На правах рукописи

ШАРОВА НАТАЛЬЯ ЮРЬЕВНА

РАЗРАБОТКА НАУЧНЫХ ОСНОВ НОВЫХ ТЕХНОЛОГИЙ ПИЩЕВЫХ

ДОБАВОК И ИНГРЕДИЕНТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

КРАХМАЛСОДЕРЖАЩЕГО СЫРЬЯ

Специальность 05.18.07. – Биотехнология пищевых продуктов

и биологических активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук

Санкт-Петербург 2013 2

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте пищевых ароматизаторов, кислот и красителей Российской академии сельскохозяйственных наук

Научный консультант: Никифорова Татьяна Алексеевна, доктор технических наук, профессор

Официальные оппоненты: Красникова Людмила Васильевна, доктор технических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «СПб НИУ ИТМО», профессор кафедры органической, физической, биологической химии и микробиологии Римарева Любовь Вячеславовна, доктор технических наук, член-корреспондент Россельхозакадемии, ГНУ ВНИИПБТ Россельхозакадемии, заместитель директора по научной работе Фридман Илья Абрамович, доктор технических наук, профессор, ГБОУ ВПО СПХФА Минздрава России, заведующий кафедрой химической технологии лекарственных веществ и витаминов

Ведущая организация – Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «СанктПетербургский государственный технологический институт (технический университет)» (СПбГТИ (ТУ))

Защита состоится _ _ 2013г. в _14 часов на заседании диссертационного совета Д 212.227.09 при Санкт-Петербургском национальном исследовательском университете информационных технологий, механики и оптики (НИУ ИТМО) по адресу: 191002, г. Санкт-Петербург, ул. Ломоносова, 9, тел./факс (812)315-30-

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИУ ИТМО.

Автореферат разослан «_» 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Колодязная В.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время потребности пищевой индустрии в сырье и пищевых добавках как технологического, так и функционального действия в значительной степени решаются за счет импортных поставок. Среди пищевых добавок определенную нишу занимают ингредиенты – продукты микробного синтеза. К их числу относятся широко используемые в пищевой промышленности лимонная кислота и ферменты амилолитического действия. Однако объемы производства в РФ этих ингредиентов, необходимых целому ряду отраслей (кондитерская, спиртовая, крахмалопаточная и др.), ниже существующих потребностей: по лимонной кислоте почти в три раза, по амилолитическим ферментам – в два раза.

К числу факторов, влияющих на развитие отечественной индустрии пищевых добавок, относятся ограниченность собственной сырьевой базы, недостаток инновационных технологий, позволяющих на базе имеющегося сырья решить проблему импортзамещения. Необходимо учитывать при этом возросшие в стране требования по экологическим нагрузкам на окружающую среду, что выдвигает новые требования к создаваемым технологиям и к действующим предприятиям. Поэтому разработка научных основ технологий микробного синтеза, базирующихся на отечественных источниках сырья, исключающих применение в технологическом процессе токсичных химических элементов, расширяющих номенклатуру и объемы отечественных пищевых ингредиентов, является актуальным направлением научных исследований.

Научные основы технологий лимонной кислоты с использованием углеводсодержащего сырья и продуцента Aspergillus niger разработаны В.С.

Омелянксим, С.П. Костычевым, С.В. Буткевич, Г.И. Журавским, О.Ф.

Терентьевой, Е.С. Минц, Е.Б. Львовой, Л.Н. Мушниковой, И.А. Аглиш, Т.А.

Никифоровой и др. В течение 50 лет с момента организации в России профильного производства единственным промышленным сырьем является свекловичная меласса, состав которой требует постоянного контроля при его отборе, хранении, а также и в процессе химпереработки, сопровождающейся загрязняющими стоками, выбросами и утилизируемыми отходами. К числу перспективных сырьевых ресурсов, имеющих стабильную возобновляемую основу, относятся крахмалсодержащие зерновые культуры, широко возделываемые в РФ, свойства которых используется не в полной мере. В зарубежном производстве лимонной кислоты прослеживается тенденция к внедрению крахмалсодержащего сырья (Н. Василев, V.S. Shankaranand, Yu Yunling, W. Lesniak, K. Tsekova, G. Xie и др.). Поскольку оно может индуцировать биосинтез амилаз, то применение его в технологиях синтеза лимонной кислоты создает возможность максимальной реализации потенциала микромицетов рода Aspergillus в части получения еще одного целевого продукта, а именно, амилолитических ферментов. Крахмалсодержащее сырье может использоваться актиномицетами рода Streptomyces для продуцирования и ингибиторов амилаз с широкой специфичностью действия. Таким образом, крахмалсодержащее сырье перспективно для создания многопрофильного биотехнологического производства как индивидуальных, так и комплексных, функциональных пищевых добавок, дефицит которых существует на российском рынке.

В основу научного решения проблемы создания многоцелевого процесса положена концепция системного анализа нетрадиционных источников сырья с целью экологизации микробиологического производства за счет перехода на экологически чистое сырье – гидролизаты крахмалов, а также комплексного подхода к регуляции биосинтеза целевых продуктов и создания инновационных технологий ингредиентов, востребованных на российском рынке.

Цель работы - разработка научных основ и создание новых экологически безопасных технологий пищевых ингредиентов и добавок, содержащих продукты метаболизма микроорганизмов различных таксономических групп, при ферментации крахмалсодержащего сырья.

В задачи исследований входило проведение комплексных исследований, направленных на обоснование возможности получения с использованием гидролизатов крахмала в едином технологическом процессе нескольких целевых продуктов – лимонной кислоты и амилаз, а также ингибиторов гликозидаз, а именно:

- разработка способов подготовки сырья – крахмала для получения лимонной кислоты, ферментов и ингибиторов;

- выбор штаммов – продуцентов для получения лимонной кислоты, ферментов и ингибиторов гликозидаз, проведение скрининга;

- исследование механизмов биосинтеза и секреции -амилазы и глюкоамилазы – ключевых ферментов углеводного метаболизма при биоконверсии гидролизатов крахмала в лимонную кислоту микромицетом Aspergillus niger, их кинетических и обменных характеристик, стабильности в клетке продуцента и во внеклеточном пространстве для установления путей регуляции продуцирования;

- научное обоснование параметров формирования активного вегетативного посевного мицелия продуцентов и технологических режимов культивирования штаммов-кислотообразователей Aspergillus niger и штаммов актиномицетов рода Streptomyces для повышения выхода и активности соответственно амилолитических ферментов и ингибиторов амилаз;

- исследование закономерностей биосинтеза ингибиторов амилаз стрептомицетами и установление химической природы целевых метаболитов;

- разработка способов выделения лимонной кислоты, амилаз и ингибиторов амилаз;

- изучение физико-химических и биохимических свойств амилаз и ингибиторов гликозидаз в составах препаратов и оценка их биологической безопасности для разработки комплексных пищевых добавок и установления эффективности их применения в технологиях хлебобулочных изделий и пива;

- разработка технологий и технической документации на производство в одном технологическом процессе лимонной кислоты, комплексного ферментного препарата кислотостабильных амилаз и комплексной пищевой добавки на его основе, технологии ингибиторов амилаз и функциональной комплексной пищевой добавки на его основе; рекомендации по применению новых пищевых ингредиентов и добавок в пищевой промышленности.

Научная новизна заключается в следующем:

- установлены закономерности биосинтеза лимонной кислоты при ферментации гидролизатов крахмалов, на основании которых впервые разработаны приемы изменения направленности биотехнологического процесса с целью получения наряду с основным метаболитом ферментов амилолитического действия в качестве целевых продуктов микробиологического синтеза; обоснован механизм биосинтеза и секреции -амилазы и глюкоамилазы, их роль в биоконверсии углеводов среды в процессе кислотообразования и установлены пути регуляции метаболизма микромицета Aspergillus niger для повышения эффективности продуцирования лимонной кислоты и амилаз;

- дана оценка стабильности, кинетических и обменных характеристик амилаз для корректного определения их активности в клетках продуцента и культуральной среде и исследованы биокаталитические, физико-химические свойства, компонентный состав, микрофлора ферментных препаратов и выявлены направления их применения;

- разработаны эффективные, экологически безопасные способы выделения целевых продуктов микробного синтеза, позволяющие получать пищевую кристаллическую лимонную кислоту в соответствии с ГОСТ 908-2004 и комплексный препарат кислотостабильных ферментов Глюкоамилонигрин с активностями амилаз на уровне мультиэнзимных композиций, декларируемых зарубежными фирмами, и высокоочищенные препараты амилаз;

- установлено наличие в культуральной жидкости, полученной в процессе ферментации гидролизатов крахмалов в лимонную кислоту, ингибиторов амилаз и выявлено их структурное подобие известным ингибиторам гликозидаз псевдосахаридной природы, синтезируемым актиномицетами рода Streptomyces.

- путем ступенчатого отбора из культур актиномицетов коллекции ГНУ ВНИИПАКК Россельхозакадемии выделены и запатентованы штаммы Streptomyces lucensis ВКПМ Ас-1743 и Streptomyces violaceus Ас-1734 – продуценты ингибиторов амилаз;

- исследовано влияние углеводов различной структуры, степени деструкции крахмалсодержащего сырья на биосинтез ингибитора амилаз и обоснована целесообразность использования в качестве источника сырья гидролизатов кукурузного крахмала;

- выявлены закономерности биосинтеза ингибиторов амилаз, разработаны составы питательных сред и определены условия культивирования продуцентов для продуктивного биосинтеза целевых метаболитов;

- установлена природа выделенных ингибиторов и разработан способ получения препаратов с активностью на уровне и выше известных аналогов;

- установлено гипогликемическое действие полученных ингибиторов гликозидаз в опытах in vivo на лабораторных животных;

- научно обоснованы и разработаны составы комплексных пищевых добавок и изучено их действие в различных пищевых системах; выявлено, что Глюкоамилонигрин, содержащий кислотостабильные гидролазы, способствует интенсификации гидролиза растительных полимеров, а Люцентин и Виолацентин, состав которых включает ингибиторы гликозидаз, снижают уровень легкоусвояемых сахаров в хлебобулочных изделиях без изменения технологических и органолептических показателей.

