Полученные в результате исследований данные показали, что при поверхностном культивировании Tr. viride на дробине и последующем автолизе содержание протеина в твердой фазе повышалось до 29,0%. По сравнению с контрольным образцом содержание «сырого» протеина при добавлении на стадии автолиза этилового спирта в концентрациях 1,0, 2,0 и 3,0% (об.) повышалось, соответственно, с 25,0% до 25,5, 27,0 и 29,0% а.с.в. Причем, дальнейшее повышение концентрации этанола в среде нецелесообразно, поскольку при выделении продуктов для использования их в качестве кормовых или пищевых добавок (с точки зрения их безвредности) предпочтительнее автолиз проводить в присутствии этанола в концентрации не более 3 %.

Таким образом, при поверхностном культивировании грибов на дробине возможно получение белково-углеводного продукта, содержащего не более 13,0% «сырой» клетчатки и не менее 29,0% «сырого» протеина.

Анализ содержания микотоксинов в полученных ферментолизатах показал, что концентрация афлатоксина В1 определялась на порядок ниже его ПДК.

Биодеградация зерновой дробины бактериями рода Bacillus В работах Ушаковой Н.А. [2004, 2006] была показана способность ферментативного расщепления целлюлозы бактериями, выделенными из слепой кишки травоядных животных, где они выполняют роль, аналогичную биоценозу рубца жвачных животных, то есть обладают целлюлолитической и пробиотической активностью.

Один из штаммов бактерий р. Bacillus БП-46 выделенных из слепой кишки большой полевки Microtus fortis, первично идентифицированный как Bacillus subtilis, был любезно предоставлен нам для исследований Н.А. Ушаковой.

Методом мультисубстратного тестирования, основанном на анализе спектров потребляемых субстратов [М.В. Горленко, П.А. Кожевин, 2005], было показано, что Bacillus БП-46 является представителем вида B.cereus. Принадлежность данного штамма к виду cereus также была подтверждена данными филогенетического анализа.

Изучение физиолого-биохимических свойств B.cereus БП-46 показало, что для роста данного микроорганизма как в аэробных условиях, так и в анаэробных требуются источники органического азота. Штамм является спорулирующим. Исследования ферментативной активности бацилл показали, что Bacillus cereus БП-46 является активным продуцентом протеолитических (110 ед./мл) и целлюлолитических ферментов (18,9 ед./мл), что определяет потенциальную возможность его использования для деструкции зерновой дробины.

Учитывая условия природного местообитания бацилл, был разработан микроаэробный твердофазный способ культивирования бациллы, имитирующий природные условия ее жизнедеятельности (нейтральное значение рН, влажность 55-60%, размеры твердых частиц не более 1 мм, анаэробные условия). Для этого культуральную жидкость выращенной аэробно в жидкой питательной среде B.cereus БП-46 смешивали с равным количеством сухой стерильной дробины. Массу 55%-влажности помещали в микроаэрофильные условия и инкубировали 48 часов при 29-300С.

По окончании ферментации клетки бацилл подвергали автолизу. Для этого гетерогенную массу, содержащую непрогидролизованную зерновую дробину и клетки B. cereus БП-46, выдерживали в течение 24 часов при температуре 550С в условиях затрудненного доступа кислорода, используя в качестве мембранотропного индуктора автолиза олеиновую кислоту в концентрации 0,3% (масс.) [О.В. Кислухина, К.А. Калунянц, Д.Ж. Аленова, 1990 г.].

Содержание «сырого» протеина в полученном продукте определялось на уровне 34,5% а.с.в., «сырая» клетчатка снижалась на 12,5% (с 18,0 до 7,5% а.с.в.) Таким образом, была показана возможность твердофазного культивирования Bacillus cereus БП-46 на зерновой дробине, повышение ее биологической ценности и получения кормового продукта, содержащего «сырого» протеина не менее 34,0%, «сырой» клетчатки не более 8,0%.

Полученный продукт обладал основными пробиотическими свойствами: был устойчив к температуре в диапазоне 60-650С, в щелочной среде до рН 9,6, к действию желчи и пищеварительных ферментов.

Деструкция зерновой дробины мультиэнзимными композициями Для более эффективной конверсии дробины были проведены исследования по изучению ферментативного гидролиза указанного сырья с применением новых комплексных ферментных препаратов (Ф-ПД-1, Ф-ПД-2 и Ф-ПД-3). Характеристика мультиэнзимных композиций (МЭК) представлена в таблице 2.

