Федеральное государственное бюджетное учреждение Научноисследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского

Министерства здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

Сергеев Олег Витальевич

РАЗРАБОТКА И ИСПЫТАНИЕ ЖИВОЙ СУХОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ

ЭПИЗООТИЧЕСКОЙ ДИАРЕИ СВИНЕЙ (ВАКЦИНА ВЕРРЕС-ЭДС)

В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ И ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ

06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание учёной степени доктора биологических наук

Научный консультант доктор биологических наук, профессор Алипер Тарас Иванович Москва

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: ЭПИЗООТИЧЕСКАЯ ДИАРЕЯ

СВИНЕЙ

1.1. Общая характеристика и распространённость…………………………… 1.2. Этиология…………………………………………………………………… 1.2.1. Вирусные гастроэнтериты свиней…………………………………... 1.2.2. Систематика вируса ЭДС …………………………………………... 1.2.3. Структура вириона…………………………………………………... 1.2.4. Физико-химические свойства………………………………………. 1.2.5. Структурные белки………………………………………………….. 1.2.6. Неструктурный белок ORF3………………………………………… 1.2.7. Структура генома……………………………………………………. 1.2.8. Антигенное родство………………………………………………… 1. 3. Культивирование…………………………………………………………. 1.4. Эпизоотологические данные……………………………………………... 1.5. Патогенез…………………………………………………………………... 1.6. Клинические признаки……………………………………………………. 1.7. Диагностика……………………………………………………………….. 1.8. Предупреждение и контроль……………………………………………... 1.8.1. Общие меры…………………………………………………………. 1.8.2. Специфическая иммунопрофилактика…………………………….. 1.9. Заключение по обзору литературы………………………………………. 1.10. Цель и задачи исследования……………………………………………..

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы………………………………………………………. 2.2. Результаты исследований 2.2.1. Культуральные свойства и aттeнуация полевого изолята вируса ЭДС с целью получения вакцинного штамма……………... 2.2.1.1. Серийное пассирование вируса в культуре клеток Vero и оценка его аттенуации……………..…………………..…… 2.2.1.2. Антигенность штамма ИС в зависимости от длительности аттенуации вируса ………………….............. 2.2.1.3. Изменения в геноме штамма ИС вируса ЭДС как результат адаптации к культуре клеток Vero……………………………... 2.2.2. Оптимизация условий массового культивирования вируса...…….. 2.2.2.1. Состояние культуры клеток……………………………………. 2.2.2.2. Зависимость накопления вируса от дозы заражения……….… 2.2.2.3. Культивирование вируса ЭДС в роллерных и статических условиях……………………………………..… 2.2.2.4. Размножение штамма ИС в других линях клеток и в сублиниях клеток Vero…………………………………..... 2.2.3. Разработка технологии изготовления и контроля живой сухой вакцины в экспериментальных условиях ………….…….. 2.2.3.1. Изготовление сухой вакцины……….……………………......... 2.2.3.2. Контроль вакцины на безопасность и реактогенность………. 2.2.4. Разработка способа применения живой вакцины против ЭДС..…. 2.2.4.1. Способ введения вакцины….………………………………….. 2.2.4.2. Антигенность штамма ИС в зависимости от прививочной дозы…………………………………………. 2.2.4.3. Антигенность штамма ИС в зависимости от кратности введения и дозы вакцины……………………... 2.2.4.4. Применение экспериментальной серии сухой вакцины в неблагополучном по ЭДС хозяйстве………………………. 2.2.5. Изготовление и применение живой сухой вакцины ИС-ЭДС в хозяйствах, неблагополучных по ЭДС..………………..…….… 2.2.5.1. Изготовление и контроль живой сухой вакцины в производственных условиях………………………………… 2.2.5.2. Распространение ЭДС в крупных свиноводческих хозяйствах России.…………………………………………..… 2.2.5.3. Вакцинопрофилактика ЭДС в производственных условиях…. 2.2.5.4. Сравнительная эффективность двух вариантов живой вакцины против ЭДС……..………….……….……..…. 2.2.6. Одновременная и последовательная вакцинация свиней против ЭДС и ТГС………………………………………….…... 2.2.6.1. Антигенность моновалентных живых вакцин……………..…. 2.2.6.2. Антигенность бивалентной живой вакцины (ЭДС+ТГС)…… 2.2.6.3. Одновременное введение вакцин ИС-ЭДС и ТР-1…………... 2.2.6.4. Последовательная вакцинация супоросных свиноматок против ТГС и ЭДС……………………………………………. 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ………. 4. ВЫВОДЫ И ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ………… 5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………... 6. ПРИЛОЖЕНИЯ………………………………………….……………..

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И РАСПРОСТРАНЁННОСТЬ

Эпизоотическая диарея свиней (ЭДС) является высококонтагиозным вирусным заболеванием свиней, характеризующимся изнурительной диареей и дегидратацией организма. Заболеванию подвержены свиньи всех возрастов, но наиболее восприимчивыми являются новорождённые поросята до двухнедельного возраста, смертность среди которых колеблется в пределах 30 - 100%. ЭДС по клиническим признакам очень сходна с трансмиссивным гастроэнтеритом свиней (ТГС). Главными отличиями ЭДС являются отсутствие рвоты и более низкая смертность новорождённых поросят, более тяжёлое течение болезни у свиней в период откорма, а также более медленное распространение.

ЭДС впервые была обнаружена в Англии в 1971 г. среди свиней в период откорма [116]. Заболевание проявлялось спорадическими вспышками энтерита в зимнее время. Основной характеристикой болезни была водянистая диарея. Данное заболевание было названо «эпизоотическая диарея типа 1». В 1976 г. наблюдали острую диарею среди свиней всех возрастов, включая подсосных поросят. Это заболевание по клиническим проявлениям напоминало ТГС и было названо «эпизоотическая диарея типа 2» Этиологическим агентом обоих типов диареи являлся [178, 179].

коронавирус, впервые выделенный и названный «вирус эпизоотической диареи свиней» в 1978 г. [106].

В течение 1980-х и 1990-х гг. ЭДС была широко распространена в странах Европы: Англии, Бельгии, Германии, Франции, Нидерландах, и Швейцарии, была зарегистрирована в Японии. В период 1995 – 2011 гг. ЭДС была зарегистрирована в Южной Корее, Китае и Таиланде. В 2013 г.

заболевание было выявлено в США [39, 158].

Таблица 1. Первичные вспышки ЭДС в различных странах публикации Япония Вспышка острой диареи у почти 2500 свиней Венгрия На 19 фермах обнаружена диарея у поросят Данные об основных первичных вспышках ЭДС в различных странах приведены в таблице 1. В России ЭДС впервые обнаружена в крупных свиноводческих хозяйствах в 2006 г. (НПО НАРВАК).

В Европе вспышки ЭДС регистрировали реже, чем в Азии. В странах Азии массовые вспышки ЭДС сопровождаются высокой смертностью новорождённых поросят, которая в среднем составляет 50%, но в отдельных случаях достигает 100%. По массовости, остроте и тяжести их нельзя клинически отличить от острых вспышек ТГС. Различные особенности возникновения и течения ЭДС отмечали в разных странах. Например, в Нидерландах заболевание остро протекало у откормочных свиней и супоросных свиноматок, хотя проявлялось в лёгкой форме или даже при отсутствии клинических признаков у подсосных поросят и поросят вскоре после отъёма. В Англии ЭДС клинически проявлялась у свиней в возрасте 8недель [178, 179]. В Венгрии наиболее существенный ущерб заболевание причиняло в послеотъёмный период [111]. В Японии вспышки ЭДС сопровождались высокой смертностью поросят-сосунов (30-100%), тогда как взрослые животные имели лишь незначительные признаки болезни [160, 164]. В Южной Корее заболеваемость поросят до 10-дневного возраста достигала 90% [33]. В Азии в целом ситуация по ЭДС характеризуется выраженной стационарностью, связанной с персистенцией вируса ЭДС в популяциях частично иммунных свиноматок.

Патологию желудочно-кишечного тракта свиней вызывают вирусы пяти семейств: Coronaviridae, Reoviridae, Caliciviridae, Astroviridae и Adenoviridae. Однако, несмотря на это многообразие, ведущая роль в этиологии массовых острых гастроэнтеритов свиней и особенно поросят в неонатальный период развития принадлежит коронавирусам. По экономическому ущербу, причиняемому промышленному свиноводству, особое значение имеют коронавирусные гастроэнтериты: трансмиссивный гастроэнтерит свиней (ТГС) и эпизоотическая диарея свиней (ЭДС) [3, 10, 11, 19]. ТГС и ЭДС – два массовых вирусных диарейных заболевания свиней, очень сходные по характеру течения, клиническим проявлениям, патологоанатомической картине и патоморфологическим изменениям. Много общего имеет их эпизоотология. Фактически ТГС и ЭДС – заболеваниядвойники, вызываемые двумя кишечными коронавирусами свиней, не имеющими антигенного родства. Оба заболевания характеризуются высокой заболеваемостью и смертностью новорожденных поросят. Поскольку поросята заболевают и гибнут в первые дни жизни, возможность их активной иммунизации исключается.

Вирус ТГС является более патогенным по сравнению с вирусом ЭДС.

Он вызывает гибель 80-100% поросят до 10-дневного возраста. Более выраженная патогенность вируса ТГС обусловлена более масштабным разрушением энтероцитов от основания до вершины ворсинок тонкого кишечника (рис. 1А). Инфицированные энтероциты разрушаются и слущиваются в просвет кишечника, ворсинки быстро атрофируются. В первые сутки после заражения резко нарушается пищеварение и всасывание и развивается диарея, следствием которой является тяжелая дегидратация.

Потеря воды с фекалиями у поросят в первые дни после рождения достигает 150 мл в сутки. У поросят 3-недельного возраста энтероциты поражаются только в отдельных участках тощей и подвздошной кишок [10].

Вирус ЭДС размножается в энтероцитах нижней части ворсинок и крипт (рис. 1 Б). По-видимому, по этой причине вирус ЭДС вызывает менее интенсивную диарею и меньшую смертность по сравнению с вирусом ТГС, но по той же причине может длительно персистировать в кишечнике животных [122, 126].

Возбудителем ЭДС является РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Соronaviridае (порядок Nidovirales). На основе антигенных и генетических критериев вирус ЭДС вместе с коронавирусами человека NL и 229 Е и несколькими коронавирусами летучих мышей принадлежат роду Alphacоronavirus (до недавнего времени антигенная группа 1) [67, 142]. В данный род также входит недавно установленный вид альфакоронавирус 1, который включает вирусы, недавно считавшиеся самостоятельными видами:

вирус ТГС, коронавирус собак, коронавирусы кошек типов I, II и вирус инфекционного перитонита кошек [49].

Вирионы вируса ЭДС обладают всеми характеристиками семейства Соronaviridае [35, 124]. Они представляют собой плеоморфные частицы диаметром 95-190 (в среднем 130) нм (Рис. 2 А). Они состоят из нуклеокапсида спиральной симметрии и липопротеидной оболочки, на поверхности которой имеются характерные радиальные булавовидные пепломеры (выступы) длиной 18-23 нм, формирующие «корону» [55, 160].

Плавучая плотность вирионов вируса ЭДС в градиенте сахарозы равна 1,18 г/см3.

инфекционность при >600С в течение 30 мин, но сохраняет стабильность при 500С. При 40С вирус стабилен при рН 4,0 - 9,0, при 370С он стабилен при рН 6,5-7,5 [28, 98].

Вирус ЭДС является чувствительным к эфиру, хлороформу и другим жирорастворителям, детергентам и ультрафиолетовым лучам, быстро инактивируется формалином (0,03%).

липопротеидной оболочки вирионов входят поверхностный (пепломерный) гликопротеин М и негликозилированный белок оболочки Е. С вирусной РНК ассоциирован негликозилированный белок N, вместе они формируют спиральный нуклеокапсид (рис. 2 Б) [110, 131].

