«ХАРАКТЕРИСТИКИ СТРУКТУРЫ И СВОЙСТВА БЕЛКОВ СИСТЕМ ИНФИЦИРОВАНИЯ БАКТЕРИОФАГОВ Т4 И PHIKZ И НЕКОТОРЫХ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ ...»

Федеральное государственное бюджетное учреждение наук

и

Институт биоорганической химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

На правах рукописи

Симакова Мария Николаевна

ХАРАКТЕРИСТИКИ СТРУКТУРЫ И СВОЙСТВА БЕЛКОВ

СИСТЕМ ИНФИЦИРОВАНИЯ БАКТЕРИОФАГОВ

Т4 И PHIKZ И НЕКОТОРЫХ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ

03.01.02 – биофизика

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Научный руководитель:

доктор химических наук Мирошников Константин Анатольевич Москва

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 ПРОБЛЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ И СВОЙСТВ

ВИРУСНЫХ И МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ (литературный обзор)

1.1 Сведения о структуре бактериофага Т4………

1.2 Адсорбция бактериофага Т4 на бактерии

1.3 Длинные хвостовые фибриллы (ДХФ)

1.3.1 Функциональная роль ДХФ

1.3.2 Физико-химические характеристики белкового комплекса ДХФ……. 1.3.3 Структурная характеристика белков ДХФ

1.4 Короткие хвостовые фибриллы (КХФ)

1.4.1 Функциональная роль КХФ

1.4.2 Молекулярная организация КХФ

1.5 Бактериофаг phiKZ…………………………………………………….……. 1.6 Фаговая терапия. Энзибиотики………………………………………..…… 1.7 Мембранные белки……………………………………………………….…. 1.7.1 Бактериородопсин в пурпурных мембранах галобактерий……….…… 1.7.2 Структура и фотоцикл бактериородопсина………………………….….. 1.7.3 Экспрессия бактериородопсина в различных системах………….…….. 1.7.4 Практическое применение бактериородопсина в технике………….….. 1.8 Методы теоретического исследования структуры белков…………..…… 1.9 Вторичная структура белков

1.9.1 Варианты -спирального coiled-coil

1.9.2 Элементы -структуры в фибриллярных белках вирусов и бактериофагов

1.9.3 Элементы вторичной структуры в трансмембранных белках …….….. 1.10 Выводы по главе и постановка задач исследования…………………......

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ИССЛЕДОВАНИЙ…………….....…. 2.1 Материалы, использованные в эксперименте по исследованию белков бактериофагов Т4 и phiKZ (штаммы, ферменты, реактивы)

2.2 Материалы, использованные в эксперименте по исследованию бактериородопсина и его делеционных мутантов (штаммы, ферменты, реактивы)………………………………………….. 2.3 Методы генной инженерии

2.3.1 Методы генной инженерии, использованные в эксперименте по исследованию белков бактериофагов Т4 и phiKZ………………………………………………………………… 2.3.2 Особенности методов генной инженерии, использованных при исследовании белка gp181 бактериофага phiKZ с помощью направленного делеционного мутагенеза………………………….…… 2.3.3 Методы генной инженерии, использованные при исследовании бактериородопсина и его делеционных мутантов……………………………………………. 2.4 Методы компьютерного анализа и биоинформатики, применяемые для теоретического исследования белков…………………………………….. 2.4.1 Методы биоинформатики для исследования периодичности расположения аминокислот в фибриллярных белках бактериофага Т4………………………………………………………….. 2.4.2 Вычислительные методы предсказания вторичной структуры мембранных белков по их аминокислотной последовательности……. 2.5 Заключение по главе 2………………………………………………….…... ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ….…... 3.1 Исследование периодичности расположения аминокислот в фибриллярных белках и литических ферментах бактериофагов Т4 и phiKZ методами биоинформатики …………………………………. 3.2 Экспериментальное исследование белков систем инфицирования бактериофагов Т4 и phiKZ …………

3.3 Результаты предсказания вторичной структуры мембранных белков вычислительными методами по их аминокислотным последовательностям……………………………………………...………. 3.4 Экспериментальное исследование бактериородопсина (bR) и его делеционных мутантов……………………………………………… ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Белки играют чрезвычайно важную роль почти во всех биологических процессах. Они имеют разнообразное строение и функционируют в различных клетках и тканях. Поэтому исследование структуры белков, которая определяет их функциональные свойства, является очень важной, интересной и актуальной проблемой для молекулярной биологии, медицины и фармакологии.

В природе существует группа (биологический таксон) различных вирусов - бактериофагов, объединенных одним общим признаком: все они размножаются в бактериальных клетках. Бактериофаги имеют важное значение при изучении структурно-функциональной организации биологических макромолекул и механизмов сборки надмолекулярных комплексов и вирусов [1-7]. Классическим объектом для изучения на молекулярном уровне является бактериофаг Т4.

Вирусные фибриллярные белки и литические ферменты играют основную роль в процессе инфицирования вирусом клетки-хозяина. Поэтому определение структуры таких белков, изучение их функциональных доменов и механизмов их взаимодействий с клеточными рецепторами являются очень важными аспектами в развитии методов контроля и борьбы с вирусными инфекциями.

Фибриллярные белки и литические ферменты вирусов являются также удобными модельными объектами для изучения механизмов генетической рекомбинации и фолдинга белка.

Кроме того, такие области медицинской биоинженерии, как, например, генная терапия или терапия рака, основаны на использовании вируса как носителя здорового гена или как "оружия" против раковых клеток. Поэтому изучение структур и свойств вирусных белков, их классификация, а также создание искусственных белков методами белковой инженерии являются не только интересными, но и необходимыми задачами.

Мембранные белки являются основными участниками очень большого числа клеточных процессов. С помощью мембранных белков осуществляется транспорт внутрь клетки и наружу огромного количества различных ионов, питательных веществ, отходов, гормонов, лекарств и таких больших молекул, как белки и ДНК.

Мембранные белки также в значительной мере ответственны за коммуникацию между клетками и окружающей их средой и за процессы энергетического обмена.

Клетки производят огромное количество мембранных белков. Так, приблизительно 25% генов в геноме человека кодируют мембранные белки.

Медицинское значение при изучении этого огромного семейства белков не может быть переоценено. Мутации, происходящие в мембранных белках, являются причинами возникновения большинства распространенных заболеваний, таких как болезни сердца и головного мозга, а также рак. Таким образом, с биомедицинской точки зрения можно отметить, что мембранные белки составляют приблизительно 50% возможных мишеней для применения новых лекарственных препаратов, начиная от препаратов, действующих на нервную систему, и до новой антимикробной терапии.

Поэтому изучение структуры и функциональных свойств мембранных белков является одной из самых актуальных задач современной структурной биологии.

Диссертационная работа выполнялась в ИБХ им. Шемякина и Овчинникова РАН, в Институте комплексных систем Научноисследовательского центра г. Юлиха (Германия), Институте структурной биологии г. Гренобля (Франция).

финансовой поддержке РФФИ по проектам № 02-04-50012-a и № 05-04a, а также по плану НИР для государственного контракта № 02.740.11.0299 по теме: “Клеточная биология и физические свойства мембранных белков”.

Целями и задачами данной работы явились исследования структуры и свойств 3-х типов белков, а, именно: фибриллярных белков бактериофага Т Escherichia coli, литического фермента бактериофага phiKZ Pseudomonas aeruginosa бактериородопсина Halobacterium salinarum с использованием комбинации теоретических и экспериментальных методов.

В теоретической части исследований, включающей применение методов биоинформатики и компьютерного моделирования, цель работы достигалась решением следующих задач.

1. Выбор оптимального варианта преобразования Фурье для анализа периодичности аминокислотных последовательностей в различных белках. Исследование периодичности расположения аминокислот в фибриллярных белках бактериофага Т4 и анализ аминокислотной последовательности литического фермента бактериофага phiKZ Pseudomonas aeruginosa преобразования Фурье с целью предсказания вторичной структуры этих белков.

2. Применение оптимального варианта метода Фурье для исследования периодичности расположения аминокислот гидрофобной группы в последовательностях мембранных белков для предсказания их вторичной структуры; разработка и использование нового метода компьютерного анализа расположения трансмембранных участков белков, основанного на применении функции и шкалы гидрофобности для предсказания вторичной структуры мембранных белков; сравнение оптимизированного метода преобразования Фурье и нового метода компьютерного анализа расположения трансмембранных участков белков между собой и с другими известными методами.

В экспериментальной части исследований, включающей использование ряда генетических, биохимических и биофизических методов, цель работы достигалась решением следующих задач.

1. Создание плазмидных векторов для рекомбинантной экспрессии в клетках E. coli двух фибриллярных белков – продуктов генов бактериофага Т4 E.

coli, Halobacterium salinarum и нескольких его делеционных мутантов.

препаративных количествах для предполагаемой последующей кристаллизации, решения их структуры и выяснения функций.

3. Исследование ферментативной активности нескольких делеционных мутантов литического фермента бактериофага phiKZ, а также анализ их КД-спектров.

Научная новизна работы заключается в следующем.

1. С использованием наиболее оптимального преобразования Фурье установлена определенная периодичность в 8-ми исследованных белках систем инфицирования бактериофагов Т4 и phiKZ (для 6-ти из них впервые) и в 24-х мембранных белках. Для 2-х вирусных и 14-ти мембранных белков установлено, что полученные результаты о периодичности согласуются с известными данными об их структуре.

2. Впервые обнаружены относительно большие периоды расположения аминокислот, которыми последовательности всех 6-ти исследованных фибриллярных белков бактериофага Т4 делятся на 4 или 6 равных частей.

3. Впервые получены экспериментальные данные о ферментативной активности и структуре рекомбинантных белков, выделенных при экспрессии делеционных мутантов литического фермента бактериофага phiKZ.

Так, было установлено, что белок gp181E, полученный в результате экспрессии делеционного мутанта, кодирующего С-концевую часть литического фермента, является гидрофобным и взаимодействует с различными штаммами клеток Pseudomonas aeruginosa, но не лизирует их, в отличие от белка, полученного при экспрессии делеционного мутанта gp181MA, кодирующего лизоцимный домен литического фермента.

С помощью гель-фильтрации было установлено, что белок gp181E является не мономером, а димером или тримером.

Анализ КД-спектров полученных рекомбинантных белков привел к выводу о том, что их вторичная структура, по-видимому, представляет собой -спиральный coiled coil.

Теоретическое предположение о роли C-концевого домена литического участвующей в процессе инфицирования бактериофагом phiKZ клетки, вышеприведенными новыми данными о свойствах делеционных мутантов gp181.

4. Плазмида pUCBM20 и модифицированная плазмидная конструкция NTS1на основе белков MBP и TrxA впервые были использованы для клонирования и экспрессии бактериородопсина и двух его делеционных мутантов в E. coli.

Теоретическая и практическая значимость работы.

1. Данные о периодичности фибриллярных белков бактериофага Т4, полученные с помощью преобразования Фурье, впоследствии были использованы при конструировании методами генной инженерии биологически активного химерного белка, состоящего из фрагмента фибриллярного белка gp37 и C-концевого домена белка gp5 бактериофага Т4. Технология с использованием такого химерного белка в дальнейшем позволила преодолеть ряд проблем рекомбинатной экспрессии целевого белка gp37.