Новизна предлагаемых технических решений защищена 12 патентами.

Основные положения, выносимые на защиту:

микроорганизмами различных таксономических групп для разработки «совмещенной» технологии лимонной кислоты и амилаз и технологии ингибиторов гликозидаз.

· Критерии оценки направленности биосинтеза и пути его регуляции при биоконверсии продуктов деструкции крахмала продуцентом лимонной кислоты микромицетом Aspergillus niger, сформулированные на основе характеристик кинетики и метаболизма синтезируемых им ключевых амилолитических ферментов (-амилаза и глюкоамилаза) углеводного обмена.

· Особенности биосинтеза ингибиторов гликозидаз при ферментации гидролизатов крахмалов штаммами аспергиллов и актиномицетов; свойства ингибиторов.

· Обоснование компонентного состава рецептур комплексных пищевых добавок, содержащих кислотостабильные гидролазы и ингибиторы гликозидаз, полифункционального назначения и функционального действия.

Методология получения пищевых ингредиентов и добавок на основе продуктов биоконверсии деструктурированного крахмалсодержащего сырья для расширения ассортимента и повышения рентабельности монопроизводства.

Практическая значимость. На основании материалов исследований разработаны:

принципиально новые конкурентоспособные на мировом рынке технологии лимонной кислоты и амилаз и комплексной пищевой добавки Глюкоамилонигрин (ТИ 085-00334557-2004, ТИ 091-0034557-2005, ТИ 092инновационные технологии ингибиторов гликозидаз и комплексных пищевых добавок функционального назначения на их основе (ТИ 115-00334557модифицированный метод определения глюкоамилазной активности в культуральной жидкости, ферментных препаратах и пищевых добавках;

утверждены:

техническая документация на ферментный препарат Глюкоамилонигрин в жидкой и порошкообразной формах (ТУ 9199-002-00334557-04). Получено Санитарно-эпидемиологическое заключение ФГУЗ «Информационнометодический центр «Экспертиза» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека о возможности использования Глюкоамилонигрина в пищевой промышленности (№ 77.99.24.919.Т.001.091.06.05. от 20.06.2005);

два вида новой продукции - добавки пищевые функционального назначения для продуктов профилактического направления Люцентин (РЦ 234и Виолацентин (РЦ 235-002-00334557-08) и соответствующая разработанная техническая документация (ТУ 9199-080-00334557-08, ТУ 9199-081-00334557-08);

методические указания по применению препарата Глюкоамилонигрин в пищевой промышленности (РД 059-00334557-2004) и методические рекомендации по применению ингибитора гликозидаз в пищевых продуктах (РД 092-00334557-2008); проведены с положительным результатом опытнопромышленные испытания улучшителя на основе ферментного препарата Глюкоамилонигрин в хлебопекарном производстве и приготовлении пива;

препарат ингибитора гликозидаз и комплексные пищевые добавки на его основе испытаны при приготовлении хлеба различных сортов;

методические указания для оценки содержания конидий продуцента в воздухе рабочей зоны при получении лимонной кислоты в лабораторных или производственных условиях с использованием различных видов сырья, в том числе и крахмалсодержащего: МУК 4.2.2656-10. «Метод микробиологического измерения концентрации клеток штамма-продуцента лимонной кислоты Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе рабочей зоны» (2010);

требования к качеству гидролизатов крахмалов как к сырью для промышленного производства лимонной кислоты (ГОСТ Р 52672-2006.

«Гидролизаты крахмала. Общие технические условия»).

Методология подготовки крахмалов к ферментации использована для разработки новых технологий лимонной кислоты на базе зернового крахмалсодержащего сырья.

Материалы исследований в виде отдельных разделов вошли в монографию «Биосинтез и выделение лимонной кислоты и амилолитических ферментов»

(Кулев Д.Х., Шарова Н.Ю., - М.: ДеЛи принт, 2008. – 128 с.), рекомендованную к использованию в учебном процессе высших учебных заведений.

Разработки технологий лимонной кислоты и амилолитических ферментов, ингибиторов гликозидаз и пищевых добавок на их основе награждены дипломами международной выставки-ярмарки «АгроРусь» (2007, 2009), седьмого международного профессионального конкурса «Ингредиент года антидиабетического направления на основе ингибиторов гликозидаз микробного происхождения в Конкурсе на лучшие инновационные проекты в сфере науки и высшего профессионального образования СПб в 2011 г. признан победителем в номинации «Лучшая научно-инновационная идея» (диплом ИП № 10/11).

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: научно-практических конференциях (НПК) Отделения хранения и переработки сельскохозяйственной продукции Россельхозакадемии (Углич, 2000-2004, 2006, 2007, 2010,2012), Всероссийской НПК «Перспективные технологии пищевых добавок» (СПб, 2007); четвертом Международном семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология – 2000» (СПб, 2000), Международном форуме «Биотехнология и современность» (СПб, 2003, 2006); Международных научнопрактических симпозиумах (НПС) по направлению «Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК» (Москва, 2004,2006,2008,2010,2012), третьей Международной НПК «Низкотемпературные и пищевые технологии в XXI веке»

(СПб, 2007), седьмой Международной конференции «Масложировая индустрия – 2007» (СПб, 2007), Международном форуме «Пищевые ингредиенты – 2008»

(Москва, 2008), НПК «Пищевые добавки и современные технологии переработки сельскохозяйственного сырья» (СПб, 2011), Международной НПК «Крахмал и крахмалопродукты, состояние и перспективы развития» (Москва, 2011), Европейском конгрессе «The first North and East European Congress on Food.

NEEFood-2012» (СПб, 2012).

Публикации результатов исследований. Основные положения диссертационной работы изложены в 92 научных работах, в том числе патентах, 2 монографиях. Основные материалы диссертации представлены статьями в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 241 страницах машинописного текста, содержит 73 таблицы и 62 рисунка, состоит из введения, аналитического обзора, объектов, методов и результатов экспериментальных исследований, изложенных в 3 основных главах, заключения, выводов, списка использованных источников и основных обозначений, содержит 53 приложения.

Библиографический список состоит из 400 наименований (206 иностранных).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана краткая оценка состояния производства пищевых ингредиентов и добавок - продуктов микробиологического синтеза, наиболее востребованных в качестве пищевых ингредиентов и добавок полифункционального назначения.

В аналитическом обзоре рассмотрены направления развития пищевой биотехнологии с использованием микроорганизмов и продуктов их метаболизма.

Представлен анализ современного состояния производства пищевой лимонной кислоты, амилолитических ферментов и их ингибиторов на лабораторном уровне и в условиях монопроизводства. Отражены особенности микробиологического производства функциональных пищевых ингредиентов, комплексных ферментных препаратов и добавок. Определены общие факторы, влияющие на биосинтез и выделение целевых метаболитов, спрогнозирована перспективность и возможность их получения в одном технологическом процессе. Обоснована актуальность рассмотрения поставленной проблемы, целесообразность проведения намеченных исследований, сформулированы цель, задачи, научная новизна и практическая значимость выносимых на защиту положений. Схема проведения эксперимента приведена на рисунке 1.

Объектами исследований являлись промышленные штаммыпродуценты лимонной кислоты Aspergillus niger, полученные методом мутагенеза (ВКПМ F-171 (Л-4), ВКПМ F-326 (Л-5), ВКПМ F-681 (В-1), ВКПМ F-696 (В-2), ВКПМ F-719 (В-3)) и вегетативной гибридизации (ВКПМ F-501 (Ли культуры актиномицетов из коллекции ГНУ ВНИИПАКК Росельхозакадемии; крахмалсодержащее сырье и его гидролизаты;

культуральная жидкость (КЖ) и нативные растворы; лимонная кислота;

ферменты, синтезируемые штаммами-кислотообразователями Aspergillus niger;

ингибиторы гликозидаз, продуцируемые культурами аспергиллов и стрептомицетов; комплексные ферментные препараты (КФП) и комплексные пищевые добавки (КПД), составы которых разработаны на основе лимонной кислоты, амилаз и их ингибиторов. Культивирование микроорганизмов проводили в условиях шейкера-инкубатора Multitron (Швейцария), встряхивающего аппарата АВУ-50Р (Россия) и экспериментальнопромышленной установки ГНУ ВНИИПАКК Россельхозакадемии.

Анализ данных научно-технической и патентной литературы.

Выбор цели и определение задач исследований Отбор производственных штаммов микромицета Aspergillus niger и культур актиномицетов из коллекции ГНУ ВНИИПАКК Россельхозакадемии с целью выявления соответственно способности к биосинтезу амилаз и получения продуцентов ингибитора гликозидаз при культивировании на Разработка оптимальных составов питательных сред на основе крахмалсодержащего сырья для продуктивного биосинтеза лимонной кислоты и амилолитических ферментов в одном биотехнологическом процессе и 1. лимонной кислоты и амилолитических ферментов;

2. ингибитора гликозидаз.