Белок S является гликопротеином типа I. Он состоит из аминокислотных остатков (штамм CV777) и имеет молекулярную массу 150кД (различных штаммах вируса). Гликопротеин S отвечает за адсорбцию вирионов на энтероцитах кишечника посредством связывания вириона с клеточными рецепторами и за слияние липопротеидной оболочки вируса с плазматической мембраной клетки [51, 135, 162]. Для вируса ЭДС выявлена связь между белком S, адаптацией вируса к размножению в культуре клеток и вирулентностью [118, 144]. Гликопротеин S также обусловливает гемагглютинирующей активностью не обладает [28]. Гликопротеин S индуцирует синтез вируснейтрализующих антител (ВНА), в его составе идентифицированы четыре вируснейтрализующих эпитопа [34, 42, 65, 78, 161].

Белок М (20-30 кД) является наиболее многокопийным компонентом вирионной оболочки. Он представляет собой структурный мембранный гликопротеин, трижды пронизывающий мембрану, с коротким N-концевым доменом на поверхности вириона и долгим С-концевым доменом внутри [79, 168]. Показано, что гликопротеин М играет важную роль в процессе сборки вирионов [113, 134], в чём не исключено также участие белка Е (7 кД) [22].

Гликопротеин М индуцирует синтез антител, способных нейтрализовать вирус в присутствии комплемента [135], и, возможно, альфа интерферона [97].

Белок N (57-58 кД) представляет собой щелочной фосфопротеин, ассоциированный с вирусным геномом [23, 43, 58, 110]. Предполагается его роль в индукции клеточно-опосредованного иммунитета [135].

вспомогательные белки, функции которых известны мало [43, 145, 183, 184].

Единственным вспомогательным белком (и геном) вируса ЭДС является ORF3, который, как показано, формирует ионные каналы в мембранах инфицированных клеток-хозяев [173], что может быть одним из механизмов регуляции продукции вируса. В ходе адаптации и размножения вируса ЭДС в перевиваемой культуре клеток ген ORF3 мутирует, что коррелирует с аттенуацией вируса для новорождённых поросят [40, 119, 152]. Аналогичным образом в ходе адаптации к культуре клеток изменяются последовательности гомологичного гена вируса ТГС [108, 111, 168] и других коронавирусов [50, 52, 70, 71, 102].

вирулентности вируса ЭДС (a также других коронавирусов) лежат изменения в генах гликопротеинов S и М [36, 118, 135, 140, 141, 144].

Геном вируса ЭДС представлен единой односпиральной линейной инфекционной (позитивной) РНК длиной 28033 нуклеотидов (штамм CV777) [26, 67, 89, 169]. На 5’- конце РНК имеются лидирующая последовательность (около 90 нуклеотидов) и нетранслируемый участок (5’-UTR, примерно нуклеотидов). На 3’-конце имеются нетранслируемый участок (3’-UTR, считывания, которые кодируют структурные и неструктурные белки. Гены, кодирующие структурные белки (S, Е, М и N) расположены в 3’-концевой части РНК и составляют примерно 30% генома. Гены, кодирующие неструктурные белки, находятся в 5’-концевой половине РНК (гены полимеразы (репликазы) 1a и 1b), а также между структурными генами S генома (рис. 3) [23, 26, 27, 54, 58, 89, 112, 157].

В клетках, инфицированных вирусом ЭДС, обнаружены шесть видов соответствует по длине вирионной РНК, а остальные виды являются последовательность на 5’-конце и идентичные последовательности информационной РНК (иРНК) и обеспечивает синтез одного белка, размер которого соответствует кодирующему потенциалу 5'-концевой последовательности, отсутствующей в более короткой субгеномной иРНК.

Субгеномные иРНК 2, 4, 5 и 6 кодируют соответственно структурные белки S, Е, М и N, иРНК 3 кодирует белок ORF3, полноразмерная иРНК 1 кодирует вирусную полимеразу (Рис. 3) [89, 110, 112].

Все штаммы вируса ЭДС, выделенные в различных странах мира, практически идентичны по антигенной структуре и представляют один серотип вируса. Сравнение нуклеотидных последовательностей генов N и S и аминокислотных последовательностей их продуктов у прототипного штамма CV777 и корейского штамма Chinju99, а также нескольких корейских и японских изолятов обнаружило высокую (96,7%) гомологию [91, 93, 99, 182].

новорожденных поросят кишечным материалом от больных поросят [46].

Адаптация вируса к размножению в культуре клеток оказалась трудной задачей. Многие типы клеток были безуспешно использованы для культивирования вируса ЭДС. Невозможность накопления вируса ЭДС в специфической профилактики заболевания. Впоследствии было найдено, что культура клеток Vero (почка зелёной мартышки) поддерживает серийное размножение вируса ЭДС. В культуре клеток Vero вирус был выделен из тонкого кишечника как естественно больных, так и экспериментально инфицированных поросят. Полевые изоляты вируса проходили свыше серийных пассажей в клетках Vero. Поддерживающая среда в период размножения вируса содержала трипсин в концентрации 1-2 мкг/мл.

Размножение вируса сопровождается выраженным цитопатическим формировании синцития (симпласты), содержащие до 100 ядер (Рис. 6). Титр вируса достигал пика (около 105,5 БОЕ / мл) через 15 часов после инокуляции 98]. При выделении вируса из фекалий больных поросят [72, 73, требовалось провести несколько «слепых» пассажей перед появлением ЦПЭ в клетках Vero [92, 94, 98, 148, 152].

При серийном пассировании вирус (105,0 ТЦД50/мл) вносили в культуру клеток через 48 часов после посева клеток, когда монослой ещё полностью не сформировался. После развития выраженного ЦПЭ, вирус выделяли из клеток путём повторного замораживания-оттаивания [72, 81].

Инфекционная активность изолята KPEDV-9 на 90 пассаже достигла титра 106,5 ТЦД50/мл [94], a изолят DR13 на 55 пассаже достиг уровня активности 106,0 ТЦД50/мл и до 100 пассажа накапливался в пределах 106,5 – 107, ТЦД50/мл [152].

Важным достижением в области культивирования вируса ЭДС явилось то, что некоторые штаммы вируса ЭДС, адаптированные к клетакм Vero, успешно размножались в культурах клеток как свиного, так и несвиного происхождения: МА 104, CPK и ESK [92]. В линиях клеток свиньи KSEK-6 и IB-RS2 штамм P-5V серийно размножался даже без добавления трипсина [81], хотя роль трипсина в повышении уровня репродукции вируса ЭДС была показана экспериментально [41].

Имеются сведения о выделении вируса ЭДС в культурах клеток мочевого пузыря и почки свиньи, выращенных в плашках, покрытых коллагеном. Присутствие трипсина в поддерживающей среде было необходимо [148].

Один штамм вируса ЭДС, МК, адаптированный к росту в культуре клеток Vero [92], оказался способным реплицироваться в нейронах новорождённых мышей после интрацеребрального заражения [150] и после Продуктивность МК-р10 по сравнению с таковой исходного штамма МК возросла [90].

Установлено, что серийное пассирование полевых вирулентных штаммов вируса ЭДС в культуре клеток приводит к потере вирулентности и получению антигенно активных аттенуированных штаммов (глава 1.2.6).

Случаи реверсии патогенности при пассировании аттенуированных штаммов на поросятах неизвестны.

энзоотической (хронической) формах.

Эпизоотическая форма ЭДС наблюдается при заносе вируса в хозяйство, где все или большинство животных чувствительны к нему.

Заболевание характеризуется внезапно появляющейся диареей у животных всех возрастов и гибелью 30 - 100% поросят до 2-недельного возраста.

Обычно вспышка болезни в хозяйстве продолжается 3-4 недели и затем прекращается после формирования иммунитета примерно у 80% животных. Эпизоотическую форму ТГС чаще регистрируют в холодное время года. Эта форма болезни нередко переходит в энзоотическую форму [10, 139].

свиноводческих хозяйствах, и она связана с персистенцией вируса и наличием чувствительных к вирусу поросят при непрерывных опоросах.

Латентное инфицирование свиней вирусом ЭДС регистрируют чаще, чем вирусом ТГС. Персистенция вируса ЭДС в организме свиней обусловлена, по-видимому, тем, что он поражает энтероциты крипт тонкого кишечника.

Это явление также обусловливает более частый переход острой инфекции в хроническую при ЭДС по сравнению с ТГС (глава 1.2.1).

При хроническом течении ЭДС аналогично ТГС условия содержания, кормления и различные стрессовые воздействия оказывают значительное влияние на тяжесть болезни. При пониженной температуре внешней среды заболевание протекает тяжелее и более длительно [10, 106].

Патогенез при ЭДС изучали на безмолозивных поросятах. 3-дневные поросята, заражённые орально изолятом СV777, заболевали через 22- эпителиальных клеток ворсинок всего тонкого кишечника (тощей и подвздошной кишок), а также ободочной кишки, что было показано иммунофлуоресценцией и электронной микроскопией. Признаки инфицирования эпителиальных клеток обнаруживают уже через 12-18 часов после заражения поросят, максимум развития цитопатологии наступает через 24-36 часов. Репликация вируса в тонком кишечнике приводит к разрушению энтероцитов и укорочению ворсинок. Отношение высоты ворсинок к глубине крипт уменьшается до 3:1 по сравнению с нормой 7:1. Дегенерацию инфицированных эпителиальных клеток ободочной кишки не наблюдали.

Патогенетические изменения в тонком кишечнике поросят при ЭДС подобны таковым при ТГС. Однако, так как репликация вируса и развитие инфекционного процесса при ЭДС протекают медленнее, инкубационный период при ЭДС длится дольше [125].

Репликация вируса ЭДС у поросят обнаружена только в клетках кишечного тракта. Shibata et al. [148] показали, что безмикрофлорные свиньи-гнотобиоты, инокулированные полевым вирусом ЭДС в возрасте от дней до 12 недель, вырабатывали иммунитет, напряжённость которого зависела от возраста, а погибали только 2-7-дневные поросята.

Патогенез ЭДС у взрослых свиней детально не изучен, но с помощью иммунофлуоресценции в эпителиальных клетках ворсинок тощей, подвздошной и ободочной кишок у откормочных свиней выявляли вирусный антиген как после экспериментальной, так и после естественной инфекции [46]. Неясно, насколько инфекция ободочной кишки усиливает клинические признаки болезни. Неясно также, какой патогенный механизм обусловливает внезапную смерть с острым некрозом мышц спины, наблюдаемую иногда у взрослых свиней и свиней в период доращивания [125].

Особенности патогенеза ЭДС, описанные в Корее и Японии, идентичны тем, которые наблюдали в Европе, за исключением того, что репликация азиатских штаммов вируса в ободочной кишке не обнаружена и не было случаев внезапной смерти откормочных животных [76, 87, 160].

Как у экспериментально, так и у естественно инфицированных поросят наблюдаются сходные патологоанатомические изменения [56, 57, 76, 126, 160] (рис. 4). Повреждается только тонкий кишечник, стенки которого обволакиваются жидкостью жёлтого цвета. Вакуолизация и слущивание энтероцитов ворсинок тонкого кишечника начинаются через часа после инокуляции и совпадает с началом диареи. Начиная с этого момента, ворсинки быстро укорачиваются и энзиматическая активность кишечника резко снижается. Данные наблюдения были подтверждены сканирующей электронной микроскопией [55]. Эта патология очень сходная с патологией при ТГС. Гистопатологические изменения в ободочной кишке не наблюдают.

Ультраструктурные изменения наблюдают сначала в цитоплазме энтероцитов, в которых органеллы уменьшаются, образуя электроннопрозрачные пятна. Позже микроворсинки и терминальная мембрана исчезают, а цитоплазма частично вытекает в просвет кишечника. Клетки становятся плоскими, теряют тесное соединение друг с другом и высвобождаются в просвет кишечника. Видно формирование вируса внутри клеток путём почкования через мембраны эндоплазматического ретикулума [55, 75, 126]. В ободочной кишке наблюдают незначительные изменения в энтероцитах, содержащих вирусные частицы, но не подвергающиеся слущиванию.

Инкубационный период ЭДС составляет приблизительно 48 часов, клинические признаки заболевания проявляются в течение 7-14 дней.