2. Полученные данные о периодичности исследованных белков в сочетании с результатами кристаллографических и электронно-микроскопических экспериментов могут быть полезными при установлении для этих белков элементов вторичной и третичной структуры.

3. Сравнение результатов, полученных в данной работе путем компьютерного анализа аминокислотных последовательностей мембранных белков с известными данными об их структуре, показало применимость обоих предложенных методов: оптимизированного метода преобразования Фурье и нового метода компьютерного анализа расположения трансмембранных участков белков как по отдельности, так и совместно, для предсказания признаков неизвестной вторичной структуры 24-х мембранных белков и обусловленных этими признаками функциональных свойств этих белков. Ценность обоих методов простота, быстрота и экономичность применения.

4. Результаты, полученные в экспериментах по клонированию и экспрессии бактериородопсина и двух его делеционных мутантов в E. coli, могут иметь практическое значение при решении проблемы выбора определенной гетерологичной системы для экспрессии конкретного мембранного белка. Они частично отвечают на вопрос: почему для экспрессии специфического мембранного белка стоит (или не стоит) использовать определенный вектор в сочетании с клеткой-хозяином и условиями культивирования? Так, полученные нами экспериментальные данные показали, что экспрессионная система на основе белков MBP и TrxA, впервые использованная для экспрессии бактериородопсина в E.

coli, не является оптимальной из-за малого выхода целевого белка и трудностей, возникающих в процессе его очистки.

Автор защищает следующие положения.

1. Обоснование выбора метода преобразования Фурье для анализа периодичностей аминокислотных последовательностей в различных белках, оптимального по наибольшей достоверности частотного спектра Фурье, простоте алгоритма и экономичности вычислений.

2. Применение выбранного оптимального метода преобразования Фурье к анализу периодичности расположения аминокислот в фибриллярных белках бактериофага Т4 и белке gp181 бактериофага phiKZ Pseudomonas aeruginosa, что в результате позволило выявить в последовательностях аминокислот, но и относительно большие периоды их следования.

3. Предсказание структурных особенностей белков систем инфицирования использованное при создании плазмидных векторов для экспрессии 3-х делеционных мутантов белка gp181 с последующим выделением и очисткой полученных рекомбинантных белков.

4. Экспериментальное исследование ферментативной активности 2-х мутантов белка gp181, анализ их КД-спектров, выводы о вторичной структуре С-концевого домена белка gp181 бактериофага phiKZ,.

5. Разработку и применение, наряду с вышеупомянутым оптимизированным методом преобразования Фурье, нового метода компьютерного анализа расположения трансмембранных участков мембранных белков для предсказания вторичной структуры этих белков, основанного на предпочтительного по сравнению методом Фурье и другими известными методами.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на Национальных и Международных конференциях:

“Математические методы в технике и технологиях” - XXV Международная научная конференция (Харьков, 2012), “Математические методы в технике и технологиях” - XVII Международная научная конференция (Кострома, 2004), биотехнологии” - XVI Зимняя молодежная научная школа ИБХ РАН (Москва, 2004), “Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук” - XLVI Научная конференция МФТИ (Москва-Долгопрудный, 2003), и на научных семинарах:

в Лаборатории молекулярной биоинженерии ИБХ РАН (Москва, 2003-2005), в Институте Комплексных Систем (ICS-5: Молекулярная биофизика, 2009Научно-исследовательского центра г. Юлиха (г. Юлих, Германия), Институте Структурной Биологии (г. Гренобль, Франция, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, глав, включая Литературный обзор, Материалы и методы исследований, Результаты исследований и их обсуждение, и заключения, содержит страниц основного текста, 48 рисунков, 7 таблиц, список цитируемой литературы из 196 наименований. Общий объем - 181 с.

ГЛАВА 1 ПРОБЛЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ И

СВОЙСТВ ВИРУСНЫХ И МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ

1.1 Сведения о структуре бактериофага Т Бактериофаг Т4 E. coli является одним из самых сложных по строению вирусов [8]. Вирус состоит из капсида с геномной линейной двухцепочечной ДНК, сократительного чехла и базальной пластинки, к которой прикреплены хвостовые фибриллы (рисунок 1.1). Геном фага имеет размер около пар оснований и содержит порядка 300 открытых рамок считывания [9].

Рисунок 1.1 - Бактериофаг Т4: a – капсид с геномной ДНК, b – хвост, Капсид имеет форму икосаэдра. Хвост состоит из сократимого чехла, жесткого полого стержня и базальной пластинки. Именно хвост отвечает за введение фаговой ДНК в клетку-хозяина и обеспечивает высокую эффективность инфицирования, доходящую до 100%. Головка фага присоединена к хвосту с помощью воротничка с бакенбардами. Длинные хвостовые фибриллы отвечают за специфичность узнавания клетки-хозяина.

1.2 Адсорбция бактериофага Т4 на бактерии Инфицирование фагом клетки E. coli начинается с обратимого связывания длинных хвостовых фибрилл (ДХФ) с липополисахаридными рецепторами на поверхности бактерии [11]. После того как произошло связывание не менее 3-х ДХФ, короткие хвостовые фибриллы (КХФ) разворачиваются под базальной пластинкой и необратимо связываются с другим типом рецепторов на внешней мембране клетки-хозяина [12]. Затем происходит реорганизация базальной пластинки из шестиугольной формы в форму шестиконечной звезды [12]. Одновременно с этим инициируется сокращение фагового чехла, и происходит инжекция фаговой ДНК в цитозоль клетки через хвостовой стержень, который проникает под мембрану бактерии [11]. В результате сокращения длина фагового чехла уменьшается с 95 нм до 38 нм. Это проникновение осуществляется благодаря комплексу белков gp5 и gp27 (в составе базальной пластинки), который, проходя сквозь внутреннюю мембрану, разрушает слой пептидогликана, позволяя ДНК бактериофага оказаться внутри клетки бактерии [13].

функциональный домен, обладающий свойствами лизоцима [14]. Данный белок входит в состав “машины” проникновения ДНК в клетку и состоит из трех доменов (рисунок 1.2).

Рисунок 1.2 - Схематичная презентация доменов в gp5 бактериофага Т4 [13] пептидогликанового слоя для последующего расщепления лизоцимным доменом. Лизоцимный домен gp5* локализован на С-конце молекулы. Он связан линкером 1 с богатым -структурами ОВ доменом и с помощью линкера 2 - с -структурным доменом на С-конце молекулы.

Между С-концевым доменом и доменом лизоцима локализован сайт расщепления gp5 при созревании. C-концевой домен представляет собой структурный домен, который, по-видимому, входит в цилиндрическую проникновения ДНК внутрь клетки (рисунок 1.3).

Рисунок 1.3 - Структура комплекса белков gp5-gp27 [13] Когда gp5 встраивается в состав базальной пластинки бактериофага Т4, происходит протеолитическое расщепление gp5 с образованием двух продуктов: gp5* и gp5С, причем оба из них остаются в структуре базальной пластинки. Gp5С – это SDS-устойчивый белок с богатой -структурной составляющей [15]. Комплекс gp5 и gp27, наблюдаемый и in vitro, и in vivo, образует гетералогичный ансамбль (gp27-gp5*-gp5С)3. При повышении температуры комплекс распадается на три гетеродимера (gp27-gp5*) и гомотример (gp5С)3.

Процесс инфицирования не требует энергии извне. Спустя 30 минут после инфицирования происходит разрушение бактериальной клетки, и из нее выходят около 100 новых фаговых частиц.

1.3 Длинные хвостовые фибриллы (ДХФ) 1.3.1 Функциональная роль ДХФ Длинные хвостовые фибриллы инициируют адсорбцию фага на поверхности бактериальной клетки [16]. Мутанты бактериофага, в которых отсутствуют ДХФ, неинфекционны. Однако при этом присоединение таких мутантов к бактерии наблюдается, хотя оно и не сопровождается сокращением хвостового чехла и вводом фаговой ДНК в цитозоль клеткихозяина [17]. Известно, что связывание всех длинных и коротких фибрилл с клеточными рецепторами является необратимым [18], однако точное количество рецепторов, необходимое для этого, не определено. При взаимодействии с рецепторами трех длинных хвостовых фибрилл из шести связывание фага с клеткой является обратимым [11].

Процесс прикрепления бактериофага Т4 к поверхности клетки E. coli осуществляется при взаимодействии дистальной (удаленной от базальной пластинки) части ДХФ с глюкозно-гептозным участком липополисахаридных рецепторов клетки [11]. Непосредственной группой взаимодействия является терминальная -(1-4)-глюкоза [19]. Адсорбция фага с помощью длинных фибрилл сопровождается механизмом запуска структурной реорганизации базальной пластинки, в результате которой происходит сокращение чехла и введение ДНК в клетку [11, 12]. Предполагают, что по длинным хвостовым фибриллам передается сигнал (вероятно, через медиатор – белок gp9) о наличии соответствующих рецепторов, после чего начинается конформационная перестройка базальной пластинки [20, 21]. После присоединения к клеточной стенке коротких фибрилл перестройка базальной пластинки завершается.

1.3.2 Физико-химические характеристики белкового комплекса Препарат длинных хвостовых фибрилл был впервые выделен в году в результате разрушения фага [22]. В дальнейшем были разработаны методики получения длинных хвостовых фибрилл и в неденатурирующих условиях [23, 24]. Согласно результатам, полученным с помощью электронной микроскопии, длинные хвостовые фибриллы имеют размеры 150 х 4.5 нм с утолщением в середине, которое разделяет их на две части по отношению к базальной пластинке фага – проксимальную (прилежащую к базальной пластинке) и дистальную (удаленную) [25]. Дистальная и проксимальная половинки фибрилл расположены друг к другу под углом около 156o. Они соединены жестко, но нековалентно. С базальной пластинкой ДХФ связаны подвижно, что позволяет им перемещаться относительно частицы фага.

В формировании фибрилл участвуют шесть генов, из которых четыре кодируют структурные белки – gp34, gp35, gp36 и gp37, а два другие гена кодируют белки – gp38 и gp57, которые помогают при сборке, но не включаются в конечную структуру. Впоследствии были определены нуклеотидная последовательность этих генов и аминокислотный состав кодируемых ими структурных белков [1, 26]. Молекулярные массы белков представлены в таблице 1.1.

Стехиометрия белкового комплекса длинных хвостовых фибрилл в течение длительного времени не была точно установлена. Данные, полученные при исследовании белков расчетными методами [27], анализом нуклеотидной последовательности генов [2], количественным SDSэлектрофорезом c использованием красителей [28] и радиоактивных меток [29] и сканирующей электронной микроскопией (STEM) [30], существенно различались. Однако в результате совершенствования экспериментальных методик и накопления сведений о структурной организации других фибриллярных белков вирусной природы, а также коротких хвостовых фибрилл бактериофага Т4 [31], была выдвинута гипотеза [30], что для длинных хвостовых фибрилл бактериофага Т4 характерна тримерная организация структурных белков, т.е. стехиометрическое соотношение белков gp35, gp34, gp36, gp37 составляет соответственно 1:3:3:3.