Выбор ферментов, входящих в состав мультиэнзимных композиций, был обусловлен присутствием в трудногидролизуемой зерновой дробине природных полимеров: целлюлозы, гемицеллюлоз типа ксиланов, арабиноксиланов, прочно связанных с целлюлозой, нерастворимого протеина, а также следовых количеств непрогидролизованного -глюкана.

Качественный и количественный состав Ф-ПД-1, Ф-ПД-2 и Ф-ПД- При определении оптимальных условий ферментативной обработки исследуемого сырья показано, что оптимальными условиями ферментолиза дробины мультиэнзимными композициями являются: диапазон рН 5,0-5,5, температура – 500С, интенсивность перемешивания 80-100 об./мин., время экспозиции 2 часа.

Подбор фермент-субстратного соотношения проводили следующим образом: для ферментолиза были подготовлены водные суспензии дробины при гидромодуле от 1,0 до 15,0% при концентрациях мультиэнзимного препарата Ф-ПД-1 0,1 и 1,0% (масс.) (табл. 3).

Прирост РВ* (г/л) при разных соотношениях дробины и препарата Ф-ПД- Концентрация дробины, % Концентрация Ф-ПД-1, % (масс.) Показано, что максимальный выход редуцирующих сахаров, 15,3 г/л наблюдался при обработке 10%-ной суспензии дробины 1%-ным раствором Ф-ПД-1. Отмечено, что при введении препарата в дозе 0,1% уровень прироста редуцирующих сахаров (11,4 г/л) оказался достаточно высоким, и повышение дозы ферментного препарата до 1,0% не обеспечивало адекватного прироста сахаров. Дальнейшее увеличение концентрации субстрата до 15% и выше, приводило к заметному снижению прироста сахаров на 16,0–54,0%, что было связано с затруднением процесса перемешивания вследствие повышения вязкости среды и ухудшением массообменных характеристик в инкубируемой системе.

Все дальнейшие исследования ферментативного гидролиза препаратом Ф-ПД-1 проводили с использованием 10 %-ной суспензии дробины.

Также изучали влияние избыточных концентраций мультиэнзимного препарата на прирост редуцирующих сахаров, образующихся при ферментативном гидролизе дробины, и на содержание «сырой» клетчатки и «сырого» протеина в твердой фазе прогидролизованного сырья. Для этого были использованы следующие концентрации Ф-ПД-1: 0,1; 0,5;

1,0; 2,0; 4,0 и 5,0%.

Эффективность гидролитического воздействия разных концентраций Ф-ПД-1 на дробину Концентрация Содержание РВ* Прирост РВ, «Сырая» клет- «Сырой» проФ-ПД-1, % после гидролиза, г/л чатка, % а.с.в. теин, % а.с.в.

(масс.) *Содержание легко экстрагируемых РВ до гидролиза (без фермента) в 10%-ной суспензии дробины составляло 8,0 г/л При введении в реакционную смесь как низких концентраций препарата Ф-ПД- (0,05–0,1%), так и избыточных (1,0–5,0%) в инкубируемой среде не отмечено существенного накопления РВ (табл. 4). «Сырая» клетчатка под воздействием ферментов гидролизовалась лишь на 3,0% при введении 0,1% Ф-ПД-1, и степень ее конверсии не возрастала при введении повышенных концентраций фермента. Аналогичная тенденция наблюдалась и по содержанию нерастворимого «сырого» протеина – снижение на 2,0 – 3,0%.

Таким образом, было показано, что оптимальным фермент-субстратным соотношением является 0,1 % Ф-ПД-1 и 10%-ная суспензия зерновой дробины. При этом суммарная концентрация РВ в гидролизате определялась на уровне 12,3 г/л.

Для снижения расхода ферментов на единицу сырья при сохранении высокой степени биоконверсии зерновой дробины были испытаны мультиэнзимные препараты Ф-ПД- и Ф-ПД-3, отличающиеся от Ф-ПД-1 более высоким уровнем содержания целлюлазы и протеазы в мультисистемах, соответственно (табл. 5). В связи с этим доза вводимых препаратов составляла 0,05; 0,075 и 0,1% (масс.).

Показатели гидролитического воздействия мультиэнзимных композиций Ф-ПД-2 и Ф-ПД- Прирост РВ*, г/л 27,0±0,15 30,0±0,25 33,5±0,22 28,5±0,26 30,5±0,25 35,0±0, «Сырая» клетчат- 16,8±0,21 13,4±0,19 10,5±0,25 17,4±0,22 14,2±0,19 9,5±0, ка, % а.с.в.