Разработка принципиальных технологических схем процессов Изучение физико-химических свойств лимонной кислоты, амилолитических Разработка технической и нормативной документации на получение:

1. в одном технологическом процессе лимонной кислоты и амилаз;

2. ингибитора гликозидаз Разработка составов комплексных пищевых добавок на основе:

1. лимонной кислоты и амилолитических ферментов;

2. ингибитора гликозидаз Исследование влияния комплексных пищевых добавок на физико-химические и органолептические показатели хлебобулочных изделий и пива 1. «совмещенную» технологию лимонной кислоты и ферментов;

2. технологию ингибиторов гликозидаз;

3. комплексные пищевые добавки на основе лимонной кислоты и амилаз;

4. комплексные пищевые добавки на основе ингибиторов гликозидаз;

Разработка рекомендаций по применению добавок в хлебопекарной и пивоваренной промышленности Рисунок 1 - Схема проведения экспериментальных исследований Методы исследований. В работе использованы общепринятые и стандартизованные в производствах лимонной кислоты и ферментов методы, в том числе хроматографические, колориметрические, биохимические, радиоизотопый и иммунохимический, а также гель-электрофорез, ИК- и УФспектроскопирование. Модифицирован колориметрический метод определения глюкоамилазной активности (ГлС), так как этот показатель по стандартной методике (ГОСТ Р 20264.4-89) определяется в узких пределах скорости ферментативной реакции гидролиза крахмала. Для очистки КЖ и нативного раствора использовали микрофильтрацию на мембранных элементах капсульного типа (ООО НПП «ТехноФильтр», Россия) из стекловолоконного картона и фторопласта, патронного типа (фирма «Sartorius», Германия, мембраны «Sartopure РР» из пропилена и стекловолокна и «Sartobran P» из полиэфирсульфона); ультрафильтрацию на мембранном модуле ВПУ (полые волокна из полисульфона, НПК «Биотест», Россия); фильтрацию через углеродноволокнистый карбонизованный актилен (УВКА); сорбцию на бентоните; ионообменную хроматографию на анионите АВ-17-2 (Cl-, CH3COO-, (B4O72-+C4H4O42-)-формы), катионитах КМТ и КУ-23 (Na+- и Н+-формы), сорбирующем геле - мелкозернистом крупнопористом силикагеле; осаждение растворами солей, оснований - по классической «цитратной» технологии в модификации. Целевые вещества выделяли: лимонную кислоту - из цитрата кальция по классической схеме и по мембранной технологии; амилолитические ферменты - из фильтрата цитрата кальция высаливанием или осаждением органическими растворителями; ретентата - осаждением этанолом;

ингибиторы амилаз - из осветленного и сконцентрированного пермеата.

Мицелиальную массу продуцента (в натрий-ацетатном буферном растворе (0,1 М, рН=4,7 ед.) разрушали ультразвуком (дезинтегратор HSF (Англия), амплитуда колебаний волны 7 мкм, время 6-8 мин), далее центрифугировали (20000 об./мин, плюс 4 °С, 20 мин). Для тонкой очистки амилаз из ретентатов и ингибиторов из пермеатов проводили гель-фильтрацию (сефадексы G-50 и Gдля ферментов и G-15 - для ингибиторов); для изучения ферментов проводили аффинную хроматографию (носитель - нативный крахмал, элюент буферный раствор Tris-HCl (0,05 М, рН=6,5 ед.) с гликогеном (массовая доля 0,4 %), ионообменную хроматографию (КМТ или ДЭАЭ-целлюлоза в Na+- и Н+формах), электрофорез в ПААГ (массовая доля ПАА 7,5 %). При технологической оценке препаратов ферментов, ингибиторов амилаз и содержащих их КПД в хлебопечении контролировали степень сохранения ингибиторной активности (ИА), углеводный состав теста и хлеба, качество выпечных изделий - по ГОСТ 21094-75, ГОСТ 5669-96, ГОСТ 4-96, ГОСТ 5667-65; в пивоварении - качество солода и уровень массовой доли спирта в пиве согласно ГОСТ 12787-81.

Статистическую обработку, графическую интерпритацию результатов проводили с использованием компьютерной программы Microsoft Office Excel.

Способность штаммов гриба Aspergillus niger – продуцента лимонной кислоты к синтезу амилолитических ферментов Селекционированные в ГНУ ВНИИПАКК Россельхозакадемии штаммыпродуценты лимонной кислоты микромицета Aspergillus niger обладают способностью активно ферментировать среды различного углеводного состава многокомпонентные (мелассные) и более «простые» (сахарозо- и глюкозоминеральные), а также синтезируют амилазы в «следовых» количествах.

Это свидетельствует о вариабельности активности их ферментной системы и возможности вести направленный биосинтез нескольких целевых продуктов микробного синтеза путем изменения условий и режимов культивирования продуцентов, в частности, замены традиционного углеводного субстрата на гидролизаты крахмала с различной степенью гидролиза. В результате перехода на специфические субстраты (декстрины, мальтоза) в составе гидролизата с декстрозным эквивалентом (ДЕ) 15-20 %, наиболее предпочтительного для ацидогенеза микромицетом Aspergillus niger, активности амилаз увеличивались до: в нативном растворе, ед./см3, АС -(0,17-0,26), ГлС - (1,5-2,5), в мицелии, ед./(г СБ), АС - (2,5-3,0), ГлС - (10-15). Продуктивность биосинтеза лимонной кислоты практически не изменялась в сравнении с адаптированными для продуцентов условиями культивирования.

Установлено, что штаммы Aspergillus niger, селекционированные для мелассных (Л-4, Л-5) и сахарозоминеральных (Л-7) сред, обладают большей способностью синтезировать амилазы при продуцировании лимонной кислоты, чем штаммы В-1 и В-2, полученные на следующих стадиях селекции (табл. 1).

Таблица 1 - Показатели процесса ферментации гидролизатов крахмала (на примере кукурузного крахмала) Доля лимонной кислоты в сумме органических кислот, % 93,7±0,1 93,1±0,2 94,2±0,1 94,3±0,1 96,5±0,1 93,4±0, Сухая биомасса с влажностью 10 % Продуктивность мицелия, г/г 0,56±0,01 0,53±0,02 0,53±0,01 0,59±0,01 0,66±0,02 0,63±0, Активность - -амилазная (АС) 1,0±0,1 0,6±0,1 1,0±0,1 0,4±0,1 0,6±0,1 1,1±0, ферментов - глюкоамилазная (ГлС) 18,7±0,5 9,3±0,3 17,5±0,6 3,5±0,2 7,9±0,5 20,1±1, в нативном - мальтазная (МС) 17,6±1,2 12,7±1,1 10,9±0,8 9,9±0,1 11,3±0,2 18,6±0, растворе, - осахаривающая (ОС) 14,1±0,5 10,6±0,2 12,6±0,4 8,8±0,1 9,5±0,1 15,4±0, ед./см : -декстринолитическая (ДС) 1,8±0,1 0,9±0,1 1,5±0,1 0,30±0,01 0,8±0,1 1,9±0, Примечание: массовая концентрация сахаров в питательной среде - 160±2 г/дм3, длительность процесса - 6 сут.

Максимум ферментативной активности посевного мицелия проявлялся в широком его возрастном диапазоне (36-48 ч), за исключеним В-3 (24-36 ч).

Наибольшая кислотообразующая способность для Л-5, Л-7 и В-3 приходилась на 36 ч культивирования, а для Л-4, В-1 и В-2 - на 48 ч. Установлено оптимальное количество суспензии конидий, необходимое для получения кислотообразующего мицелия - 20 % к объему питательной среды с титром (6-7) конидий/см3 среды А4. Изменение значения данного показателя в большей мере влияло на активности амилаз, чем на образование лимонной кислоты. Конверсия сахаров в лимонную кислоту снижалась на 1,3-6,7 % (исключение – В-2).

Скорость накопления амилаз продуцентами Л-4 и В-3 была выше таковой для других штаммов в 1,2-2,2 раза (рис. 2). Полученные данные свидетельствуют о том, что с практической точки зрения, исследуемые штаммы при биоконверсии гидролизатов крахмала в лимонную кислоту являются потенциальными продуцентами амилаз, но для максимального проявления возможностей их ферментной системы необходимо оптимизировать питание микроорганизмов, в частности по углеводному составу, и условия культивирования.

Исследование влияния углеводного состава среды на биосинтез лимонной Сравнительное изучение зависимостей изменения концентрации трех фракций углеводов (декстринов, мальтозы, глюкозы) в среде, содержащей гидролизат кукурузного крахмала с ДЕ=(19±1) %, в процессе ферментации показало, что скорость их биотрансформации штаммами уменьшается в ряду:

Л-4В-3Л-7Л-5. На вторые сутки культивирования всех продуцентов декстрины в среде отсутствовали, а значения максимальных скоростей накопления ферментов (по АС и ДС) были близки. Максимальное значение концентрации мальтозы, которая присутствовала в среде до конца процесса ферментации, наблюдалось на 2 сут культивирования штамма Л-4 и превышало в 1,2, 1,8 и 2,7 раз таковое соответственно для штамов Л-7, Л-5 и В-3 (рис. 3). Скорость накопления ферментов штаммами Л-4 и В- была выше по сравнению с Л-5 и Л-7 в 1,2-2,2 раза. Максимальная скорость синтеза лимонной кислоты приходилась на 5 сут процесса для штаммов Л-4, В-3, Л-5 и на 4 сут - для Л-7. Для Л-7 и Л-5 биосинтез Рисунок 3 - Динамика декстринов (), амилаз, процессы накопления-потребления мальтозы () и глюкозы (- -) мальтозы и катаболизм сахаров в лимонную в среде, содержащей гидролизат кислоту носят пролонгированный характер.

Аналогичные зависимости получены при Л-4 (--), Л-5 (--), Л-7 (--), В-3 (-х-) ферментации гидролизатов пшеничного, ржаного и картофельного крахмалов. Выявлено, что для продуктивного биосинтеза целевых веществ эффективно использование гидролизатов крахмалов с ДЕ, %: картофельного - 12,5±2,5 кукурузного, пшеничного, ржаного - 27,5±2,5, (рис. 4). Предпочтительная концентрация сахаров находилась в пределах от 120 до 150 г/дм3. Для дальнейших исследований выбраны два штамма F-171 (Л-4) и F-719 (В-3), обладающие наибольшей способностью к биосинтезу амилаз при периодическом способе ферментации гидролизатов кукурузного крахмала.

