На правах рукописи

ПАЩЕНКОВ

МИХАИЛ ВЛАДИМИРОВИЧ

ИММУНОМОДУЛЯТОРЫ НА ОСНОВЕ

МУРАМИЛПЕПТИДОВ И БАКТЕРИАЛЬНОЙ ДНК:

ОТ ЭКСПЕРИМЕНТА К КЛИНИКЕ

03.03.03 – Иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва, 2013 г.

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства

Научный консультант:

Доктор медицинских наук, профессор Пинегин Борис Владимирович

Официальные оппоненты:

Атауллаханов Равшан Иноятович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом иммунной биотехнологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России Казанский Дмитрий Борисович, доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией механизмов регуляции иммунитета НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН Козлов Иван Генрихович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой фармакологии педиатрического факультета, проректор по научной работе и инновационному развитию ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России

Ведущая организация: ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н.Габричевского»

Роспотребнадзора

Защита диссертации состоится «25» декабря 2013 г. в 1400 ч на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.017.01 в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России по адресу: Москва, Каширское шоссе, д. 24, к. 2. Факс: (499)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России по адресу:

115478 Москва, Каширское шоссе, д. 24, к. 2.

Автореферат разослан «»2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Гудима Георгий Олегович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность Разработка препаратов, направленных на повышение резистентности организма против инфекций и на отторжение злокачественных опухолей является важной, актуальной задачей. Это обусловлено ростом частоты инфекций, вызванных антибиотикоустойчивыми штаммами бактерий (Gould, 2008), ростом частоты хронических инфекционно-воспалительных заболеваний, сопровождающихся вторичными иммунодефицитами, ростом частоты злокачественных новообразований.

Повышение резистентности против инфекций может быть достигнуто путем стимуляции как адаптивного, так и врожденного компонентов иммунной системы. Вакцины активируют адаптивный иммунитет и обеспечивают длительную специфическую защиту, которая, как правило, развивается медленно и эффективна только против одного вида микроорганизмов. Иммуномодyляторы бактериального происхождения активируют врожденный иммунитет. Поэтому защитное действие этой группы препаратов, в отличие от действия вакцин, наступает быстро, а также является относительно неспецифичным, т.е. эффективным против больших групп патогенов. Все это делает иммуномодуляторы бактериального происхождения мощными средствами не только профилактики, но и лечения инфекций. Иммуномодуляторы, в отличие от антибиотиков, не действуют непосредственно на микробы, в связи с чем к ним не формируется лекарственной устойчивости у микробов. Кроме того, правильно подобранная иммунотерапия позволяет частично или полностью восстановить нарушенную функцию иммунитета у пациентов с вторичными иммунодефицитами, по крайней мере на время лечения антибиотиками.

Учитывая сказанное, иммуномодуляторы бактериального происхождения целесообразнон применять совместно с антибиотиками для лечения инфекционно-воспалительных заболеваний, особенно при инфекциях лекарственно-устойчивыми штаммами и/или при наличии иммунодефицитных состояний (стратегия «двойного удара» [Пинегин, Андронова, 1998]). Кроме того, эта группа иммуномодуляторов может применяться и в ситуациях, требующих быстрого повышения резистентности организма при угрозе индивидуального или массового заражения. Учитывая разнообразие микроорганизмов, иммуномодyлятора «против всех инфекций», вероятно, не существует. Однако поиск препаратов, дающих оптимальную защиту против определенных видов инфекций, оправдан и пока далек от завершения.

Известные на сегодня бактериальные иммуномодyляторы относятся в основном к двум группам: 1) мурамилпептиды и их синтетические аналоги;

2) нуклеиновые кислоты и их синтетические аналоги. Мурамилпептиды представляют собой мономерные фрагменты пептидогликана (ПГ) бактерий.

Все известные на сегодня мурамилпептидные иммуномодyляторы, в том числе отечественный препарат Ликопид, являются аналогами мурамилдипептида, который активирует врожденный иммунитет через рецептор NOD2 (Girardin et al, 2003; Meshcheryakova et al, 2007). В то же время мурамилпептиды грамотрицательных бактерий обладают структурной особенностью, а именно содержат в 3-м положении остаток мезодиаминопимелиновой кислоты (мезо-ДАП). Такие мурамилпептиды распознаются рецептором NOD1 (Chamaillard et al, 2003). По данным литературы, агонисты NOD1 являются более эффективными активаторами системы фагоцитов, чем агонисты NOD2, и поэтому лучше защищают от бактериальных инфекций (Clarke et al, 2010). Однако возможности терапевтического применения мурамилпептидов грамотрицательных бактерий, активирующих рецептор NOD1, практически не исследованы.

Недостаточно изучены механизмы действия этих мурамилпептидов на клетки врожденной и адаптивной иммунной системы и на организм человека в целом, не охарактеризована возможная терапевтическая эффективность при инфекционно-воспалительных заболеваниях.