«Сырой» проте- 23,0±0,16 19,8±0,24 18,0±0,25 21,8±0,23 18,6±0,20 15,0±0, ин, % а.с.в.

*Без учета начальной концентрации легко экстрагируемых редуцирующих веществ в 10%ной суспензии дробины – 8 г/л.

Показано, что оптимальным соотношением фермент-субстратного комплекса для ферментативного гидролиза дробины препаратами Ф-ПД-2 и Ф-ПД-3 также является 10%ная суспензия зерновой дробины и 0,1%-ный раствор мультиэнзимной композиции. Прирост редуцирующих сахаров при гидролизе дробины препаратами Ф-ПД-2 и Ф-ПД-3 составил, соответственно, 25,5 и 27,0 г/л (табл. 5).

«Сырая» клетчатка при действии Ф-ПД-2 в дозе 0,05-0,1% уменьшалась с 19,0 до 16,8-10,5% а.с.в. Также отмечено наибольшее снижение уровня «сырого» протеина с 25, до 15,0% при действии препарата Ф-ПД-3 в дозе 0,1%, содержащего в своем составе протеазу.

Таким образом, первичная оценка мультиэнзимных препаратов Ф-ПД-2 и Ф-ПД- выявила преимущество Ф-ПД-3, под действием которого осуществлялся более эффективный гидролиз «сырого» протеина, и отмечена тенденция к повышению выхода РВ и разрушения «сырой» клетчатки по сравнению с другими МЭК.

Сравнение эффективности гидролитического воздействия мультиэнзимных препаратов (масс.) *Включая начальное содержание легко экстрагируемых РВ в 10%-ной суспензии дробины - 8,0 г/л **Исходное содержание «сырой» клетчатки в дробине 19%, «сырого» протеина - 25%.

В результате проведенных исследований, было показано, что мультиэнзимные препараты по-разному воздействуют на структурные компоненты зерновой дробины (табл. 6).

Так, прирост РВ составил от 12,5 до 27,6 г/л, «сырая» клетчатка гидролизовалась на 3,0 – 10,0%, «сырой» протеин – на 5,0 – 10,0%. При этом показано, что по сравнению с препаратами Ф-ПД-1 и Ф-ПД-2, более эффективным гидролизующим агентом являлся мультиэнзимный препарат Ф-ПД-3, поскольку он способствовал деградации целлюлозных компонентов дробины, в среднем, на 19,0–47,0% и белка – на 16,7–28,6%, присутствие протеазы в составе Ф-ПД-3 обеспечивало более глубокую конверсию нерастворимого протеина зерновой дробины.

При изучении углеводного состава ферментолизатов дробины методом тонкослойной хроматографии показано, что в их состав входят пентозы, гексозы, дезоксигексозы, представленные L-рамнозой, и ряд олигосахаридов. Доля пентоз в гидролизатах составляла 45,0–47,0%, гексоз – 40,0–45,0% и 13,0–20,0% - смесь поли - и олигосахаридов (табл. 7).

Фракционный состав углеводов в ферментолизатах дробины, % (масс.) Ф-ПД-2 20,0±0,49 25,0±0,38 10,0±0,25 5,0±0,11 5,0±0,13 15,0±0,31 20,0±0, Ф-ПД-3 22,0±0,51 25,0±0,44 12,0±0,22 7,0±0,12 8,0±0,12 13,0±0,27, 13,0±0, Результаты определения углеводного состава показывали, что ферментолизаты зерновой дробины могут быть использованы в качестве питательной основы для культивирования дрожжей и молочнокислых микроорганизмов для получения белково-углеводных кормовых добавок и препаратов с пробиотическими свойствами, предназначенных для кормления сельскохозяйственных животных.

Известно, что одним из эффективных способов стабилизации ферментов является воздействие низкомолекулярных соединений фенольной природы - алкилоксибензолов, синтезирующихся в фазе роста развивающейся микробной культуры.

Исходя из литературных данных, исследовали влияние факторов микробного анабиоза на стабильность ферментов, входящих в состав мультиэнзимной композиции Ф-ПДпри ферментативном гидролизе зерновой дробины.

- прединкубационный способ внесения АОБ в реакционную смесь, когда исследуемые гомологи – С7-АОБ в течение 30 минут и С12-АОБ в течение 60 минут – раздельно выдерживали в растворе с ферментом или с субстратом и затем проводили ферментативный гидролиз.

