидроксида калия образуются полиамины с характерным рыбным запахом;

• выявление в нативных препаратах мазков из влагалища «ключевых клеток» (эпителиальные клетки с адгезированными на них коккобациллами).

Часто для лучшей идентификации «ключевых клеток» мазки окрашивают по Граму.

Таблица 2. Микроскопическая характеристика биоценоза влагалища (Кира Е.Ф.,1995).

Состояние (тип) биоценоза Доминирование лактобактерий, отсутствие лактобактерий, наличие грамположительных здоровых женщин, редко Промежуточный тип Обнаруживают лейкоциты, моноциты, субъективными жалобами Дисбиоз грамположительная палочковая и кокковая влагалища микрофлора; наличие «ключевых клеток».

(воспалительный тип мазка) При обнаружении: гонококков, трихомонад, Гонорея, трихомоноз, Обычно упоминают о том, что содержание «ключевых клеток» должно быть не менее 20%. Изначально в критериях Амсела процентное соотношение данного показателя не определено. Для положительного результата необходимо наличие хотя бы 3 из четырех критериев.

Однако определение двух из четырех критериев Амсела бывает установлено, рН-тест является наиболее чувствительным (89%), а аминныйтест – наиболее специфичным (93%) [139].

Другим наиболее распространенным критерием БВ является оценка по шкале Нугента (Ньюджента), предложена в 1991 году [233]. В основе лежит система баллов от 0 до 7 и их комбинация для диагностики бактериального вагиноза по оценке трех морфотипов бактерий: А лактобациллы - большие грам-позитивные палочки, B - гарднерелла и бактероиды - мелкие грамвариабельные и грамотрицательные кокки, С Мобилункус - изогнутые грамвариабельные палочки. Мазок из влагалища окрашивают по Граму и считают отдельно количество выявленных морфотипов под иммерсионной системой микроскопа (табл.3).

Таблица 3. Шкала Ньюджента.

Количество полученных баллов суммируют (A+B+C). Количество баллов оценивают следующим образом:

0 - 3 балла : нормальная микрофлора 4 - 6 баллов: промежуточная микрофлора => 7 баллов: бактериальный вагиноз.

Менее известна система оценки БВ по Hays/Ison [146; 161] используется культуральный метод, иммуноферментные методы и ДНКтестирование. Лабораторные тесты дают больше информации для установления инфекционных этиологических факторов заболевания.

стандандартом» диагностики. Помимо видовой идентификации микроорганизмов он дает представление о чувствительности выявленных микроорганизмов к антибиотикам. Внедрение в практику микробиологии протеомной идентификации культивированных микроорганизмов с помощью время-пролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF масс-спектрометрия) расширило возможности диагностики. Масс-спектрометрия обеспечивает высокую производительность, автоматизацию процесса и близкую к 100% специфичность и чувствительность, а также непревзойденную скорость анализа (менее 2 минут на образец), при этом образцом может служить первичная колония. Спектр белков определяется напрямую из бактериальной клетки без предварительной длительной пробоподготовки.

Однако бактериологический метод диагностики не лишен ряда серьезных ограничений. Условно-патогенная микрофлора, являющаяся наиболее частой причиной урогенитальных заболеваний у женщин, представлена, главным образом, анаэробными микроорганизмами.

Подавляющее большинство лечебных учреждений практического здравоохранения в настоящее время не имеют условий для культивирования таких микроорганизмов. К недостаткам культурального метода следует отнести длительные сроки культивирования микроорганизмов (в среднем 5 дней) и необходимость сохранения их жизнеспособности до момента поступления биоматериала в лабораторию [40; 49].

Иммунологические методы исследования направлены на выявление антигенов и антител патогенных микроорганизмов.

Молекулярные методы исследования направлены на выявление ДНК и РНК бактерий, грибов и вирусов. Наибольшее распространение в последние годы получили методы полимеразной цепной реакции и секвенирования микроорганизмов.

Методы секвенирования микроорганизмов включают несколько принципиально разных подходов. Во-первых, используется традиционный метод секвенирования по Сэнгеру. В основе метода лежит процесс ферментативного секвенирования с использованием терминирующих ddNTP.

