ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ВОЕННОЕ

ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«ВОЕННО-МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ ИМ. С.М.КИРОВА»

МИНИСТЕРСТВА ОБОРОНЫ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

ЛЕБЕДЕВ Виктор Андреевич

ЦЕНТРАЛЬНЫЕ ЭФФЕКТЫ ПОЛИПРЕНОЛСОДЕРЖАЩИХ

ПРЕПАРАТОВ

14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор медицинских наук профессор П.Д. ШАБАНОВ Санкт-Петербург

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ ……………………………………………………………….. Глава 1. РОЛЬ И ФУНКЦИИ ПОЛИПРЕНОЛОВ В ОРГАНИЗМЕ (АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР) ……………………………………..…… Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ …………….. 2.1. Выбор животных и их содержание …… …………………………… 2.2. Вживление электродов в дофаминергические структуры мозга ….. 2.3. Методы самораздражения мозга у крыс ……………………………. 2.4. Исследование поведения крыс в «открытом поле» ………………… 2.5. Исследование функциональной асимметрии мозга с помощью метода ротации …………………………………………………………… 2.6. Исследование поведения крыс в приподнятом крестообразном лабиринте …………………………………….……….. 2.7. Исследование агрессии в тесте «чужак-резидент» ………………... 2.8. Исследование антидепрессантной активности в тесте Порсолта …. 2.9. Моделирование экспериментального подострого гепатоза ………. 2.10. Биохимическое исследование крови ……………………………… 2.11. Гистологическое исследование печени ……….………………….. 2.12. Биохимическое исследование мозга ………………………………. 2.13. Фармакологические вещества, используемые для анализа двигательных и эмоциональных форм поведения ……………………… 2.14. Статистическая обработка полученных материалов …………….. Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ………. 3.1. Исследование поведенческих эффектов полипренолов …………... 3.1.1. Влияние ропрена на двигательную активность и поведение крыс в «открытом поле» ………………………………………………….. 3.1.2. Влияние полипренолов на двигательную активность и стереотипное (ротационное) поведение крыс …………………………… 3.1.3. Влияние полипренолов на поведение крыс в приподнятом крестообразном лабиринте …………………………………………….… 3.1.4. Влияние полипренолов на показатели агрессии в тесте «чужакрезидент» у крыс …………………………………………………………. 3.1.5. Влияние полипренолов на показатели депрессии в тесте Порсолта у крыс …………………………………………………………… 3.1.6. Влияние полипренолов на систему мозгового подкрепления в тесте самостимуляции латерального гипоталамуса у крыс ………..… 3.1.7. Заключение …………………………………………………………. 3.2. Исследование поведенческих и нейрохимических эффектов полипренолов при подостром гепатозе ………………………………….. 3.2.1. Характеристика экспериментальной модели …………………….. 3.2.2. Влияние полипренолов и адеметионина на выживаемость крыс, подвергнутых воздействию CCl4 …………………….………………….. 3.2.3. Влияние полипренолов и адеметионина на поведение крыс, подвергнутых воздействию CCl4 …………………….………………….. 3.2.4. Влияние полипренолов и адеметионина на биохимические показатели крови крыс, подвергнутых воздействию CCl4 ……….………………….. 3.2.5. Влияние полипренолов и адеметионина на морфологическую картину печени на модели подострого гепатоза, вызванного CCl4 у крыс ……….………………………………………………………... 3.2.6. Влияние полипренолов и адеметионина на обмен моноаминов в структурах мозга крыс, подвергнутых воздействию CCl4 ……….…….. Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ …………… 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………. 6. ВЫВОДЫ………………………………………………………………… 7. НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ …………………… 8. ЛИТЕРАТУРА……………………………………………………………

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

5-гидрокси-3-индолуксусная кислота 5-ГИУК четыреххлористый углерод CCl АЛТ аланинтрансаминаза АСТ аспартаттрансаминаза ГВК гомованилиновая кислота ДОФУК 3,4-диоксифенилуксусная кислота КОМТ катехол-О-метилтрансфераза ЛПНП липопротеиды низкой плотности НА норадреналин СЕР серотонин ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота

ВВЕДЕНИЕ

Современная фармакология требует открытия и изучения новых нейропротекторов и средств защиты печени, в том числе растительного происхождения. К их числу может быть отнесен и ропрен, получаемый из нейтральной части хвои сосны и ели. И хотя ропрен зарегистрирован и позиционирован, прежде всего, как гепатопротектор, у него обнаружены нейропротекторные свойства при ишемии и токсическом поражении головного мозга (Шабанов П.Д, Султанов В.С., 2012).

