«ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ВТОРИЧНЫЕ ИММУНОДЕФИЦИТНЫЕ СОСТОЯНИЯ И ИХ ФАРМАКОТЕРАПИЯ РАСТИТЕЛЬНЫМИ СРЕДСТВАМИ ...»

На правах рукописи

ХОБРАКОВА ВАЛЕНТИНА БИМБАЕВНА

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ

ВТОРИЧНЫЕ ИММУНОДЕФИЦИТНЫЕ СОСТОЯНИЯ

И ИХ ФАРМАКОТЕРАПИЯ

РАСТИТЕЛЬНЫМИ СРЕДСТВАМИ

06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных,

патология, онкология и морфология животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Благовещенск – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки «Институт общей и экспериментальной биологии» Сибирского отделения Российской академии наук

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Николаев Сергей Матвеевич

Официальные оппоненты:

Хибхенов Лопсондоржо Владимирович, доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Бурятская государственная сельскохозяйственная академия им. В.Р.

Филиппова» Министерства сельского хозяйства РФ, кафедра анатомии, гистологии и патоморфологии, заведующий кафедрой Овчаренко Нина Дмитриевна, доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Алтайский государственный аграрный университет» Министерства сельского хозяйства РФ, кафедра общей биологии, физиологии и морфологии животных, заведующий кафедрой Кушеев Чингис Беликтуевич, доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Иркутская государственная сельскохозяйственная академия» Министерства сельского хозяйства РФ, кафедра специальных ветеринарных дисциплин, профессор кафедры

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Якутская государственная сельскохозяйственная академия» Министерства сельского хозяйства РФ

Защита диссертации состоится «28» ноября 2012 года в 10 00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.027.02 при ФГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный аграрный университет» по адресу: 675005, г. Благовещенск, ул.

Политехническая, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный аграрный университет».

Автореферат разослан “ ” _2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук О.Л. Самусенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время актуальной является проблема развития и коррекции состояний, сопровождающихся нарушением функционирования иммунной системы организма. Интенсивные исследования в последние десятилетия в области теоретической и клинической иммунологии способствовали выявлению широкого круга заболеваний, обусловленных дисфункцией различных звеньев иммунитета и требующих иммунокорригирующей терапии. Поиск средств и способов регуляции иммунологической реактивности организма человека и животных стал одним из приоритетных направлений развития современной медицины и ветеринарии (Астафьева Н.Г. и др., 2008; Енукашвили А.И., 2011; Иванова С.Ф., Сухинин А.А., 2011; Нестерова И.В., 2008; Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., 2005; Gertsch J. et al., 2011;

Kumar S. et al., 2011; Luss L.V., 2005; Margalit M., 2005; Wagner H., 1991).

Потребность в лекарственной коррекции нарушенных функций организма в настоящий момент ощущается особенно остро. Воздействие неблагоприятных экологических факторов, стрессовые ситуации, применение некоторых лекарственных препаратов (в первую очередь глюкокортикоидов, антибиотиков, цитостатиков, туберкулостатиков и др.) неизбежно приводят к нарушению иммунного статуса организма. Иммунная недостаточность приводит к снижению эффективности проводимой фармакотерапии, способствует активизации условно-патогенной микрофлоры, смене возбудителя и к суперинфекции, что, в свою очередь, приводит к затяжному течению болезни, тяжелым осложнениям, а в ряде случаев – к летальному исходу. Поэтому восстановление функциональной активности иммунной системы является непременным условием успеха комплексной терапии различных патологических состояний (Винницкий Л.И. и др., 2008; Клевцова М.Н., 2008; Лебедева М.И., 2011; Локтионов А.Л., 2011; Лунев М.А. и др., 2011; Мухамадиева Л.Р., 2011;

Фомин В.В. и др., 2008; Bisheva I.V. et al., 2005; Karaulov A.V., Kokushkov D.V., 2005;

Vitkovsky Yu., 2005). В связи с этим, оправдан значительный интерес исследователей к использованию средств, способных предупреждать и корригировать нарушения в иммунной системе организма. Арсенал современных иммуномодуляторов представлен, в основном, синтетическими лекарственными средствами. Лишь в последние десятилетия начали уделять внимание средствам природного происхождения.

Иммуноактивные продукты высших растений, изученные в наименьшей степени, в отличие от синтетических имеют ряд преимуществ: мягкое иммуномодулирующее действие, низкая токсичность, способность к активации функций не только иммунной, но и нервной и эндокринной систем, благодаря наличию биологически активных веществ, оказывающих комплексное воздействие на организм в целом (Бакуридзе А.Д.

и др., 1993; Борсук О.С. и др., 2011; Лазарева Д.Н. и др., 2005; Gertsch J. et al., 2011;

Kumar S. et al., 2011; Wagner H., 1991).

К настоящему времени вопросы патогенеза вторичных иммунодефицитных состояний, а также методологические аспекты иммунокоррекции, несмотря на их актуальность и значимость, в литературе отражены отрывочно и крайне недостаточно (Бедулева Л.В., Меньшиков И.В., 2008; Угнич К.А.и др., 2008; Шмагель К.В., 2008;

Browne S.K., Holland S.M., 2010; Matsumoto K., 1982; Sanz J.M. et al., 2009; Yoshikazu M., Routes J.M., 2008). Имеющиеся сведения о влиянии метаболитов лекарственных растений на иммунную систему носят скрининговый характер или являются фрагментарными. Практически не изучено протекторное действие иммуномодуляторов растительного происхождения в условиях иммуносупрессии, а также не ясными остаются многие аспекты механизма иммуномодулирующего действия большинства фитопрепаратов.