Главным и часто единственным видимым клиническим признаком ЭДС является водянистая диарея. Вспышки в восприимчивых репродукторных стадах могут значительно варьировать по заболеваемости, длительности и летальности. На некоторых фермах заболевают свиньи всех возрастов, а заболеваемость приближается к 100%. ЭДС очень сходна с ТГС за исключением более медленного распространения и несколько более низкой смертности новорождённых поросят. Поросята в возрасте до 1 недели могут погибнуть от дегидратации после 3-4-дневной диареи. Смертность поросят в среднем составляет 50%, но может достигать 100%. Более старшие поросята выздоравливают примерно через 1 неделю. После острой вспышки диарея у них может наблюдаться 2-3 недели после отъёма [125]. В последние два десятилетия типичные острые вспышки с высокой смертностью новорождённых поросят в Европе наблюдают редко, но они часто происходят в Японии [160], Корее [33], Китае [37, 38, 40, 101] и других странах Азии [115, 128]. В 2013 г. ЭДС, характеризующаяся острыми вспышками, охватила 27 штатов США [39, 158].

При острой вспышке ЭДС в хозяйстве все откормочные свиньи заболевают с развивитием диареи в течение недели. Животные аноректичны, угнетены, и их фекалии водянистые. К концу периода откорма клинические признаки ЭДС могут быть суровее, чем при ТГС. В частности, животные проявляют большую болезненность в области живота. Как правило, животные выздоравливают через 7-10 дней. Смертность среди откормочных свиней составляет 1 - 3%, гибель наступает на ранней стадии диареи или даже до её появления. При некропсии у таких животных обнаруживают острый некроз спинной мускулы. Наиболее высокая смертность наблюдается среди пород, чувствительных к стрессу. По сравнению с ТГС ЭДС распространяется медленнее. Распространение вируса из одного свинарника в другой может занять 4-6 недель, некоторые свинарники могут оставаться свободными от инфекции [125].

Диагноз на ЭДС нельзя поставить только по клиническим признакам.

Клинически острые вспышки диареи у свиней всех возрастов нельзя отличить от проявления ТГС. В ряде случаев вспышки ЭДС могут проявляться в виде быстро распространяющейся водянистой диареи у послеотъёмных поросят и более взрослых животных на репродукторных фермах, но без клинических признаков у новорождённых поросят.

Этиологический диагноз можно установить прямым обнаружением вируса ЭДС и / или его антигена, или специфических антител. Наиболее демонстративными методами являются электронная микроскопия (ЭМ), иммуноэлектронная микроскопия (ИЭМ), прямая иммунофлуоресценция (ИФ) и иммуногистохимия ультратонких срезов тонкого кишечника новорождённых поросят.

Частицы вируса ЭДС можно видеть в фекалиях в прямой ЭМ, хотя их нелегко обнаружить, если шипы вириона потеряны или неясно видны.

Наивысший результат обнаружения вируса в фекальных образцах составил 73% и получен при исследовании экспериментально зараженных поросят в дифференциации вирусов ЭДС и ТГС, требуется ИЭМ, так как оба вируса имеют одинаковую морфологию [125].

ИФ и особенно иммуногистохимию можно применять в основном при исследовании образцов кишечника поросят, убитых во время острой фазы диареи, предпочтительно в течение 2 дней после её начала. Данные методы часто ненадёжны при исследовании патологического материала от естественно погибших животных из-за элиминации энтероцитов в период болезни [23, 47, 68, 160]. Использование ИФ позволяет быстро обнаружить вирус ЭДС, выделенный из фекалий в культуре клеток Vero или других линий клеток [72, 148].

В настоящее время создан ряд наборов иммуноферментного анализа (ИФА) для обнаружения антигенов вируса ЭДС в фекалиях, а также для демонстрации специфических антител в сыворотке крови. Они чувствительны и надёжны, особенно для группового диагноза. Для антигенных версий ИФА использовали поли- и моноклональные антитела к антигенам вируса, размноженного в поросятах [29, 31, 171]. Для размноженный в поросятах или в культуре клеток [29, 32, 94], а также вирусные белки S и N, выделенные из инфицированных клеток Vero [88].

Антительный ИФА также используют для обнаружения иммуноглобулина в молозиве и молоке свиноматок [45]. Для обнаружения специфических антител в сыворотке крови и молозиве как инфицированных, так и вакцинированных свиней используют ИФA, блокирующий ИФA, непрямую ИФ, блокирующую ИФ и реакцию нейтрализации (РН) в культуре клеток Vero [29, 73, 74, 127, 148, 177]. Повторные (парные) образцы сыворотки следует брать для исследования не раньше 2 недель после начала диареи [32].

Для оценки протективного иммунитета большее значение имеют концентрация антител класса IgA в молозиве и вируснейтрализующая активность молозива по сравнению с аналогичными показателями сыворотки крови [69].

Для дифференциальной диагностики вирусов ЭДС и ТГС весьма успешно используют иммунохроматографический метод на нитроцеллюлозных мембранах с иммобилизованными моноклональными антителами против структурных белков обоих вирусов [83]. Данный метод особенно подходит для массового обследования проб от свиней в случаях, когда высока вероятность одновременной инфекции обоими вирусами.

Наиболее чувствительным и специфичным тестом на вирус ЭДС является обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция (RT-PCR).

последовательности вирусного генома (5’ UTR) успешно применяется для выявления как лабораторных штаммов, так и полевых изолятов вируса ЭДС [77, 91, 84]. Также разработана дуплексная RT-PCR для дифференциальной диагностики вирусов ЭДС и ТГС [85]. Однако в случаях, когда доступны лишь образцы тканей, фиксированные формалином, иммуногистохимия и гибридизация in situ являются лучшими методами диагностики по сравнению с RT-PCR [86].

В Европе специфическую профилактику ЭДС считают экономически невыгодным мероприятием вследствие редкого возникновения и небольших потерь от заболевания. Поэтому в странах Европы борьба против ЭДС основана на общих превентивных мерах. Подсосные поросята, страдающие ЭДС, должны иметь свободный доступ к воде, чтобы уменьшить дегидратацию. Откорм свиней рекомендуется приостановить. Так как ЭДС не распространяется очень быстро, можно применять общесанитарные превентивные меры и на время задержать проникновение вируса в репродукторные свинарники с опоросами и новорождёнными поросятами.

Задержка естественного заражения поросят до достижения более старшего возраста может значительно уменьшить заболеваемость и гибель свиней.

Если вирус циркулирует в последовательных помётах подсосных поросят, можно попытаться прекратить его перманентную передачу путём перемещения свиней сразу после окончания подсосного периода в другое место не менее, чем на 4 недели. Одновременно с этим прибытие новых животных в хозяйство должно быть временно прекращено.

Как и при ТГС, целенаправленное скармливание супоросным свиноматкам фекалий больных ЭДС свиней или суспензии кишечника погибших от ЭДС поросят стимулирует лактогенный иммунитет и сокращает продолжительность вспышки заболевания в хозяйстве. Однако при данном подходе напряжённость иммунитета сильно варьирует в связи с неопределённым содержанием вируса ЭДС в фекалиях или суспензии распространения других инфекционных заболеваний, связанную с возможной контаминацией фекалий другими патогенами (вирус РРСС, цирковирус и др.).

До 13-дневного возраста поросята получают защиту против ЭДС в виде специфических антител, в основном класса IgG, из молозива и молока иммунитета зависит от титра антител.

После сенсибилизации кишечника свиноматок вирусным антигеном иммуноциты, продуцирующие антитела, мигрируют в молочную железу, где секретируют антитела в молозиво и молоко. Иммунологическая связь кишечник-молочная железа является важным фактором, который следует учитывать при разработке вакцины, обеспечивающей лактогенный иммунитет [6, 12, 13, 14, 138, 174]. Антитела класса IgG составляют более 60% суммарного иммуноглобулина в молозиве, но антитела класса IgA эффективнее нейтрализуют патогены, проникающие оральным путём, чем IgG и IgM [16, 24, 30, 149, 170]. Это объясняется более высокой способностью IgA к нейтрализации вируса и его большей устойчивостью к протеолитической деградации в кишечном тракте [114, 159]. Таким образом, только пассивный перенос IgA от иммунизированной матери создаёт эффективный пассивный иммунитет у новорождённых поросят [2, 7, 20, 25, 107, 136].

Разработку и испытание вакцин против ЭДС проводили в основном в странах Азии, где, в отличие от Европы, происходят суровые вспышки заболевания с высокой смертностью новорождённых поросят. Наиболее эффективным путём создания вакцины против ЭДС является аттенуация вируса длительным пассированием в культуре клеток. Cерийное пассирование приводит к снижению и утрате патогенности вируса для свиней, особенно для новорожденных поросят, но сохраняет его способность вызывать протективный иммунный ответ у привитых свиней [95, 153].

Аттенуированный штамм KPEDV-9 на 93 пассаже в культуре клеток Vero был использован для орального и внутримышечного введения безмолозивным поросятам в возрасте 1-4 дня. Из 8 поросят, получивших орально 10 мл суспензии вируса в концентрации 108 ТЦД50/мл, только развили мягкую диарею. Все поросята, привитые вирусом в дозах 106 и ТЦД50/мл, не показали каких-либо признаков инфекции [95]. Штамм DR13 на 100 пассаже в клетках Vero не вызвал диарею, анорексию и виремию у новорождённых поросят и супоросных свиноматок. Только 1 из 14 поросят проявлял слабую диарею [152]. Эти данные были подтверждены в последующих экспериментах [153, 154]. Супоросные свиноматки, привитые внутримышечно аттенуированным штаммом KPEDV-9 в дозе 107 ТЦД50, развили высокие титры противовирусных антител в крови и молозиве, которые легко выявляли в ИФА. Новорождённых поросят, полученных от вакцинированных свиноматок, заражали орально полевым вирулентным вирусом ЭДС в дозе 10 и 5 ЛД50 и наблюдали в течение 2 недель. При ЛД50 смертность поросят с лактогенным иммунитетом составила 20% по сравнению со 100% гибелью аналогичных поросят в контрольной группе;

при 5 ЛД50 все иммунные поросята выжили по сравнению с гибелью 60% поросят в контрольной группе [95].

Аналогичные результаты были получены в опытах с культуральным штаммом DR13, аттенуированным подобным способом [152]. Было также показано, что оральное введение аттенуированного DR13 приводит к более выраженному иммунитету у свиноматок и лучшей защите потомства от инфекции по сравнению с внутримышечным введением [155]. Этот штамм не проявил вирулентность в течение трёх серийных пассажей в безмолозивных поросятах. В Корее его используют для вакцинации свиней с 2004, в Филиппинах – с 2011. Однако после вакцинации выделение вируса с фекалиями у экспериментально зараженных поросят существенно не уменьшается по сравнению с контрольной группой, что может свидетельствовать о недостаточной иммунной защите вакцинированных животных. С другой стороны, выделение вируса ЭДС с фекалиями количественно трудно измерить, много зависит от штамма вируса и метода исследования [156].

В Японии с 1997 для профилактики свиноматок применяют коммерческую живую вакцину из штамма Р-5V, аттенуированного в культуре клеток. Вакцина считается эффективной, хотя не все свиноматки развивают выраженный лактогенный иммунитет [167].

Представляет также интерес альтернативное получение безопасного антигена вируса ЭДС для использования в качестве вакцины. Синтез рекомбинантного гликопротеина S вируса в трансгенном табаке составил 2,1% от общего растворимого белка, что делает это растение потенциальной «съедобной вакциной» [82]. Трансгенные морковь и салат тестировали на мышиной модели скармливанием. Антитела, индуцированные в организме мышей, обладали вируснейтрализующей активностью in vitro [20]. Для оценки перспективности данного направления вакцины необходимы дальнейшие исследования с определением протективного эффекта на свиньях.

Кроме исследований по вакцинопрофилактике ЭДС известны опыты пассивной защиты поросят специфическими иммуноглобулинами естественно нечувствительных к ЭДС иммунизированных животных.

Оральное введение новорождённым поросятам желтка куриных яиц или молозива коров, содержащих иммуноглобулины к вирусу ЭДС, предотвращало заболевание или снижало смертность [96, 147].

Есть предложение использовать рекомбинатные бактерии E. coli, синтезирующие вариабельные фрагменты мышиных моноклональных антител к антигенам вируса ЭДС [129].