Целью иммуномодyлирующей терапией при онкологических заболеваниях является разрыв выгодных для опухоли взаимоотношений с иммунной системой, активация клеток-эффекторов противоопухолевого иммунитета. В этом отношении привлекательны синтетические олигодезоксинуклеотиды (ОДН), содержащие тандемы «неметилированный цитозин — гуанин» (CpG). Эти соединения представляют собой синтетические аналоги бактериальной ДНК (Krieg et al, 1995). CpG-ОДН обладают несколькими видами противоопухолевой активности: вызывают антипролиферативным и иммунодулирующим действием; посредством ИФН вызывают активацию противоопухолевых эффекторов — NK-клеток, CD8+ Т-клеток; вызывают созревание плазмацитоидных дендритных клеток, что способствует индукции адаптивного иммунного ответа против опухоли (Krieg et al, 2002). В доклинических испытаниях на животных показана противоопухолевая активность CpG-ОДН in vivo, тогда как в I фазе клинических испытаний показана безопасность CpG-ОДН у человека (Krieg et al, 2004). Однако терапевтическая эффективность CpG-ОДН у пациентов со злокачественными опухолями не изучена. Не решен принципиальный вопрос: возможно ли путем активации врожденной иммунной системы с помощью CpG-ОДН добиться регресса злокачественной опухоли у человека.

Не охарактеризованы механизмы действия CpG-ОДН при злокачественных новообразованиях, биомаркеры ответа иммунной системы на CpG-ОДН, предикторы возможной клинической эффективности CpG-ОДН.

Бактериальная ДНК, помимо активации врожденного иммунитета, может выступать и в ином качестве — как носитель (вектор) генотерапевтического воздействия. Традиционные бактериальные иммуномодyляторы, воздействуя на клетки иммунной системы, вызывают изменение экспрессии сотен генов. Генотерапия представляет собой принципиально иной подход к иммуномодуляции, поскольку позволяет более тонко влиять на отдельные процессы в иммунной системе путем изменения экспрессии отдельных генов. Одним из таких процессов является миграция клеток, которая контролируется хемокинами (цитокинамихемоаттрактантами). Регулирование миграции путем трансгенной экспрессии хемокинов, которая обеспечивается бактериальными векторами, можно рассматривать как способ иммуномодулирующего воздействия. Однако возможности этого подхода практически не изучены. В частности, одним из ключевых хемокинов, регулирующих миграцию клеток врожденной и адаптивной иммунной системы, является CCL21 (von Andrian, Mempel, 2003).

Неизвестно, можно ли с помощью плазмидных векторов добиться значимой экспрессии CCL21 in vivo. Неизвестны кинетика и распределение трансгенного белка в организме. Неизвестно, какое влияние может оказывать трансгенный CCL21 на миграцию клеток в месте экспрессии и во вторичных лимфоидных органах.

Цель работы — изучение механизмов действия и терапевтической эффективности иммуномодуляторов бактериального происхождения на основе мурамилпептидов, бактериальной ДНК и ее синтетических аналогов.

Изучить иммунобиологические свойства мурамилпептидов грамотрицательных бактерий.

Изучить терапевтическую эффективность мурамилпептидов грамотрицательных бактерий в клинических испытаниях.

Изучить терапевтическую эффективность и механизмы действия синтетического олигодезоксинуклеотида, содержащего неметилированные тандемы цитозин-гуанин (CpGолигодезоксинуклеотида), в клинических испытаниях при метастатической меланоме.

Изучить возможность применения бактериальной плазмидной ДНК как носителя геноcпецифического иммуномодулирующего воздействия (на модели регулирования миграции клеток иммунной системы путем трансгенной экспрессии хемокина CCL21, достигаемой с помощью плазмидных векторов).

В работе получены новые данные о возможностях клинического применения и механизмах действия мурамилпептидов и CpG-ОДН;

предложен принципиально новый подход к иммуномодуляции, основанный на временной трансгенной экспрессии хемокинов.

В частности, впервые систематически изучены иммунобиологические свойства естественных мурамилпептидов грамотрицательных бактерий, иммуномодулирующей (иммуностимулирующей) активностью обладают мурамилпептиды, содержащие остаток мезо-ДАП не только в концевом положении, но и внутри олигопептидной цепи.

Впервые охарактеризован рецепторный аппарат и сигнальные пути, участвующие в активации клеток под действием димерного мурамилпептида диГМтетра. В отличие от мономерного ГМтри, который распознается преимущественно через NOD1, в распознавании диГМтетра участвуют рецепторы NOD1, NOD2 и TLR2. С помощью ингибиторного анализа показано, что оба мурамилпептида активируют сигнальную цепочку RIP2 – IKK – NF-B, а также киназу p38.

На основе этих предпосылок впервые создан иммуномодyлирующий препарат, представляющий собой комплекс мурамилпептидов (КМП) грамотрицательных бактерий (ГМтри + ГМтетра + диГМтетра). Впервые показано, что КМП активирует систему фагоцитов у экспериментальных мышей и обладает выраженным протективным действием против бактериальных инфекций. В доклинических и клинических испытаниях показана безопасность этого препарата. В рамках клинических испытаний указанного комплекса мурамилпептидов впервые изучено влияние агонистов NOD1 на иммунную систему человека. Показано, что при введении здоровым добровольцам препарат усиливает бактерицидность лейкоцитов, индуцирует выработку провоспалительных цито- и хемокинов, C-реактивного белка, IgM.