Специфическая терминация синтеза обеспечивается добавлением в реакционную смесь наряду с dNTP флуоресцентно-меченных 2',3'дидезоксинуклеозид-трифосфатов (ddATP, ddTTP, ddCTP или ddGTP).

ddNTP включается в растущую цепь ДНК без дальнейшего копирования ДНК из-за отсутствия 3'-ОН группы. Отношение концентраций dNTP/ddNTP подобраны так, чтобы в итоге получить набор копий ДНК различной длины [269; 270]. Используемые в реакции праймеры чаще всего специфичны к региону 16SрРНК, т.к. данный регион есть у всех бактерий; содержит как консервативные, так и вариабельные области; кроме того, у большинства бактерий последовательности известны. К ограничениям метода следует микроорганизмов, т.к. для работы нужна колония; идентификация смеси бактерий не возможна.

С разработкой так называемых "методов нового или второго поколения" (Next-Generation Sequencing, NGS) диагностические возможности метода секвенирования расширились. Во-первых, при использовании NGS можно расшифровать все ампликоны 16SрРНК, полученные из клинического образца даже при смешанных инфекциях.

секвенирования микроорганизма с определением факторов патогенности, но при этом микроорганизм должен быть предварительно культивирован для получения достаточного количества материала.

В-третьих, NGS обеспечивает возможность тотального прочтения ДНК всего генетического материала всех микроорганизмов в составе микробиоценозов отдельных локусов: кожа, кишечник, ротовая полость, влагалищные мазки и т.д. (метагеномные исследования). В 2008 году по инициативе Национального института здоровья США с целью определить видовой и количественный состав всей микробиоты здорового человека стартовал масштабный международный проект «Микробиом человека» [300].

В 2012-2013 году были опубликованы первые результаты работы по данному проекту [61; 125; 198].

Классические методы диагностики патогенных микроорганизмов, когда достаточно определить наличие возбудителя (культуральный метод, качественное определение микроорганизмов по ДНК или серодиагностика по АГ и АТ), оказались малоинформативными в диагностике заболеваний, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, т.к. обычно не учитывается количество микроорганизмов. Культуральный метод оказался неинформативным для диагностики БВ. Более того, культуральный метод специфичности [142].

Внедрение в практику ПЦР в режиме реального времени существенно улучшило лабораторную диагностику воспалительных заболеваний, сократив время исследования до 3-6 часов. К другим преимуществам ПЦР в режиме реального времени можно отнести: исключение контаминации ампликонами за счет закрытых систем детекции результатов амплификации, возможность количественной оценки микроорганизмов, определение микроорганизмов и вирусов, которые сложны для культивирования, высокая чувствительность и специфичность метода (от 2 до 10 копий ДНК в амплификационной пробирке). Например, тест-система «Фемофлор 16» (Россия) обеспечивает определение широкого спектра микроорганизмов, в том числе анаэробных бактерий, большая часть из которых сложна для культивирования, дает возможность количественной оценки нормофлоры (лактобактерии) и условно-патогенной микрофлоры в составе общей бактериальной массы [9;

10; 30; 36; 57].

эндометрита Клинико-лабораторная диагностика хронического эндометрита сложна и основана на анализе клинических симптомов и анамнеза, результатах ультразвукового исследования, гистероскопии и морфологического исследования [50; 58; 96; 113].

Эхографические критерии хронического эндометрита впервые разработаны В.Н.Демидовым (1993 г.). Исследование проводят на 5–7-й и 17–21-й день ментруального цикла. Наиболее частыми признаками являются изменение структуры эндометрия, что выражается в возникновении в зоне срединного М-эха участков повышенной эхогенности различной величины и формы. Внутри участков выявляются отдельные зоны неправильной формы и сниженной эхогенности. В полости матки могут определяться пузырьки газа, иногда с характерным акустическим эффектом “хвоста кометы”. В базальном слое эндометрия часто визуализируются четкие гиперэхогенные образования диаметром до 0,1–0,2 см, представляющие собой очаги фиброза, кальциноза.