В качестве терапевтического средства предложено применять фактор эпидермального роста (EGF), который стимулирует пролиферацию эпителиальных клеток в криптах кишечника и тем самым способствует восстановлению ворсинок после атрофии [80].

1.9. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ

заболевание представляет собой проблему для промышленного свиноводства. Причиной тому являются существенные экономические потери или высокая вероятность таковых в крупных свиноводческих хозяйствах при возникновении ЭДС. Возникновение ЭДС носит внезапный характер, после одной или нескольких вспышек она часто приобретает стационарный (энзоотический) характер. При ЭДС отчётливо выражена возрастная чувствительность. Наиболее чувствительны к вирусу поросята до двухнедельного возраста, летальность среди которых составляет 30 - 100%.

Летальность среди свиней начиная с послеотъёмного возраста составляет обычно 1 - 3 %.

В полевых условиях разные штаммы вируса ЭДС обладают различной вирулентностью. Штаммы вируса, циркулирующие в странах Азии, в целом характеризуются более высокой вирулентностью по сравнению со штаммами, циркулирующими в странах Европы. Механизмы данной географической корреляции неясны. Однако существенные экономические потери, причиняемые ЭДС в азиатском регионе, явились основанием для интенсивного изучения заболевания и его возбудителя. Можно выделить три направления исследований, в которых достигнут наибольший прогресс:

этиология, культивирование вируса и лабораторная диагностика. Результаты исследований в данных направлениях являются научной основой для разработки эффективных мер борьбы против ЭДС. Достаточно изучены иммунобиологические свойства вируса ЭДС, особенности его репродукции, строение вириона и вирусного генома.

Важным шагом в научном и практическом плане явилась разработка методов массового культивирования вируса ЭДС вне организма хозяина, что позволило получать достаточное количество вируса для его изучения и изготовления диагностических и вакцинных препаратов. Адаптация вируса ЭДС к культуре клеток позволила также давать оценку его биологической и антигенной активности, что имело важное научное и практическое значение.

Хотя эффективность выделения полевого вируса ЭДС в культуре клеток Vero относительно высокая и после проведения нескольких слепых пассажей репликация вируса сопровождается выраженным ЦПЭ, вирус накапливается в относительно невысоком титре (не выше 6,5 – 7,0 lg ТЦД50 / мл), даже после продолжительной адаптации к культуре клеток Vero или последующей адаптации к другой культуре клеток. Серийное пассирование вирулентных штаммов вируса ЭДС в культуре клеток относительно быстро приводит к снижению и потере вирулентности и получению аттенуированных вакцинных штаммов. Молекулярной основой аттенуации вируса ЭДС и её необратимости при серийном размножении в культуре клеток считается делеция в последовательности вспомогательного гена ORF3. Возможность реверсии некоторых аттенуированных штаммов в организме свиней теоретически не исключена. Однако реверсию патогенности вакцинных штаммов вируса ЭДС ни в практических условиях, ни в процессе ограниченного пассирования на новрождённых серонегативных поросятах никто не наблюдал.

Остаются невыясненными многие вопросы эпизоотологии ЭДС, в частности, носительство вируса ЭДС различными технологическими и возрастными группами свиней. Известно, что при ЭДС острая инфекция в хозяйствах чаще переходит в хроническую форму, чем при ТГС. В качестве возможного объяснения считается предпочтительное инфицирование вирусом ЭДС энтероцитов крипт тонкого кишечника.

Предварительный диагноз ТГС / ЭДС ставят на основании клинических признаков, патологоанатомических изменений и эпизоотологических данных. Окончательный (этиологический) диагноз устанавливают на основании результатов лабораторных исследований.

Лабораторная диагностика включает обнаружение вирусного антигена или вирусной нуклеиновой кислоты и специфических антител. Серологические методы, помимо диагностического значения, представляют ценность для оценки иммунитета в практических условиях. Наиболее чувствительным и специфическим методом дифференциальной диагностики ТГС / ЭДС является ПЦР. Для дифференцирования этих вирусов используют гнездовую (дуплексную) версию ПЦР.

Специфическая профилактика ЭДС представляет собой актуальную проблему для ряда стран с развитым свиноводством. Как и в случае ТГС, основу стратегии специфической профилактики ЭДС составляет пассивный лактогенный иммунитет, то есть иммунизация супоросных свиноматок и защита потомства антителами молозива и молока. Медиатором лактогенного иммунитета служит секреторный иммуноглобулин который нейтрализует вирус на поверхности слизистой оболочки и предупреждает развитие инфекции. Роль клеточного иммунитета в защите свиней от ЭДС не изучена.

применяются различные живые вакцины из культуральных аттенуированных штаммов вируса ЭДС. Создание инактивированной вакцины против ЭДС не представляется реальным вследствие низкого накопления вируса как в культуре клеток, так и в организме. Живые препараты вводят супоросным свиноматкам, как правило, орально или внутримышечно. Одна группа авторов показала, что оральное введение вакцины приводит к более выраженному иммунитету у свиноматок и лучшей защите потомства от инфекции по сравнению с внутримышечным введением. Однако оральное введение неприменимо для массовой вакцинации в условиях крупных хозяйств. Существуют опасения некоторых исследователей, что напряжённость иммунитета, индуцированного некоторыми коммерческими живыми вакцинами, часто недостаточна, так как после вакцинации свиноматок вирус ЭДС выделяется с фекалиями у экспериментально зараженных поросят примерно так же, как у серонегативных поросят контрольной группы. Однако главным критерием иммуногенности живых вакцин против ЭДС является их эпизоотическая эффективность, которая тесно коррелирует с уровнем лактогенного иммунитета (титр ВНА в молозиве и молоке) вакцинированных свиноматок.

Основываясь на анализе данных литературы, характеризующих современный уровень исследований и разработок по проблеме ЭДС, а также учитывая актуальность специфической профилактики заболевания для промышленного свиноводства России, мы провели работу научного и прикладного значения, результаты которой обобщены в данном труде.

Цель работы. Разработка сухой живой вакцины против ЭДС и условий её применения в ветеринарной практике.

Получение авирулентного культурального штамма вируса ЭДС;

Изучение генетических основ аттенуации вируса ЭДС;

Оптимизация условий культивирования аттенуированного вируса ЭДС в перевиваемой культуре клеток;

Разработка метода изготовления и контроля сухой живой вакцины и режима её хранения;

Изготовление экспериментальных серий вакцины и испытание их эффективности в лабораторных и производственных условиях;

Изготовление производственных серий вакцины и испытание их в неблагополучных по ЭДС хозяйствах;

Изучение возможности одновременной вакцинации свиней

Работа выполнена в 2008 – 2012 гг. в ОАО НИИ ДПБ и ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава России

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Вирус первоначально был выделен от больных поросят в культуре клеток Vero и размножался слабо в течение первых пассажей. Расплодка пассажа в культуре клеток Vero имела титр 2,5 lg ТЦД50/мл.

экспериментального заражения поросят, представлял собой суспензию кишечного материала, взятого от естественно инфицированных поросят.

Клетки Vero размножали в среде DMEM с 5-10% сыворотки крови крупного рогатого скота (FetaClone) с антибиотиками (гентамицин 20 мкг / мл или ципрофлоксацин 25 мкг / мл). Из флакона с выросшим клеточным монослоем удаляли ростовую среду, монослой промывали 1-2 раза раствором Версена (0,02%) и 1 раз смесью растворов Версена (0,02%) и трипсина (0,025%) в соотношении 4:1, затем выдерживали при 370С 5-10 мин. После отделения клеток от стенки флакона их разводили средой DMEM с сывороткой. Клеточную суспензию, содержащую 1-2 х 105 клеток/мл, вносили по 150 мл в 1,5 мл флаконы. Клетки выращивали при 37 0С. Срок формирования монослоя: 48-72 часа.

Клетки СПЭВ выращивали на среде 199, остальные клетки выращивали на среде DMEM с антибиотиком (2 мкг/мл гентамицина или 2,5 мкг/мл ципрофлоксацина). Клетки всех линий пересевали каждые 3-4 дня с коэффициэнтом 1:4 – 1:5.

Для выращивания вируса использовали клетки Vero, покрывающие ростовую поверхность флакона на 95-100%. Клетки отмывали раствором Хэнкса и заражали вирусом с множественностью 0,1 ТЦД50 на клетку. Вирус вносили одновременно с поддерживающей средой (DMEM с антибиотиками без сыворотки), содержащей трипсин в концентрации 5 мкг / мл.

Выраженный ЦПЭ развивался через 18-20 часов после заражения. В этот период (разрушение не менее 70% клеток монослоя) культивирование вируса прекращали, и сосуды с инфицированной культурой клеток интенсивно встряхивали. В случаях, когда на стенках культуральных сосудов оставалась значительная часть клеток, сосуды кратковременно замораживали. Вируссодержащую культуральную суспензию сливали в пластиковые бутыли и хранили при -200- -700С. Вирус ЭДС, адаптированный к культуре клеток Vero экспериментальных серий вакцины.

Инфекционность вируса в жидких и лиофилизованных препаратах определяли методом титрования в культуре клеток Vero в 96-луночных плашках.

Клетки Vero в 96-луночных плашках выращивали стандартным способом в атмосфере 4% СО2. Концентрация клеток при посеве: 2-4 х клеток / мл, в лунку вносили 100 мкл клеточной суспензии, срок формирования монослоя: 24-48 ч. Перед внесением разведений вируса монослой в лунках промывают 1-2 раза раствором Хэнкса. Серийные 10кратные разведения вируса готовили в среде DMEM, содержащей трипсин ( мкг / мл) и гентамицин (20 мкг / мл). Разведения от 10-1 до 10-5 вносили в отмытые от ростовой среды лунки по 100 мкл, каждое разведение в 4 лунки.

Плашки инкубировали при 370С, 4% СО2. Результаты титрования вируса учитывали через 48-72 ч. Титр вируса определяли по методу Рида-Менча и выражали в единицах ТЦД50 /мл.

Инфекционную активность определяют (1) в исходном культуральном вирусе, (2) культурального вируса, смешанного со стабилизатором и замороженного (до сушки), (3) свежевысушенного вируса и (4) высушенного вируса после ускоренного старения (инкубация при 370С в течение 7 дней) и (5) в процессе хранения при 20-80С.

Оценку антигенной и иммуногенной активности вакцинных препаратов проводили на лабораторных животных, супоросных свиноматках, откормочных свиньях и новорожденных поросятах. Новорождённых поросят содержали под своими свиноматками. Поросят в возрасте 30-35 дней содержали отдельно от свиноматок и их потомства. Содержание и кормление свиноматок и откормочных свиней, находящихся в опытах, проводили согласно технологическим нормам.

Поросята-гнотобиоты получены путем кесарева сечения свиноматок.

Поросят извлекали из матки и переносили в стерильные камеры с подачей стерильного воздуха. Кормили поросят каждые 3 часа автоклавированной молочной смесью. Аналогичным образом содержали и безмолозивных поросят. Орально и назально вирусные препараты вводили с помощью шприца-полуавтомата с силиконовой насадкой вместо иглы.

В качестве лабораторных животных использовали морских свинок массой 350-450г и кроликов массой 2,5-4,0 кг.

Для испытания схемы вакцинации использовали серонегативных в отношении ЭДС свиней из хозяйства, благополучного по инфекционным заболеваниям. Три глубоко супоросные свиноматки крупной белой породы в возрасте 3,5-4 года содержали в отдельном помещении для опороса.

Животных содержали в соответствии с общепринятыми нормами.

2.1.6. Сбор и приготовление образцов для исследований Пробы сыворотки крови, молозива и молока, а также легочные смывы свиней исследовали серологическими методами до и после вакцинации. Кровь брали из наружной ушной вены в стерильные флаконы и выдерживали 2 часа в термостате при 37°С, затем выдерживали в течение ночи при 4°С. Сыворотку отделяли центрифугированием при 1500 об/мин в течение 20 мин. Молозиво и молоко брали в стерильные флаконы. Для получения молока свиноматкам внутривенно вводили 50 ед окситоцина.

Каждую пробу получали не менее чем из трех долей вымени. Полученные пробы подвергали центрифугированию в режиме 19000 об/мин в течение часов, после чего собирали среднюю фракцию, содержащую сыворотку.