Впервые показано, что лабораторными маркерами ответа на мурамилпептиды грамотрицательных бактерий у человека могут служить уровни хемокинов CCL4 (MIP-1) и CCL2 (MCP-1), цитокина ИЛ-6, а также C-реактивного белка в сыворотке. Во II/III фазе клинических испытаний впервые показано, что КМП обладает терапевтическим действием у пациентов с гнойной инфекцией, ускоряет их выздоровление при добавлении к стандартному лечению (хирургическая операция + антибиотикотерапия).

Впервые обнаружено, что миелоидные ДК при стимуляции мурамилпептидами секретируют существенно более низкие количества провоспалительных цито- и хемокинов, чем макрофаги (МФ) при тех же условиях стимуляции, что обусловлено минимум двумя факторами: ранним прекращением экспрессии генов провоспалительных цитокинов и неэффективностью трансляции мРНК провоспалительных цитокинов в ДК, стимулированных мурамилпептидами. Впервые показано усиливающее действие интерлейкина-1 на секрецию цитокинов ДК при стимуляции мурамилпептидами.

Показано, что мурамилпептиды грамотрицательных бактерий не индуцируют перекрестную толерантность к липополисахариду (ЛПС). В то же время мурамилпептиды индуцируют перекрестную толерантность друг к другу, а также не влияют на ЛПС-индуцированную толерантность к ЛПС, что обосновывает возможность сочетанного применения мурамилпептидов и ЛПС для профилактики септического шока.

Впервые обнаружены антигенные и иммуногенные свойства диГМтетра, изучены кинетика, изотипический состав и эпитопная специфичность антител (АТ) к диГМтетра, показаны их защитные свойства на модели летальной инфекции грамотрицательными бактериями.

Впервые показана принципиальная возможность добиться регресса метастатической меланомы, вплоть до индукции длительной ремиссии, с помощью агонистов рецептора TLR9 — CpG-ОДН. Подтверждена безопасность применяемого агониста TLR9 — CpG-ОДН 7909. Впервые всесторонне изучены иммунологические эффекты, индуцируемые CpG-ОДН у пациентов с метастатической меланомой. Впервые показано, что CpG-ОДН при введении пациентам с меланомой вызывает продукцию ИФН I типа, активацию плазмацитоидных предендритных клеток (ппДК), повышение уровней циркулирующих ранних плазматических клеток, снижение уровней циркулирующих NK-клеток, а также — у части пациентов — повышение NK-активности. Впервые показано, что терапевтическая активность CpGОДН ассоциирована с повышением NK-активности, что позволяет рассматривать цепочку «CpG-ОДН — ппДК — цитокины (ИФН I типа) — NK-клетки» в качестве одного из основных механизмов противоопухолевого действия CpG-ОДН. Впервые охарактеризованы изменения в лимфатических узлах (ЛУ), дренирующих места подкожного введения CpG-ОДН, показана роль ЛУ в механизмах действия CpG-ОДН. Впервые выдвинуто предположение о том, что Treg-клетки блокируют некоторые иммуномодyлирующие эффекты CpG-ОДН, что позволяет рассматривать деплецию Treg-клеток как способ повышения терапевтической активности CpG-ОДН.

Впервые показана принципиальная возможность дистанционно управлять клеточным составом регионарных лимфатических узлов (ЛУ) путем трансгенной экспрессии хемокинов в эпидермисе. Впервые получены плазмидные конструкции, позволяющие экспрессировать в эукариотических клетках хемокин CCL21 и маркерный белок EGFP (как раздельно, так и в виде гибридного белка), что позволяет отслеживать трансфицированные клетки и оценивать внутриклеточное распределение трансгенного CCL21.

Показано, что внутрикожное введение этих конструкций с помощью технологии генного ружья позволяет добиться высокой экспрессии хемокина CCL21 в эпидермисе, которая длится несколько суток. Впервые показано, что трансгенный CCL21, экспрессируемый в эпидермисе, доставляется с током лимфы в регионарные ЛУ и накапливается в них в высокой, физиологически значимой концентрации. Впервые показано, что трансгенный CCL21, транспортирующийся в ЛУ, влияет на клеточный состав ЛУ, в частности, усиливает накопление в этих ЛУ зрелых ДК и наивных Т-клеток. Кроме того, впервые обнаружена способность CCL21 усиливать макропиноцитоз и экспрессию CD40 на ДК.

Теоретическая и практическая значимость Теоретическая значимость работы состоит в обнаружении новых свойств и механизмов действия иммуномодуляторов бактериального происхождения. Во-первых, обнаружены новые аспекты влияния мурамилпептидов на врожденный и адаптивный иммунитет: уточнены механизмы распознавания мурамилпептидов грамотрицательных бактерий клетками врожденной иммунной системы человека; описаны особенности экспрессии и секреции провоспалительных цитокинов клетками врожденной иммунной системы человека при воздействии мурамилпептидов; описана способность мурамилпептидов грамотрицательных бактерий усиливать резистентность к грамположительным бактериям; обнаружена иммуногенность более сложных по структуре мурамилпептидов грамотрицательных бактерий, таких как диГМтетра, которая проявляется при иммунизации высокими дозами этих соединений; продемонстрированы защитные свойства АТ против таких мурамилпептидов. В целом, эти результаты расширяют понимание механизмов действия мурамилпептидных иммуномодyляторов. Во-вторых, показана принципиальная возможность добиться регресса меланомы с помощью активатора врожденного генотерапевтического подхода к иммуномодуляции с использованием бактериальных векторов.