Из экспериментальных данных известно, что проксимальная часть длинных хвостовых фибрилл является гомоолигомером gp34. Дистальная же часть сформирована продуктами трех генов: gp35, gp36 и gp37 [2, 27].

Сборка дистальной половинки начинается с тримеризации gp37, в результате чего образуется предшественник фибриллы длиной около 65 нм [2]. На следующем этапе присоединяются три копии gp36 c удлинением предшественника на 17 нм [2]. Формирование длинных хвостовых фибрилл соединителя двух половинок фибрилл.

Таблица 1.1 - Молекулярные массы белков длинных хвостовых фибрилл [2, 27] масса, кДа 1.3.3 Структурная характеристика белков ДХФ экспериментальные сложности в получении белков длинных хвостовых фибрилл в индивидуальном состоянии, как выделенных из бактериофага, так и рекомбинантных. Поэтому анализ их структурной организации в основном проксимальной и дистальной половинках длинных хвостовых фибрилл выявлены все канонические элементы вторичной структуры, существование которых подтверждено анализом спектров кругового дихроизма [24, 25] (таблица 1.2).

Таблица 1.2 - Содержание элементов вторичной структуры (%) в длинных хвостовых фибриллах бактериофага Т4 (расчет из спектров кругового дихроизма) [24] (gp36 + gp37) Высокоразрешающая микроскопия STEM позволила выделить в структуре длинных хвостовых фибрилл ряд характерных доменов [30], помимо ранее известного проксимального утолщения [2].

глобулярных домена (Р3 – Р5). Дистальная часть состояла из набора утолщений разных размеров, распределенных вдоль нитей [32]. Позже положение утолщений было уточнено и открыто еще три домена (D1 – D3), Распределение доменов длинных хвостовых фибрилл по массе позволило сопоставить их положение и аминокислотную последовательность с высокой точностью (рисунок 1.4, таблица 1.3).

Рисунок 1.4 - Изображения длинной хвостовой фибриллы (b), а также проксимальной (а) и дистальной (с) ее частей, полученные микроскопией STEM темного поля. Положение соединительного “колена” ДХФ указано на (b). Домены ДХФ указаны на (d) [30] Таблица 1.3 - Положение и массы доменов длинных хвостовых фибрилл [21] Между самими модулями одного и того же белка гомология практически не наблюдается, в то время как с аналогичными модулями подобных белков других фагов гомология последовательности порой достигает 90% [30, 31, 33].

Особый интерес вызывает структура домена, расположенного на Сконце gp37, который представляет собой тонкую, но жесткую “иглу” размером ~ 2.5 15 нм на конце дистальной половинки длинных фибрилл.

Этот домен (D11) содержит шесть гомологичных мотивов TxxxGxHxH или “гистидиновых рамок” [34]. Существенное содержание остатков глицина позволяет предположить, что структура “иглы” отличается от структуры остальной части длинных хвостовых фибрилл. В качестве гипотетической структуры домена D11 была предложена полиглициновая тройная спираль типа II [35], которая имеет расчетную плотность ~1.0 нм/кДа, что недопустимо ниже значения, полученного экспериментально [30].

Альтернативная гипотеза предполагает наличие в “игле” коллагеноподобной тройной спирали [36], что лучше согласуется с экспериментальными данными. Эта модель, однако, не обеспечивает жесткость, наблюдаемую в домене D11 ДХФ. Таким образом, вопрос о структуре “иглы”, равно как и остальных частей длинных хвостовых фибрилл, остается открытым.

Интересным является также исследование функциональных свойств домена D11. Именно “игла” длинных хвостовых фибрилл содержит сенсоры, которые распознают липополисахаридные рецепторы на поверхности клетки E. coli. Другие вирусы Т-четной группы имеют сходную локализацию сенсоров, которые, тем не менее, реагируют на другие типы рецепторов [2, 26, 37]. Установлено, что количество гистидиновых рамок и их взаимное расположение существенно влияет на специфичность выбора бактериофагом клетки-хозяина [37]. Таким образом, исследование структуры “иглы” длинных хвостовых фибрилл интересно не только с точки зрения структурной биологии, но и представляет практический интерес для генетики и медицины.

1.4 Короткие хвостовые фибриллы (КХФ) 1.4.1 Функциональная роль КХФ Короткие хвостовые фибриллы входят в состав базальной пластинки бактериофага Т4. Они представляют собой протяженные структуры, которые обеспечивают необратимость адсорбции и инфекционность фага [38, 39].

липополисахаридными рецепторами на поверхности клеточной стенки, короткие фибриллы, находящиеся в свернутом состоянии, разворачиваются и взаимодействуют со своими клеточными рецепторами. После разворачивания фибрилл, которое приводит к перестройке базальной пластинки из гексагональной формы в форму шестилучевой звезды, длина коротких хвостовых фибрилл становится равной 40 нм [16]. Этот процесс вызывает сокращение хвостового чехла и последующее введение ДНК фага в бактериальную клетку [20].

Известно, что рецепторами для длинных хвостовых фибрилл являются липополисахариды клеточной стенки E. coli [11, 19]. Вероятно, рецепторы коротких хвостовых фибрилл, которые также имеют липополисахаридную природу, отличаются от рецепторов, необходимых для взаимодействия с длинными хвостовыми фибриллами. Было показано, что участки связывания с клеточными рецепторами у длинных и коротких фибрилл имеют гомологию аминокислотной последовательности, но не идентичны [40]. Также наблюдается взаимодействие коротких фибрилл с рецепторами клеток E. coli штамма В/4, на котором не могут сорбироваться длинные хвостовые фибриллы [41].

Короткие хвостовые фибриллы обеспечивают инфекционность фаговой частицы. Дефектные фаговые частицы, у которых отсутствуют короткие хвостовые фибриллы, не являются инфекционными [39, 42], в то время как обработка клетки E. coli изолированными короткими фибриллами или полными фагами приводит к ее гибели [38]. Механизм инфицирования пока до конца не определен, хотя предполагается, что короткие хвостовые фибриллы принимают участие в образовании трансмембранных каналов.

Добавление фага Т4 или коротких фибрилл к суспензии компетентных клеток E. coli приводит к утечке ионов калия из клетки и нарушению энергетического потенциала мембраны [42].

1.4.2 Молекулярная организация КХФ Структурный белок коротких хвостовых фибрилл бактериофага Т кодируется геном 12, входящим в кластер поздних генов базальной пластинки [39, 40]. Каждая короткая фибрилла является гомотримером gp12 [38, 43], в состав которого также входит 1 атом цинка на каждую копию gp12 [43]. В сборке коротких хвостовых фибрилл участвует собственный шаперон бактериофага Т4 – gp57 [27]. При изучении структурной организации коротких хвостовых фибрилл и gp12 возникают некоторые затруднения, связанные с тем, что выделенный белок сильно агрегирует и необратимо сорбируется на многих хроматографических носителях [39, 41]. Была разработана методика выделения и очистки gp12 в присутствии мочевины и последующего рефолдинга [42], а также выделения целых КХФ в неденатурирующих условиях [31]. С помощью этой методики удалось получить относительно стабильный в растворе препарат, исследование которого позволило получить ряд детальных сведений о структуре и функциях gp12.

По данным электронной микроскопии длина коротких хвостовых фибрилл составляет 38-52 нм, а диаметр около 2.5 нм. Один из концов фибриллы, соответствующий С-концу gp12, имеет массивную “головку” длиной около 10 нм. Вдоль белковой молекулы распределены восемь бусообразных утолщений диаметром 3.3-3.8 нм [31, 41], в ее середине располагается гибкая перемычка. Короткая хвостовая фибрилла заканчивается доменом длиной около 4 нм. Этот домен, соответствующий N-концу gp12, отвечает за прикрепление фибриллы к базальной пластинке и расположен глубоко в теле фага [31].

Основной фрагмент полипептидной цепи gp12 (остатки 48…320) состоит из шести тандемных повторов, в каждом из которых около 40 а.о. и еще двух более коротких, но подобных одиночных повторов [31]. С помощью компьютерных методов была предсказана вторичная структура этих повторов, представляющая собой набор чередующихся -тяжей и изгибов. Повторы gp12 имеют довольно высокую степень гомологии с аналогичными повторами длинных хвостовых фибрилл. Предполагается, что переход базальной пластинки из гексагонального состояния в звездообразное [20] сопровождается конформационным изменением gp12 [31]. Такой переход обусловлен наличием гибкой области и согласуется с существованием двух изоформ gp12 c pI 7.0 и 7.2 [44].

1.5 Бактериофаг phiKZ Бактериофаг phiKZ – это вирус, который инфицирует бактерию Pseudomonas aeruginosa, являющуюся патогенной для человека. Его геном имеет размер 280334 пар оснований и является линейной, переставляемой по кругу и избыточной на концах А+Т-богатой двухнитевой молекулой ДНК последовательности с другими вирусами и микроорганизмами и не содержит сайты рестрикцирующих эндонуклеаз NotI, PstI, SacI, SmaI, XhoI и XmaIII. С помощью компьютерного анализа было установлено, что геном имеет открытых рамок считывания, варьирующихся по размеру от 50 до аминокислотных остатков [46]. Сравнение этих выделенных аминокислотных последовательностей с другими аминокислотными последовательностями из баз данных для различных белков показало, что только 59 белков бактериофага phiKZ имеют четкую гомологию с белками, у которых функции известны. Кроме того, в белках бактериофага phiKZ были обнаружены консервативных доменов. Подобные выводы были сделаны и при изучении бактериофага Т4, а именно: только 50 белков из 300 имеют заметную гомологию по аминокислотной последовательности с известными последовательностями других белков. Низкая гомология с другими бактериофагами как на уровне ДНК, так и на уровне белков ясно показывает, что бактериофаг phiKZ представляет собой ветвь, эволюционно отличную от ранее известных представителей семейства Myoviridae.

Частица бактериофага phiKZ имеет сократимый хвост длиной 2000 и большой икосаэдрический капсид диаметром двухнитевую ДНК (рисунок 1.5). Внутри капсида была обнаружена плотная спиральная структура, и было установлено, что суперспиральная геномная ДНК закручена вокруг этого “внутреннего тела” [47]. Большой размер капсида делает бактериофаг phiKZ удобным объектом для исследования с рентгеноструктурного анализа.

Электронная микрофотография негативное контрастирование при 0.75% уранил формиата, рН 4.5. На вставке изображен капсид phiKZ с сократимым чехлом [46].

Рисунок 1.5 - Сравнение морфологии фагов phiKZ и Т 1.6 Фаговая терапия. Энзибиотики Бактериофаг phiKZ эффективно инфицирует различные штаммы бактерии Pseudomonas aeruginosa, но он может быть полезен для разработки способов борьбы и с другими бактериальными инфекциями, например, для разработки фаговой терапии. Так, фаг phiKZ очень стабилен, его можно легко и быстро наработать, поэтому его производство коммерчески выгодно.

Псевдомонады – это аэробные бактерии, которые имеют значительную научную и практическую важность. Они являются активными участниками процесса минерализации и участвуют в разрушении огромного числа различных органических соединений [48]. Некоторые виды псевдомонад, например, P. aeruginosa проявляют устойчивость к антибиотикам.