Ропрен представляет собой смесь полипренолов, природных линейных полимеров, содержащих 8-18 изопреновых единиц, и имеет следующую структурную формулу: СН где n – число изопреновых звеньев от 8 до 18.

Препарат разрешен к практическому перименению (регистрационный номер ЛСР-001521/07), его получают по способу, описанному в патенте RU2238291. Ропрен производства ОАО «Фармацевтическая фабрика», СанктПетербург, рассматривается как концентрат полипренолов (с содержанием суммы полипренолов 95%), он рекомендован в качестве гепатопротекторного средства растительного происхождения (Код АТХ05ВА). Показаниями к применению ропрена являются жировая дистрофия печени различной этиологии, гепатит, цирроз печени (в комплексном лечении), токсические поражения печени (алкогольные, наркотические, лекарственные).

Использование ропрена стимулирует репаративно-регенерационные процессы в печени, восстанавливает нарушенный гомеостаз, выводит токсины, способствует повышению активности антиоксидантной системы организма. Наряду с этим отмечено стимулирующее действие ропрена на уровень неспецифической резистентности организма (нейтрофильного и моноцитарного звена). В ходе лечения больных с патологией печени было установлено, что ропрен обладает еще иммуномодулирующим действием, оказывает нормализующее влияние на измененный статус организма, особенно на клеточное звено иммунитета, о чем свидетельствует повышение активных Тлимфоцитов и индекса Тхелперы/Тсупрессоры. Применение ропрена снижает уровень аллергической напряженности организма, что подтверждается снижением циркулирующих иммунных комплексов и эозинофилов крови (Свидерский В.Л. и др., 2006).

Вместе с тем, ропрен – это высококонцентрированный препарат полипренолов, применяемый как гепатопротектор в достаточно высоких дозах.

Имеются сведения, что малые дозы полипренолов могут проявлять и нейропротекторную активность, особенно при хронических ишемических повреждениях головного мозга (Свидерский В.Л. и др., 2007).

Центральные эффекты ропрена и вообще полипренолов изучены недостаточно. Более того, нет точных сведений о мишенях и интимных механизмах действия полипренолов на центральную нервную систему (ЦНС) и высшие функции мозга. Не изучено влияние полипренолов на нейромедиаторные процессы в клетках головного мозга, по-видимому, во многом определяющих психоактивирующее действие препарата. Все указанное позволило сформулировать цель и задачи настоящей работы.

Целью исследования было изучение поведенческих, антитоксических и нейропротекторных эффектов полипренолов у крыс.

Задачи исследования:

1) Исследовать влияние полипренолов на поведение крыс в тестах «открытое поле», приподнятый крестообразный лабиринт, «чужак-резидент», ротации, вынужденной беспомощности Порсолта, самостимуляции латерального гипоталамуса.

2) Исследовать поведение, состояние системы крови и морфологию печени крыс с экспериментальным гепатозом и токсической энцефалопатией, вызванной подострым введением четыреххлористого углерода.

3) Исследовать нейропротекторные эффекты полипренолов на модели подострого гепатоза и токсической энцефалопатии, вызванной четыреххлористым углеродом у крыс.

4) Исследовать влияние полипренолов на метаболизм моноаминов (дофамина и серотонина) в двигательных и эмоциогенных структурах головного мозга крыс.

Отсутствие четких представлений о системных эффектах полипренолсодержащих препаратов и интимных механизмах их действия позволили автору сосредоточить основное внимание на изучении поведенческого спектра эффектов ропрена и выяснении его нейропротекторных свойств в модели экспериментального токсического поражения головного мозга. Показано, что полипренолы в широком диапазоне доз (2,2-4,3-11,6 мг/кг) обладают умеренными психоактивирующими свойствами, антидепрессантной активностью, способностью изменять подкрепляющие свойства головного мозга. Указанные особенности действия полипренолов на ЦНС связаны, по-видимому, с изменением обмена моноаминов, в частности дофамина, в головном мозге. В действии препарата можно выделить, по крайней мере, два направления:

первое связано с эффектами на эмоциональную сферу (депрессивность, подкрепление), второе – с двигательными эффектами препарата (в основном, нормализация разных видов двигательной активности, сниженной вследствие токсических воздействий на мозг). Традиционно эти виды фармакологической активности связывают с влиянием на нейромедиаторные системы мозга.