иммуномодyлятора «Полимурамил», представляющего собой комплекс мурамилпептидов грамотрицательных бактерий. По результатам клинических испытаний, «Полимурамил» рекомендуется к применению в сочетании со стандартной терапией гнойных хирургических инфекций и гнойных инфекций кожи. Препарат улучшает общие результаты лечения, ускоряет разрешение воспаления, заживление раневых дефектов.

Субстанция «Полимурамил» включена в Государственный реестр лекарственных средств РФ под № ФС-000557, лекарственный препарат «Полимурамил» — под № ЛП-002069.

Результаты работы позволяют рассматривать вопрос о повышении разовой и курсовой дозы «Полимурамила», а также о расширении показаний к применению препарата. Кроме того, полученные в работе новые теоретические данные о свойствах мурамилпептидов могут быть использованы для создания семейства препаратов, являющихся как «чистыми» иммуномодyляторами (ГМтри, ГМтетра и их возможные аналоги), так и антибактериальными вакцинами широкого спектра действия (диГМтетра).

Уровни CCL4 (MIP-1), CCL2 (MCP-1), ИЛ-6 и C-реактивного белка в сыворотке являются биологическими маркерами ответа врожденной иммунной системы на мурамилпептиды грамотрицательных бактерий. Эти показатели могут использоваться для лабораторного мониторинга иммунного ответа при клинических испытаниях мурамилпептидных препаратов.

Подтверждено, что мурамилпептиды не индуцируют секрецию Th1- и Th17-инструктивных цитокинов антигенпредставляющими клетками, что следует учитывать при использовании мурамилпептидов в качестве иммунологических адъювантов в вакцинах.

Показано, что CpG-ОДН в качестве монопрепаратов обладают объективной противоопухолевой активностью у части пациентов с метастатической меланомой, что дает основание для клинического применения этого класса препаратов. Полученные данные могут быть использованы в качестве отправной точки при оптимизации режима введения CpG-ОДН, а также при разработке способов применения CpG-ОДН при других злокачественных опухолях. Результаты работы показывают, что применение CpG-ОДН, вероятно, необходимо сочетать с деплецией Tregклеток, с тем чтобы повысить активирующее влияние CpG-ОДН на адаптивный иммунный ответ. В работе идентифицированы показатели иммунной системы, которые могут быть использованы для предварительного отбора пациентов, у которых терапия CpG-ОДН будет наиболее эффективна.

Идентифицированы биологические маркеры активации иммунной системы под действием CpG-ОДН: 1) активность 2’5’-олигоаденилатсинтазы в сыворотке; 2) уровень ранних плазматических клеток (CD19+CD38high) в крови. Эти показатели могут использоваться для иммуномониторинга при последующих клинических испытаниях CpG-ОДН. Динамика NK-активности мононуклеарных клеток крови, нормализованная на процентное содержание NK-клеток, может быть использована как лабораторный показатель при оценке клинической эффективности CpG-ОДН в ходе терапии.

Технология дистанционного управления клеточным составом ЛУ с помощью трансгенной экспрессии хемокинов в эпидермисе может применяться в эксперименте для регулирования миграции различных клеток иммунной системы. Полученные данные позволяют разрабатывать эту технологию в практических целях в качестве средства, повышающего эффективность профилактической и лечебной вакцинации. Обработка дендритных клеток хемокином CCL21 может использоваться для усиления поглощения антигенов при приготовлении дендритно-клеточных вакцин.

Мурамилпептиды грамотрицательных бактерий индуцируют комплекс защитных реакций врожденного иммунитета, приводящий к повышению резистентности против бактериальных инфекций.

Лекарственный препарат, представляющий собой комплекс мурамилпептидов грамотрицательных бактерий, обладает объективной иммунологической и клинической эффективностью у человека.

CpG-ОДН обладают объективной иммунологической и клинической эффективностью у пациентов с метастатической меланомой. Механизм противоопухолевого действия CpG-ОДН при меланоме связан с повышением NK-активности в процессе лечения.

Временная трансгенная экспрессия хемокина CCL21 в эпидермисе является инструментом, позволяющим регулировать численность дендритных клеток и Т-клеток в регионарных ЛУ.

Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на ежегодной конференции Американского Общества клинической онкологии (2004); 65-й, 66-й ежегодных конференциях по исследованиям в дерматологии (2004, 2005); 31-й, 32-й, 34-й, 38-й ежегодных конференциях Комитета по дерматологическим исследованиям (2004, 2005, 2007, 2011); 35й и 36-й ежегодных конференциях Европейского общества дерматологических исследований (2005, 2006); Международной конференции по исследованиям в дерматологии (2008, Эдинбург); XI Международном конгрессе «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (2011, Казань); XIX и XX Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (2012, 2013, Москва);

объединенном иммунологическом форуме (2013, Нижний Новгород).