Ферментативная активность, % ферментами мультиэнзимной композиции Ф-ПД-3 не обуславливало стимуляцию их каталитической активности, при более высоких концентрациях гомолога (выше 0,05 мг/см3) вызывало ингибирование, при этом способ внесения АОБ не влиял на характер изменения По результатам проведенных исследований в качестве лучшего стабилизатора ферментативной активности мультиэнзимной композиции Ф-ПД-3 был выбран гомолог С7АОБ при дозе внесения 1,0 мг/см3 и времени прединкубации с Ф-ПД-3 30 минут.

Таким образом, на основании проведенных исследований была показана возможность биодеструкции зерновой дробины под действием ферментов, продуцируемых грибом Trichoderma viride, бактериями Bacillus cereus БП-46 и промышленными мультиэнзимными композициями. Редуцирующие вещества, содержащиеся в гидролизатах дробины на уровне 35,0-40 г/л, могут быть использованы другими микроорганизмами, обеспечивающими получение БАД с функциональными свойствами, что и явилось целью исследований, проводимых на последующих этапах работы.

В четвертой главе представлены результаты гетерофазного культивирования микроорганизмов на ферментативных гидролизатах зерновой дробины.

Гетерофазное культивирование дрожжей на ферментативных гидролизатах зерновой дробины. Получение белково-углеводного продукта и продукта, обогащенного микроэлементами селеном и йодом Для обогащения ферментолизатов дробины микробным белком был исследован рост апатогенного штамма дрожжей Yarrowia lipolytica, способного усваивать широкий спектр источников углерода, активность роста на гидролизатах растительного сырья которого была показана ранее [Е.Б. Цугкиева, 2007].

Дрожжи выращивали на ферментолизатах зерновой дробины в режиме глубинного гетерофазного культивирования. Для этого 10%-ная водная суспензия сырья обрабатывалась культуральной жидкостью гриба Trichoderma viride из расчета 10 ед. целлюлолитической активности на 1 г дробины, или мультиэнзимной композицией Ф-ПД-3 в концентрации 0,1% (масс.). Ферментативный гидролиз осуществляли в реакторе периодического действия при рН 5,0-5,5, t=500C и перемешивании 80-100 об/мин. Время экспозиции составляло 2 часа. При таких условиях подготовки субстрата в результате ферментативного гидролиза в среде определялись РВ 16,5 и 35,0 г/л при обработке культуральной жидкостью Tr. viride и Ф-ПД-3, соответственно. В полученные ферментолизаты вносили минеральные соли в концентрациях, соответствующих их содержанию в среде «П» и инокулят дрожжей Y. lipolytica в количестве 2,0х106 кл/мл.

Дрожжи культивировали в периодическом режиме до начала стационарной фазы в ферментере (Vобщ.=2 л) при t = 30-320С, рН 5,0, при перемешивании 500 об/мин и аэрации.

Показатели гетерофазного глубинного культивирования дрожжей на ферментолизатах дробины представлены в таблице 8.

Твердая фаза после отстаивания отделялась методом декантации, промывалась и подвергалась термолизу (750С, 30 мин.). Полученный продукт сушили при t=500C до остаточной влажности 7-8%.

В процессе гетерофазного культивирования потребление дрожжами редуцирующих веществ составило 85,0-87,0%, прирост дрожжевых клеток 2,5-4,0 х108 кл/мл. Содержание «сырого» протеина в белково-углеводном продукте увеличилось на 8,0-11,0% и составило 29,0-32,0% а.с.в., а содержание «сырой» клетчатки снизилось на 4,0-9,5% и составило 9,5а.с.в.

Показатели гетерофазного глубинного культивирования дрожжей Y.lipolytica на Концентрация РВ, г/л:

Таким образом, при гетерофазном глубинном культивировании дрожжей Y.lipolytica на ферментативных гидролизатах дробины, полученных как при использовании культуральной жидкости гриба Tr. viride, так и МЭК Ф-ПД-3, показана возможность получения белково-углеводного продукта.

Для повышения биологической ценности полученного белково-углеводного продукта была исследована возможность его обогащения такими микроэлементами, как селен и йод.

Для обогащения селеном перед началом культивирования дрожжей в среду, содержащую ферментативный гидролизат дробины и минеральные соли, вносили диоксид селена в концентрации 20 мг/л, оптимальной для развития культуры Y. lipolytica. Для йодирования в качестве источника йода использовали раствор йодида калия в концентрации г/л [Е.Б. Цугкиева, 2007]. Йодирование продукта осуществляли в аэробных условиях после начала стационарной фазы роста дрожжей (16-18 часов) в течение 1 часа при 37°С в присутствии окислителя - 1%-ной перекиси водорода.