Легочные смывы получали из легких вакцинированных свиней в условиях убойных пунктов или мясокомбината. С этой целью в просвет трахеи вводили 500-700 мл фосфатно-буферного раствора (рН 7,4) и после тщательного массирования долей легких собирали смывы в стерильные флаконы. Полученные смывы осветляли центрифугированием при об/мин в течение 30 мин. В ИФА и РН использовали также гипериммунные сыворотки кроликов, иммунизированных вакцинным штаммом вируса ТГС. Все пробы до исследования хранили при -20°С.

Другие материалы брали и обрабатывали перед исследованием в соответствии с принятыми нормами.

изготовлена из вируса ЭДС, прошедшего не меньше 40 пассажей в культуре клеток Vero и представляла культуральную жидкость с титром вируса 5,0 lg ТЦД50 / мл. Вирус-содержащую культуральную жидкость с момента получения до испытания на свиньях хранили при -200С.

изготовлена из того же вируса. К инактивированному формалином (0,2%, часа, 370С) вирусу добавляли мертиолат натрия 1:10 000 и 25% гидроокиси алюминия (ГОА). Вакцину хранили при 4 – 60С.

Свиноматок вакцинировали по разным схемам. 1) Живой вакциной орально двукратно: за 4-5 недель и за 2-3 недели до опороса. Каждый раз мл живой вакцины смешивали с 5 мл пастеризованного коровьего молока непосредственно перед оральным введением. Разовая доза вакцинного вируса составляла 5,7 lg ТЦД50. 2) Живой, а затем инактивированной вакциной.

Живую вакцину вводили однократно орально за 4-5 недель до опороса в объёме и дозе, указанных выше. Инактивированную вакцину вводили однократно внутримышечно в дозе 5 мл за 2-3 недели до опороса.

30-35-дневных поросят разделили на три равные группы, которых иммунизировали по трём схемам: 1) живой вакциной орально однократно, 2) живой вакциной внутримышечно однократно и 3) живой вакциной орально однократно и через 2 недели инактивированной вакциной внутримышечно однократно. Доза живой вакцины составляла 5,0 lg ТЦД50 (в объёме 3 мл), инактивированную вакцину вводили в дозе 2 мл.

За вакцинированными животными ежедневно проводили клиническое наблюдение, фиксируя отклонения от физиологической нормы, в течение всего срока эксперимента.

2.1.10. Заражение новорождённых поросят Трёх поросят под каждой вакцинированной свиноматкой заражали в возрасте 3 дня. Вирулентный штамм вируса ЭДС вводили орально в дозе 3, ЛД100 в объёме 2 мл. После заражения за поросятами каждого помёта наблюдали 10 дней.

Реакцию нейтрализации использовали для оценки антигенной активности вакцинного вируса по уровню вируснейтрализующих антител (ВНА) в сыворотке крови свиней до и после вакцинации и в молозиве (молоке) свиноматок, взятом в день опороса и в последующие дни.

Для реакции нейтрализации вируса использовали: 1) культуру клеток Vero со сплошным монослоем в 96-луночных пластиковых планшетах, предварительно отмытые от ростовой среды средой ДМЕМ, 2) вирус ЭДС с известным титром инфекционности в виде культуральной суспензии.

Пробы иммунной сыворотки крови свиней предварительно инактивировали при 560С 30 мин. Пробы молозива / молока замораживали, оттаивали и обезжиривали центрифугированием при 3000 об/мин 10 мин.

Затем готовили серийные 2- или 10-кратные разведения на среде ДMEM с антибиотиком.

Для активации вируса ЭДС в суспензию, содержащую вирус, добавляли трипсин до концентрации 20 – 30 мкг / мл и инкубировали 30 мин при 370С. Активированный вирус разводили средой ДMEM до концентрации 2-4 х 103 ТЦД50 / мл и смешивали с равным объёмом серийного разведения сыворотки или молозива. После инкубации 1 ч при 37 0С смесь вируссыворотка вносили в отмытые от ростовой среды лунки с монослоем по мкл. Доза вируса в каждой лунке составляла 100-200 ТЦД50. Смесь каждого разведения сыворотки вносили в 4 лунки. Клетки со смесью вирус-сыворотка инкубировали 1 ч при 370С в атмосфере 4% СО2, после чего смесь удаляли, монослой отмывали от сыворотки и вносили поддерживающую среду ДMEM с трипсином (5-10 мкг / мл) по 100 мкл в лунку. Планшеты инкубировали при 370С, 4% СО2. Результаты реакции учитывали через 2 - 4 суток при наличии ЦПЭ в культуре, заражённой вирусом в рабочем разведении без сыворотки (контроль +) и отсутствии ЦПЭ в лунках с незаражённой культурой клеток (контроль –). Вируснейтрализующий титр выражали как предельное разведение сыворотки (молозива), ингибирующее развитие ЦПЭ в 50% заражённых культур клеток.

С целью уменьшения потери активности в результате сушки вирусную суспензию смешивали с одной из трёх стабилизирующих (защитных) сред, использованных в работе: декстраново-желатиновой, пептонно-желатозной и молоком.

Декстраново-желатиновую среду готовили следующим образом. В 2/3 конечного объёма бидистилированной воды вносили компоненты в следующем порядке (в граммах на 1 л воды): гидрофосфата калия 1,25, дигидрофосфата калия 0,5, желатина 30, декстрана 50, сорбита 50, сахарозы 30, гидролизата казеина 20. Каждый следующий компонент добавляли после полного растворения предыдущего. После доведения рН до 7,3-7,4 2М гидроксидом калия добавляли бидистиллят до конечного объёма и автоклавировали при 121-1250С в течение 30 мин.

Пептонно-желатозную среду готовили смешиванием равных объёмов двух растворов. Первый раствор содержит (в порядке растворения) дигидрофосфат калия 0,27%, лактозу 10% и пептон 10%. Второй раствор содержит дигидрофосфат калия 0,27% и желатозу 4%. Для растворения компонентов смеси нагревают или оставляют на ночь. рН обоих растворов доводят до 7,3-7,4 2М гидроксидом калия. После автоклавирования при 121С 30 мин растворы смешивали.

Молоко готовили альтернативно двумя способами. 1) Сухое обезжиренное молоко стерилизовали гамма-облучением интенсивностью млн рад. Растворяли в стерильном фосфатно-солевом буферном растворе (рН 7,3-7,4) в весовой пропорции 1:6, затем центрифугировали суспензию в 50-мл центрифужных пробирках при 5 000 об/мин в течение 10 мин. 2) Коммерческое пастеризованное молоко 2,5 или 3,2 % жирности стерильно разливали в 50-мл центрифужные пробирки, однократно замораживалиоттаивали, затем центрифугировали суспензию в 50-мл центрифужных пробирках при 5 000 об/мин в течение 10 мин. После проверки рН (7,2-7,4) супернатант сливали и смешивали с вирусной суспензией или хранили в замороженном виде.

Вирусную суспензию смешивали с декстраново-желатиновой средой в отношении 0,7 : 0,3, с пептонно-желатозной средой или молоком - в отношении 1 : 1.

2.1.13. Сублимационная сушка вакцины ВЕРРЕС-ЭДС Смесь культурального вируса со стабилизирующей средой расфасовывали вручную (малые объёмы) или на автоматической линии по мл во флаконы объёмом 3 см3, устанавливали на каждый флакон резиновую пробку с пазами для удаления влаги.

Для сушки в лабораторной установке Christ Alpha расфасованную вакцину предварительно замораживали в холодильнике при –600 - -70 0С в течение 16 ч, затем помещали в сушильную установку.

При производственной сушке расфасованную вакцину замораживали в установке Christ Epsilon перед началом сублимации. Сразу после расфасовки в один или два флакона с вакциной помещали датчики температуры.

Замораживание проводили в течение 6-8 ч до достижения в материале температуры полного замораживания, - 500С или ниже.

Сублимацию проводили при значениях вакуума в камере около 0, мБар в течение не менее 50 ч. После удаления из препарата около 90% влаги проводили досушивание при температуре 30-350С в течение 15 ч. График изменения температуры в препарате в процессе сублимации показан на рисунке 5.

По окончании сублимационной сушки флаконы герметично укупоривали непосредственно в камере сублиматора с помощью прижимных плит, после чего камеру заполняли атмосферным воздухом. После определения вакуума и остаточной влажности флаконы с сухой вакциной закатывали алюминиевыми колпачками.

2.1.14. Определение вакуума в сухой вакцине Вакцина считается пригодной для практического применения только при наличии вакуума во флаконах. Поэтому все флаконы сухой вакцины проверяли на наличие вакуума с помощью аппарата Д’Арсонваля. Наличие светящегося разряда во флаконах свидетельствует о наличии вакуума.

2.1.15. Определение массовой доли влаги в сухой вакцине Определяли уменьшение массы сухой вакцины после досушивания её по ГОСТ № 24061 – 89 (СТ СЭВ 6279 – 89). Массовая доля влаги в сухой вакцине должна быть в пределах 1-4%.

2.1.16. «Ускоренное старение» вакцины 6 флаконов с сухой вакциной, содержащих вакуум, выдерживали в течение 7 суток при 370С. По истечении этого срока определяли активность вируса в усреднённой пробе титрованием вируса в культуре клеток.

2.1.17. Иммунохроматография на нитроцеллюлозных стрипах Дифференцирование антигена вирусов ЭДС и ТГС в полевых и культуральных образцах проводили с использованием коммерческих наборов Antigen Rapid TGE\PED Ag Kit и ZETECT TGE/PED компании BIONOTE (Южная Корея) в соответствии с инструкцией производителя.

2.1.18. Наборы и ферменты для ПЦР и секвенирования Маркеры молекулярной массы от 100 до 3000 н. п. (GeneRulertm 100 bp DNA Ladder Plus, Fermentas, Литва).

Набор для выделения ДНК из геля (Рrоmеgа, DNА Рurificatrion System, Wizard®, США) Набор для выделения ДНК из геля QIАЕХ II Gеl Ехtraction Kit (Qiagen, Германия).

Набор для очистки ПЦР-продуктов (Рrоmеgа, Wizard™ РСR Рrерs DNА Purification System for Rapid Purification of DNA Fragments, США).

Hабор для выделения плазмидной ДНК (Рrоmеgа, DNА Purification System, Wizard®Рlus, SV Minipreps, США).

Набор для секвенирования ДНК Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit, (Applied Biosystems, США).

Обратная транскриптаза (ревертаза):

Из вируса лейкемии мышей Молони (ММLV) (Рromegа, США), Из вируса миелобластоза птиц (АМV) (Рromegа, США);

Taq-полимераза (Рromegа, США);

Ингибитор РНКаз (RNAzin, 40 ед/мкл) (Рromegа, США).

2.1.19. Оборудование для ПЦР и секвенирования Автоматический секвенатор АВI РRISМ 3130 Genetic Analyzer (Аррlied Biosystems; США), монитор и компьютер (DELL,). Вортекс "Fisons" (UК), твердотельный термостат "Гном" (ДНК-Технология, Россия), источник питания "Эльф" (ДНК-Технология, Россия), настольные микро центр и фуги Eppendorf, центрифуга с охлаждением RС2-В (Sorvall), прибор для проведения горизонтального электрофореза в агарозном геле (Хеликон, Россия), вакуумный насос (Gast), енегодслательная машина AF (Scotsman), низкотемпературный холодильник (Nuare), водный термостат Bromma (LКВ), амплификаторы «Терцик» (ДНК-Технология, Россия) и Нуbaid, термостат воздушный ТС 1/20 (СНУ), трансиллюминатор, холодный шкаф Bromma (LKB), пипетки переменного объёма Gilson, Eppendorf, автоклав настольный Sanyo, дистиллятор СПУ, холодильник Stinol, система для очистки воды Milli Q (Millipore, США), электронные настольные весы 1219 МР (Sartorius), магнитная мешалка ММ-5 (СССР), рН-метр 420А+ (Thermo Orion, США), спектрофотометр Biophotometr (Eppendorf, Германия), фотокамера для фотографирования гелей (Olympus C5060 Wide Zoom).