По материалам диссертации опубликовано 34 печатных работы, из них 20 статей в 11 научных изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций («Иммунология», «Российский аллергологический журнал», «Российский иммунологический журнал», «Медицинская иммунология», «Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии», «Цитокины и воспаление», «Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова», Journal of Clinical Oncology, Journal of Investigative Dermatology, Brain Pathology, International Immunopharmacology), 1 патент, 2 статьи в научных журналах, 1 методическое пособие, 10 публикаций в материалах отечественных и международных конференций и конгрессов.

Диссертация изложена на 246 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы, 52 рисунка. Диссертация включает следующие разделы: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты собственных исследований, Обсуждение, Выводы, Список литературы.

Библиография включает 406 источников, в том числе 25 отечественных и зарубежный.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

КМП грамотрицательных бактерий, очищенный от других компонентов бактерий, был получен в лаборатории препаративной биохимии ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА» путем многократной фенольной экстракции пептидогликана S. typhi, его гидролиза в присутствии лизоцима, с последующим диализом продуктов реакции через мембрану с размером отсечки 5 кДа. Диализат содержал три мурамилпептида: 1) N-ацетил-Dглюкозаминил-(14)-N-ацетил-D-мурамоил-L-аланил-D-изоглютамилмезо-диаминопимелиновую кислоту (ГМтри), 2) N-ацетил-D-глюкозаминилN-ацетил-D-мурамоил-L-аланил-D-изоглютамил-мезодиаминопимелоил-D-аланин (ГМтетра) и 3) димер ГМтетра (диГМтетра), в котором мономерные остатки ГМтетра соеднинены путем амидной связи между карбоксильной группой терминального D-аланина одного остатка ГМтетра и -аминогруппой мезо-диаминопимелиновой кислоты другого остатка ГМтетра (Pashenkov et al, 2010). Выделение химически чистых мурамилпептидов из КМП проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Химическую структуру компонентов верифицировали с помощью масс-спектрометрии и ЯМР-спектроскопии.

Исследование свойств мурамилпептидов in vitro проводили на культурах МФ и миелоидных ДК человека, полученных согласно общепринятым методикам из моноцитов крови здоровых доноров (Sallusto et al, 1994). Длительность стимуляции клеток мурамилпептидами составляла от 3 до 24 ч., концентрация — от 0,1 до 100 мкг/мл. В качестве внутреннего контроля использовали липополисахарид (ЛПС) E. coli O111:B4. Для определения экспрессии мРНК цитокинов и других генов использовали полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в реальном времени. Использовали валидированные тест-системы (Applied Biosystems, США), либо специфичность ПЦР-амплификации проверяли путем гель-электрофореза и анализа кривых плавления в предварительных экспериментах. Секрецию цитокинов и хемокинов исследовали с помощью иммуноферментного и мультиплексного анализа. Экспрессию молекул антигенпредставления и костимуляции исследовали с помощью иммунофлюоресцентного окрашивания и проточной цитометрии. Аллостимулирующую способность ДК оценивали путем сокультивирования с аллогенными наивными Тхелперами, с оценкой пролиферативного ответа последних через 120 ч. после начала сокультивирования. Для подавления экспрессии (нокдауна) рецепторов врожденной иммунной системы NOD1, NOD2 и TLR использовали РНК-интерференцию (Opitz et al, 2005); эффективность нокдауна оценивали с помощью ПЦР в реальном времени (определение мРНК целевых и нецелевых генов) и проточной цитометрии (определение экспрессии TLR2 на поверхности клеток). Для изучения сигнальных путей, активируемых мурамилпептидами, использовали апробированные, специфические низкомолекулярные ингибиторы компонентов сигнальных путей. Толерантность МФ к мурамилпептидам и ЛПС индуцировали путем 24-часового культивирования с различными дозами соответствующих агонистов; наступление толерантности оценивали по продукции ФНО при повторной 24-часовой стимуляции МФ теми же или другими агонистами. Все эксперименты были выполнены не менее, чем на 4 независимых биологических образцах, в большинстве случаев — на 5 и более образцах.

Доклинические испытания иммунотропной активности КМП проводили на мышах F1 (C57/BL6 x CBAlac) массой 18-20 г. Влияние препарата на бактерицидность лейкоцитов перитонеального экссудата исследовали с помощью проточной цитометрии (Dambaeva et al, 2003), влияние на уровни цитокинов в сыворотке — с помощью ИФА, влияние на антибактериальную резистентность — путем оценки выживаемости мышей при заражении летальными дозами бактерий. Уровень АТ к КМП и их отдельных изотипов в сыворотках оценивали с помощью ИФА. Все эксперименты были поставлены на группах из 5 мышей на группу/точку и более, при оценке выживаемости использовали 10 мышей на группу.

соответствующими регуляторными органами. I фаза клинических испытаний КМП (препарата «Полимурамил») была проведена на базе Отделения аллергии и иммунопатологии кожи ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА». различных режима введения препарата были исследованы на 28 здоровых добровольцах. Использовали стандартные критерии включения и исключения, а также стандартный комплекс методов для выявления нежелательных явлений. Клиническая часть испытаний была проведена квалицифированными аллергологами-иммунологами. В ходе работы оценивали влияние препарата на ключевые показатели иммунного статуса, в частности на бактерицидность лейкоцитов крови (проточная цитометрия), уровни цитокинов и хемокинов в сыворотке (мультиплексный анализ), уровни иммуноглобулинов и C-реактивного белка в сыворотке (нефелометрия), уровни ауто-АТ и АТ к препарату (ИФА).