P. aeruginosa – один из основных патогенов в ICU-пневмонии, первичной бактеримии при СПИДе и кистозном фиброзе [49]. Бактерия P.

aeruginosa устойчива почти ко всем общеизвестным антибиотикам и первого, и второго поколений, таким как пенициллин, цефалоспорин, тетрациклин, хлорамфеникол и ванкомицин.

Совсем недавно с помощью многочисленных экспериментов было показано, что фаги могут спасать животных от различных видов смертельных инфекций, в том числе и от тех, которые вызываются бактерией P. aeruginosa [50, 51]. Бактериофаги могут быть эффективны в борьбе против бактериальных инфекций, которые не лечатся с помощью антибиотиков. Но в фаговой терапии есть ряд ограничений: это и трудность доставки фага к инфицированной области организма, и иммуногенность фаговых частиц, и потенциально патогенные участки ДНК в составе фагов. Так, в бактериофаге phiKZ обнаружены белки, которые имеют очень сильное сходство с белками гемагглютинином, а gp164 имеет гомологию с гемолизином. Кроме того, большое количество белков патогенных организмов (H. influenzae, M.

tuberculosis, V. cholerae, etc.) являются гомологами белков фага phiKZ, что подтверждает необходимость строгого контроля перед применением фаговой терапии. Предполагается, что некоторые из вредных генов, входящих в состав ДНК бактериофага phiKZ и кодирующих эти опасные белки, могли быть захвачены фагом при инфицировании бактерий.

Другим новым методом борьбы с бактериальными инфекциями, устойчивыми к синтетическим антибиотикам, является использование литических ферментов бактериофагов. В работе [52] было показано, что муреиновая гидролаза из стрептококкового бактериофага G1, называемая лизином, убивает А стрептококки как in vitro, так и in vivo, при этом не действуя отрицательно на другие микроорганизмы. Кроме этого, в работе [53] также была установлена высокая скорость лизиса клеток Streptococcus pneumonae под действием литического фермента Pal из фага пневмококка. А в работах [54, 55] при совместном действии литических ферментов Pal и Clp- на клетки Streptococcus pneumonae выявляется увеличение скорости деградации клеточной стенки бактерий, по сравнению с индивидуальными белками. Эти ферменты обладают различной активностью (Clp-1 - мурамидаза и Pal - амидаза), что, по-видимому, и объясняет увеличенную активность за счет кооперативного эффекта этих ферментов. В работе [56] был исследован PlyG-лизин, полученный из фага Bacillus anthraсis. Установлено, что он способен лизировать как взрослые клетки, так и споры.

Применение энзибиотиков также может быть полезным при лечении инфекции, вызываемой P. aeruginosa. Геном phiKZ кодирует два литических фермента – литическую трансгликозилазу (gp144) и пептидогликановую гидролазу (структурный лизин gp181), разрущающих пептидогликановый слой бактериальной клетки P. aeruginosa в процессе ее инфицирования фагом. Белок gp144, имеющий 260 аминокислотных остатков, является аминокислотных остатков, имеет четкую гомологию по последовательности с белком gp144 [46].

Таким образом, исследование литического фермента gp181 фага phiKZ является актуальной задачей молекулярной биологии и медицины. Изучению белка gp181 с помощью направленного делеционного мутагенеза посвящена часть данной работы.

1.7 Мембранные белки 1.7.1 Бактериородопсин в пурпурных мембранах галобактерий Как известно, мембранные белки являются очень сложными объектами для изучения и манипуляций с ними. Особенность их природы в том, что они находятся в гидрофобном окружении липидного бислоя. Добавление детергентов становится необходимым условием для работы с такими белками, однако при извлечении из нативного липидного окружения они становятся нестабильными.

Чтобы понять и научиться контролировать функции мембранных белков, важно как можно точнее узнать их трехмерную структуру, которая обычно определяется методом рентгеновской кристаллографии [57, 58].

Однако, трудности, возникающие при работе с этими белками, сдерживают изучение их структур, и на сегодняшний день известны структуры не более 300 мембранных белков, что составляет менее 1 % от всех известных белковых структур. Поэтому мембранные белки остаются одними из наиболее важных объектов исследования в современной структурной биологии.

Идеальной моделью для изучения мембранных белков может служить бактериородопсин (bR). С момента своего открытия в 1971 году bR продолжает оставаться объектом пристального изучения [59]. Лаборатории по всему миру проводят многочисленные исследования, ставящие своей функционирования этого белка, тем самым создавая основу для дальнейших изучений других трансмембранных белков.

Бактериородопсин представляет собой сравнительно небольшой по массе (~26 кДа) трансмембранный белок, состоящий из 7-ми -спиралей, который был обнаружен в пурпурных мембранах (ПМ) галобактерий Halobacterium salinarum (иначе называемых H. salinarium и H. halobium).

Галобактерии относятся к архебактериям, которые представляют собой совершенно особую линию эволюции, отличающуюся как от прокариот, так и от эукариот. Археи – единственные организмы, способные существовать в экстремальных условиях солевых озер, концентрация NaCl в которых достигает очень высоких значений (до 5 М или 25%), создавая тем самым, так называемые, “автостерильные” физиологические условия. Органический материал, который время от времени приносится в солевые озера свежей морской водой, может быть использован, как источник для жизни и размножения бактерий в условиях, когда возможны окислительные реакции.

Через некоторое время, когда кислород заканчивается, единственным источником энергии остается солнечный свет. В ходе эволюции и в процессе адаптации к внешним условиям H. salinarum приобрели фототропную способность к бесхлорофилльному фотосинтезу. Этот галофильный аэробный организм может производить энергию даже при низком парциальном давлении кислорода в окружающей среде (но при наличии освещения) по альтернативному пути без использования электрон-транспортной дыхательной цепи. Галобактерии обладают уникальным в своем роде фотосинтетическим механизмом, главную роль в котором играет bR [60, 61].

Бактериородопсин имеет связанную ковалентно молекулу ретиналя, которая реагирует на действие фотонов [59]. После поглощения кванта света ретиналь изомеризуется, вызывая конформационные изменения в белке, которые в свою очередь создают трансмембранный градиент протонов.

Протоны выкачиваются из цитоплазмы во внеклеточное пространство, преобразуя световую энергию в химическую [62]. Эффективность такого механизма достигает 15%, что заметно ниже хлорофильного фотосинтеза (35%) [63]. Образованный в результате действия bR протонный градиент в дальнейшем используется для различных нужд бактериальной клетки, в наибольшей степени для синтеза аденозинтрифосфата (АТФ) посредством фермента АТФ-синтазы [64]. Когда освещение отсутствует, а парциальное давление кислорода высоко, бактерии возвращаются к аэробному окислительному фосфорилированию [65].

Схема главных функциональных систем галобактерии показана на рисунке 1.6, заимствованном из работы [66]. На рисунке 1.6 видно, что галобактериальная клетка содержит в своей клеточной мембране двумерные кристаллические массивы, состоящие из однонаправлено ориентированных молекул bR и липидов. Такие двумерные кристаллы называются пурпурными мембранами благодаря их интенсивной и специфической окраске. Другие компоненты, входящие в состав клеточной мембраны и участвующие в фотосинтетических процессах: АТФ-синтаза, сенсорные родопсины SR I и SR II, галородопсин hR и жгутиковый мотор [66].

Рисунок 1.6 - Схема галобактериальной клетки и ее главных функциональных систем Согласно рисунку 1.6, кроме bR галобактерии имеют ряд других bRподобных белков. В том числе два рецепторных белка сенсорные родопсины SR I и SR II. Они позволяют бактерии детектировать в световом спектре наличие диапазона длин волн, пригодного для осуществления фотоцикла. Это связанно с тем фактом, что бактериородопсин работает как протонная помпа лишь при его освещении зеленым или желтым светом.

Избыточное синее освещение ингибирует фотоцикл. Белки SR I и SR II, реагируя на различные длины волн, запускают каскад сигналов, приводящих, в конечном счете, к активации бактериальной локомоторной системы, осуществляющей с помощью жгутиков перемещение клетки в область пространства с подходящим для фотосинтеза спектральным составом света.

Мембраны галобактерий содержат еще один белок, относящийся к группе bR-подобных.

поддерживающая в клетке физиологическую концентрацию ионов хлора [66].

На рисунке 1.7, взятом из работы [67], представлено схематическое изображение взаимосвязанных систем жизнедеятельности галобактерий, основанных на различных типах бактериальных родопсинов.

1 - перенос протона из клетки с помощью электрон-транспортной дыхательной цепи;

2 - светозависимый протонный насос bR;

3 - образование АТФ с помощью АТФ-синтазы и протонного градиента;

4 - переносчик (антипортер) ионов Na+/Н+;

5 - транспорт аминокислот, зависимый от градиента концентрации ионов Na+;

6 - транспорт ионов калия, зависимый от мембранного потенциала;

7 - светонезависимая система переноса ионов Cl (совместно с Na+ );

8 – галородопсин Рисунок 1.7 - Схема транспорта ионов в клетке галобактерии [67] Кратко эту схему можно описать следующим образом. Создаваемая дыхательной системой (при высокой концентрации кислорода) или bR (в условиях недостаточной аэрации) разность потенциалов на мембране используется для синтеза АТФ, переноса ионов калия в клетку, а ионов натрия во внешнюю среду. А созданный таким образом градиент ионов натрия используется в свою очередь для переноса аминокислот и ионов хлора в клетку.

интегрированные в мембрану двумерные гексагональные комплексы, в которые помимо собственно трех молекул бактериородопсина, повернутых специфические липиды. На рисунке 1.8, заимствованном из работы [68], хорошо различимы тримеры бактериородопсина, периодически расположенные и образующие пурпурную мембрану.

Рисунок 1.8 - Изображения внеклеточной стороны ПМ, полученные с высоким разрешением с помощью атомно-силовой микроскопии [68] До 80% поверхности бактериальных клеток могут быть покрыты участками ПМ. Все молекулы bR ориентированы в ПМ в одном направлении, так что карбоксильный участок белка расположен во внутренней части клетки. ПМ состоят на 75% (по сухому весу) из белка bR и на 25% из смеси сульфатных гликолипидов, фосфолипидов, фосфатидилглицерофосфатов и эфирносвязанного липида сквалена [69, 70].

Суммируя результаты исследований ПМ, проводимых в течение последних трех десятилетий, можно отметить следующие их особенности.

Пурпурные мембраны состоят из липидов и bR в молярном соотношении 10:1; имеют нерегулярную форму с поперечными размерами до 5 мкм и постоянной толщиной, равной 5 нм [66]. ПМ отличаются очень высокой стабильностью к различным физико-химическим воздействиям. В частности, ПМ сохраняют свои свойства после длительного (несколько лет) пребывания на солнечном свету в присутствии кислорода, а также при высушивании.

Также ПМ выдерживают в воде температуры до 80С, а в сухом состоянии – до 140С, однако подобная стабильность утрачивается при разрушении кристаллической структуры ПМ [66, 71]. Устойчивость к значениям pH наблюдается в диапазоне от 0 до 12 единиц. ПМ устойчивы в растворах с высокой ионной силой и стабильны в растворах NaCl с концентрацией до М. ПМ чувствительны к воздействию полярных органических растворителей, таких как этанол и ацетон, однако устойчивы в неполярных растворителях, таких как гексан [66, 72].