2.1.20. Химические реагенты и расходные материалы Tризол (Gibco ВRL, Life Technologies, США), трис основной, дeзоксинуклеотид – трифосфаты, ЭДТА (Promegа, США), хлорид калия, хлорид кальция, хлорид магния, хлорид натрия, гидроксид натрия, легкоплавкая агароза, диэтилпирокарбонат, силика (Sigma, США), уксусная кислота, соляная кислота, хлороформ, изопропиловый спирт - ректификат, ацетон (Химмeд, Россия), глицерин (Меrck, Германия), тритон Х-100 (IСN, США), масло минеральное (ЕSSО, Германия), метиловый оранжевый (Рeахим, Россия), бромистый этидий (Servа, Германия), гуанидинтиоцианат (РеqLаb, Германия).

Пробирки объемом 0,6 мл тонкостенные для ПЦР (QSР, США), 1,6 мл и 2 мл микроцентрифужные пробирки с градуировкой (Ерреndorf, Германия), микронаконечники на 0,5 – 1,0 мкл, микронаконечники на 0,1 - 2,5 мкл, микронаконечники на 1 - 200 мкл желтые (Greiner, Австрия), желтые с фаской (Тreff), наконечники на 100 - 1000 мкл голубые (Greiner, Австрия), микронаконечники с фильтром на 1 - 20, 1 - 200 и 100 - 1000 мкл (QSР, США), пластиковые пробирки с завинчивающейся крышкой на 15 и 50 мл, центрифужные пробирки (Nаlgеnе, Италия), стеклянная лабораторная посуда с градуировкой и пластиковыми завинчивающимися крышками (Scott Duran), пробирки оптические на 200 мкл MicroAmp, 96-луночные оптические плашки 96-well Optical Reaction Plate, кюветы для спектрофотометра 50 - 2000 мкл, свободные от ДНКаз, РНКаз, протеаз.

Для выделения РНК из монослоя и суспензии культуры клеток использовали методику выделения с тризолом (Gibco ВRL, Life Technologies).

Для жидких образцов: к 500 мкл образца добавляли 500 мкл тризола и инкубировати при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем добавляли 200 мкл хлороформа, тщательно перемешивали и снова инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Центрифугировали минут, 13000 об/мин при +4° С. Отбирали верхнюю РНК-содержащую водную фазу и добавляли к ней равный объем 100% изопропанола.

Инкубировали при -20° С в течение 20 минут. Центрифугировали 15 минут, 13000 об/мин при +4°С. Образовавшийся осадок РНК промывали дважды 75% этанолом, подсушивали при 37°С в течение 20-30 минут и растворяли в 30-40 мкл воды, обработанной диэтилпирокарбонатом (DEPC).

Для монослоя и тканевых образцов: на монослой клеток наносили тризол из расчета 37,5 мкл на 1 см2 культуралыюй поверхности, дожидались отделения монослоя от поверхности чашки, переносили суспензию клеток в тризоле в микроцентрифужную пробирку (1,5 мл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 5-10 минут. Затем добавляли 200 мкл хлороформа, тщательно перемешивали и снова инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Для разделения фаз центрифугировали 15 минут, 13000 об/мин при +4°С. Затем отбирали верхнюю РНК-содержащую водную фазу и добавляли к ней равный объем 100% изопропанола. Инкубировали при -20°С в течение 20 минут, центрифугировали 15 минут, 13000 об/мин при +4°С.

Образовавшийся осадок РНК промывали и растворяли, как указано выше.

2.1.22. Обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция (ОТПЦР) для детекции геномов вирусов ЭДС и ТГС В работе использовали метод множественной ОТ-ПЦР, позволяющий обнаружение и различение геномов вирусов ТГС и ЭДС в одной пробе. Две пары праймеров, последовательности которых приведены ниже, подобраны на основе геномных последовательностей штамма CV777 вируса ЭДС и штамма Purdue вируса ТГС. Специфические праймеры были подобраны таким образом, чтобы исключить перекрёстные реакции для этих двух вирусов и неспецифические реакции. Условия проведения реакции отрабатывали на матрице двух референтных штаммов вируса ТГС, ТМК и Miller, и референтного штамма CV777 вируса ЭДС. Последовательности праймеров соответствуют консервативным участкам гена мембранного белка (М) вируса ЭДС и гена нуклеокапсида (N) вируса ТГС. Размеры специфических фрагментов соответствуют 412 п.н. и 612 п.н. для вирусов ЭДС и ТГС. Последовательности праймеров приведены ниже.

М, прямой праймер: 5’-GGGCGCCTGTATAGAGTTTA-3’ М, обратный праймер: 5’-AGACCACCAAGAATGTGTCC-3’ N, прямой праймер: 5’-GATGGCGACCAGATAGAAGT-3’ N, обратный праймер: 5’-GCAATAGGGTTGCTTGTACC-3’ Состав реакционной смеси: 1 мM MgSO4, 50 мM Tрис-HCl (pH 8,3), 1, мM MgCl2, 0,01% желатина, 0,1% тритона Х-100, 0,25 мМ смеси четырёх дезокси-нуклеотид-трифосфатов (dNTPs), 2,5 ед. Taq-полимеразы, 2,5 ед.

обратной транскриптазы (AMV-ревертазы), по 0,25 мкМ каждого праймера и 2 – 5 мкл РНК-содержащего препарата. Вода – до 25 мкл.

Режим проведения реакции. 1 цикл обратной транскрипции: 420С – мин, 940С – 2 мин; 40 циклов амплификации: 940С – 30 сек, 550С – 30 сек, 720С – 30 сек; 1 цикл общей элонгации: 950С – 30 сек, 600С – 30 сек, 720С – мин; охлаждение до 00С.

ОТ-ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик» (ДНК-Технология, Россия).

Анализ фрагментов ДНК проводили методом электрофореза в агарозном геле. В 1% гель вносили по 25 мкл продуктов ПЦР при длине фрагмента более 1000 пар нуклеотидов, в 2% - при длине фрагмента менее 1000 пар нуклеотидов. Электрофорез проводили с использованием трис-ацетатного буфера (рН 8.5), содержащего бромистый этидий в концентрации 0,4 - 0, мкг/мл, при напряженности электрического поля 10 - 15 В/см в течение минут. Гели просматривали в ультрафиолетовом свете с длинной волны нм. Наработанные фрагменты вырезали из геля и выделяли с использованием набора для очистки ПЦР-продуктов (Fermentas, Литва) по методике производителя.

2.1.24. Определение нуклеотидной последовательности гена ORF Для секвенирования гена ORF3 по двум цепям использовали праймеры, разработанные Song с соавторами [2003]. Нуклеотидную последовательность определяли по методу Сэнгера при помощи секвенирования ПЦР-продукта с использованием набора Big Dye Terminator Сусlе Sequencing Kit (Аррlied Biosystems) согласно инструкции изготовителя.

Электрофорез ДНК осуществляли на автоматическом секвенаторе АВI 2.1.25. Компьютерный анализ полученных последовательностей Анализ полученных нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакетов программ BioEdit (version 7.0.0. Copyright© 1997-2004) и программы SeqMan из пакета программ Lasergene (version 7.1.0.(44) Copyright © 1993-2006).

2.2.1. КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА И ATTEНУАЦИЯ ПОЛЕВОГО

ИЗОЛЯТА ВИРУСА ЭДС С ЦЕЛЬЮ ПОЛУЧЕНИЯ

ВАКЦИННОГО ШТАММА

Полевой вирус эпизоотической диареи свиней (ЭДС) был передан в ЗАО НПО НАРВАК в виде культуральной жидкости. Данный вирус был выделен в культуре клеток Vero из кишечника больного поросёнка и к моменту передачи прошёл шесть серийных пассажей в культуре клеток Vero.

2.2.1.1. Серийное пассирование вируса в культуре клеток Vero Прежде всего, предстояло выяснить культуральные и вирулентные свойства полученного вируса. Выявление спектра чувствительных линий клеток естественного хозяина представляло интерес с целью выбора наиболее пригодного клеточного субстрата для исследовательских и производственных целей. На первом этапе исследовали чувствительность линий клеток СПЭВ и ППК, используемых в работе с вирусом ТГС. В нечувствительными к вирусу ЭДС. Поэтому для дальнейших исследований и прежде всего для аттенуации вируса ЭДС использовали линию клеток Vero.

В процессе решения различных задач вирус ЭДС прошёл более серийных пассажей в культуре клеток Vero. Размножение вируса постоянно сопровождалось характерным ЦПЭ, который выражался в интенсивном формировании вакуолизированных синцитиев, сливающихся в симпласты (рис. 6). По мере пассирования период наступления выраженного ЦПЭ постепенно сокращался, а накопление вируса постепенно повышалось. Так, в течение первых 20 пассажей вирус накапливался в титре 3,0-3,5 lg ТЦД50/мл, а после 40 пассажей титр вируса был в пределах 4,0-5,0 lg ТЦД50/мл.

Выраженный ЦПЭ наступал через 18 ч, а разрушение монослоя – через 24- ч после заражения (таблица 1).

Таблица 1. Инфекционность и цитопатическая активность штамма ИС в зависимости от длительности пассирования в культуре клеток Vero множественность наступления Характер ЦПЭ Результаты проведенных исследований (таблица 1) показали, что время наступления цитопатического эффекта и накопления вируса зависели от длительности пассирования и множественности заражения культуры клеток Vero. После 80 пассажей вирус накапливался максимально в титре 5,50 – 6, lg ТЦД50/мл.

Начиная с 40 пассажа, вирус периодически использовали для изготовления экспериментальных образцов живой вакцины.

С целью аттенуации полевой вирус серийно пассировали в культуре клеток Vero. Вирулентность культурального вируса ЭДС на уровне 15, 26 и 30 пассажей в культуре клеток Vero изучали в опытах на 2-3-дневных безмолозивных поросятах, полученных от свиноматок, серонегативных к вирусам ЭДС и ТГС. Культуральную вируссодержащую жидкость поросятам вводили орально в объёме 2 мл. Доза вируса составляла 3,33 lg ТЦД50 ( пассаж) и 3,66 lg ТЦД50 (26 и 30 пассажи). Каждый вариант вируса вводили двум поросятам. В течение опыта (7 дней) поросят содержали при температуре 25-270С и в течение первых суток после заражения кормили стерилизованным коровьим молоком через соску каждые 4-6 часов. Вирус пассажа вызвал слабовыраженную диарею через 16 часов после введения, которая прекратилась через 48 часов. У поросят, которым ввели вирус пассажа, отклонений от нормального состояния не отмечали в течение всего периода наблюдения. Безмолозивные поросята, которым ввели вирус пассажа, оставались нормальными в течение всего периода наблюдения ( дней).

Из результатов этого опыта следует, что после 25-30 серийных пассажей в культуре клеток Vero вирус ЭДС полностью утратил вирулентность для новорождённых поросят.

Авирулентный штамм вируса ЭДС получил название ИС (по названию страны первичного выделения вирулентного вируса - Испания). Штамм ИС депонировали в коллекцию вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского (удостоверение ГКВ 2467 от 08.10.2009). В дальнейшем его использовали в исследовательских целях и разработке живой вакцины.

Антигенные свойства штамма ИС, аттенуированного в культуре клеток Vero, послеотъёмного возраста (35-40 дней). Поросят иммунизировали внутримышечно, однократно. Через 21 день после введения вируса определяли титр ВНА в сыворотке крови.

В первом опыте вирус, прошедший 40 пассажей в культуре клеток Vero, вводили в дозе 4,0 и 5,0 lg ТЦД50. Введение вируса вызывало образование ВНА в титре 1:32 – 1:40 и 1:60 – 1:80 соответственно дозе инокуляции. Данные этого опыта показали антигенность вакцинного штамма вируса ЭДС для свиней, степень которой зависит от дозы вакцины.

В следующем опыте с целью определения возможного диапазона пассирования вакцинного штамма ИС без снижения его антигенной активности исследовали вирус 40, 60 и 80 пассажей в культуре клеток Vero.

Вирусом одного уровня пассажа прививали группу 35-40-дневных поросят, которых в соответствии с технологией в период доращивания содержали в одном секторе (53-71 голов). Доза иммунизации составляла 4,0 lg ТЦД50.