II/III фаза клинических испытаний препарата «Полимурамил» была проведена на базе ГКБ №15 им. О.М.Филатова г. Москвы и кафедры факультетской хирургии с курсом анестезиологии и реаниматологии Рязанского государственного медицинского университета им. академика И.П.Павлова. Исследовано 2 группы пациентов с гнойными хирургическими инфекциями, каждая по 30 человек: первая группа получала стандартное лечение (хирургическая операция + антибиотикотерапия), вторая группа — стандартное лечение + Полимурамил. Эффективность препарата регистрировали квалифицированные хирурги по апробированным шкалам объективной и субъективной оценки. В ходе работы проводили мониторинг ключевых показателей иммунного статуса (см. выше).

CpG-ОДН 7909 представляет собой полностью фосфоротиоатный ОДН с последовательностью 5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’ (Krieg et al, 2004). Клинические испытания CpG-ОДН 7909 проводились на базе клинических центров Австрии и Германии. Исследование представляло собой открытые, неконтролируемые, мультицентровые испытания II фазы. В испытаниях участвовали 20 пациентов с метастатической меланомой (IIIB-IV стадии). Препарат вводили по 6 мг подкожно 1 раз в неделю, по возможности в область ЛУ, дренирующих кожно-подкожные метастазы (Pashenkov et al, 2006).

квалифицированные специалисты по лучевой диагностике и дерматоонкологи. Показатели иммунного статуса, имеющие отношение к предполагаемым механизмам действия препарата, исследовали до начала лечения и на 8-й неделе. Для исследования субпопуляционного состава лимфоцитов крови и синтеза цитокинов лимфоцитами крови использовали иммунофлюоресцентное окрашивание и проточную цитометрию, для исследования клеточного состава лимфатических узлов — лазерную конфокальную микроскопию. Для исследования активности NK-клеток использовали стандартную клеточную линию-мишень — K562. Для исследования экспрессии генов в ЛУ и в опухолевой ткани использовали ПЦР в реальном времени, с использованием валидированных тест-систем. Тклетки, специфичные к антигенам меланомы, выявляли по секреции ими ИФН-гамма в тесте ELISPOT. Растворимые факторы в сыворотках исследовали с помощью ИФА и радиоиммунного анализа. Для изучения влияния Treg-клеток на пролиферативный ответ Т-клеток производили деплецию CD25high Treg-клеток с помощью иммуномагнитных частиц, Для изучения влияния временной трансгенной экспрессии хемокина CCL21 в коже на клеточный состав регионарных ЛУ использовали плазмидные векторы, содержащие кДНК гена CCL21 мыши и кДНК маркерного белка EGFP, позволяющих экспрессировать как два белка независимо, так и гибридный белок (Jalili et al, 2010). Правильность последовательностей кДНК подтверждали путем секвенирования.

Экспрессию и секрецию трансгенов in vitro подтверждали с помощью иммуноцитохимии, конфокальной микроскопии, Вестерн-блоттинга и иммуноферментного анализа. Для подтверждения хемотактической активности секретируемого CCL21 использовали систему Transwell, в качестве клеток-мишеней использовали спленоциты мыши. Для введения плазмидных векторов in vivo (внутрикожно) использовали технологию генного ружья. Экспрессию трансгена in vivo подтверждали методами иммуногистохимии и конфокальной микроскопии. Уровни CCL21 в регионарных ЛУ оценивали с помощью ИФА тканевых лизатов, клеточный состав ЛУ анализировали с помощью проточной цитометрии. Для подтверждения результатов использовали также модель адоптивного переноса спленоцитов, меченных флюоресцентной меткой (карбоксифлюоресцеином). Все опыты повторяли не менее 3 раз, в каждом опыте использовали не менее 3 мышей на группу/точку.

Статистика. При сравнении двух независимых групп использовали Uтест Манна—Уитни. При сравнении парных измерений использовали тест Уилкоксона; если количество измерений было менее 5, то использовали парный t-тест. При множественных сравнениях достоверность различий вначале тестировали в ANOVA; при получении p < 0,05 различия в парах групп выявляли с помощью тестов Манна—Уитни или Уилкоксона. Доли сравнивали с помощью критерия 2.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Развитие иммуномодуляторов бактериального происхождения шло по пути упрощения химического состава, избавления от ненужной белковой (антигенной) нагрузки. Бактериальными иммуномодуляторами первого поколения были цельные бактерии (Coley, 1910), затем появились нефракционированные лизаты бактерий (Foissin et al, 1967). В последующем были выделены в чистом виде компоненты бактерий, обладающие собственно иммуномодулирующим (иммуностимулирующим) действием. В клеточной стенке бактерий таковыми оказались пептидогликан и его фрагменты — мурамилпептиды (Ellouz et al, 1974), в цитозоле — ДНК (Krieg et al, 1995). Именно эти две группы соединений — мурамилпептиды и ДНК, а также их (полу)синтетические аналоги — составляют на сегодня два основных класса иммуномодуляторов бактериального происхождения.