1.7.2 Структура и фотоцикл бактериородопсина Апопротеин (apoprotein) бактериоопсин (bO), кодируемый геном bop в геноме бактерий H. salinarum, состоит из 248 аминокислот и имеет молекулярный вес 26 кДа [73, 74]. Пространственная структура этого белка состоит из 7-ми гидрофобных -спиралей, пронизывающих липидный бислой клеточной мембраны и соединенных петлями с каждой стороны мембраны.

Эти -спирали обозначают латинскими буквами от A до G в порядке следования. N- и С-концы полипептидной цепи находятся по разные стороны цитоплазматической мембраны: N-конец обращен во внешнюю среду, а Сконец - внутрь клетки. Упакованные таким образом молекулы белка организованы в тримеры, которые образуют кристаллическую гексагональную структуру.

К аминокислотному остатку Lys 216, расположенному в средней части спирали G, ковалентно через Шиффово основание присоединен хромофор ретиналь [59]. В результате связывания ретиналя с апопротеином возникает хромобелок бактериородопсин. Ретиналь находится в окружении -спиралей в центре белка, разделяя его на две "половины" – цитоплазматическую и внеклеточную [59].

Ретиналь представляет собой каротиновую производную витамина А.

Этот хромофор, не связанный с белком и растворенный в этаноле, имеет бактериородопсин пребывает в состоянии “покоя”, то есть не поглощает фотон, ретиналь находится в термодинамическом равновесии между двумя формами – all-trans и 13-cis, 15-syn в отношении 1:2, соответственно, таким образом тример бактериородопсина содержит один изомер all-trans и два изомера 13-cis, 15-syn [75, 76]. Максимум поглощения такого хромобелка находится на 558 нм и определяет, так называемую, Dark Adapted (DA) form – адаптированную к темноте форму бактериородопсина.

Когда bR в форме DA освещается, равновесие между двумя формами ретиналя полностью теряется – все молекулы ретиналя переходят в форму адаптированную к свету форму бактериородопсина с максимумом поглощения на 568 нм у bR дикого типа. Бактериородопсин в форме LA начинает фотоцикл: при поглощении кванта света определенной длины волны ретиналь претерпевает процесс фотоизомеризации и переходит в состояние 13-cis, 15-anti. Фотоизомеризация запускает процесс переноса протона с цитоплазматической стороны мембраны во внешнюю среду через ряд промежуточных состояний. Детальный механизм фотоцикла будет рассмотрен ниже.

Многообразие накопленных спектроскопических данных вместе с информацией, полученной с помощью рентгеновской кристаллографии низкого разрешения, позволили надежно определить следующие основные шаги в механизме переноса протона [77–83].

После фотоизомеризации ретиналя из all-trans формы в форму 13-cis, 15-anti протон с Шиффова основания переносится на аминокислотный остаток Asp 85, расположенный на внеклеточной стороне цепи (рисунок 1.9), и протон затем выбрасывается во внеклеточное пространство. Следующий этап – это репротонирование Шиффова основания через предполагаемую сеть молекул воды, заключающееся в переносе на него протона с аминокислотного остатка Asp 96, расположенного на цитоплазматической стороне цепи, который затем протонируется за счет цитоплазматического протона. Заключительный этап цикла – это реизомеризация ретиналя в форму all-trans и депротонирование Asp 85 [84]. Весь фотоцикл длится порядка 10 мс, причем бактериородопсин не обладает рефрактерным периодом, т.е. по завершении одного фотоцикла, он готов к следующему [85].

Рисунок 1.9 - Структура бактериородопсина (слева) и кинетическая схема его фотоцикла На заимствованном из работы [84] рисунке 1.9 слева показана структура bR с функциональными боковыми цепями, ретиналем и молекулой воды 402, справа – кинетическая схема его фотоцикла. Стадии K, L, M, N и O различаются по их спектральным свойствам, определенным с помощью спектроскопии в видимом и инфракрасном свете, спектроскопии Рамана и ЯМР. Также эти стадии различимы по их кристаллическим структурам, когда эти структуры известны. Промежуточные состояния (подсостояния) M1, M2, M'2, N' определяются из кинетических и спектральных данных, а также по их структурным отличиям. Только состояния BR и O имеют ретиналь в форме all-trans. На всех остальных стадиях ретиналь находится в форме 13-cis,15anti. Выброс протона во внешнюю среду и захват протона из цитоплазмы показаны так, как это происходит при физиологических условиях: pH>7.

Еще в самых ранних работах, посвященных изучению динамики протонного транспорта бактериородопсином, были описаны квазистабильные состояния белка, различимые спектроскопически, рисунок 1.9. Эти стадии, последовательно сменяющие друг друга в фотоцикле, были обозначены латинскими буквами от J до O. Лишь первая из реакций фотоцикла J зависит от света, остальные реакции представляют собой реакции термического типа, сходные с такими же реакциями в других биологических транспортных системах. Каждая реакция соответствует определенному физическому процессу, поэтому ряд спектроскопически неразличимых (батохромных) состояний был разделен впоследствии на подсостояния: M1, M2, M'2 и N, N' [84].

Модель фотоцикла, полученная для бактериородопсина, является наиболее детальной среди моделей, известных для других ионных насосов.

Несмотря на это, все еще остается ряд важных невыясненных вопросов, связанных с протонным транспортом в бактериородопсине. Например, как энергия сохраняется на молекуле ретиналя, и как эта энергия переносится на белок? Какой переключатель задает протонному насосу направленность действия – из цитоплазмы во внеклеточное пространство? Если сеть водородных связей, образованная между молекулами воды, создана для улучшения репротонирования Шиффова основания, то, где располагаются эти молекулы воды, и как сеть водородных связей формируется [84]?

Но за последние несколько лет произошел большой прогресс в структурных методах и подходах. И есть надежда, что на все еще не выясненные вопросы, связанные с транспортом протонов в бактериродопсине, будут получены ответы.

Исследования, проводимые с помощью ЯМР твердого тела, позволили получить некоторые критические для понимания механизма межатомные расстояния и валентные углы, а также их изменения после фотоизомеризации ретиналя [86, 87]. Фурье-спектроскопия в ИК-диапазоне (FTIR-spectroscopy) дает все более специфические представления о механистической сути протонного транспорта [88, 89]. Развитие метода кристаллизации в кубической липидной фазе [90] сделало возможным выращивание трехмерных кристаллов bR с высоким качеством для рентгеновской дифракции. При этом разрешение структур улучшилось с 2.5 [91] до 2. [92], 1.9 [93], 1.55 [94], а затем и до 1.43 [95]. Сообщения о полученных кристаллографических структурах для промежуточных состояний бактериородопсина K [95, 96], L [97], M [98-101] и N [102], а также его мутантов, предположительно имеющих сходство с состояниями N [103, 104] и O [105] в отсутствии освещения, дали надежду на то, что механизм протонного транспорта скоро будет понят на беспрецедентном молекулярном уровне.

Однако в настоящий момент обилие накопленной информации о структуре бактериородопсина, полученной разными научными лабораториями, остается предметом споров и противоречий. Это касается не только гипотез и интерпретаций по поводу механизма протонного транспорта. Данные, полученные по структуре bR, также часто являются противоречивыми [84]. Кроме того, все еще существуют проблемы с разрешением кристаллов: кристаллы бактериородопсина имеют склонность к образованию двойников (crystal twinning), фотостационарные состояния bR в фотоцикле существуют очень короткое время [106, 107]. Все это очень затрудняет изучение промежуточных стадий в фотоцикле бактериородопсина в освещенном состоянии. Эти трудности усугубляются тем фактом, что большинство структурных изменений, относящихся к транспорту ионов и представляющих собой образование и разрушение водородных связей при движении боковых цепей и молекул воды, имеют величину только в несколько ангстремов. Для преодоления этих трудностей необходимо получать кристаллы очень высокого качества и находить оптимальные условия для изучения промежуточных состояний в фотоцикле [106].

1.7.3 Экспрессия бактериородопсина в различных системах Как было доказано с помощью многочисленных исследований, процесс получения мембранных белков, как в гомологичных, так и в гетерологичных экспрессионных системах намного сложнее процесса получения растворимых белков [108].

Подбор эффективной системы для экспрессии мембранных белков является ключевым моментом для успешного их получения и последующего изучения. Так, например, благодаря созданию специфических плазмидных конструкций для последующей экспрессии мембранных белков, стало возможным разделение белковых комплексов на водорастворимые и мебранные домены, что безусловно облегчает исследования таких комплексов. Кроме того, введение специфических “хвостов” (например, Histag из 6-ти остатков гистидина для металлической аффинной хроматографии или пептидный хвост для специфического узнавания определенными антителами) помогает значительно облегчить процесс очистки рекомбинантных мембранных белков.

В кристаллизационных экспериментах сам белок и его свойства являются определяющими факторами для подбора условий кристаллизации.

Выбор правильной системы экспрессии может позволить изменить белок и его свойства для улучшения процесса кристаллизации: подвижные части молекулы, которые затрудняют кристаллизацию, могут быть удалены; сайты трансляционных и послетрансляционных модификаций, которые могут быть источниками негомогенности белка, могут быть изменены точечными мутациями или отрезанием; синтез мембранных доменов с доменами, инициирующими кристаллизацию, может быть полезным для получения высокоупорядоченных кристаллов мембранных белков [108].

На сегодняшний день не существует строго определенной и универсальной системы для экспрессии мембранных белков. Например, несколько белков - бактериородопсин, галородопсин и транспортеры сахара было экспрессировано в гомологичных системах на достаточно высоком уровне. Но эти же белки и многие другие были экспрессированы также и в различных гетерологичных системах.

Одной из самых популярных гетерологичных систем экспрессии грамотрицательной бактерии E. coli. Это связано с тем, что этот организм может быть с легкостью генетически модифицирован. Кроме того, всестороннее понимание процессов транскрипции и трансляции в этой бактерии дает возможность достигать высоких уровней экспрессии белков.

Высокая скорость роста бактерий и относительно низкая стоимость использования метода также являются привлекательными условиями.

Существует ряд других гетерологичных систем, в которых были экспрессированы мембранные белки: дрожжи, клетки млекопитающих (методом трансфекции), клетки насекомых (на основе бакуловирусной системы), in vivo (трансгенные животные), экстрамембранные системы экспрессии (экспрессия в цитоплазме бактерии и cell-free экспрессионная система) [109, 110].

Как уже было упомянуто выше, бактериородопсин был получен в различных экспрессионных системах. В этих исследованиях можно выделить несколько этапов, которые были связаны как с развитием приборной базы, так и с появлением новых методологических подходов.

В 1970-е годы бактериородопсин был впервые выделен напрямую из природного источника - пурпурных мембран галобактерий Halobacterium salinarum [59, 111, 112]. Проводились биохимические и биофизические исследования bR, выделенного из ПМ, были определены его функции в клетке [73], обнаружен фотоцикл и изучены его кинетические особенности [113], определена аминокислотная последовательность [114] и предложен ряд гипотез о механизме протонного транспорта.