Действительно, полипренолы, применяемые в сравнительно низких дозах (2,2-4,3 мг/кг) повышают активность мезолимбической (прилежащее ядро) и нигростриатной (стриатум) дофаминергических систем у крыс с подострым гепатозом и токсической энцефалопатией. Этот эффект не связан с гепатопротекторными свойствами полипренолов. Данное положение подтверждается фактом, что гепатопротектор адеметионин (гептрал) таким действием не обладает. Сказанное позволяет отнести полипренолы к перспективным современным средствам с выраженным центральным психоактивирующим действием и способностью защищать печень и другие внутренние органы от действия токсикантов типа четыреххлористого углерода.

Теоретическая и практическая значимость В результате проведенных исследований получены новые данные о системных нейропротекторных, гепатопротекторных, антитоксических и эмоциогенных свойствах полипренолсодержащих препаратов, в частности, малых доз ропрена. В модельных опытах на крысах, у которых воспроизводили подострый гепатоз введением четыреххлористого углерода доказано, что полипренолы в дозах 2,2-4,3-11,6 мг/кг оказывает нормализующее действие на двигательную и исследовательскую активность, а также эмоциональность крыс, нарушенную CCl4. Препарат сравнения адеметионин (гептрал 300 мг/кг такого действия не оказывает). Полипренолы проявляют умеренное антиагрессивное действие, превышающее таковое для адеметионина, включая высокую степень защиты (защитного поведения) у экспериментальных животных. Полипренолы нормализуют показатели крови, нарушенные введением CCl4. Гепатопротекторное действие полипренолов заключается в нормализации морфологического повреждения печени при экспериментальном гепатозе (белковой и жировой дистрофии), вызванном CCl4. Максимальный гепатопротекторный эффект регистрируется при введении ропрена в дозе 11,6 мг/кг и гептрала в дозе 300 мг/кг (данные сопоставимы статистически). В противоположность адеметионину полипренолы в дозах 2,2-4,3-11, мг/кг оказывают умеренное психоактивирующее действие, в основе которого лежит их влияние на активность дофаминергических систем головного мозга:

у крыс с подострым гепатозом и токсической энцефалопатией полипренолы повышают активность мезолимбической (прилежащее ядро) и нигростриатной (стриатум) дофаминергических систем, тогда как адеметионин таким действием не обладает. В целом продемонстрирована фармакологическая близость гепатопротекторных эффектов полипренолов (особенно в дозе 11, мг/кг) и адеметионина, но принципиальное отличие в их центральных эффектах. Изучение этих и родственных с ними вопросов во многом может приблизить нас к пониманию механизмов действия полипренолсодержащих препаратов и к разработке конкретных рекомендаций по их использованию в неврологической практике.

Методология исследования состояла в изучении у крыс поведенческих эффектов полипренолов растительного происхождения в разных дозах (2,2мг/кг), оцененных в батарее тестов («открытое поле», приподнятый крестообразный лабиринт, ротационный тест, «чужак-резидент», тест Порсолта, самостимуляция латерального гипоталамуса), моделировании подострого гепатоза с энцефалопатией введением CCl4 с последующей оценкой гепато- и нейропротекторных эффектов полипренолов в сравнении с адеметионином на основании поведенческих тестов, биохимии крови, морфологических изменений в печени и нарушенеий обмена моноаминов (дофамина и серотонина) в головном мозге. Исследования выполнены с соблюдением всех правил доказательной медицины.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Полипренолы в дозах 4,3-8,6-13,4 мг/кг при их курсовом введении (5-7 дней) умеренно активируют двигательную активность, проявляют анксиогенное действие, подавляют индивидуальное поведение и оказывают двухфазный эффект (подавление-активация) на поведение самостимуляции в камере Скиннера у интактных крыс.

2. В модели экспериментального подострого гепатоза с энцефалопатией, вызванного четыреххлористым углеродом, полипренолы в дозах 2,2-4,3мг/кг нормализуют двигательную и исследовательскую активность, а также эмоциональность крыс, проявляют умеренное антиагрессивное действие, при этом препарат сравнения адеметионин 300 мг/кг такого действия не оказывает.

3. Полипренолы в дозах 2,2-4,3-11,6 мг/кг, так же как и препарат сравнения адеметионин, нормализуют показатели крови, нарушенные введением CCl4, и восстанавливают нормальную морфологическую структуру печени при токсическом подостром гепатозе (антитоксическое действие). Эффекты полипренолов 11,6 мг/кг и адеметионина 300 мг/кг приблизительно равны.