Титр ВНА в сыворотке крови определяли у 5 поросят из каждого сектора.

Результаты исследования показали, что штамм ИС, прошедший 40, и 80 пассажей в культуре клеток Vero, не различается по антигенной активности для свиней. Поросята, иммунизированные вирусом всех трёх уровней пассажа, развили антительный ответ сходной интенсивности. Титр ВНА составлял 1:30 – 1:40 (таблица 2).

Таблица 2. Антигенность штамма ИС в зависимости от длительности пассирования в культуре клеток Vero Примечание. В скобках указан уровень ВНА в среднем по группам поросят авирулентный штамм, обладающий выраженной антигенностью.

2.2.1.3. Изменения в геноме штамма ИС вируса ЭДС как результат Адаптация и размножение вируса ЭДС в культуре клеток Vero сопровождается мутациями в гене ORF3 (см. Обзор литературы, глава 1.2.6).

Целью настоящего исследования являлось изучение изменений, произошедших в гене ORF3 штамма ИС в ходе его адаптации к размножению в культуре клеток Vero. Для этого сравнивали первичную структуру гена ORF3 трёх вариантов вируса: штамма ИС, прошедшего 70 и 110 пассажей в культуре клеток (соответственно ИС70 и ИС110), и полевого изолята. В качестве референс-последовательности была взята последовательность гена ORF3 прототипного штамма CV777 вируса ЭДС (GenBank, NCBI, номер доступа Z24733).

Сравнительный анализ последовательностей ORF3 полевого изолята и эталонного штамма CV777 вируса ЭДС показал их идентичность на 97,5%. В нуклеотидных замен в позициях: 54 G -> A, 62 T -> C, 160 G -> A, 162 T -> C, 235 G -> A, 238 T -> G, 241, 243, 264, 274 C -> T, 301 G -> A, 450 C -> T, 481 G -> A, 497 A -> G, 579 G -> A, 586 A -> T и 588 T -> C (Рис. 7).

Сравнение последовательностей ORF3 ИС70, ИС110 и CV777 выявило делеции размером 29 и 38 нуклеотидов в 5’-концевом участке гена соответственно ИС70 и ИС110. Остальная часть последовательности всех трёх исследованных вариантов вируса имеет абсолютное сходство за исключением одной нуклеотидной замены в случае ИС70 и ИС110 (586 A -> T, Рис. 7).

2.2.2. ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ МАССОВОГО

КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСА

представляет повышение выхода культурального вируса. С целью получения максимально возможного выхода штамма ИС вируса ЭДС изучали зависимость накопления вируса в культуре клеток Vero от различных факторов: 1) состояния культуры клеток, 2) наличия следов сыворотки в среде, 3) дозы заражения и 4) способа культивирования (роллерная или статическая культура). Серию опытов проводили с длительно адаптированным вирусом (50-60 пассажей), обладающим выраженной репродукцией (значения инфекционной активности 4,50 – 5,50 lg ТЦД50/мл).

Клетки Vero выращивали в 1,5 л матрасах или в роллерных сосудах ёмкостью 3 л. В культуру клеток, выращенную в 1,5 л матрасах или в 3 л роллерных сосудах, вносили соответственно по 150 или 250 мл поддерживающей среды DMEM c антибиотиком и трипсином (5 мкг / мл).

Культуру клеток, выращенную различным способом, заражали вирусом одновременно и инкубировали при 370С до выраженного цитопатогенного эффекта (поражение не менее 80% клеток монослоя). Образцы вирусной культуральной жидкости перед титрованием для определения инфекционной активности вируса хранили при температуре не выше -200С. Инфекционную активность всех образцов вируса, полученных в одном опыте, определяли одновременно, используя культуру клеток одного посева.

Сравнивали накопление вируса ЭДС в культуре клеток Vero в зависимости от интенсивности клеточного роста (формирование монослоя на 85-90 и на 95-100%). После удаления ростовой среды и однократного промывания монослоя клеток раствором Хэнкса в культуральные сосуды вносили поддерживающую среду ДМЕМ, содержащую трипсин (5 мкг / мл) и вирус 75-85 пассажа (0,1 ТЦД50 / клетка). Накопление вируса определяли через 18 ч после заражения при ярко выраженном ЦПЭ. Инфекционную активность вируса определяли титрованием в культуре клеток Vero.

Из результатов, представленных в таблице 3, видно, что в культуре клеток с более развитым монослоем вирус накапливается в большем титре.

Наблюдения также показали, что возраст заражаемого монослоя Vero в пределах 48 - 96 ч имеет меньшее значение для накопления вируса ЭДС, чем численность (плотность) клеток в монослое.

Таблица 3. Накопление вируса в зависимости от интенсивности формирования клеточного монослоя поддерживающую в ней могут остаться следы сыворотки крови, которая угнетает репродукцию вируса ЭДС, представлялось целесообразным изучить значение такой возможности. Перед заражением однослойной культуры вирусом остатки ростовой среды, содержащей сыворотку, удаляли однократным промыванием раствором Хэнкса (20-25% объёма ростовой среды). В качестве контроля использовали культуру клеток без промывания раствором Хэнкса перед заражением.

Вирус (0,1 ТЦД50/клетка) вносили вместе с поддерживающей средой.

Накопление вируса в культуре определяли через 18 ч после инкубирования.

В культуре клеток, отмытой от ростовой среды, титр вируса был выше в 30-50 раз по сравнению с титром вируса в неотмытой культуре (таблица 4).

Это, вероятно, связано с частичной нейтрализацией трипсина остатками сыворотки ростовой среды.

Таблица 4. Влияние удаления следов ростовой среды перед заражением 2.2.2.2. Зависимость накопления вируса от дозы заражения Использовали культуру клеток с полностью сформированным монослоем (48 - 72 ч) и вирус 50 и 80 пассажа с исходным титром соответственно 5,00 и 5,50 lg ТЦД50/мл. После удаления ростовой среды и однократного промывания раствором Хэнкса культуру клеток заражали вирусом с множественностью 0,1; 0,01; 0,001 и 0,0001 ТЦД50/клетка. Через ч во всех заражённых культурах развился ЦПЭ, характерный для вируса ЭДС. Интенсивность ЦПЭ коррелировала с заражающей дозой вируса. Все культуры клеток инкубировали до развития выраженного ЦПЭ, т.е.

культуры, заражённые вирусом в дозе 0,1 и 0,01, инкубировали 18 часов, а в дозе 0,001 и 0,0001 – 42 часа.

Результаты этого исследования (таблица 5) показали прямую зависимость накопления вируса от дозы заражения неависимо от уровня пассажа. Накопление вируса было максимальным (5,33 - 6,23 lg ТЦД50/мл) в культуре клеток, инфицированной с множественностью заражения 0,01 и 0, ТЦД50/клетка.

Таблица 5. Накопление вируса ЭДС при различной дозе заражения вируса 2.2.2.3. Культивирование вируса ЭДС в роллерных Культуру клеток Vero, сформировавшую монослой на 95-100% в статических матрасах объёмом 1,5 л и в роллерных бутылях объёмом 3 л, после удаления ростовой среды использовали для выращивания вируса ЭДС.

Вирус 82-86 пассажей с исходным титром 5,50 - 6,00 lg ТЦД50 / мл вносили в дозе 0,1 ТЦД50 / клетка вместе с поддерживающей средой (содержащей трипсин в концентрации 5 мкг/мл) после удаления следов ростовой среды. В каждом опыте заражали по 3-5 сосудов со статической или роллерной культурой.

Урожай вируса собирали через 18 ч после заражения при ярко выраженном ЦПЭ.

Результаты исследования представлены в таблице 6. По накоплению вируса ЭДС оба способа культивирования практически не различались между собой и поэтому являются альтернативными.

2.2.2.4. Размножение штамма ИС в других линях клеток Данное исследование было проведено с целью возможного выявления высокопродуктивной линии клеток для производственного размножения штамма ИС вируса ЭДС. Изучали способность указанного штамма к размножению в культуре клеток перевиваемых линий различного происхождения (PK15, SK6, IB-RS2, MARC-145 и HRT). Прежде всего, Таблица 6. Накопление вируса в зависимости от способа культивирования Номер опыта интересовала возможность накопления вакцинного штамма в большем титре по сравнению с его накоплением в культуре клеток Vero.

Исходным материалом являлся штамм ИС 90 - 100 пассажа в культуре клеток Vero (5,50 – 6,00 lg ТЦД50 / мл). Размножение вируса в клеточных культурах различного происхождения определяли в течение нескольких серийных пассажей. Культуры клеток выращивали в пластиковых матрасах ёмкостью 50 см3.

Для заражения брали культуры клеток, сформировавшие монослой на 90-100% (24 - 48 ч после пересева). Перед заражением монослой дважды промывали от ростовой среды. В сосуды с отмытым монослоем вносили мл соответствующей ростовой среды без сыворотки, содержащей вирус в дозе 0,1-1,0 ТЦД50 на клетку и трипсин в концентрации 5 мкг/мл. За развитием ЦПЭ наблюдали в течение 96 часов. В качестве контроля использовали те же культуры клеток, не заражённые вирусом, а также заражённую и незаражённую культуру клеток Vero. Культуры замораживали в период развития ЦПЭ, а при его отсутствии – через 96 часов после заражения. После размораживания культуральную жидкость использовали для очередного пассажа в гомологичной линии клеток (серийные пассажи).

Результаты адаптации вируса к новым линиям клеток учитывали по развитию ЦПЭ, биопробе в культуре Vero и с помощью ПЦР анализа.

Из данных, приведенных в таблице 7, видно, что из 6 исследованных линий клеток чувствительными к размножению штамма ИС после пассажей в культуре клеток Vero оказались две линии: IB-RS2 и MARC-145.

Таблица 7. Чувствительность различных линий клеток к размножению вакцинного штамма ИС вируса ЭДС Пассаж Культура Происхождение вируса клеток Примечание. + наличие ЦПЭ, + сомнительный результат, - отсутствие В культуре клеток МАRC-145 штамм ЭДС прошёл пять серийных пассажей, максимальная активность вируса (4,23 lg/мл) была в первых двух пассажах. В ходе дальнейшего пассирования в данной культуре активность вируса снижалась и в пятом пассаже составила около 3,00 lg/мл.

В культуре клеток IB-RS2 вирус прошёл восемь серийных пассажей, максимальная активность была отмечена в шестом пассаже (4,76 lg/мл).

использованных культур клеток только Vero поддерживает репликацию штамма ИС на относительно высоком уровне, удовлетворяющем требованиям изготовления живой вакцины. Только культуру клеток Vero использовали в дальнейшем для производственного культивирования вируса.

Так как предыдущее исследование показало, что для массового культивирования штамма ИС пригодна только культура клеток Vero, было целесообразно сравнить его накопление в культуре различных доступных сублиний клеток Vero. Культуру клеток Vero трёх сублиний: испанской, английской и российской (Vero B) выращивали и заражали в одинаковых оптимальных условиях. В таблице 8 приведены значения инфекционной активности в расплодках вакцинного вируса ЭДС, выращенного в различных сублиниях клеток Vero. Из представленных в таблице 8 данных видно, что накопление вируса было сходным во всех использованных сублиниях клеток Vero. Любая из этих трёх сублиний клеток пригодна для производственного культивирования штамма ИС вируса ЭДС.

Таблица 8. Накопление штамма ИС в сублиниях клеток Vero для заражения Накопление вируса в сублинии, lg ТЦД50 / мл 2.2.3. РАЗРАБОТКА ТЕХОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ

И КОНТРОЛЯ ЖИВОЙ СУХОЙ ВАКЦИНЫ

В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ

результата, определивших дальнейшую стратегию разработки средств специфической профилактики ЭДС. Титр культурального вируса ЭДС повысился в ходе серийного пассирования в культуре клеток Vero, однако не достиг уровня, пригодного для изготовления инактивированной вакцины (> 107,0 ТЦД50/мл). Серийное пассирование полевого вируса ЭДС в культуре клеток Vero относительно быстро (25-30 пассажей) привело к потере вирулентности, что было установлено в опыте на новорождённых поросятах.