В конце 80-х годов стал возможен прорыв в определении механизма функционирования благодаря использованию сайт-специфичного мутагенеза. Так, впервые была разработана система, в которой химическисинтезированный ген бактериородопсина был экспрессирован в E. coli [115Эта экспрессионная система позволила использовать сайтнаправленный мутагенез для изучения механизма протонного транспорта в bR, в частности, были определены аминокислотные остатки, вовлеченные на разных стадиях в этот механизм [118]. Примерно в тоже время была создана другая экспрессионная система, позволяющая получать бактериородопсин в альтернативой для изучения bR и его мутантов был отбор белка с природными мутациями или классический мутагенез [120], но этот подход не обладает избирательной способностью, которая есть у сайт-направленного мутагенеза.

В начале 90-х годов группой ученых была разработана новая система трансформации, использующая галобактериальный плазмидный вектор и позволяющая вставлять bop-ген в bR-дефицитные штаммы галобактерии полученными из нескольких штаммов bR дикого типа [121]. Также эта система позволяла создавать мутанты bR с помощью сайт-направленного мутагенеза. Однако, в молекулярной генетике галофильных археев, особенно в Halobacterium salinarum, существует проблема: при введении коротких последовательностей ДНК (insertion sequence elements) в геном и вставке плазмидных векторов штаммы бактерии становятся нестабильными [122].

Кроме того, клетки, производящие мутантов бактериородопсина, не всегда воспроизводят его так же, как клетки дикого типа [122].

пурпурных мембран для получения бактериородопсина и его мутантов было бы предпочтительнее. Но, как было сказано выше, существует ряд трудностей, связанных с получением мутантов bR в галобактериях. Между тем, есть еще одна причина, подтолкнувшая ученых к разработке новых гетерологичных систем экспрессии бактериородопсина: выращивание галобактерий и выделение из них достаточного количества белка для его исследований и кристаллизации занимает длительное время, до нескольких месяцев. Предполагалось возможным создать систему экспрессии, позволяющую получать готовый белок быстрее.

На сегодняшний день самой распространенной гетерологичной системой экспрессии бактериородопсина и его мутантов является экспрессионная система на основе бактерии E. coli [123]. Так как формирование нативной укладки бактериородопсина затруднено в мембранах E. coli [124], рекомбинантный bR был получен в форме апопротеина – бактериоопсина (bO), который затем был восстановлен до bR с помощью ретиналя in vitro [125]. Первоначально экспрессированный в E. coli бактериородопсин имел низкий выход из-за активной протеолитической деградации в цитоплазме [115]. Однако, использование экзогенных Nконцевых последовательностей помогло при встраивании bO во внутреннюю мембрану бактерии и тем самым повысило выход и стабильность белка [116, 124]. Наилучшим выходом ренатурированного bR, полученного таким образом, было количество в 17 мг/л [126, 127], но тем не менее неконтролируемый протеолиз белка в клетке привел к тому, что полученный bR был негомогенным.

Позже была разработана система экспрессии bR, использующая стратегию создания гибридных белков и позволяющая получить bO в форме телец включения [128, 129], что, безусловно, уменьшило количество проблем, связанных с нестабильностью белка и его токсичностью для клеток.

Кроме того, в качестве N-концевых белков-переносчиков, помогающих при встраивании бактериородопсина в мембрану E. coli, были успешно использованы мальтоза-связывающий белок (Maltose-Binding Protein MBP) и фрагмент -галактозидазы (454 а.о.). При этом уровень экспрессии таких гибридных белков составлял около 200 мг/л [130]. Однако, при очистке и ренатурации значительная часть белка терялась, и выход очищенного и ренатурированного bR был порядка 6-10 мг/л [130].

В настоящее время белки-носители, такие как MBP с N-концевой сигнальной последовательностью [131], Mistic [130, 132] или GlpF [133] могут быть успешно использованы для эффективного встраивания bR и других гетерологичных белков в мембрану E. coli, тем самым позволяя экспрессировать рекомбинантные мембранные белки с большим выходом, достаточным для очистки и последующей кристаллизации.

1.7.4 Практическое применение бактериородопсина в технике Предположения об использовании бактериородопсина (дикого типа или его мутантов) для различных технических нужд начали появляться практически сразу после его открытия. Этому, в частности, способствовали детальные исследования белка учеными самого разного профиля.

Технические приложения бактериородопсина были собраны в ряд масштабных направлений [66]:

1) протонный транспорт: генерация АТФ в реакторах, опреснение морской воды, генерация электрической энергии из света;

2) фотоэлектрические применения: ультрабыстрое детектирование света, создание искусственной сетчатки, детектирование движения;

3) фотохромные применения: хранение информации на 2D-, 3D- и голографических носителях; обработка информации с использованием световых переключателей, оптической фильтрации; создание нейросетей; распознавание образов; интерферометрия;

4) другие применения: детектирование радиации, биосенсорные приложения.

На сегодняшний момент существует порядка 100 патентов на изобретения, в основе которых лежит использование bR. Самое раннее изобретение, к котором бактериородопсин был использован в качестве преобразователя солнечной энергии в химическую и электрическую, датируется 1980 годом [134]. Однако оказалось, что использованию bR в качестве преобразователя световой энергии препятствует ряд факторов, например, техническая невозможность создавать стабильные пленки bR больших размеров с равномерными свойствами по поверхности [66]. Кроме того, разработка таких систем на основе bR превышает стоимость реализации процессов преобразования энергии с помощью уже имеющихся устройств.

В связи с этим основной областью для технического применения бактериородопсина стала оптическая обработка данных, основанная на его фотохромных свойствах. Устройства для хранения и обработки информации на основе bR обладают рядом преимуществ по сравнению с уже известными аналогами.

Основные требования к материалам для молекулярной электроники состоят в том, что они должны обратимо изменять свою структуру в ответ на некое физическое воздействие и существовать, по крайней мере, в двух состояниях, которые заметно различаются по легко измеряемым физическим характеристикам, например, по спектральным или оптическим свойствам.

Хотя на настоящий момент синтезирован целый ряд фотохромных органических соединений, альтернативных бактериородопсину [135], они не обладают достаточными для использования в технике свойствами высокой цикличностью и одновременно достаточно высоким квантовым выходом [136]. Под цикличностью понимается число циклов фотопревращений молекул между двумя основными состояниями до разрушения или денатурации 37 % образца [137]. Цикличность же молекул bR превышает 106, что достаточно для его использования в устройствах не только для хранения информации (например, для CD-RW необходима цикличность 104105), но и для обработки информации. Например, при обработке изображения в реальном времени требуется приблизительно 106 циклов WRE (write-readerase запиcывать-читать-стирать) за день работы, что невозможно для большинства синтетических органических фотохромных материалов [66, 137].

В 1980-х годах бактериородопсин впервые был использован для создания голографических изображений [138, 139]. Запись голографических изображений на пленках bR основана на интерференции двух когерентных лазерных лучей. В результате образуется голографическая решетка (пространственное распределение интермедиатов бактериородопсина B и M, где B – первоначальное LA состояние bR, M – наиболее долго живущий интермедиат bR), которая возникает благодаря изменению оптической плотности и показателя преломления пленки bR при поглощении кванта света.

Проведенные исследования показали, что молекулярная память на основе бактериородопсина имеет определенные преимущества перед традиционной полупроводниковой памятью. Во-первых, благодаря достижениям в биотехнологии и генетической инженерии стало возможным получать bR – основу такой памяти – в больших количествах при относительно невысоких денежных затратах. Во-вторых, система может полупроводниковая память. В-третьих, данные сохраняются постоянно: даже если выключить электропитание системы памяти, это не приведет к потере информации. По оценкам исследователей данные, записанные на таком запоминающем устройстве, должны сохраняться не менее пяти лет. Вчетвертых, оптический носитель информации на основе bR позволяет осуществлять запись по всему объему, а не только по поверхности (как это реализуется на магнитных носителях), что значительно увеличивает его емкость. Так, группой исследователей был разработан прототип подсистемы памяти, использующей для запоминания в качестве цифровых бит промежуточные состояния бактериородопсина [140].

Определенно установлено, что использование бактериородопсина в качестве молекулярного переключателя в оптоэлектронных и других приложениях технически возможно. Но это не может служить основанием для того, чтобы прекратить научные исследования технических применений бактериородопсина и перейти только на коммерческие проекты. Основной причиной для использования биоматериалов в технических системах вместо обычных органических материалов или электроники является увеличение производительности таких систем. Фотохромизм бактериородопсина является природной функцией, поэтому эволюция оптимизировала эту функцию на протяжении миллионов лет. Генная инженерия в настоящее время используется для "второй эволюции", цель которой усилить фотохромные свойства bR, не теряя при этом уникальных свойств обратимости молекулы.

Возможности технического применения bR были обнаружены более лет назад. Текущие исследования направлены на разработку способов интеграции бактериородопсина в технические системы. Поскольку не существует таких технических систем, в которых можно удалить один из бактериородопсина, то необходимо реконструировать технические системы для того, чтобы использовать в них bR.

Бактериородопсин не является изолированным исключительным объектом исследований, он стал основой технологической платформы, на которой с помощью различных инструментов разрабатываются новые и полезные материалы [66].

1.8 Методы теоретического исследования структуры белков Известно, что структуру белков не всегда удается решить с помощью экспериментальных методов из-за сложности получения этих белков в кристаллическом состоянии. Тем не менее, знание пространственной структуры белков очень важно. Поэтому часто применяются различные теоретические методы исследования и предсказания структуры белков.

К наиболее распространенным из них можно отнести статистические методы, основанные на анализе белков с известной структурой. Эти методы учитывают частоты локализации аминокислотных остатков в разных типах вторичной структуры:

-спираль, -тяж, -поворот, неупорядоченная структура [141]. Такие статистические методы отражают закономерности ближнего и среднедистанционного взаимодействия, такие как геометрия остатка, и в соответствии с этим, возможность встраивания в ту или иную структуру.

Можно выделить группу методов, основанных на идентификации паттернов, где строго определенные позиции на участке последовательности заняты строго определенными остатками. Эти методы учитывают как среднедистанционные, так и дальние взаимодействия. Консервативные гидрофобные позиции в паттернах вторичных структур указывают на контакты между отдельными частями белковой молекулы.

Последовательности -тяжей, входящих в состав гидрофобного ядра, состоят в основном из остатков с крупными разветвленными боковыми группами (Val, Leu, Ile) [142], а паттерны -листов, лежащих между гидрофобным ядром и водным окружением, состоят из перемежающихся полярных и неполярных остатков (типа Val-Ser-Leu) [142].

Более разнообразны паттерны различных вариантов упаковки спиралей. Установлено, что -спирали могут контактировать между собой различными способами. В частности, контакт между двумя спиралями чаще всего происходит под углом около 50. При этом расположение неполярных остатков, формирующих область контакта, определяет паттерн того или иного варианта упаковки. Определены паттерны -спиралей, прилежащих к -листу [142]. В настоящее время успешно выявляются также паттерны супервторичных структур типа -шпилек, -, - и -петель [143], которые, вероятно, могут играть роль инициаторов фолдинга белка.

Однако, эффективность предсказаний, основанных на паттерн-методах, невелика, т.к. они плохо учитывают, что для элементов вторичной структуры часто характерна избыточность гидрофобных остатков. Исключение составляют фибриллярные белки, у которых удельная поверхность больше, и паттерны укладки могут быть определены с большей вероятностью.

идентифицированы с помощью преобразования Фурье.