4. Полипренолы в дозах 2,2-4,3-11,6 мг/кг оказывает центральное психоактивирующее действие, в основе которого лежит его влияние на активность дофаминергических систем головного мозга. Это выявляется в модели подострого гепатоза с токсической энцефалопатией, когда полипренолы повышают активность мезолимбической (прилежащее ядро) и нигростриатной (стриатум) дофаминергических систем. Адеметионин таким действием не обладает.

Степень достоверности и апробация материалов исследования Степень достоверности определяется большим количеством экспериментальных животных (306 крыс), рандомизацией и формированием групп сравнения и активного контроля, адекватными поведенческими, токсикологическими, морфологическими, биохимическими и фармакологическими методами исследования, длительными сроками наблюдения и корректными методами статистической обработки.

Материалы исследования используются в лекционном курсе кафедры фармакологии Военно-медицинской академии имени С.М.Кирова, кафедры терапии, нервных болезней и психиатрии Института медицинского образования Новгородского государственного университета им. Ярослава Мудрого.

Работа выполнена в соответствии с плановыми научно-исследовательскими разработками Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова. Материал диссертации вошел в грантовые разработки Российского фонда фундаментальных исследований РАН (РФФИ №10-04-00473).

Материалы, вошедшие в диссертацию, доложены на научной конференции Российской ассоциации психонейроэндокринологии (СанктПетербург, 2010), международных конференциях «Актуальные проблемы химии природных соединений» (Ташкент, 2010) и «Новые технологии в медицине и экспериментальной биологии» (Рио-де-Жанейро, 2011), 4-ом съезде фармакологов России (Казань, 2012). По теме диссертации опубликованы 3 статьи (все в журналах, рекомендованных ВАК РФ) и тезиса. Апробация диссертации прошла на совместном заседании кафедр фармакологии и НИО обитаемости НИЦ Военно-медицинской академии им.

С.М.Кирова.

Личный вклад автора осуществлялся на всех этапах работы и состоял в планировании экспериментов, их непосредственном выполнении, обработке полученных результатов, обсуждении результатов, написании статей и тезисов, написании диссертации и автореферета. Участие автора в выполнении, сборе и анализе – 95%, статистической обработке – 100%, в написании статей и тезисов – 90%, написании диссертации и автореферата – 95%.

Диссертация состоит из введения, главы обзора литературы, материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований (включающей 2 раздела), обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, иллюстрирована 32 рисунками и таблицами. Библиографический указатель содержит 158 наименований, в том числе 62 отечественных и 96 иностранных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. РОЛЬ И ФУНКЦИИ ПОЛИПРЕНОЛОВ В ОРГАНИЗМЕ Синтез таких известных антиоксидантов как витамины А, Е, каротиноиды, убихиноны идет через образование и использование изопреновых звеньев. Главным структурным звеном этих соединений является изопрен С5Н8. Изопреноидный путь обмена осуществляется через ацетилкоэнзим А, мевалонаткиназу, полипренолы (долихолы), сквален и далее может приводить к образованию циклических производных – холестерина, стероидов, гормонов, либо к длинноцепочечным линейным полиенам – каротина, каротиноидов, витамина А, либо к построению таких хиноновых соединений, как витамин К2 и убихинон. Участвуя в изопреноидном пути обмена, полипренолы, как транспортные липидсодержащие молекулы, обладают разносторонней биологической активностью. Изопрениловые молекулы убихинона и менахинона являются наиболее важными, так как они являются дыхательными коферментами в системах переноса электронов, как у растений, так и у животных.

Полипренолы, или как их еще называют полиизопреноиды, представляют собой большую группу соединений – линейных 1,5-полиенов с различной конфигурацией тризамещенных связей СС с -изопреновым звеном.

Биологически они являются высоко функционально активными веществами.

Полипренолы относятся к соединениям с общей структурной формулой (рис. 1) Н(С5Н8)n ОН, где n=5-24.

Большинство изопреновых остатков имеют цис-замещенную двойную связь, и только 2 или 3 в -конце цепи представлены транс-конфигурациеей, возрастающей до ди(транс) или три(транс)поли(цис)преноидных алкоголей.

В этом отношении они отличаются от полипренолов, таких как соланенол, которые являются предшественниками боковой цепи пластохинонов, убихинонов и менахинонов. Некоторые поли(цис)преноидные алкоголи содержат один или, по крайней мере, небольшое число насыщенных изопреновых остатков. Долихолы (от греч. – длинный) имеют насыщенный остаток, то есть являются 2,3-дигидрополи(цис)изопреноидными алкоголями.