ГлС, ед./см Влияние азот-, фосфорсодержащих компонентов и солевого состава питательной среды на биосинтез лимонной кислоты и амилаз В результате исследований установлено, что при соотношении углерода и азота (С:N) менее 30 развитие и рост мицелия штаммов Л-4 и В-3 гриба Aspergillus niger замедляются (СБ (5,3±0,5) г/дм3 против (10,1±0,1) г/дм3 в контроле (С:N75)). Повышенное содержание углеводов (С:N>75) вызывало активное накопление биомассы и приводило к снижению его кислотообразующей способности. Увеличение активности - и глюкоамилазы соответственно на 44-50 % и 21-30 % выявлено при С:N в среде 55±5 с использованием NH4NO3 (рис. 5);

показатель конверсии сахаров в контроля. Выявлено существенное биосинтез амилаз при конверсии сахаС:N ров в лимонную кислоту практически Условные обозначения:

на уровне контроля наблюдался в при- -- – АС, ед./см3; - - – ГлС, ед./см сутствии автолизата мицелия Aspergil- Рисунок 5 - Зависимость биосинтеза амилаз и lus niger (N:Р=6,7±0,7). Для повыше- конверсии сахаров в лимонную кислоту от С:N при ния активности продуцирования ами- использовании в качестве источника азота NH4NO лаз без существенного снижения активности синтеза лимонной кислоты обоснована необходимость применения макроэлементов в виде солей MgSO47Н2О и КН2РО4 и микроэлементов: Zn, Cu в сочетании с Fe для штамма Л-4 (F-171) и с Co - для штамма В-3 (F-719). Сочетание минерального и органического источников азота и микроэлементов позволило достичь повышения активности амилаз в 1,3-3,3 раза по сравнению с ферментацией комплексных сред, содержащих в качестве источника азота только NH4NO3.

Регуляция процесса биосинтеза лимонной кислоты и амилаз Ранее (Никифорова, 1998) отмечено, что в условиях, оптимальных в основном для биосинтеза лимонной кислоты (ДЕ20 %), изменение активности цитратсинтазы - регуляторного фермента ЦТК имеет фазный характер. В ходе исследований процесса ферментации гидролизатов кукурузного крахмала с ДЕ=(27,5±2,5) %, обеспечивающем продуктивный биосинтез не только лимонной кислоты, но и амилаз, установлена аналогичная зависимость (рис. 6).

Содержание белка, мг/г СБ Снижение активности цитратсинтазы наблюдалось по мере накопленияпотребления глюкозы в среде, максимумы которых совпадали с периодом наибольшего прироста цитрата в клетке (рис. 6,7). В начальный период активного ацидогенеза (3 сут) скорость потребления углеводов была минимальна, несмотря на то, что активность -амилазы в среде достигала максимума и активизировалась секреция глюкоамилазы. Совмещение периодов наибольшей активности глюкоамилазы в клетках аспергилла с пиками скоростей превращения мальтозы и вторичного прироста цитрата в клетке свидетельствует об ее активном включении в сложную систему гликолиза и цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) с образованием избыточного количества лимонной кислоты. Второй пик активности цитратсинтазы в этот период был ниже, в цитозоле вновь наблюдалось повышение активности амилаз, очевидно, в связи с накоплением во внеклеточном пространстве мальтозы. Проведенный анализ позволил сделать вывод о косвенном влиянии амилаз гриба-кислотообразователя Aspergillus niger на биосинтез лимонной кислоты. Сохранение их активности в конце ферментации и повышение активности цитратсинтазы в стационарной фазе роста гриба свидетельствует о высоком потенциале микромицета Aspergillus niger для синтеза лимонной кислоты при на уровне углеводного обмена.

деградации внутриклеточных - и глюкоамилазы (2), скорости изменения концентраций раза быстрее второй. Распад секрештаммом Aspergillus niger F-171 (Л-4) Таблица 2 - Параметры обмена амилаз микромицета Aspergillus niger штамм F-171 медленнее, чем секреторной глюкоНаименова- Значения показателей исследований мкг/см3 мкг/(см3·сут) сут-1 сут Глюкоамилаза 200,0 18,2 0,091 7, t – время полужизни 1/ изменении состава питательной среды, поэтому полученные данные позволяют корректно определить активность амилаз в пересчете на ферментативно активный белок и использовать ее в качестве критерия оценки продуктивности биосинтеза ферментов при биоконверсии гидролизатов крахмала в лимонную кислоту. На основании результатов опытов определены возможные пути регуляции биосинтеза лимонной кислоты и амилаз:

• поддержание постоянного уровня соотношения концентраций углеводов среды (декстрины, мальтоза, глюкоза), что длительное время обеспечивает максимальную биоконверсию сахаров в лимонную кислоту или при увеличении содержания моно- и дисахаридов позволяет продуктивно получать и амилазы;

• обеспечение соотношения С:N в питательной среде на уровне, способствующем активизации биосинтеза целевых продуктов;

• дополнительное введение в питательную среду органического источника азота, который позволяет повысить активность ферментов при продуктивном ацидогенезе.

По совокупности результатов исследований получены уравнения регрессии, позволяющие оценить влияние различных факторов на технологические показатели при культивировании штаммов F-171 и F-719. В тексте в качестве примера приведены уравнения для F-171 (уравнения 1-3):

Y2=2,68+0,05X1+0,21X2-0,009X4-0,73X5-0,63X1X2-0,09X1X3+0,06X2X3 (2);

Y3=166,32+1,67X1+50,61X2-0,19X3-1,45X4-18,2X5-0,003X1X2-0,003X1X3+ где Y1 - конверсия сахаров в лимонную кислоту; %, Y2, Y3 - активности, ед./см3, соответственно АС и ГлС; Х1,Х2,Х3,Х4 - массовые концентрации, г/дм3, соответственно глюкозы, мальтозы, декстринов, общего сахара; Х5 - С:N.

Наибольшее влияние на биосинтез лимонной кислоты оказывает концентрация глюкозы, а ферментов – концентрация мальтозы и С:N. С учетом вышеприведенных данных разработаны составы питательных сред, г/дм3:

гидролизат кукурузного крахмала - 140 (ДЕ=(26,5±1,5) %); аммоний азотнокислый - 2,0; автолизат мицелия Aspergillus niger - 0,5; магний сернокислый семиводный - 0,25; калий фосфорнокислый однозамещенный цинк сернокислый семиводный - 0,005; медь сернокислая пятиводная железо сернокислое семиводное – 0,001 (для F-171) и кобальт сернокислый семиводный - 0,0025 (для F-719). Установлены технологические режимы подготовки питательных сред оптимизированного состава. При оптимальных значениях параметров (массовые концентрации сахаров, глюкозы, мальтозы и декстринов в составе питательной среды, г/дм3, соответственно 130±5, 3,1±0,3, 23,1±1,2 и 73,2±2,5; С:N=55±1) показатели процесса имели значения: АС – (4,1±0,2) ед./см3, ГлС – (140±6) ед./см3, конверсия сахаров в лимонную кислоту – (84,5±2,5) %.

Очистка нативного раствора, выделение лимонной кислоты и амилаз Полученные в результате ферментации нативные растворы содержали вещества минеральной, углеводной и белковой природы (табл. 3).

Таблица 3 - Характеристика нативных растворов ед.оп. пл. рН, мут- ед. органических кислот золь- саха- бел- колоцвет- Исследованные варианты очистки нативных растворов и выделения лимонной кислоты и амилаз приведены в таблице 4. Из исследованных приемов для предварительной очистки нативных растворов эффективно применять обработку бентонитом и УВКА (осветляющие сорбирующие материалы) или ионный обмен на анионите (сорбция – при рН=3 ед.). В результате получены обесцвеченные на 90 % растворы с содержанием сухих веществ (СВ) от 10 % до 12 %, концентрацией лимонной кислоты на уровне исходного нативного раствора и удельными АС и ГлС, увеличенными в 3-4 раза. Однако совместить и очистку нативного раствора, и разделение целевых веществ удалось только при модификации классического «цитратного» способа или применении приемов баромембранный технологии. Мембранный способ составляет альтернативу классическому «цитратному» способу при создании новых профильных предприятий по переработке крахмалсодержащего сырья в лимонную кислоту с преимуществом по количественному выходу целевых продуктов. Качество полученной лимонной кислоты соответствовало требованиям ГОСТ 908-2004, а жидкой - ТУ 9199-056-00334557-2001.

Оценка безопасности продуктов биоконверсии гидролизатов В КЖ при биоконверсии гидролизатов крахмала микромицетом Aspergillus niger идентифицирован ненормируемый афлатоксин G2, содержание которого в процессе инактивации мицелия и очистки нативного раствора существенно снижалось (табл. 5). Установлено, что обсемененность КЖ находилось на уровне 20 КОЕ/см3 (по гигиеническим требованиям для пищевых добавок от 10 до 100 КОЕ/см3). В растворах лимонной кислоты микроорганизмы отсутствуют, а в ферментных препаратах выявлены только бактериальные формы (от 20 до 40 КОЕ/г).

Таблица 4 – Выделение целевых продуктов из очищенных нативных растворов Классический «цитратный» способ (Смирнов, 1983) Кристаллическая лимонная кислота Разработанный модифицированный «цитратный» способ с использованием осадителей Кристаллическая лимонная кислота и препарат амилаз Наименование Содержа 50 % Раствор лимонной кислоты и препараты амилаз Наимеамилаза и глюкоамилаза нование сорб- десорб КМТ Na+ 4,7±0,3 5,5±0,1 70± кристаллическая 78±2 Порошкообразный препарат (лиофилизированный ретентат) лимонная кислота и препараты амилаз Примечание: * н.р. – нативный раствор, ** - ф.п. – ферментный препарат Разработанный модифицированный «цитратный» способ, отличия от классического:

нейтрализация: t=(50±3) оС до рН=(5,9±0,1) ед., одностадийное обесцвечивание активным углем (1 г/100 г лимонной кислоты); фильтрат цитрата кальция концентрируют (вакуум 0,082 МПа, t=(27±2) оС, до рН=(4,7±0,2) ед., СВ (11±2) %) и выделяют из него ферменты методом осаждения; маточные растворы как отходы утилизируют по классическому «цитратному» способу.

Разработанный бесцитратный способ: очистка бентонитом - (22±2) г на 100 г н.р.* и УВКА (рН=3,8 ед., t=(22±3) оС) с последующим разделением лимонной кислоты и ферментов на ионитах или силикагеле и осаждением амилаз этанолом (70 %).

Разработанный мембранный способ: микрофильтрация (мембраны с размером пор 1,65; 1,2;

0,45 и 0,25 мкм), ультрафильтрация («отсечение» 15 кДа), осветление пермеата (1 г угля БАУ-А на 100 г лимонной кислоты, длительность 30 мин), концентрирование (t=(37±2) оС);

маточные растворы возвращают на стадию осветления.