В работе исследованы свойства и возможности клинического применения представителей обоих классов соединений. Мурамилпептиды грамотрицательных бактерий и синтетические аналоги бактериальной ДНК (CpG-ОДН) использовались как активаторы врожденного иммунитета;

бактериальная ДНК в форме плазмидных векторов применялась как носитель генотерапевтического воздействия, с целью получения иммуномодулирующего эффекта путем изменения экспрессии только одного гена.

Иммунобиологические свойства мурамилпептидов Существующие мурамилпептидные иммуномодуляторы являются агонистами рецептора NOD2, тогда как терапевтические возможности мурамилпептидов, содержащих остаток мезо-ДАП и активирующих NOD1, не изучены. Путем лизоцимного гидролиза ПГ грамотрицательной бактерии — S. typhi — был получен комплекс мурамилпептидов (КМП), состоящий из трех компонентов — ГМтри, ГМтетра и диГМтетра (рисунок 1). Все три мурамилпептида содержат остаток мезо-ДАП.

DAP DAP

Рисунок 1. Схема строения пептидогликана S. typhi и его фрагментов, получаемых путем обработки лизоцимом. GlcNAc – N-ацетилглюкозамин, MurNAc – N – ацетилмурамовая кислота, L-Ala – L-аланин, D-isoGlu – D-изоглютаминовая кислота, meso-DAP – мезо-диаминопимелиновая кислота.

Первоочередным вопросом была характеризация и сравнение активности полученных мурамилпептидов по отношению к клеткам врожденной иммунной системы. Для опытов использовали 2 ключевых типа клеток врожденного иммунитета: МФ и миелоидные ДК.

При стимуляции МФ все три мурамилпептида дозозависимо индуцировали продукцию цитокинов ФНО (рисунок 2), ИЛ-6, ИЛ-1бета и ИЛ-10 (рисунок 3), причем активности мурамилпептидов соотносились как ГМтри > ГМтетра > диГМтетра. Влияние мурамилпептидов и ЛПС на поверхностный фенотип МФ было менее выраженным: ни одно из протестированных соединений не влияло на экспрессию CD86 и HLA-DR, экспрессия CD80 возрастала незначительно (Pashenkov et al, 2010).

Рисунок 2. Уровни ФНО в супернатантах МФ после 24-часовой стимуляции указанными веществами (ИФА). M ±, n = 7. * p < 0,05 в сравнении с уровнем ФНО в супернатантах клеток, культивированных без стимуляторов.

ЛПС ГМ ГМ ЛПС ГМ

Рисунок 3. Уровни ИЛ-1бета, ИЛ-6, ИЛ-10 в супернатантах МФ после 24-часовой стимуляции указанными веществами. M ±, n = 5. * p < 0,05 в сравнении с уровнями в супернатантах МФ, культивированных без стимуляторов.

Рисунок 4. Уровни ФНО в супернатантах ДК после 24-часовой стимуляции указанными веществами (ИФА). M ±, n = 7. * p < 0,05 в сравнении с клетками, культивированными без стимуляторов.

Миелоидные ДК при стимуляции мурамилпептидами секретировали существенно более низкие количества ФНО, чем МФ, при примерно одинаковом ответе обоих типов клеток на ЛПС (рисунок 4, ср. с рисунком 2). Аналогичные закономерности были получены для секреции ИЛ-1бета, ИЛ-6, ИЛ-10 дендритными клетками (Пащенков и соавт., 2012).

Тем не менее, мурамилпептиды при воздействии на ДК усиливали экспрессию маркера CD83 (рисунок 5), а также HLA-DR и молекул костимуляции CD80 и CD86 (Пащенков и соавт., 2012). Совокупность этих признаков указывает на созревание ДК. Активности трех мурамилпептидов соотносились между собой как ГМтри > ГМтетра > диГМтетра.

ГМтри вызывал не только фенотипическое, но и функциональное созревание ДК, поскольку усиливал способность ДК активировать наивные CD4+ Т-клетки в аллогенной смешанной лейкоцитарной реакции (Pashenkov et al, 2010). Кроме того, ГМтри индуцировал экспрессию ряда хемокинов, участвующих в привлечении различных субпопуляций лейкоцитов, в частности CXCL8 (ИЛ-8) и CCL4 (MIP-1) (рисунок 5).

ДК, стимулированные мурамилпептидами, не вырабатывали Th1- и Th17-инструктивные цитокины (ИЛ-12, ИЛ-23). Последнее позволяет предполагать, что такие ДК неспособны индуцировать дифференцировку Tклеток по Th1- и Th17-пути, что согласуется с данными литературы (Fritz et al, 2007; Magalhaes et al, 2008).

Исследованные мурамилпептиды не индуцировали экспрессию ИФН I типа и ИФН-индуцибельных генов ни в ДК, ни в МФ.

% исходной экспрессии Рисунок 5. Влияние мурамилпептидов и ЛПС на фенотип и продукцию хемокинов дендритными клетками. Слева — экспрессия маркера созревания CD83 на ДК после 24-часовой стимуляции мурамилпептидами и ЛПС (проточная цитометрия).

M ±, n = 5. Справа — уровни хемокинов в супернатантах ДК после 24-часовой стимуляции ГМтри (10 мкг/мл, черные столбики), ЛПС (0,1 мкг/мл, заштрихованные столбики), или без стимуляции (белые столбики), по данным мультиплексного анализа. M ±, n = 4. *p < 0,05, **p < 0,01 в сравнении с нестимулированными ДК.