Как уже отмечалось в п. 1.3.3 и п. 1.7.1, экспериментальные трудности получения белков ДХФ и различных мембранных белков в кристаллическом состоянии в настоящее время не преодолены. Поэтому анализ их структуры основывается в первую очередь на данных о последовательности аминокислотных остатков полипептидной цепи и является актуальной задачей.

Предполагалось, что в структуре белков ДХФ имеет место некоторая периодичность [144]. Для анализа этой периодичности наряду с новыми методами, например, методом “информационного разложения” [145] можно применять хорошо известные теорию и методы преобразования Фурье [146Более подробно о методе Фурье будет рассказано в главе 2.

Из многообразия всех мембранных белков значительный интерес вызывает группа интегральных трансмембранных белков, имеющих несколько гидрофобных участков, насквозь пронизывающих мембрану и совместно выполняющих функцию транспортных каналов для различных веществ. Очевидная особенность этих белков состоит в том, что свойство повторяемости (возможно, периодической) в расположении гидрофобных аминокислот им органически присуще. Если отмеченная повторяемость периодическая, то она как признак вторичной структуры белка может быть выявлена с использованием преобразования Фурье, как это делалось в случае фибриллярных белков.

Поскольку трансмембранные участки белка состоят в большей степени из гидрофобных аминокислот [151], для анализа расположения трансмембранных участков были разработаны численные методы, основанные на применении к белковой последовательности ее функции гидрофобности и различных шкал гидрофобности аминокислот [151-155].

периодичности расположения аминокислот гидрофобной группы в последовательностях мембранных белков и об использовании нового метода компьютерного анализа расположения трансмембранных участков белка, основанного на применении функции гидрофобности, будет рассказано в главе 6.

1.9 Вторичная структура белков Основные типы вторичной структуры были впервые найдены в фибриллярных белках [156]. Эта группа белков до сих пор является наиболее удобным объектом для теоретического исследования мотивов укладки.

1.9.1 Варианты -спирального coiled-coil Структурный элемент coiled coil впервые был предложен в 1953 году Полингом и Кори [157] и независимо от них Криком [158], как главный структурный элемент большого класса фибриллярных белков, таких как кератин, миозин и фибриноген.

В структурном плане coiled coil представляет собой суперспираль, образованную двумя, тремя или четырьмя спиралями. Известны даже белки coiled coil, содержащие пять спиралей [159]. Спирали могут быть упакованы в одном (параллельный coiled coil) или в противоположных направлениях (антипараллельный coiled coil). Регулярное строение coiled coil требует периодичности в упаковке боковых цепей остатков аминокислот в ядре протяженной структуры. Однако такая регулярность невозможна без искажений канонической -спирали, где на один оборот приходится 3. аминокислотных остатка. В структуре coiled coil -спираль деформируется таким образом, что число остатков на виток уменьшается до 3.5, и положения боковых цепей повторяются через два оборота. Обычно последовательность аминокислот суперспиральных белков имеет гептадную периодичность. В каждой гептаде в первой и четвертой позициях находятся гидрофобные остатки, боковые группы которых обеспечивают межспиральные взаимодействия и формируют гидрофобное ядро (core) суперспирали. Если позиции аминокислот в гептаде обозначить соответственно как (a, b, c, d, e, f, g)n, то гидрофобные остатки занимают положения a и d, а в положениях b, c, экспонированную в растворитель внешнюю поверхность coiled coil (рисунок 1.10).

Рисунок 1.10 - Взаимодействие -спиралей при образовании coiled coil структуры [160] На рисунке 1.10 из работы [160] показан вид с торца для параллельных димерного (А) и тримерного (Б) coiled coil. Гидрофобные взаимодействия взаимодействия между остатками e и g показаны штриховой линией.

1.9.2 Элементы -структуры в фибриллярных белках вирусов и Физико-химическое исследование ряда белков, ответственных за адсорбцию фагов на клеточной мембране, выявило преобладание конформации в их вторичной структуре. К указанной группе можно отнести белки дистальной и проксимальной половинок длинных хвостовых фибрилл бактериофага Т4 [24], хвостовой белок (gp9) фага P22. Такие же особенности отмечены для белка фибрилл аденовируса [161], который также необходим для специфической адсорбции вириона. Во всех указанных белках большую часть молекулы составляют фибриллярные структуры.

По результатам анализа спектров кругового дихроизма дистальной половинки длинных хвостовых фибрилл бактериофага Т4 было сделано предположение, что каждый из мономеров данного белка образует длинный перпендикулярных к оси фибриллы. Два -листа образуют сильно перекрученную структуру типа cross- [32]. Подобная модель раньше была предложена для кератина пера. При анализе последовательностей gp37 и gp36 были найдены стереохимические паттерны cross- в виде фрагментов чередующихся полярных и неполярных остатков [26]. Предсказанные структурные участки занимают большую часть последовательности gp37.

формировать coiled-coil.

Несмотря на экспериментальные сложности выделения белков и получения их в кристаллическом состоянии, структура 20-ти белков бактериофага Т4 была решена методами рентгеноструктурного анализа и криоэлектронной микроскопии.

Так, например, методом рентгеноструктурного анализа была решена структура белка gp5. В его структуре был обнаружен уникальный мотив – тримерная -спираль (рисунок 1.11) [13].

По результатам рентгеноструктурного анализа установлено, что молекула лизоцима фага Т4 имеет размеры примерно 503030 3 и состоит из 165 аминокислотных остатков (молекулярный вес равен 18.7 кДа). Она подразделяется на два домена: один состоит из спиральных участков и трех антипараллельных -слоев, а другой только из спиральных участков.

A вид сбоку (вертикальная проекция), B вид сверху, Между собой домены соединены длинным спиральным участком длиной в 20 а.о. Таким образом, примерно, 70% от общего числа аминокислотных остатков включены в более или менее регулярные структуры: около 60% а.о. образуют спиральные участки, а 16 остатков образуют -слой.

1.9.3 Элементы вторичной структуры в трансмембранных белках Мембранные белки могут быть разделены на две основные категории:

интегральные белки, которые пронизывают мембрану насквозь и называются трансмембранными белками, и периферические белки, которые расположены на внешней стороне мембраны или прилегают к ее внутренней стороне.

Большинство биомембран содержит оба вида мембранных белков.

На рисунке 1.12, заимствованным из [162], представлена схематическая диаграмма биологической мембраны, в состав которой входят интегральные и периферические мембранные белки.

Фосфолипидный бислой, основная структура всех клеточных мембран, состоит из двух слоев фосфолипидных молекул, жирные ациловые хвосты которых формируют внутреннюю часть бислоя, а полярные гидрофильные группы головок образуют поверхность бислоя. Олигосахариды в основном связаны с мембранными белками, однако, некоторые прикрепляются к липидам, формируя гликолипиды.

Рисунок 1.12 - Схематическая диаграмма типичных мембранных белков в биологической Трансмембранные белки, которые составляют большинство в группе интегральных мембранных белков, пронизывают бислой насквозь, но некоторые из интегральных белков соединены с бислоем только на одной его стороне с помощью связанной ковалентно липидной якорной группы.

Гидрофобные аминокислотные остатки интегральных мембранных белков взаимодействуют с жирными ациловыми группами фосфолипидов в мембране, таким образом, закрепляя белок в мембране [162]. Такое гидрофобное взаимодействие может быть разрушено только при добавлении детергентов или некоторых других неполярных растворителей.

Интегральные трансмембранные белки включают многочисленные рецепторы, каналы, транспортеры, фотосистемы и респираторные комплексы [163].

Периферические белки связаны с мембраной намного слабее, чем интегральные белки. Соединение с мембраной у них осуществляется главным образом посредством специфических белковых взаимодействий.

Так, периферические белки прикреплены либо к полярным головкам липидов в липидном бислое, либо к интегральным белкам с помощью гидрофобных, электростатических или других нековалентных взаимодействий. Этот вид белков не взаимодействует с гидрофобной внутренней частью фосфолипидного бислоя. Поэтому для отделения периферических белков от мембраны не требуется ее разрушения. Для диссоциации достаточно использовать растворы с низким или высоким значением pH и высокой концентрацией соли. К периферическим мембранным белкам относятся ассоциированные с мембраной ферменты, транспортеры, сигнальные липидсвязанные домены, гормоны, токсины и т.д. [163-166].

Трансмембранные белки содержат от одного до нескольких доменов, пронизывающих бислой трансмембранные домены, и домены, выходящие с обеих сторон бислоя в водное окружение топологические домены. Во всех трансмембранных белках, исследованных на сегодняшний день, элементы вторичной структуры в трансмембранных доменах состоят либо из спиралей, либо из -тяжей. Структуры, состоящие из -спиралей, являются наиболее распространенными у трансмембранных белков [162].

На рисунке 1.13 схематически изображены трансмембранные белки, трансмембранные домены которых состоят из -спиралей и -складчатой структуры.

Трансмембранные домены состоят из единичной трансмембранной -спирали и множественных трансмембранных -спиралей – A, -складчатой структуры – B.

Рисунок 1.13 - Схематическое изображение трансмембранных белков пронизывающие мембрану, удерживаются в ней посредством гидрофобных взаимодействий с внутренней частью липидного бислоя и, вероятно, также с фосфолипидов. Например, гликофорин, главный мембранный белок эритроцитов, имеет оба вида указанных взаимодействий с мембраной. В мембране эритроцитов гликофорин представляет собой димер, состоящий из двух идентичных полипептидных цепей. Два трансмембранных спиральных домена гликофорина пронизывают бислой, формируя coil-coiled структуру [162].

Большой и важный класс интегральных трансмембранных белков определяется наличием у них 7-ми трансмембранных -спиралей. Более таких белков было идентифицировано. Типичным представителем класса семиспиральных трансмембранных белков является бактериородопсин.

Другие белки, входящие в этот класс, включают опсины и GPCRs (G-proteincoupled receptors) [109].

представлены, во внешних мембранах грамотрицательных бактерий, митохондрий и хлоропластов. Так, например, во внешней мембране E.coli были найдены несколько типов поринов, структура которых радикально отличается от других интегральных трансмембранных белков. Порины во внешней мембране E.coli образуют каналы или поры для прохождения различных молекул. Аминокислотные последовательности поринов, главным образом, полярные и не содержат длинных гидрофобных доменов, типичных для -спиральных интегральных белков. С помощью рентгеновской кристаллографии было установлено, что порины образуют тримеры, состоящие из идентичных субъединиц. В каждой субъединице из 16 -тяжей формируется -складчатая структура в виде бочонка (-barrel) с порой в центре [162].

1.10 Выводы по главе и постановка задач исследования исследования структуры и свойств вирусных и мембранных белков, можно сделать следующие выводы.

Безусловно, одним из главных и активно развивающихся направлений в сегодняшней науке является структурная биология, нацеленная на изучение структуры и свойств белков различной природы, что может быть полезным для понимания фундаментальных природных механизмов жизни и развития медицины.

экспериментальных, так и на теоретических методах.

получении фибриллярных белков бактериофага Т4 в кристаллическом состоянии, решение структуры этих белков по-прежнему остается актуальной задачей для разработки способов борьбы с вирусными инфекциями.