Таблица 5 - Содержание афлатоксина G2 в продуктах биоконверсии гидролизатов крахмала микромицетом Aspergillus niger Выделение высокоочищенных амилаз и их свойства Полученный ферментный комплекс, как установлено, содержит 10-20 % амилазного белка, который состотит из двух форм -амилазы (М.м 55-66 и 29- кДа) и глюкоамилазы (М.м. 97 и 116 кДа), мальтазы (М.м. 24-29 кДа) (рис. 8).

Наборы стандартных белков Wide Range Molecular Weight Calibration Kit («Sigma»)-7,8; исходный ретентат-4;

амилазы, осажденные из ретентата этанолом - 1;

внутриклеточные формы (ультрафильтрация):

внеклеточные формы (аффинная хроматография):

Рисунок 8 - Электрофореграмма амилаз Aspergillus niger Для выделения высокоочищенной -амилазы наиболее эффективна аффинная хроматография, глюкоамилазы – ультрафильтрация (табл. 6).

Таблица 6 - Результаты очистки амилолитических ферментов Гель-фильтрация (формы G1 и G2) 2000-2100 2500-2700 1-2 116- Выделенные - и глюкоамилаза Aspergillus niger имеют практически равные оптимумы проявления активности (рН=(4,5-5,0) ед.; t=(50±1) оС) и отличаются по аминокислотному составу от амилаз, синтезируемых штаммамипродуцентами ферментов Aspergillus niger. В отличие от данных Svensson (1983) и Stein (1960) -амилаза продуцента лимонной кислоты содержит аминокислот против 433, а глюкоамилаза - 564 против 616.

Исследование физико-химических и биохимических свойств ферментного комплекса, выделенного из нативного раствора Ферменты выделенного комплекса сохраняли (97±3) % активности при рН=(2,5-6,5) ед. и t=(20-70) оС в составе концентрата (ретентата), при t=(20-60)оС – порошкообразной формы (осаждение этанолом). Помимо - и глюкоамилазной активностей они обладали мальтазной (МС), осахаривающей (ОС), декстринолитической (ДС), протеиназной (ПС) и ксиланазной (КС) способностью.

Исследование углеводного состава пшеничной муки (распространенный вид пищевого сырья) показало, что амилазы Aspergillus niger проявляют большее осахаривающее действие, чем глюкоамилаза «Novo Nordisk» и МЭК «Biobake fresh XL». Увеличение степени гидролиза углеводов муки наблюдали при рН=(4,7±0,3) ед. и дозировке полученных ферментных препаратов к массе муки 0,005-0,010 % (рис. 9). В течение 12 мес хранения при (5±1)оС и минус (12±1)оС амилазы в препаратах сохраняли до 100 % активности. При (22±3) оС активность концентрата в течение 6 мес снижалась до (46±2) % и 12 мес - до (23±2) %.

Разработка составов и оценка качества комплексного ферментного препарата и комплексной пищевой добавки Глюкоамилонигрин Установлено, что в составе полученного концентрата (ретентата) помимо комплекса ферментов содержится остаточная лимонная кислота (4-6 %), которая является регулятором буферности растворов и способствует сохранению рН в пределах проявления активности амилаз на высоком уровне (табл. 7).

Таблица 7 – Характеристика ферментного препарата Глюкоамилонигрин Массовая доля, %:

бензоата натрия (Е211) или сорбата калия (Е202) или 0,005(Е211,202)/ Количество мезофильно-аэробных и факультативноанаэробных микроорганизмов, КОЕ/г, не более Показано, что для длительного хранения концентрата (6 мес) при (22±3) оС необходима стабилизация активности амилаз (сохранение на 90 %) ионами кальция. В ферментном комплексе, осажденном этанолом из такого концентрата, уровень активности превышал в 1,5 раза активность препаратов без кальция.

Присутствие последнего исключает необходимость дополнительного введения в составы препаратов других веществ с аналогичными функциями в технологиях приготовления пищевой продукции. Для стандартизации активности амилаз в состав препарата введен наполнитель (крахмал - аффинный лиганд). В процессе хранения в указанных выше условиях обсемененность жидкой формы КФП превышала нормативный уровень, что потребовало добавления консервантов; в порошкообразной форме изменение микробиологического состава не выявлено.

Каталитическая активность Глюкоамилонигрина оценена в хлебопечении и пивоварении (рис. 10,11).

1-3 - концентрат, 5-7 - порошкообразная форма; 1,3,6,8 и 2,4,7,9 - использование солода соответственно Рисунок 10 - Влияние комплекса амилаз на Выявлено, что при приготовлении хлебобулочных изделий из пшеничной муки использование препарата на разных стадиях технологического процесса приводит к увеличению содержания редуцирующих веществ, интенсификации газообразования и положительно отражается на качестве готового продукта (увеличение пористости на 4-15 %, удельного объема на 6-12 %). После хранения в течение 48-96 ч показатель сжимаемости мякиша опытных образцов хлеба превышал уровень контроля на 16-30 %, что свидетельствует о возможности увеличения срока хранения готового изделия. Применение Глюкоамилонигрина в пивоварении показало, что введение его в затор с солодом как с пониженной ферментативной активностью, так и со стандартными свойствами, способствует снижению времени осахаривания на 10-15 мин, увеличению содержания редуцирующих веществ в сусле на 5-8 % и обьмной доли спирта в пиве - на 11-20 %. КФП Глюкоамилонигрин стандартизован по амилолитической активности, однако он содержит и другие ферменты (ксиланазу, протеиназу, мальтазу), а также, наряду с остаточной лимонной кислотой, цитрат кальция, образующийся в результате стабилизации активности амилаз. Указанное выше расширяет функциональные свойства препарата и позволяет обосновать состав КПД на его основе. Молочная кислота, введенная в состав КФП для предотвращения повышения обсемененности (альтернатива консервантам), обладает влагоудерживающей способностью, что важно при Таблица 8 - Состав комплексной хранении пищевых продуктов. В итоге пищевой добавки Глюкоамилонигрин разработан состав полифункциональной Наименование Массовая доля, % КПД Глюкоамилонигрин (табл. 8). По Сухие вещества 25 уровню активностей ферментов и спектру Таблица 9 - Каталитические свойства комплексной пищевой добавки Глюкоамилонигрин и промышленных образцов Наименование препарата - глко- маль- осахари- декстри- проте- ксилаамилазная амилазная тазная вающая нолити- иназная назная SAN Super 240L, «Novozymes» 700±50 3000±130 3,5±0,2 6200±150 34±2 - Глюкаваморин (БЗБП) 15±2 1000±45 1,5±0,1 2000±120 16±1 10±1 Порошкообразная форма Глюкоамилонигрин 1300±60 10000±520 28±2 8200±230 120±5 50±5 100± МЭК «Biobake fresh XL»

(«Quest International») 380±20 8200±140 84±5 2500±120 20±2 - Глюкавморин, ЗАО «БК Восток» 30±2 2000±160 35±3 1000±50 2,5±0,1 15±1 Эффективность Глюкоамилонигрина при испытаниях в хлебопечении проявлялась в интенсификации брожения и улучшении органолептических показателей готовой продукции (более приятные вкус, запах, более нежный мякиш) и длительном сохранении свежести.

Ингибиторы амилаз, синтезируемые грибом-кислотообраpователем Установлено, что нативные растворы, ролизатов крахмала, содержат углеводы со значениями Rf, близкими к Rf мальтозы (0,58) (рис. 12). По-видимому, это вещества, не что их структуры содержат -1,2- и -1,4- 1– глюкоза, 2 - мальтоза, 3 - посевной гликозидные и двойную связи, альдегидные, Изучаемые вещества имеют относительную 9 – пермеат после осаждения белков ТХУ М.м.1500, ингибируют амилазы продуцента. Рисунок 12 - Углеводный состав нативного При ферментации кристаллического сахара вещества с указанными выше свойствами не обнаружены. На основании полученных данных сделан вывод о том, что гриб Aspergillus niger синтезирует ингибитор амилазы только в присутствии их субстратов-индукторов.

Исследование способности стрептомицетов к синтезу ингибиторов гликозидаз при ферментации крахмалсодержащего сырья Синтез ингибиторов гликозидаз в промышленном масштабе аспергиллами не эффективен, но этой способностью обладают стрептомицеты. Показано, что при ферментации среды, содержащей растворимый (картофельный) крахмал, культуры Streptomyces из коллекции ГНУ ВНИИПАКК Россельхозакадемии продуцируют ингибитор -амилазы (в качестве тестового выбран фермент из панкреаса свиньи, по специфичности действия близкий к панкреатической амилазе человека). Методом ступенчатого отбора селекционированы активные штаммы S. lucensis ВКПМ Ас-1743 и S. violaceus ВКПМ Ас-1734.

В результате исследования влияния химической природы и концентрации углеводов на биосинтез ингибитора установлено, что наиболее предпочтительным источником углерода для получения посевного материала с высокой дегидрогеназной активностью, является глюкоза. Продуктивный биосинтез ингибитора происходил в присутствии в среде премущественно декстринов и мальтозы, и в наибольшей мере при ферментации гидролизатов кукурузного крахмала (рис. 13).

активность, ед. ИА/ см Ингибиторная 1,2,4 – гидролизаты соответственно кукурузного, картофельного и пшеничного крахмалов;

Рисунок 13 - Влияние источника крахмала и степени его гидролиза на биосинтез ингибитора панкреатической -амилазы: А- S. lucensis ВКПМ Ас-1743, Б – S. violaceus ВКПМ Ас- В результате замены гидролизатов крахмалов на индивидуальные углеводы (глюкоза, мальтоза, декстрины, сахароза) синтезировался ингибитор глюкоамилазы (Asp. awamori), но не -амилазы (панкреатическая, Bac. subtilis).