При культивировании дрожжей в периодическом режиме в условиях гетерофазного глубинного культивирования на подготовленной зерновой дробине и после осуществления постферментационной обработки был получен белково-углеводный продукт, состоящий из биомассы дрожжей и твердой непрогидролизованной фазы дробины, который содержал 33,0% «сырого» протеина, «сырой» клетчатки - 9,5%, селена - 35,2 мг/кг и йода мг/кг. В продукте, обогащенном селеном, включение йода происходило на 7,0% эффективнее, чем в продукте, не содержащем селен. Микотоксины в полученных белковоуглеводных продуктах практически отсутствовали.

Гетерофазное культивирование молочнокислых культур на ферментолизатах Отбор продуцентов для гетерофазного глубинного культивирования на нативной дробине и ее ферментолизатах проводили среди штаммов молочнокислых бактерий Lactobacillus casei– B 7657, Lactobacillus acidophilus – AT-41, Lactococcus lactis ТБ2, ассоциативных культур кефирного грибка G и S, используемых на Ставропольском и Гагаринском молочных заводах, и неидентифицируемых культур молочнокислых бактерий, выделенных из данных кефирных грибков и растущих на глюкозе.

Эксперименты показали, что все исследованные молочнокислых культуры способны активно расти на средах, содержащих как молочную сыворотку и глюкозу, так и на ферментативных гидролизатах зерновой дробины. Для исследований были отобраны бактерии Lactobacillus casei и ассоциативная культура кефирного грибка G, которые обладали наибольшей активностью молочнокислого брожения по показателю снижения рН и общей титруемой кислотности (таблица 9).

Активность роста молочнокислых бактерий на ферментолизатах зерновой дробины Lactobacillus casei 6,70/4,70 120,0±1,25 6,70/4,80 118,0±1, Lactobacillus acidophilus 6,70/4,85 90,0±1,25 6,70/4,80 108,0±1, Ассоциативная культура кефирного грибка G Ассоциативная культура кефирного грибка S 6,70/4,60 130,0±1,28 6,70/4,60 128,0±1, Смешанные культуры, выделенные из кефирного грибка S Смешанные культуры, выделенные из кефирного грибка G Для глубинного гетерофазного культивирования молочнокислых культур на ферментолизатах зерновой дробины 10%-ную водную суспензию сырья обрабатывали мультиэнзимной композицией Ф-ПД-3 в концентрации 0,1% (масс.). Ферментативный гидролиз осуществляли в реакторе периодического действия при рН 5,0-5,5, t=500C и перемешивании 80-100 об/мин. Время экспозиции составляло 2 часа. При таких условиях подготовки субстрата концентрация РВ составила 35,0 г/л. В полученные ферментолизаты вносили минеральные соли в концентрациях, соответствующих их содержанию в среде «MRS» и трехсуточный инокулят бактерий L.casei и ассоциативной культуры кефирного грибка G в количестве 5,0% по объему при плотности популяции не менее 106 КОЕ/мл.

Молочнокислые микроорганизмы культивировали в периодическом режиме в анаэробных условиях при t=370С, рН 6,5-6,8 в течение 17-18 часов.

В процессе гетерофазного культивирования потребление молочнокислыми культурами редуцирующих сахаров составило 45-48%, плотность популяции L.casei – не менее 108 КОЕ/г, ассоциативной культуры кефирного грибка G – не менее 109 КОЕ/г. Титруемая кислотность продукта, содержащего бактерии L.casei, определялась на уровне 118-1200Т, продукта, содержащего ассоциативную культуру кефирного грибка G – 140-1450Т.

В результате проведенных опытов показано, что подобранные молочнокислые микроорганизмы - L. casei и ассоциативная культура кефирного грибка G - способны развиваться на ферментативных гидролизатах зерновой дробины, а продукт, получаемый при их культивировании на ферментолизатах, обладает всеми свойствами, определяющими его пробиотическую активность, что и исходные молочнокислые культуры при культивировании их на обезжиренном молоке.

В пятой главе приведены способы получения биологически активных добавок, обладающих пробиотическими свойствами, на основе зерновой дробины и ее ферментолизатов.

Придание продукту пробиотических свойств возможно при культивировании на субстрате молочнокислых бактерий, которые для своего развития требуют сложных питательных сред и микроаэрофильных условий.