После потери вирулентности аттенуированный штамм вируса ЭДС ещё в течение длительного серийного пассирования в культуре клеток Vero сохранял выраженные антигенные и иммуногенные свойства. Эти данные определили возможность и целесообразность разработки живой вакцины на основе аттенуированного штамма ИС вируса ЭДС.

Были изготовлены экспериментальные серии живой вакцины против ЭДС: восемь серий сухой и три серии замороженной вакцины для проведения испытаний на безвредность (реактогенность) и сохранность в сухом и замороженном состояниях.

Живая вакцина против ЭДС получила название вакцина ВЕРРЕС -ЭДС.

Предстояло изучить влияние различных условий лиофилизации вакцины, допустимый срок хранения сухой вакцины и сохранность жидкой вакцины в замороженном состоянии.

Сохранность вируса ЭДС в процессе изготовления При производстве и использовании живых вакцин важное значение уделяется так называемой «холодовой цепи». Целью данного раздела работы являлась разработка способа производственного изготовления сухой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС и условий её хранения, обеспечивающих максимальную биологическую активность вакцинного вируса. Максимальное сохранение биологической активности вакцинного вируса в сухом препарате является особенно важным, если учесть, что в культуре клеток он накапливается в относительно низком титре (5,50 – 6,50 ТЦД50/мл). Для достижения этой цели необходимо было выбрать: наиболее эффективную для данного вируса стабилизирующую среду, оптимальный режим лиофилизации и метод ускоренной оценки стабильности сухой вакцины.

В процессе изготовления сухой вакцины определяли титр вируса до смешивания со стабилизатором, после смешивания со стабилизатором, после замораживания (перед сушкой), сразу после сушки и после испытания сухой вакцины методом ускоренного старения. В качестве исходного материала для приготовления сухой вакцины использовали вирус 45 - 114 пассажей в культуре клеток Vero c титром 5,50 - 6,33 lg ТЦД50 / мл.

Среда высушивания. Сравнивали протективную эффективность трёх защитных сред при лиофилизации вируса. Состав и способ приготовления сред №1, №2 и №3 и смешивание их с вирусной суспензией описан в главе 2.1.12 раздела «Материалы и Методы». Лиофилизацию вируса со всеми вариантами защитной среды проводили одновременно в аппарате Christ Alpha. Протективный эффект трёх защитных сред по биологической активности вакцинного штамма оценивали сразу после лиофилизации.

Из представленных данных (таблица 9) видно, что активность вируса активности вируса на этой стадии со средой №1, №2 и №3 соответственно составляла 0,00 – 0,24, 0,33 – 0,50 и 0,00 – 0,34 lg ТЦД50 / мл.

В процессе высушивания с защитной средой №1 или №2 вирус терял 0,50 - 0,84 lg ТЦД50 / мл, а с защитной средой №3 - 0,66 – 0,84 lg ТЦД50 / мл.

Таким образом, суммарное снижение активности вируса по сравнению с исходной культуральной суспензией составило 0,66 - 0,84; 1,00 – 1,24 и 0, – 1,00 lg ТЦД50 / мл при использовании соответственно защитной среды №1, №2 и №3.

Таблица 9. Активность вируса ЭДС при высушивании с тремя защитными желатиновая желатозная обезжиренное Для оценки стабильности вакцинного препарата в будущем при длительном хранении проводили испытание методом «ускоренного старения» (370С, 7 суток). В ходе ускоренного старения активность вируса снижалась на 1,00; 1,43 – 1,53 и на 1,33 – 1,66 lg ТЦД50 / мл соответственно в препаратах с защитной средой №1, №2 и №3.

Дополнительно была проведена сушка вирусной культуральной суспензии с консервированным концентрированным молоком (без предварительного обезжиривания), рН 7,2-7,4. Использовали культуральную суспензию с активностью вируса ЭДС 5,5 lg ТЦД50/мл. Вирусную суспензию смешивали с концентрированным молоком в отношениях 1:1, 2:1 и 4:1.

Образцы сушили в сублиматоре Christ alpha. В качестве контроля одновременно сушили смеси вируса с декстраново-желатинным и пептонножелатозным стабилизаторами в соответствующих пропорциях.

Из результатов этих исследований, представленных в Таблице 10, видно, что концентрированное молоко (обезжиренное и необезжиренное) в качестве защитной среды менее пригодно по сравнению с другими защитными средами. Увеличение концентрации молока в смеси не приводило к улучшению сохранности вируса в сухом препарате. Однако молоко хорошо защищало вирус при замораживании.

Таблица 10. Активность вируса при сушке с концентрированным молоком Содержание вирусной суспензии, % Результаты проведённых исследований показывают, что наиболее эффективной из испытанных защитных сред является декстрановожелатиновая (среда №1, таблица 9).

Изготовление экспериментальных серий сухой вакцины. С целью оценки воспроизводимости результатов изготовления сухой вакцины и дальнейшего изучения её свойств при хранении изготовили восемь экспериментальных серий сухой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС. Серии вакцины готовили из вируса, прошедшего 45-114 пассажей в культуре клеток Vero. Титр вируса в исходной культуральной суспензии был 4,33 - 6,33 lg ТЦД50 / мл. В качестве защитной среды использовали декстраново-желатиновый стабилизатор.

Лиофилизацию экспериментальных серий вакцины проводили в аппарате Christ Alpha, каждая серия насчитывала 80 – 100 флаконов.

Данные по изменению активности вируса в процессе изготовления восьми серий сухой вакцины представлены в Таблице 11. Определение инфекционной активности вируса на различных этапах изготовления вакцины показало, что после смешивания с защитной средой активность вируса снижалась не больше, чем на 0,16 lg ТЦД50 / мл, а в результате высушивания – на 0,50 – 0,84 lg ТЦД50 / мл. Суммарное снижение активности вируса по сравнению с исходной культуральной суспензией составляло 0,50 lg ТЦД50 / мл. В результате ускоренного старения инфекционная активность вируса в сухой вакцине снижалась на 1,00 – 1,23 lg ТЦД50 / мл.

Эти данные согласуются с результатами, приведёнными в таблице 9 и свидетельствуют о воспроизводимости выбранного режима изготовления сухой вакцины. Выбранный режим использовали в дальнейших исследованиях, а также при изготовлении производственных серий сухой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС.

Сохранность вакцинного штамма в сухой вакцине Для определения срока годности вакцины образцы всех восьми экспериментальных серий помещали на хранение при +2 - +80С (согласно инструкции по применению вакцины ВЕРРЕС-ЭДС). Через различный срок хранения (3, 6, 9 и 12 месяцев) определяли биологическую активность вакцины. Все серии вакцины, как указано выше, также были испытаны в режиме «ускоренного старения» (Материалы и Методы, глава 2.1.16).

Результаты этого исследования приведены в Таблице 12. Через каждые три месяца хранения активность вируса в сухой вакцине снижалась на 0,00 lg ТЦД50 / мл, за 12 мес хранения активность вируса снижалась на 0,50 – 0,83 lg ТЦД50 / мл. При испытании в режиме ускоренного старения активность вируса в вакцине снижалась на 1,00 – 1,23 lg ТЦД50 / мл (в большинстве случаев на 1,00 lg ТЦД50 / мл).

Таблица 11. Изменение активности вируса в процессе изготовления экспериментальных сериях сухой вакцины В скобках указано снижение инфекционной активности вируса по сравнению с предыдущим этапом изготовления вакцины Изучение стабильности сухой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС при испытании в режиме ускоренного старения в сравнении с её сохранностью при +2-+80С в течение 12 месяцев показало ценность данного метода для предварительной оценки будущей стабильности вакцины при длительном хранении. Так, испытание 8 серий сухой вакцины методом ускоренного старения показало снижение титра инфекционности на 1,00 – 1,23 lg ТЦД50 / мл (в среднем на 1,00 lg), тогда как те же серии вакцины через 12 месяцев хранения при +2С снижали активность на 0,50-0,83 lg ТЦД50 / мл (в среднем на 0,70 lg). Из результатов этого исследования можно сделать следующее заключение: если при ускоренном старении сухой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС биологическая активность вакцинного штамма вируса снижается на 1,00 lg ТЦД50 / мл, можно с большой долей вероятности утверждать, что при хранении в течение Таблица 12. Активность вируса в экспериментальных сериях сухой вакцины 12 месяцев при +2-+80С его активность снизится не больше, чем на 0,83 lg ТЦД50 / мл.

Таким образом, метод ускоренного старения представляет интерес как экспресс метод оценки, новых стабилизаторов, режимов сублимации и в целом качества сухих вакцин.

Сохранность вакцинного штамма в замороженном При изготовлении и использовании живой вакцины против ЭДС часто возникает необходимость хранения культурального вируса при умеренно низкой температуре. В этой связи изучали сохранность вакцинного вируса при температуре -18 - -200С. С этой целью были изготовлены три экспериментальные расплодки вакцинного вируса 50 – 70 пассажей.

Вирусную суспензию смешивали с декстрановым стабилизатором в отношении 7:3 (как при изготовлении сухой вакцины), разливали по 10 мл в 10 мл стеклянные флаконы и хранили при -18 - -200С. Инфекционную активность вируса определяли перед замораживанием и через 1, 2, 3, 6, 9 и месяцев хранения в замороженном состоянии.

Таблица 13. Сохранность вируса в процессе хранения в замороженном Результаты, представленные в таблице 13, показали, что при выбранных условиях хранения культуральный вирус снижал инфекционную активность не более чем на 1,0 lg в течение 12 месяцев (срок наблюдения), что сравнимо с потерей его активности в сухом препарате при +2 – +80С.

альтернативными способами хранения живой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС.

Хранение расплодки вакцинного штамма ИС в замороженном состоянии может быть полезным при экстренной необходимости иммунизации свиней против ЭДС в практических условиях.

2.2.3.2. Контроль вакцины на безвредность и реактогенность Безвредность аттенуированного штамма ИС и сухой вакцины проверяли на морских свинках массой 350-400 г. Испытуемые препараты вводили однократно внутримышечно в область бедра. Вакцинный вирус и сухую вакцину вводили трём морским свинкам в дозе 4,0 lg ТЦД50 в объёме 2 см3. За морскими свинками наблюдали в течение 10 дней. Все испытуемые препараты:

вакцинный вирус 36 - 40 пассажей и 2 сухая вакцина серий 1 и 2, оказались безвредными при контроле на морских свинках.

ЖИВОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ЭДС

Предыдущие исследования показали безвредность и эффективность живой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС в экспериментальных условиях. Для иммунизации свиней против ЭДС в производственных условиях необходимо было определить схему введения вакцины. В связи с этим на данном этапе работы изучали антигенность (иммуногенность) вакцинного штамма в зависимости от способа введения, прививочной дозы вируса и кратности вакцинации.

В качестве предварительного этапа провели оценку применения живой вакцины против ЭДС на серонегативных свиньях двух технологических групп: супоросных свиноматках (возраст 3,5 – 4 года) и поросятах послеотъёмного возраста (35-40 дней), с использованием различных способов введения живой вакцины, а также последовательности применения живой и инактивированной «кишечной» вакцин (Материалы и методы, глава 2.1.9).

Для иммунизации свиней применяли вакцинный вирус в виде инактивированную «кишечную» вакцину против ЭДС (таблица 14). Наличие и выраженность иммунитета определяли по титру ВНА в сыворотке крови свиней через 21 день после вакцинации и через 15 дней после ревакцинации.

ВНА в высоком титре обнаружены в сыворотке крови и молозиве вакцинированных свиноматок, а также в сыворотке крови их потомства. Титр Таблица 14. Схема применения двух вакцинных препаратов Примечания. Орально: вакцинный вирус в дозе 5,66 lg ТЦД50 свиноматкам В/М жив.: живой вакцинный вирус внутримышечно в дозе 5,0 lg ТЦД В/М инакт.: инактивированная вакцина внутримышечно в объёме 5 мл ВНА в молозиве при вакцинации по схеме 1 был выше, чем по схеме (таблица 15). Высокий титр ВНА в крови новорождённых поросят указывает на эффективную передачу колостральных антител потомству. Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии преимущества ревакцинации супоросных свиноматок инактивированной вакциной против ЭДС.

Таблица 15. Сероконверсия у вакцинированных свиноматок и колостральный иммунитет у их потомства