Для преодоления трудностей в эксперименте по исследованию фибриллярных белков необходимо совершенствовать экспериментальные подходы и методы.

исследования, таких как компьютерное моделирование, методы биоинформатики также являются ключевыми инструментами для изучения и предсказания структуры фибриллярных белков.

Новым методом борьбы с бактериальными инфекциями, устойчивыми к синтетическим антибиотикам, является использование литических ферментов бактериофагов в качестве энзибиотиков. Для создания эффективных лекарств необходимо знать структуру и функции литических ферментов, а также их ферментативную активность.

происходящих в природе, невозможно переоценить. Но из-за объективных сложностей с экспериментальным получением мембранных белков и их кристаллов, к сожалению, структура лишь малой их части решена с помощью рентгеновской кристаллографии.

Структура бактериородопсина – модельного объекта для изучения мембранных белков – была экспериментально определена ранее. Но все еще остается ряд противоречий, касающихся понимания механизма протонного транспорта, осуществляемого этим белком. Поэтому развитие и усовершенствование экспериментальных методов исследования мембранных белков, проводимое на бактериородопсине, могло бы помочь как для разрешения противоречий в понимании структуры и механизма действия самого bR, так и для разработки подходов к исследованию других мембранных белков.

экспериментальному подходу при исследовании структуры мембранных белков, активно развиваются и применяются методы компьютерного моделирования.

В соответствии с изложенным в данной главе в теоретической части исследований, включающей применение методов биоинформатики и компьютерного моделирования, предполагалось решить следующие задачи.

1. Выбор оптимального варианта преобразования Фурье для анализа периодичности аминокислотных последовательностей в различных белках. Исследование периодичности расположения аминокислот в фибриллярных белках бактериофага Т4 и анализ аминокислотной последовательности литического фермента бактериофага phiKZ Pseudomonas aeruginosa с помощью оптимизированного метода преобразования Фурье с целью предсказания вторичной структуры гидрофобной группы в последовательностях мембранных белков расположения трансмембранных участков белков, основанного на применении функции и шкалы гидрофобности, для предсказания оптимизированного метода преобразования Фурье и нового метода компьютерного анализа расположения трансмембранных участков белков между собой и с другими известными методами.

использование ряда генетических, биохимических и биофизических методов, планировалось решение следующих задач.

1. Создание плазмидных векторов для рекомбинантной экспрессии в клетках E. coli двух фибриллярных белков – продуктов генов бактериофага Т4 E. coli, нескольких делеционных мутантов литического фермента бактериофага phiKZ Pseudomonas aeruginosa, бактериородопсина Halobacterium salinarum и нескольких его делеционных мутантов.

2. Выделение и очистка полученных рекомбинантных белков в препаративных количествах для предполагаемой последующей кристаллизации, решения их структуры и выяснения функций.

3. Исследование ферментативной активности нескольких делеционных мутантов литического фермента бактериофага phiKZ, а также анализ их КД-спектров для выявления элементов вторичной структуры.

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Материалы, использованные в эксперименте по исследованию белков бактериофагов Т4 и phiKZ (штаммы, ферменты, бактериофага Т4, клонированного в плазмидный вектор pET-23d(+) E. coli (Novagen, США) с промотора фага Т7, использовали штамм E. coli BL21(DE3) (Novagen, клонированного в плазмидный вектор pQE-30 E. coli (QIAgen, США) с промотора фага Т5, использовали штамм E. coli AD494(DE3) (Novagen, США).

Для наработки плазмидных конструкций со вставкой гена 35 и гена 181 был использован штамм E. coli Top10 (Invitrogen, США).

питательную среду 2хTY: 16 г триптона (ДИА-М, Россия), 10 г дрожжевого экстракта (DIFCO, США) и 5 г NaCl (Реахим, Россия) на 1 л воды. В качестве твердой питательной среды использовали 2хTY среду, содержащую 1,5% агара (DIFCO, США). Все среды стерилизовали автоклавированием.

Векторы для клонирования. Плазмиды. Векторы для клонирования и экспрессии гена 35 и гена 181 pET-23d(+) (Novagen, США) и pQE- (QIAgen, США), соответственно. Вектор pQE-30 имеет His-tag или экспрессированный в таком векторе, будет содержать на своем N-конце шесть дополнительных остатков гистидина, что облегчает процесс очистки белка с помощью аффинной никель-хелатной хроматографии.

Плазмиды с фрагментами ДНК, полученные в процессе исследований:

1) pl_g35 вектор pET-23d(+) со вставкой по сайтам NcoI-BamHI, содержащей ген 35 ДХФ (1140 п.н).

2) pl_g35-36 в качестве вектора использовали плазмиду pl_g35 (pET-23d(+), NcoI-BamHI), линеаризованную по сайтам BamHI-XhoI, в качестве вставки плазмиду pl_g36 (pET-23d(+), NcoI-BamHI), порезанную по сайтам BglII-XhoI и содержащую ген 36 ДХФ (660 п.н.).

Плазмида pl_g36 была также получена в нашей лаборатории.

3) pl_g181M вектор pQE-30 со вставкой по сайтам BamHI-HindIII, содержащей ген g181M.

4) pl_g181MA вектор pQE-30 со вставкой по сайтам BamHI-HindIII, содержащей ген g181MA.

5) pl_g181E вектор pQE-30 со вставкой по сайтам BamHI-HindIII, содержащей ген g181E.

Ферменты. В работе использовались рестриктирующие эндонуклеазы NcoI, BamHI, HindIII, XhoI, BglII и ДНК лигаза фага Т4 фирмы Fermentas (Литва), ДНК полимераза Thermophilus aquaticus (Taq – полимераза) фирмы New England Biolabs (США).

рекомендациям фирм-изготовителей с использованием прилагаемых буферов.

Олигонуклеотиды для проведения ПЦР.

Прямой праймер (g35-FOR): 5’- ggt acc atg gaa att tat gg - 3’ Обратный праймер (g35-REV): 5’- gaa gga tcc cta aat tta aac ttc - 3’ Прямой праймер (g181M-FOR): 5’ – aga gga tcc gct caa gct aca – 3’ Прямой праймер (g181E-FOR): 5’ – tat gga tcc atg gag aat aag – 3’ Обратный праймер (g181-REV): 5’ - tat aag ctt acc aag tga ttg act att – 3’ ампициллин, фенол, хлороформ, IPTG, бромистый этидий фирмы Sigma (США), бакто-триптон, дрожжевой экстракт фирмы Difco (США), SDS (Serva, Германия), Coomassie R (Sigma, США), уксусную кислоту (Реахим, Россия), Tris-НСl (Sigma, США), EDTA (Serva, Германия), лизоцим (Serva, Германия). Растворы приготавливались с использованием воды Milli-Q, полученной на установке Millipore (США).

2.2 Материалы, использованные в эксперименте по исследованию бактериородопсина и его делеционных мутантов (штаммы, Штаммы бактериальных культур. Для экспрессии гена bO (и его делеционных мутантов), выделенного из плазмиды pUCBM20 [167] и клонированного в плазмидный вектор NTS1-1233 [168, 169] с lac промотора, использовали различные штаммы E. coli – DH5, ER2507, BL21(DE3), BL21Star, BL21(DE3)(pLysS) (New England Biolabs GmbH (NEB), Германия).

Для наработки плазмидных конструкций со вставкой гена bO и его делеционных мутантов были использованы штаммы E. coli XL10-Gold (Stratagene, США) и Top10 (Invitrogen, США).

Среды для выращивания бактерий. Использовали ряд жидких питательных сред:

1) 2хTY - 16 г триптона (AppliChem GmbH, Германия), 10 г дрожжевого экстракта (AppliChem GmbH, Германия) и 5 г NaCl (AppliChem GmbH, Германия) на 1 л воды;

2) LB - 10 г триптона (AppliChem GmbH, Германия), 5 г дрожжевого экстракта (AppliChem GmbH, Германия) и 10 г NaCl (AppliChem GmbH, Германия) на 1 л воды;

3) TB - 12 г триптона (AppliChem GmbH, Германия), 24 г дрожжевого экстракта (AppliChem GmbH, Германия), 5 г глицерола (MP Biomedicals LCC, Франция), 16.43 г K2HPO43H2O (AppliChem GmbH, Германия), KH2PO (AppliChem GmbH, Германия) на 1 л воды;

4) SOC - 2% триптон (AppliChem GmbH, Германия), 0.5% дрожжевой экстракт (AppliChem GmbH, Германия), 10 mM NaCl (AppliChem GmbH, Германия), 2.5 mM KCl (AppliChem GmbH, Германия), 10 mM MgCl (AppliChem GmbH, Германия), 10 mM MgSO4 (AppliChem GmbH, Германия), 20 mM глюкоза (Sigma-Aldrich, Германия).

В качестве твердой питательной среды использовали LB среду, содержащую 1,5% агара (MP Biomedicals LCC, Франция). Все среды стерилизовали автоклавированием.

Векторы для клонирования, плазмиды. Векторы для клонирования и экспрессии pUCBM20 [167] и NTS1-1233 [168, 169]. Плазмида pUCBM была любезно предоставлена нашей лаборатории профессором, доктором М.

Энгельхардом (Prof. Dr. M. Engelhard, Max-Planck Institute of Molecular Physiology, Otto-Hahn-Str. 11, 44227 Dortmund, Germany), а плазмида NTS1доктором Р. Гриссхаммером (Dr. R. Grisshammer, Membrane Protein Structure Function Unit, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, Rockville, MD 20852, USA).

Плазмида pUCBM20 (3525 п.н.) является плазмидой для cell-free экспрессии и имеет в качестве вставки ген bO без лидерного пептида и Asp 249 на С-конце.

Плазмида NTS1-1233 (8600 п.н.) имеет His-tag или “гистидиновый хвост”, состоящий из десяти остатков His, наличие которых призвано облегчить процесс очистки белка с помощью аффинной никель-хелатной нейротензиновый рецептор (NTR), к N-концу которого присоедин белок MBP (42 кДа), а к C-концу - бактериальный белок тиоредоксин А (TrxA, 12 кДа), который призван стабилизировать конструкцию и увеличить уровни экспрессии и очистки.

Ниже приведен список из трех запланированных для получения в процессе исследований плазмид с фрагментами ДНК. Все теоретические разработки плазмид были сделаны с помощью программы APE_Plasmid Editor. В качестве вектора использовалась плазмида NTS1-1233 (сокращенно v.1233), порезанная по сайтам NcoI-HindIII, вставка состояла из трех фрагментов ДНК.

1) pl_bOWT v.1233/NcoI-HindIII со вставкой по сайтам NcoI-HindIII, вставка NA-bOWT-fr.1233: фрагмент NA (219 п.н.), ген bOWT (744 п.н.), fr.1233 (450 п.н.).

2) pl_bO10 v.1233/NcoI-HindIII со вставкой по сайтам NcoI-HindIII, вставка NE-bO10-fr.1233: фрагмент NE (223 п.н.), ген bO10 (702 п.н.), fr.1233 (450 п.н.).

3) pl_bO13 v.1233/NcoI-HindIII со вставкой по сайтам NcoI-HindIII, вставка NE-bO13-fr.1233: фрагмент NE (223 п.н.), ген bO13 (693 п.н.), fr.1233 (450 п.н.).