При разработке возможных способов получения пробиотических БАД была исследована возможность обогащения питательной среды продуктами автолиза продуцентов белка, предварительно культивируемых на ферментолизатах зерновой дробины, учитывали также такие техноэкономические показатели, как необходимость снижения энергоемкости, уменьшения количества технологических стадий и необходимости гарантий получения продукта требуемого качества, что возможно при замене аэробных процессов культивирования на анаэробные.

Исходя из этих положений, исследовали ряд способов получения белковоуглеводной добавки, обладающей пробиотическими свойствами:

• Двухстадийный аэробно-анаэробный процесс. На первой стадии гриб Trichoderma viride выращивали на измельченной стерильной дробине в условиях твердофазного культивирования. На второй стадии осуществляли автолиз грибной биомассы с добавлением этанола и на полученной среде в анаэробных условиях культивировали молочнокислые бактерии. Результаты представлены в таблице 10.

Характеристика белково-углеводных продуктов на основе зерновой дробины, полученных при последовательном твердофазном культивировании гриба Tr. viride и молочнокислых автолиза грибных клеток, % а.с.в. 25,6±0,49 27,2±0,25 29,3±0,28 25,6±0,44 27,2±0,27 29,3±0, В том числе растворимый белок, г/л 4,5±0,21 8,5±0,25 10,8±0,19 4,5±0,21 8,5±0,25 10,8±0, Потребление РВ*:

Титруемая кислотность, 0Т Молочная кислота, г/л «Сырой» протеин в полученном продук- 29,2±0,49 31,3±0,51 33,9±0,27 30,6±0,31 32,8±0,45 33,5±0, те, % а.с.в.

«Сырая» клетчатка в полученном продук- 13,2±0,25 13,0±0,29 12,9±0,21 12,8±0,29 13,1±0,33 13,1±0, те, % а.с.в.

*Начальная концентрация РВ - 15,0 г/л Результаты, представленные в таблице 10 показывают, что присутствие этилового спирта в среде до 3% стимулировало развитие молочнокислых организмов, причем, показатель титруемой кислотности для обоих вариантов составил 1401900Т. При этом, в среде отмечено накопление молочной кислоты: при культивировании L. casei – 8,710,8 мг/л при потреблении 77,384,0% РВ, при культивировании ассоциативной культуры кефирного грибка G – 9,010,8 мг/л при потреблении 80,786,3% РВ, содержание «сырого» протеина и «сырой» клетчатки составило 29,233,9% а.с.в и 12,813,0% а.с.в., соответственно.

При исследовании биологической ценности полученных продуктов на тест-культуре Tetrahymena pyriformis было показано отсутствие острой токсичности, также были получены данные, подтверждающие их пробиотические свойства и антагонистические свойства по отношению к Staphylococcus aureus.

• Двухстадийный аэробно-анаэробный процесс. На первой стадии дрожжи Yarrowia lipolytica аэробно выращивали на ферментативных гидролизатах нативной и измельченной зерновой дробины в условиях глубинного гетерофазного культивирования до потребления примерно 50% редуцирующих веществ, содержащихся в ферментолизате. На второй стадии после автолиза дрожжевых клеток на полученной среде в анаэробных условиях культивировали молочнокислые бактерии. Результаты представлены в таблице 11.

Результаты аэробно-анаэробного способа получения белково-углеводного продукта, обладающего пробиотическими свойствами, и показатели его качества Гетерофазное глубинное культивирование дрожжей Y.lipolytica «Сырой» протеин после автолиза, % а.с.в.

Анаэробное культивирование молочнокислых микроорганизмов «Сырой протеин», % а.с.в.:

-в продукте, содержащем ассоциативную культуру кефирного грибка G 23,0±0,23 30,0±0, Данные, представленные в таблице11, показывают, что на ферментолизатах измельченной дробины дрожжи развивались более активно, потребляя до 51% редуцирующих веществ, что обеспечивало после автолиза дрожжевых клеток накопление «сырого»

протеина в среде до 26,0% а.с.в., при этом содержание «сырой» клетчатки в твердой фазе уменьшалась с 18,0 до 10,2% а.с.в. При культивировании молочнокислых культур на такой среде потребление РВ составило около 93% при накоплении молочной кислоты до 13,5 г/л. Содержание «сырого» протеина и «сырой» клетчатки в полученном продукте определялось, соответственно, на уровне 30,0 и 10,2% а.с.в.