Исследование культурально–морфологических и физиолого-биохимических свойств продуцентов ингибитора гликозидаз Стадии физиологического развития посевного мицелия двух изучаемых штаммов стрептомицетов были практически идентичны, однако культура S.

luсensis ВКПМ Ас-1743 проявляла дегидрогеназную активность уже в возрасте 24 ч и сохраняла активное физиологическое состояние в течение 72 ч в отличие от мицелия S. violaceus ВКПМ Ас-1734 (от 43 до 48 ч). Накопление ингибитора в КЖ происходило в период максимального потребления продуцентами источника углерода (от 1 до 3 сут) на фоне снижения их амилолитической активности, которая практически отсутствовала к 3 сут процесса. В данный период изменялись морфологические признаки продуцентов: активное спорообразование и формирование из спор «розеток» у S. violaceus Ас-1734, интенсивное ветвление мицелия у S. luсensis Ас-1743 (рис. 14).

Совпадение периодов биосинтеза ингибитора и дифференциации клеток актиномицетов предполагает, что образование ингибитора - это защитная реакция в ответ на активный синтез амилаз продуцента, которая находит отражение в видоизменении мицелия.

Влияние химической природы и концентрации источников азота, макро- и микроэлементов на биосинтез ингибитора гликозидаз Исследуемые штаммы стрептомицетов продуцировали ингибитор гликозидаз только в присутствии органического источника азота, а именно, соевой муки. При ее замене на дрожжевой экстракт или пептон синтезировался ингибитор с пониженной активностью (в 5-6 раз). Отношение С:N, обеспечивающее наибольшую продуктивность биосинтеза, составило: для S.

lucensis ВКПМ Ас-1743 - (20-22), для S. violaceus ВКПМ Ас-1734 – (40-42). На стадии приготовления посевного материала наибольший эффект в конечном результате оказало присутствие в питательной среде ионов натрия и кальция, а при ферментации гидролизатов как кукурузного, так и картофельного крахмалов - ионов натрия и магния. По совокупности проведенных исследований разработаны составы питательных сред, г/дм3: для шт. S. lucensis ВКПМ Ас- - гидролизат кукурузного крахмала – 20 (ДЕ=(20-25) %) и для шт. S. violaceus ВКПМ Ас-1734 - 40 (ДЕ=(30-35) %); соевая мука – 5,0; натрий хлористый – 3,0;

магний сернокислый семиводный – 0,5. Получены уравнения множественной регрессии, характеризующие влияние основных компонентов питательной среды на биосинтез ингибитора гликозидаз при ферментации гидролизатов кукурузного крахмала (уравнение 7 - для S. lucensis ВКПМ Ас-1743, уравнение 8 - для S. violaceus ВКПМ Ас-1734):

Y=1654+165,02Х1+236,17Х2+7,83Х3+28,91Х1Х2-5,88Х1Х3-0,62Х1Х4+ где Y – ИА, ед./см ; Х1,Х2,Х3,Х4 – соответственно массовые концентрации, г/дм, соевой муки, глюкозы, мальтозы, декстринов. Согласно уравнениям, ингибиторная активность в большей мере зависит от концентрации в питательной среде глюкозы и соевой муки.

Влияние эпигенетических факторов на процесс биосинтеза ингибитора гликозидаз и разработка технологических параметров ферментации Интенсивный биосинтез ингибитора амилаз происходил при температуре культивирования продуцента (28±1) оС. Повышение до (35±1) оС отрицательно влияло на продуцирование ингибитора (ингибиторная активность составляла от 60 % до 70 % от достигнутого уровня); при (24±1) оС рост актиномицета отсутствовал. Наиболее активный мицелий актиномицетов, который можно передавать на стадию ферментации, формировался на 43-48 ч культивирования как S. lucensis ВКПМ Ас-1743, так и S. violaceus ВКПМ Ас-1734. В данный период мицелий обладал максимальной дегидрогеназной активностью (время обесцвечивания метиленового синего от 2 до 3 мин). Количество посевного материала, при котором формируется активный ингибиторобразующий мицелий в процессе ферментации, составил 10 % от объема ферментационной среды.

Уровень активности синтезируемого ингибитора зависел от способа ферментации и наиболее эффективным был отъемно-доливной. Так, при практически одинаковой с периодическим способом интенсивностью биосинтеза ингибитора продуктивность мицелия и абсолютное значение ингибиторной активности были выше (соответственно в 1,5 и 1,3 раза), а длительность процесса составила 5 сут против 7 сут. Наибольший эффект достигнут при лимитации уровня кислорода в среде (скорость перемешивания 80-150 об. мин-1, расход воздуха 290-580 дм3ч-1) (табл. 10).

Таблица 10 - Показатели процесса ферментации отъемно-доливным способом Наименование показателя Разработка способа выделения ингибиторов гликозидаз Нативные растворы, полученные в результате ферментации гидролизатов крахмала штаммами актиномицетов, представляли собой окрашенные жидкости, обсемененные клетками продуцента, содержащие редуцирующие сахара и белок.

В результате изучения режимов ультрафильтрации (отсечение мембраны 15 кДа) достигнута полная очистка от клеток микроорганизмов, удалены вещества, создающие мутность, снижено содержание окрашенных и белковых примесей при сохранении ингибиторной активности на исходном уровне (табл. 11).

Таблица 11 - Показатели процесса выделения ингибитора гликозидаз Массовая концентрация, г/дм3, г/г Показатель цвет- Ингибиторная активности, D360, е.о.п. ность, ед. ИА/см3(мг) вание S.lucensis S.violaceus S.lucensis S.violaceus S.lucensis S.violaceus S.lucensis S.violaceus Пермеат 1,5±0,1 1,9±0,1 6,9±0,5 6,0±0,5 0,8±0,1 1,0±0,1 3700±120 3500± Концентрат Примечание: * - фракционирование методом гель-фильтрации Для снижения содержания окрашенных примесей в 2,0-2,5 раза использовали уголь активный порошкообразный БАУ-А из расчета 2 мг на 1 см пермеата при t=(25-50) оС в течение 60 мин. Изменение дозировки угля и времени очистки либо не изменяло свойства пермеата, либо приводило к их ухудшению. Далее очищенный пермеат концентрировали (СВ 50 %) под вакуумом, высушивали при температуре плюс (55±5) оС, обеспечивающей оптимальную длительность процесса и сохранение свойств ингибиторов (избежание карамелизации), измельчали субстанцию до однородного состояния и стандартизовали ингибиторную активность препарата. Разработанный способ позволяет получать препарат ингибитора в количестве от 7 до 12 г/дм3 нативного раствора и выходом по активности от 60 % до 85 % (от 500 до 700 ед. ИА/мг).

Исследование химической природы и свойств ингибитора гликозидаз Состав выделенных препаратов на 85-88 % представлен веществами углеводной природы, содержащими альдегидные, гидроксильные, -1,2- и -1,4гликозидные, двойную связи, амино- и иминогруппы; ингибиторы проявляют высокое сродство к амилазам и являются субстратами для микробной глюкоамилазы (табл. 12).

Таблица 12 - Физико- и биохимические свойства ингибиторов Относительная М.м.: компонент1 / компонент 2 2100-2300 / 1100-1200 1800-2000 / 900- КI, М, в отношении -амилазы:

- свиной панкреатической Кm, М, при воздействии на ингибиторы - глюкоамилазы Aspergillus niger штамм Л-4 (1,2±0,1)·10-2 (1,8±0,1)·10- Показатель КМАФАнМ составляет от 20 до 50 КОЕ/г, клетки продуцента– стрептомицета отсутствуют. В процессе хранения в течение 12 мес при температурах (4±1)оС и (22±3)оС увеличение обсемененности не обнаружено.

Испытания биологической безопасности и гипогликемического действия в условиях in vivo (совместно с ВМедА им. Кирова) показали, что при введении в рацион питания опытным крысам препарата ингибитора в сочетании с крахмалом соответственно в количестве 0,5 и 3,0 г/(кг массы животного) уровень глюкозы в крови снижается на 40-60 %. Изменения в общем состоянии подопытных животных не обнаружены.

Разработка рецептур новых пищевых добавок функционального назначения Изучение действия ингибиторов при приготовлении хлебобулочных изделий для потребителей с нарушениями углеводного обмена и имеющими ограничения по их суточному потреблению, показало, что независимо от способа приготовления теста и сорта хлеба ингибиторная активность сохраняется в процессе выпечки. В лабораторных образцах хлеба пшеничного сорта содержание глюкозы в составе хлеба с ингибитором было ниже в сравнении с контрольным образцом на (3,8±0,1) %. При внесении ингибиторов в тесто совместно с цитратом калия или мальтодекстрином в массовом соотношении 1:1 или 1:5 содержание глюкозы в хлебе было на (8±1) % ниже контроля. В результате проведения технологических испытаний установлено, что опытные образцы хлеба, независимо от соотношения ингредиентов при безопарном способе приготовления теста в сравнении с контролем содержали меньше глюкозы. В итоге разработаны рецептуры КПД Люцентин и Виолацентин, включающие наряду с ингибитором гликозидаз цитрат калия (1:2), регулирующий кислотность пищевой системы, и мальтодекстрин (1:1), придающий текучесть и легкость тесту. Установлено, что в сравнении с приготовленных по рецептуре хлеба качеству соответствовал действующей 1-6 – хлеб пшеничный (1-3 – безопарный и Таким образом, введение ингибитора как функционального ингредиента в 1,4,7,10 – контрольные образцы (без перспективу расширения ассортимента 2,3,5,6,8,9,11,12– опытные образцы:

изделий с низким традиционных пшеничных и диетических Рисунок 15 - Содержание (%) глюкозы Результаты проведенных исследований позволили сформулировать использованием экологически безопасного сырья, методология реализации которого приведена на рис. 16.

Крахмалсодержащее сырье: крахмалы, мука Продуцент: мицелиальный гриб, актиномицет Перевод сырья в доступную для продуцентов форму среда Гидролизаты с различным ДЕ макро- и микроэлементы, неорганический источник азота «цитратный»

Комплексные пищевые добавки Рисунок 16 – Методология получения пищевых ингредиентов и добавок для расширения ассортимента и повышения рентабельности монопроизводства Разработана научная концепция получения в одном производственном цикле из крахмалсодержащего сырья и при использовании в качестве продуцентов микроорганизмов различных таксономических групп нескольких продуктов микробного синтеза (органических кислот, ферментов и их ингибиторов) для применения в пищевой промышленности в качестве ингредиентов и добавок полифункционального назначения (в том числе комплексных), соответствующих нормативным требованиям безопасности.