Таким образом, в результате первого этапа иследования было установлено, что все три исследованных мурамилпептида обладают активностью по отношению к клеткам врожденного иммунитета — МФ и ДК (ГМтри > ГМтетра > диГМтетра). При этом было сделано две относительно неожиданных находки: 1) мурамилпептиды слабо активируют продукцию цитокинов в ДК (слабее, чем в МФ и слабее, чем ЛПС в ДК); 2) иммуностимулирующим действием обладают все три исследованных мурамилпептида, тогда как, по данным литературы, ГМтетра и диГМтетра считаются у человека иммунологически неактивными (Girardin et al, 2003).

Эти два явления были исследованы более подробно.

При исследовании кинетики экспрессии мРНК ФНО в ДК и МФ, стимулированных ГМтри или ЛПС, оказалось, что пиковый уровень мРНК ФНО наступает через 1 ч. после начала стимуляции и имеет примерно одинаковую величину, независимо от вида клеток и вида стимула (рисунок 6А). Пиковый уровень ФНО в супернатанте наступает примерно к 3 ч. после начала стимуляции; при этом уровень ФНО в супернатантах ГМтристимулированных ДК более чем в 10 раз ниже, чем уровень того же цитокина в супернатантах МФ и ЛПС-стимулированных ДК (рисунок 6В и 6Г).

Исходя из этого был сделан вывод о том, что в ДК, стимулированных ГМтри, имеет место относительная неэффективность трансляции мРНК ФНО в белок. Неэффективность трансляции, в свою очередь, может быть обусловлена недостаточной активацией киназы p38 в ДК, стимулированных ГМтри. В присутствии ИЛ-1бета, который является активатором p38, ГМтристимулированная продукция ФНО дендритными клетками возрастает до уровня ЛПС-стимулированной (Пащенков и соавт., 2013).

мРНК ФНО (2Ct) ФНО (пг/мл) Рисунок 6. Кинетика экспрессии мРНК ФНО и секреции ФНО макрофагами и ДК при стимуляции ГМтри (10 мкг/мл) и ЛПС (0,1 мкг/мл). А — кинетика экспрессии мРНК ФНО (показана относительная экспрессия; уровень мРНК ФНО в МФ в точке «0 ч.» принят за 1). M±, n=4. Б — кинетика убыли мРНК ФНО в МФ и ДК, стимулированных ГМтри или ЛПС, после остановки транскрипции с помощью актиномицина D (ActD), который добавляли через 1 ч. после начала стимуляции ГМтри или ЛПС. Уровень мРНК ФНО, достигнутый в этой точке в данном типе клеток при данной стимуляции, принят за 100%, уровень мРНК в нестимулированных клетках того же типа — за 0%. M±, n=3. В и Г — кинетика уровней ФНО в супернатантах ДК (В) и МФ (Г). M±, n=4.

Кроме того, в ДК, стимулированных ГМтри, возврат уровня мРНК ФНО к исходному происходил уже к 9 ч., т.е. раньше, чем в ДК, стимулированных ЛПС, и МФ, стимулированных ЛПС и ГМтри (рисунок 6А). Падение уровня мРНК в ГМтри-стимулированных ДК не было обусловлено недостаточной стабильностью мРНК: после добавления актиномицина D — ингибитора транскрипции — через 1 ч. после начала стимуляции уровни мРНК ФНО в ДК и МФ падают с примерно одинаковой скоростью (рисунок 6Б). Таким образом, раннее падение уровня мРНК ФНО в ГМтри-стимулированных ДК, наиболее вероятно, обусловлено ранним прекращением транскрипции.

Аналогичные закономерности экспрессии мРНК были обнаружены для цитокина ИЛ-6, хемокинов CCL4, CXCL1, CXCL8 (Пащенков и соавт., 2013).

Таким образом, низкая секреция цитокинов ГМтри-стимулированными ДК обусловлена ранним прекращением транскрипции генов цитокинов и относительной неэффективностью трансляции.

Чтобы понять механизмы, участвующие в активации МФ под действием диГМтетра, ранее считавшегося «неактивным», применили трансфекцию МФ малыми интерферирующими РНК (siRNA) с целью нокдауна рецепторов, участвующих в распознавании пептидогликана и мурамилпептидов. Ответ МФ на диГМтетра более существенно и в равной степени подавлялся при нокдауне NOD1 и NOD2, в меньшей степени — при нокдауне TLR2 (рисунок 7). Наиболее существенное подавление ответа МФ на ГМтри наблюдалось при нокдауне NOD1,что согласуется с литературными данными (Girardin et al, 2003; Chamaillard et al, 2003), хотя небольшое ингибирующее влияние оказывал также нокдаун TLR2 и NOD2.

Ответ на контрольный мурамилпептид — ГМДП — подавлялся исключительно при нокдауне NOD2, что также согласуется с данными литературы (Meshcheryakova et al, 2007).

ОПФНО (%) Рисунок 7. Остаточная продукция ФНО (ОПФНО) макрофагами, трансфицированными контрольной или геноспецифическими siRNA и стимулированными ГМтри, ГМДП или диГМтетра. ОПФНО в клетках,