Показано, что полученные продукты обладали основными свойствами, определяющими их пробиотическую активность, что и исходные молочнокислые культуры при культивировании их на молоке, а также проявляли антагонистические свойства по отношению к условно-патогенной культуре Staphylococcus aureus.

• Двухстадийный анаэробный процесс. На первой стадии в микроаэрофильных условиях проводили твердофазное культивирование бактерий Bacillus cereus БП-46 на измельченной стерильной дробине. На второй стадии после автолиза бактериальных клеток на полученном сырье в анаэробных условиях культивировали молочнокислые бактерии.

Результаты представлены в таблице 12.

При исследовании влияния штамма бактерий Bacillus cereus БП-46 на развитие молочнокислых микроорганизмов было показано отсутствие антагонистических отношений между культурами.

Показатели процесса последовательного твердофазного культивирования на зерновой дробине Bacillus cereus БП-46 и молочнокислых культур Титруемая кислотность, 0Т 80,0±1,25 70,0±1,25 120,0±1,30 150,0±1, Сырой протеин*, % а.с.в.:

-после твердофазного -после молочнокислого брожения Сырая клетчатка**, % а.с.в.

*Исходное содержание сырого протеина в дробине 21,0%.

**Исходное содержание сырой клетчатки в дробине 18,0%.

Результаты, представленные в таблице 12, показывают, что молочнокислые бактерии активно развивались на зерновой дробине, обогащенной продуктами автолиза бактерий Bacillus cereus БП-46, при этом содержание «сырого» протеина в продукте увеличивалось на 13,8%, «сырая» клетчатка гидролизовалась на 10,5%, показатель титруемой кислотности повышался до 120-1500Т, рН снижался с 6,9 до 4,0-4,3, плотность популяции молочных микроорганизмов составляла не менее 108 КОЕ/г. Содержание молочной кислоты повышалось в среднем, в 1,5-2 раза.

Исследование свойств полученной кормовой белково-углеводной добавки показало, что все культуры молочнокислых микроорганизмов, содержащиеся в полученных продуктах, обладали терморезистентностью в диапазоне 60-650С и устойчивостью к фенолу, поваренной соли; к действию пищеварительных ферментов и желчи.

Таким образом, на основании проведенных исследований показана возможность получения биологически активных кормовых добавок с различными функциональными свойствами на основе зерновой дробины (белково-углеводная биологически активная добавка, белково-углеводная биологически активная добавка, обогащенная микроэлементами селеном и йодом и белково-углеводная биологически активная добавка, обладающая пробиотическими свойствами), при этом данные продукты могут быть получены на ферментативных гидролизатах зерновой дробины при культивировании дрожжей в аэробных условиях для обогащения белком, при твердофазном культивировании гриба рода Trichoderma или бактерий рода Bacillus с последующим автолизом микробных клеток и культивированием молочнокислых микроорганизмов для придания продукту пробиотических свойств.

Общая схема переработки зерновой дробины в БАД с функциональными свойствами представлена на рисунке 3.

Способы повышения биологической ценности зерновой дробины для получения БАД с Твердофазное культивирование Гетерофазное культивирование Культивирование молочнокислых бактерий и ассоциативных Рис. 3. Схема возможных способов переработки зерновой дробины в БАД с функциональными свойствами

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

- определены условия культивирования гриба Tr. viride на зерновой дробине в глубинной культуре, при накоплении целлюлолитических ферментов в среде до 25 ед./мл и снижении содержания «сырой» клетчатки в дробине с 19,0 до 15,0% а.с.в.; показана возможность использования посевного материала гриба в виде спор и вегетативных клеток;

- показана биодеструкция зерновой дробины как при твердофазном культивировании гриба Trichoderma viride, так и при использовании его культуральной жидкости, обеспечивающая снижение в дробине «сырой» клетчатки на 6%. и накопление в среде РВ до 16, г/л;

- методом мультисубстратного тестирования проведена таксономическая идентификация штамма бактерий Bacillus БП-46, показана его принадлежность к виду B.cereus. При твердофазном культивировании бактерий Bacillus cereus БП-46 на измельченной дробине «сырая» клетчатка в субстрате снижалась на 11,5%.