1. Теоретически обоснованы и экспериментально подтверждены технологические режимы биокатализа крахмалсодержащего сырья, которые позволяют повысить доступность субстратов для продуцентов лимонной кислоты, амилолитических ферментов и ингибиторов.

2. Установлены закономерности биосинтеза лимонной кислоты при ферментации гидролизатов крахмалов. Показана возможность использования штаммов-кислотообразователей микромицета Aspergillus niger в качестве промышленных продуцентов амилаз и оптимизированы биотехнологические процессы получения продуктов микробного синтеза.

3. Селекционированы штаммы актиномицетов Streptomyces lucensis ВКПМ Ас-1743 и Streptomyces violaceus ВКПМ Ас-1734 - продуценты ингибиторов гликозидаз широкого спектра действия. Установлены закономерности биосинтеза ингибиторов актиномицетами и штаммами-кислотообразователями при ферментации гидролизатов крахмалов, на основе которых определены функции целевых метаболитов в биотехнологическом процессе: индуцибельные амилазы катализируют гидролиз углеводов питательной среды, а ингибиторы, образующиеся при лимитировании концентрации источника углерода, подавляют их активность для регулирования интенсивности гидролиза. Штаммы актиномицетов запатентованы (2 патента).

4. Установлено, что регуляция направленности биосинтеза при ферментации гидролизатов крахмалов как аспергиллами-кислотообразователями, так и актиномицетами возможна путем оптимизации состава питательной среды по содержанию моно-, ди и олигосахаридов и источников азота. Методом математического планирования при постановке полного многофакторного эксперимента показано, что в сбалансированном составе питательных сред основное влияние на биосинтез лимонной кислоты оказывают концентрация глюкозы, ферментов – концентрация мальтозы и отношение С:N, ингибиторов гликозидаз – концентрации глюкозы и соевой муки. Для биосинтеза ингибитора амилаз стрептомицетами предпочтительными являются продукты гидролиза кукурузного крахмала в составе гидролизатов с ДЕ, близким к значению, полученному для биосинтеза лимонной кислоты и амилаз. Разработаны технологии ферментации гидролизатов крахмалов аспергилламикислотообразователями и штаммами стрептомицетов, обеспечивающие продуктивность процесса соответственно по ферментам и ингибиторам, превышающую показатели действующих технологий в 3-5 раз (5 патентов).

5. Теоретически обоснован и экспериментально подтвержден механизм биосинтеза-секреции -амилазы и глюкоамилазы продуцентом лимонной кислоты Aspergillus niger при ферментации гидролизатов крахмала. Динамика уровня активностей амилаз и цитратсинтазы (регуляторный фермент ЦТК на стадии биосинтеза лимонной кислоты) имеет фазный характер.

6. Установлено, что внутриклеточные и секреторные амилазы штамма F- Aspergillus niger - это самостоятельные белки, которые различаются строением, кинетическими и обменными параметрами, и представлены двумя изоэнзимами, внутри- и внеклеточные формы которых имеют близкие значения М.м.:

• уровни константы Михаэлиса и максимальной скорости реакции гидролиза крахмала для секреторных амилаз выше, чем для внутриклеточных соответственно на два порядка и в 2,2 раза для -амилазы, в 5 раз для глюкоамилазы;

• время полуобновления и скорость распада внеклеточной -амилазы в 3, раза, а глюкоамилазы соответственно в 4,5 и 4,8 раза меньше, чем у внутриклеточных ферментов. Содержание внеклеточной -амилазы и глюкоамилазы в 2,4 раза ниже, чем их внутриклеточный уровень, что позволяет высказать предположение о большей востребованности ферментов во внутриклеточном углеводном обмене для обеспечения клетки продуцента продуктами гидролиза транзитных внеклеточных олигосахаридов. По отношению к общему белку -амилаза составляет 22,2 %, а глюкоамилаза - 6,2 %, что свидетельствует об активной индукции синтеза -амилазы продуктами гидролиза крахмала.

7. Доказано, что полученные препараты кислотостабильных амилаз обладают каталитическими свойствами на уровне ферментов в составах известных мультиэнзимных композиций, в том числе и импортных (3 патента).

Разработаны рекомендации по их применению в качестве биокатализаторов при подготовке растительного сырья к биотехнологическому процессу, в процессах брожения при производстве хлеба и пива, в производстве модифицированного крахмала, глюкозных сиропов, в биохимии и медицине. Разработан состав комплексной пищевой добавки Глюкоамилонигрин, содержащий амилазы и лимонную кислоту, для интенсификации процессов брожения и улучшения свойств готовой продукции в пивоварении и хлебопечении (2 патента).

8. Установлена принадлежность ингибиторов, синтезируемых стрептомицетов при биоконверсии гидролизатов крахмала, к группе псевдосахаридов, существенно различающихся сродством к гликозидазам.

Доказано, что ингибиторы, продуцируемые актиномицетами, в отличие от ингибиторов, синтезируемых аспергиллами-кислотообразователями, являются потенциальными гипогликемическими средствами.

9. Разработаны составы комплексных пищевых добавок Люцентин и Виолацентин, обеспечивающие снижение гликемического индекса готовой хлебобулочной продукции по сравнению с традиционными изделиями при сохранении соответствия физико-химических и органолептических показателей действующей нормативной документации. Показана возможность расширения ассортимента функциональных продуктов антидиабетического направления, в том числе и хлебобулочных изделий, приготовленных по рецептурам хлеба пшеничных сортов. Выпуск такой продукции имеет социальный эффект.

10. Разработана нормативная документация на сырье – гидролизаты крахмала (ГОСТ Р 52672-2006 «Гидролизаты крахмала. Общие технические условия») и техническая документация на новые технологии, апробированные на полупромышленных установках: 1. «совмещенная» (лимонная кислота и амилолитические ферменты); 2. технология ингибиторов гликозидаз.

Технологии позволяют за счет использования крахмалов и практически безотходного мембранного способа выделения и очистки целевых веществ в условиях одного промышленного предприятия по производству лимонной кислоты дополнительно получать пищевые добавки, в том числе комплексные, специального и функционального (антидиабетического) назначения с физикохимическими и биохимическими показателями, отвечающими современным требованиям. Годовой экономический эффект от реализации технологий, обеспечивающих многоцелевой процесс получения пищевых ингредиентов и полифункциональных пищевых добавок в производстве лимонной кислоты, составит от 37 до 120 тыс. руб/(т готовой продукции).

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Шарова, Н.Ю. Биосинтез и выделение лимонной кислоты и амилолитических ферментов/ Д.Х. Кулев, Н.Ю. Шарова- М.: ДеЛи принт, 2008. - 128 с.

Шарова Н.Ю. Процессы получения пищевых кислот и амилолитических ферментов/ Н.Ю. Шарова/ Теоретические основы пищевых технологий/ отв.

редактор В.А. Панфилов. – М.: КолосС, 2009, Книга 2. - 608 с.

Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК РФ 3. Акулова (Шарова), Н.Ю. Инактивация глюкозидаз под действием биологически активного вещества из Actinoplanes sp./ Н.Ю. Акулова (Шарова), Е.В. Аверьянова, М.Д. Большакова, А.А. Селезнева // Прикладная биохимия и микробиология. - 1992. - т. 28, № 3. - С. 375-379.

4. Акулова (Шарова), Н.Ю. Сравнительное изучение действия ингибиторов микробного происхождения на различные -глюкозидазы/ Н.Ю.Акулова (Шарова), Г.А. Казанина, А.А. Селезнева //Прикладная биохимия и микробиология. - 1994.- т.30, вып.1. - С.83- 87.

5. Акулова, (Шарова) Н.Ю. Микробные ингибиторы -глюкозидаз псевдосахаридной природы. Обзор./ Н.Ю. Акулова (Шарова), А.А. Селезнева// Прикладная биохимия и микробиология. - 1995. - т. 31, № 4. - С. 371-380.

6. Шарова, Н.Ю. Новый ингибитор -глюкозидаз из Streptomyces tomyces (Kitasatoa) sp./ Н.Ю. Шарова, А.А. Селезнева// Прикладная биохимия и микробиология. - 1999. - т. 35, № 1. - С. 10-14.

7. Шарова, Н.Ю. Роль экзогенных амилолитических ферментов Aspergillus niger при биосинтезе лимонной кислоты на гидролизате крахмала/ Т.А.

Никифорова, Н.Ю. Брик, Л.Н. Мушникова, Н.Ю. Шарова, Т.В. Выборнова// Хранение и переработка сельхозсырья. - 1999. - № 9. - С. 17-18.

8. Шарова, Н.Ю. Очистка нативных растворов амилолитических ферментов/ Н.Ю. Шарова, Н.Н. Макагонова, Л.Н. Мушникова//Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 1999. - № 3. - С. 68-70.

9. Шарова, Н.Ю. Научные аспекты биоконверсии гидролизатов крахмала в лимонную кислоту/Н.Ю. Шарова, Л.Н. Мушникова, Т.А.Никифорова // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2001. - № 4. - С. 40-42.

10. Шарова, Н.Ю. Физико-химический и микробиологический состав углеводулеводсодеращего сырья – субстрата для биосинтеза лимонной кислоты/ Л.Н.

Мушникова, Т.А. Никифорова, Т.А. Позднякова, Н.Ю. Шарова// Хранение и переработка сельхозсырья. - 2001. - №7. - С.7-9.

11. Шарова, Н.Ю. Выделение кислотостабильных амилолитических ферментов/ Н.Ю. Шарова, Л.Н. Мушникова //Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2002. - № 4. - С. 80-81.

12. Шарова, Н.Ю. Ферментный препарат кислотостабильных амилаз – потенциальный улучшитель при приготовлении хлебобулочных изделий / Н.Ю.