Они представляют собой очень гидрофобные длинные молекулы с n в верхней части ряда, как правило, от 18 до 24.

СН3 – С =СН – СН2 – (СН2-С =СН – СН2–)n-2 – СН2 – С = СН – СН2 –ОН Рис 1. Общая структура полиизопреноидных спиртов (полипренолов).

Термин поли(цис)изопреноидные алкоголи часто сокращается до поли(цис)пренолов или полипренолов в зависимости от контекста. Само содержание полипренолов в ткани не всегда отражает концентрацию соединения в его функциональной форме, которой является монофосфат. Поэтому часто необходимо измерять фосфатазную активность или скорость метаболизма свободных полипренолов, чтобы более точно оценить их функциональную активность.

Полипренолы относятся к природным биорегуляторам (физиологически активны), для которых установлены коферментные функции мембраноактивных участников транспорта гидрофильных частиц в процессе биосинтеза полисахаридов, гликопротеидов, пептидогликанов и углеводсодержащих биополимеров.

Все бактерии содержат ди(транс)поли(цис)пренолы с 10-12 изопреновыми остатками. Их главный компонент ундекапренол иногда называют бактопренолом. В организме бактерий он присутствует, как правило, в форме фосфоундекапренола или его гликозилированных производных. В частности, такие структуры присутствуют в золотистом стафилококке, Staphylococcus aureus, а также в лактобактериях, Lactobacilli. В Staphylococcus aureus, находящегося в стационарной фазе, свыше 90% ундекапренола (0,03 моль/г клеток) неэстерифицировано (Hemming F.W., 1985).

Зеленые листья высших растений содержат три(транс)поли(цис)пренолы, в которых n колеблется в пределах 10-13 изопреновых остатков, обычно большинство компонентов в смеси составляют 11-12 остатков. Например, в работах, выполненных на листьях фикуса, Ficus elastica, большинство полипренолов было представлено фикапренолом-11 и фикапренолом-12. Концентрация этих спиртов в листьях обычно возрастает по мере старения листьев.

Иглы сосны разных видов накапливают три(транс)поли(цис)пренолы с колебаниями изопреновых остатков от 13 до 21, которые представлены главным образом ациловыми эфирами. Нефотосинтезирующие ткани высших растений иногда содержат мало отличающиеся поли(цис)пренолы с малым числом изопреновых единиц (6-9), обычно в форме эфиров жирных кислот. Например, в древесной ткани серебристой березы, Betula verricosa, содержатся бетулапренолы-6-9 (Hemming F.W., 1985).

Большинство эукариотических клеток содержат 2,3дигидрополи(цис)пренолы, которые называют долихолами. Почти все они включают 2 транс-остатка в -конце цепи. Суммарные данные по распределению долихолов в организме позвоночных представлены в табл. 1. Видно, что наиболее изучено распределение долихолов в организме человека и крысы. Концентрация долихолов резко колеблется в зависимости от органа или ткани. У человека содержание долихолов в тканях в 10-50 раз превышает таковое в организме крысы. Из тканей человека, наиболее богатых долихолами, необходимо выделить гонады (яички), гипофиз и надпочечники, то есть именно те органы, которые осуществляют гормональный контроль функциями. В организме крысы концентрация долихолов наиболее высока в селезенке, поджелудочной железе и печени. Если в человеческом организме содержание долихолов колеблется весьма выражено, то у крысы оно мало отличается от органа к органу. Достаточно высокие концентрации долихолов обнаружены в клетках печени свиньи, причем неэстерифицированные долихолы локализованы главным образом в митохондриях, а эстерифицированные с жирными кислотами – в грубой ядерной фракции.

Радиоактивный [3H]долихол, введенный крысам внутривенно, обнаруживается главным образом в печени, на митохондриальной внешней мембране, в меньших количествах – в легких, желудочно-кишечном тракте и селезенке. При введении крысам радиоактивного долихола, смешанного с подсолнечным маслом, сыворотка крови и печень содержали по одной третьей части общей радиоактивности каждая, менее всего – в легких и селезенке.

При внутрижелудочковом введении содержание долихола в различных отделах мозга крыс снижалось в ряду: мозжечок > средний мозг > серое вещество > ствол мозга > белое вещество.

Распределение долихолов в организме животных и человека Поджелудочная железа Поджелудочная железа