- на основании сравнительной оценки эффективности воздействия на зерновую дробину трех мультиэнзимных композиций Ф-ПД-1, Ф-ПД-2 и Ф-ПД-3, отличающихся составом и соотношением уровней активности в мультисистемах, был отобран препарат Ф-ПДопределены условия его применения, обеспечивающие при 2-х часовой экспозиции накопление РВ в ферментолизате до 35,0 г/л, снижение «сырой» клетчатки и «сырого» протеина в твердой фазе с 19,0 до 8,5% и с 25,0 до 15,0%, соответственно.

2. При исследовании влияния химических аналогов факторов микробного анабиоза – алкилоксибензолов (С7- и С12-АОБ) на стабильность ферментативной активности мультиэнзимной композиции Ф-ПД-3 показано, что гомолог С7-АОБ в концентрации 1,0 мг/см стабилизировал активность ферментов, входящих в состав Ф-ПД-3, при этом уровень продуктов гидролиза – редуцирующих сахаров – повышался до 40,0 г/л. Препарат С12АОБ практически не оказывал положительного влияния на ферментативную активность Ф-ПД-3.

3. Исследована активность роста семи молочнокислых бактерий на глюкозе и ферментолизатах зерновой дробины. Отобраны культуры, наиболее активно развивающиеся на ферментолизатах зерновой дробины - бактерии Lactobacillus casei и ассоциативная культура кефирного грибка G, при этом ассоциативная культура кефирного грибка G обладала большей активностью молочнокислого брожения.

4. Разработаны способы получения БАД с функциональными свойствами:

- белково-углеводной добавки, содержащей до 32,0% «сырого» протеина, а также белковоуглеводной добавки, обогащенной микроэлементами: селеном (35,2 мг/кг) и йодом (32, мг/кг) при гетерофазном культивировании дрожжей Yarrowia lipolytica на ферментолизатах дробины;

- белково-углеводных добавок с содержанием «сырого» протеина не менее 30,0%, «сырой» клетчатки не более 10,0%, обладающих пробиотическими свойствами, на основе двухстадийного культивирования дрожжей Y. lipolytica, или грибов Tr. viride, или бактерий B. cereus, автолиза их клеток и последующего выращивания молочнокислых бактерий;

- белково-углеводной кормовой добавки при двухстадийном твердофазном процессе культивирования Bacillus cereus БП-46 на измельченной зерновой дробине в анаэробных условиях, автолизе клеток бактерий и последующем выращивании молочнокислых микроорганизмов. Получен продукт с содержанием «сырой» клетчатки не более 8,0% и «сырого»

протеина не менее 34,0% при плотности популяции молочнокислых культур не менее КОЕ/г.

6. По стандартным методикам определена пробиотическая активность полученных БАД на основе зерновой дробины, показано, что культуры молочнокислых микроорганизмов, содержащиеся в продуктах были терморезистентны при t=60-650C, устойчивы к действию поваренной соли, желчи и пищеварительных ферментов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ:

2. Касаткина, А.Н. Способы повышения биологической ценности дробины / А.Н. Касаткина, Е.К. Лещина, Н.Б. Градова // Комбикорма – 2008. – № 5 – С. 51-52.

3. Касаткина, А.Н. Разработка биотехнологических способов биодеградации дробины как основы для получения белково-углеводной кормовой добавки / А.Н. Касаткина, Н.Б. Градова // Сб. мат. Всероссийской научно-технической конференции «Наука-производствотехнологии-экология». – Киров: Изд-во ВятГУ, 2006. – С. 179-180.

4. Касаткина, А.Н. Исследование пивной дробины как сырья для получения белковоуглеводной кормовой добавки / А.Н. Касаткина // Материалы IV съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, 5-7 декабря 2006 г. – Пущино: Изд-во ООО «МАКС Пресс», 2006. – С. 118-119.

5. Касаткина, А.Н. Дробина как сырье для получения белково-углеводных кормовых добавок и препаратов с пробиотическими свойствами / А.Н. Касаткина, Г.А. Егерева // Материалы VI международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения», 15-16 ноября 2007 г. – М: МГУПБ, 2007. – С.17-18.

6. Касаткина, А.Н. Практическое использование специфических микроорганизмов для трансформации целлюлозосодержащего сырья / А.Н. Касаткина, Н.Б. Градова, Н.А. Ушакова // Тез. докл. международной школы–конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвящённой 40-летию института ГосНИИгенетика, 21-24 октября г. - Москва – Пущино, 2008 г. – С. 43.

7. Заявка на патент на изобретение № 2008119515. Способ получения белково-углеводной биологически активной кормовой добавки / А.Н. Касаткина, Е.К. Лещина, Н.Б. Градова. – заявл. 19.05.2008.