Шарова, Т.А. Никифорова, Л.И. Кузнецова, Н.Д. Синявская // Хлебопечение России.- 2003. -№ 2. - С. 26-28.

13. Шарова, Н.Ю. Углеводный состав пшеничной муки при гидролизе кислотостабильными амилазами/ Н.Ю. Шарова// Хранение и переработка сельхозсырья. - 2003. - № 5. - С.46-48.

14. Шарова, Н.Ю. Научные аспекты совмещенной технологии микробного синтеза/ Н.Ю. Шарова, Т.А. Никифорова// Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2004. - № 3. - С. 69-71.

15. Шарова, Н.Ю. Биокатализатор на основе кислотостабильного амилолитического комплекса микробного происхождения/ Н.Ю. Шарова// Хранение и переработка сельхозсырья. - 2005. - № 2. - С. 27-29.

16. Шарова, Н.Ю. Влияние азотсодержащих компонентов питательной среды на биосинтез лимонной кислоты и кислотостабильных амилаз/ Н.Ю.

Шарова// Хранение и переработка сельхозсырья. - 2005. - № 9. - С. 36-39.

17. Шарова, Н.Ю. Амилолитические ферменты гриба Aspergillus niger:

выделение и свойства/ Н.Ю. Шарова, Т.А. Никифорова, А.В. Кабанов, В.П.

Комов// Хранение и переработка сельхозсырья. - 2006. - № 3. - С. 42-44.

18. Шарова, Н.Ю. Секреция, выделение и характеристика -амилазы плесневого гриба Aspergillus niger/ Н.Ю. Шарова, Т.А. Никифорова, В.П. Комов// Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2006. - № 1. - С. 80-82.

19. Шарова, Н.Ю. Биосинтез ингибиторов амилаз при биоконверсии гидролизатов крахмала штаммом актиномицета Streptomyces lucensis/ Н.Ю. Шарова, О.А. Ходкевич // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2006. - № 11. - С. 43-45.

20. Шарова, Н.Ю. Модифициованный метод определения глюкоамилазной активности/ Н.Ю. Шарова//Хранение и переработка сельхозсырья. -2007. -№ 2.С. 41-44.

21. Шарова, Н.Ю. Синтез и стабильность -амилазы из плесневого гриба Aspergillus niger/ Н.Ю. Шарова, А.В. Кабанов, В.П. Комов// Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2007. - № 1. - С. 56-58.

22. Шарова, Н.Ю. Регуляция направленности биосинтеза лимонной кислоты при биоконверсии гидролизатов крахмала плесневым грибом Aspergillus niger/Н.Ю. Шарова, Т.А. Никифорова //Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2007. - № 6. - С. 19-21.

23. Шарова, Н.Ю. Закономерности биотрансформации гидролизатов крахмала штаммами актиномицетов – продуцентами ингибиторов амилаз/ Н.Ю. Шарова, О.А.

Ходкевич // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2007. - № 4. - С. 27-30.

24. Шарова, Н.Ю. Биосинтетическая способность штаммов грибакислотообразователя Aspergillus niger при ферментации крахмалсодержащего сырья/ Н.Ю. Шарова, Т.В. Выборнова, Т.А. Позднякова // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2008. - № 1. - С. 52-54.

25. Шарова, Н.Ю. Влияние углеводных субстратов на биосинтез ингибитора гликозидаз/ Н.Ю. Шарова, Т.А. Никифорова, О.А. Ходкевич // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2008. - № 1. - С. 89-91.

26. Шарова, Н.Ю. Биосинтез ингибиторов гликозидаз актиномицетами рода Streptomyces/ Н.Ю. Шарова, О.А. Ходкевич // Хранение и переработка сельхозсырья.- 2008. - № 3. - С. 53-56.

27. Шарова, Н.Ю. Новые комплексные пищевые добавки для создания хлебобулочных изделий с низким гликемическим индексом / Н.Ю. Шарова, Т.А.

Никифорова, О.А. Ходкевич, Л.И. Кузнецова, Е.С. Иванова // Хлебопродукты.С. 57-59.

28. Шарова, Н.Ю. Теоретические аспекты синтеза -амилазы мицелиальным грибом-кислотообразователем Aspergillus niger/ Н.Ю. Шарова, Т.А. Никифорова, А.В. Кабанов, В.П. Комов // Хранение и переработка сельхозсырья.- 2008. - № 8.

- С. 59-61.

29. Шарова, Н.Ю. Крахмалсодержащие продукты переработки зерна ржи – перспективное сырье для биосинтеза лимонной кислоты/ Т.А. Позднякова, Н.Ю.

Шарова, Т.В. Выборнова //Хранение и переработка сельхозсырья.- 2008.-№ 7.-С.56-59.

30. Шарова, Н.Ю. Выделение и свойства ингибитора гликозидаз псевдосахаридной природы/ Н.Ю. Шарова, О.А. Ходкевич// Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2009. - № 1. - С. 65-67.

31. Шарова, Н.Ю. Культурально-морфологические и физиологобиохимические свойства новых штаммов актиномицетов – продуцентов ингибиторов гликозидаз/ Н.Ю. Шарова, О.А. Ходкевич, Т.А. Позднякова// Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2009. - № 3. - С. 74-76.

32. Шарова, Н.Ю. Ингибитор гликозидаз – ингредиент для создания функциональных хлебобулочных изделий антидиабетического направления/ Н.Ю.Шарова, Т.А. Никифорова, О.А. Ходкевич, Л.И. Кузнецова, Е.С. Иванова// Хранение и переработка сельхозсырья. - 2010. - № 6. - С. 49-51.

микробиологического производства лимонной кислоты/ Н.Ю. Шарова// Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2011. - № 2. - С. 75-77.

34. Шарова, Н.Ю. Синтез и стабильность глюкоамилазы мицелиального гриба Aspergillus niger/ Н.Ю. Шарова, Т.А. Никифорова, А.В. Кабанов, В.П. Комов // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2011. - № 3. - С. 76-77.

35. Шарова, Н.Ю. Новые ферментные препараты для подготовки деструктурированного зерна ржи к ферментации в лимонную кислоту/ Н.Ю.

Шарова, Н.В. Каменькова, О.А. Ходкевич // Хранение и переработка сельхозсырья. –2012. - № 6. - С. 37-39.

36. Шарова, Н.Ю. Технология ингибитора гликозидаз– ингредиента для пищевых продуктов функционального назначения/ Н.Ю. Шарова, Т.А.

Никифорова, О.А. Ходкевич // Материалы VII научно-практич. конф.:

Инновационные технологии в пищевой промышленности. – Минск, 2008, ч. 2. С. 202-208.

37. Шарова, Н.Ю. Новые технологии лимонной кислоты на основе крахмалсодержащего сырья/ Н.Ю. Шарова, Н.В. Каменькова, Т.В. Выборнова// Материалы VIII междунар. научно-практич. конф.: Инновационные технологии в пищевой промышленности. - Минск, 2009. - С. 46-53.

38. Шарова, Н.Ю. Направленный биосинтез ингибитора гликозидаз для лекарственной субстанции антидиабетического действия/ Н.Ю. Шарова// Материалы национального съезда фармацевтов Украины: Фармация Украины.

Взгляд в будущее. – Харьков, 2010, Т. 1. - С. 565-566.

39. Пат. 1816379 СССР Способ получения ингибитора -глюкозидаз / Акулова (Шарова), Н.Ю., Большакова, М.Д., Аверьянова, Е.В., Селезнева, А.А. ДСП. - заявл. 17.12.90.

40. Пат. 2186850 РФ Способ получения лимонной кислоты / Шарова, Н.Ю., Мушникова, Л.Н., Позднякова, Т.А., Никифорова, Т.А. Опубл. 10.08.2002, Бюл. 22.

41. Пат. 2215036 РФ Способ получения лимонной кислоты / Шарова, Н.Ю., Мушникова, Л.Н., Позднякова, Т.А., Никифорова, Т.А. Опубл. 27.10.2003, Бюл. 30.

42. Пат. 2233882 РФ Способ получения лимонной кислоты / Шарова, Н.Ю., Мушникова, Л.Н., Кулв, Д.Х., Зенькевич, В.Б., Чиванов, В.Н., Старевский, А.В.

Опубл. 10.08.2004, Бюл. 22.

43. Пат. 2261915 РФ Способ получения цитрата кальция / Шарова, Н.Ю., Мушникова, Л.Н. Опубл. 10.10.2005, Бюл. 28.

44. Пат. 2266960 РФ Способ получения лимонной кислоты, альфа-амилазы и глюкоамилазы / Шарова, Н.Ю., Никифорова, Т.А.. Опубл. 27.12.2005, Бюл. 36.

45. Пат. 2294368 РФ Пищевая добавка для гидролиза растительного сырья/ Шарова Н.Ю. Опубл. 27.02.2007, Бюл. № 6.

46. Пат. 2294371 РФ Способ получения лимонной кислоты и комплекса кислотостабильных амилолитических ферментов/ Шарова, Н.Ю. Опубл.

27.02.2007, Бюл. 6.

47. Пат. 2345529 РФ Способ производства хлеба и хлебобулочных изделий/ Евелева, В.В., Шарова, Н.Ю., Кузнецова, Л.И., Синявская, Н.Д. Опубл.

10.02.2009, Бюл. 4.

48. Пат. 2346042 РФ Штамм актиномицета Streptomyces violaceus – продуцент ингибитора гликозидаз / Шарова, Н.Ю., Никифорова, Т.А., Позднякова, Т.А. Опубл. 10.02.2009, Бюл. 4.

49. Пат. 2355755 РФ Штамм актиномицета Streptomyces lucensis – продуцент ингибитора гликозидаз / Шарова, Н.Ю., Позднякова, Т.А., Ходкевич, О.А. Опубл. 20.05.2009, Бюл. 14.

50. Пат. 2366712 РФ Способ получения лимонной кислоты, альфа-амилазы и глюкоамилазы / Шарова, Н.Ю., Позднякова, Т.А., Выборнова, Т.В., Кулев, Д.Х.

Опубл. 10.09. 2009, Бюл. 25.