Изложенные обстоятельства обосновывают необходимость продолжения поиска средств, обладающих иммунопротекторным действием, безопасных для организма, эффективных при применении в условиях вторичных иммунодефицитов. Подобным требованиям соответствуют средства из лекарственных растений, приготовленные из отечественного сырья.

Таким образом, решение проблем диагностики, профилактики и лечения вторичной иммунной недостаточности организма зависит как от всестороннего изучения морфофункциональных показателей состояния иммунной системы в норме и в условиях патологии, так и от выбора эффективных лекарственных средств, рекомендуемых в качестве иммуномодуляторов.

Целью исследования явилось определение особенностей нарушений функций иммунной системы, вызванных цитостатиком азатиоприном, антибиотиком канамицином и туберкулостатиками, и оценка эффективности растительных средств при экспериментальных вторичных иммунодефицитах.

Для достижения указанной цели были сформулированы следующие задачи:

1) определить влияние цитостатика азатиоприна, антибиотика канамицина и туберкулостатиков: изониазида, рифампицина, пиразинамида, стрептомицина на функциональное состояние клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунитета и оценить их влияние на процессы свободнорадикального окисления липидов и активность ферментов антиоксидантной защиты организма;

2) изучить морфофункциональное состояние центрального органа иммунной системы – тимуса при экспериментальной иммунодепрессии, вызванной цитостатиком азатиоприном;

3) оценить иммунокорригирующие свойства моноэкстрактов – сухих экстрактов пятилистника кустарникового, сабельника болотного, софоры желтоватой в отношении основных звеньев иммунной системы организма при моделировании вторичных иммунодефицитов, вызванных применением азатиоприна, канамицина и туберкулостатиков;

4) оценить влияние многокомпонентных растительных средств (сухих полиэкстрактов «Иммунополифит», «Фитоуросепт», «Нефрофит») на состояние клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунной системы организма при иммуносупрессии;

5) изучить влияние основных индивидуальных соединений растительного происхождения на состояние основных звеньев иммунной системы организма при иммунодепрессии;

6) сопоставить эффективность исследуемых растительных средств и препарата сравнения – экстракта элеутерококка колючего по отношению к основным звеньям иммунитета в условиях иммуносупрессии;

7) выявить основные молекулярно-клеточные механизмы иммуномодулирующего действия растительных средств.

Научная новизна. Проведены комплексные экспериментальные исследования по влиянию цитостатика азатиоприна, антибиотика канамицина и туберкулостатиков:

изониазида, рифампицина, пиразинамида, стрептомицина на морфофункциональное состояние иммунной системы организма экспериментальных животных (мышей, белых крыс) и обоснована возможность и целесообразность коррекции растительными средствами вторичных иммунодефицитов. Установлено, что воздействие данных ксенобиотиков на организм животных сопровождается резким угнетением показателей клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунного ответа. Введение цитостатика азатиоприна вызывает резкие изменения морфофункционального состояния центрального органа иммуногенеза – тимуса интактных животных, характеризующиеся инволюцией, инверсией слоев и сосудистыми нарушениями, связанными, прежде всего, с уменьшением количества клеток лимфоидного ряда, а также жировым перерождением органа. Установлена важная роль активации процессов свободнорадикального окисления липидов, угнетения эндогенной антиоксидантной системы организма и связанной с этим деструкции мембранных структур иммунокомпетентных клеток в патогенезе вторичных иммунодефицитных состояний независимо от природы повреждающего фактора.

В работе впервые установлена выраженная иммуномодулирующая активность растительных лекарственных средств – моноэкстрактов (сухих экстрактов пятилистника кустарникового, сабельника болотного, софоры желтоватой), многокомпонентных растительных средств (сухих полиэкстрактов «Иммунополифит», «Фитоуросепт», «Нефрофит»), а также индивидуальных соединений растительного происхождения в экспериментально-терапевтических дозах на показатели основных звеньев иммунной системы при вторичных иммунодефицитах.

Определены особенности иммуномодулирующего действия испытуемых средств и их фармакотерапевтическая направленность при иммунодепрессиях. Показано, что сухой экстракт пятилистника кустарникового наиболее эффективен в отношении клеточного звена, сухой экстракт софоры желтоватой – гуморального звена, сухой экстракт сабельника болотного – макрофагального звена иммунного ответа. Курсовое введение животным сухого экстракта пятилистника кустарникового в условиях иммуносупрессии нормализует морфофункциональное состояние тимуса, что выражается в восстановлении структурных компонентов тимуса.

Установлена выраженная иммуномодулирующая активность индивидуальных соединений: моноглюкозида сирингарезинола из скорцонеры испанской, флаванонов из софоры желтоватой (софорафлаванон G и кураринон), а также полисахаридов при экспериментальной иммунодепрессии. Показана зависимость степени выраженности иммуномодулирующей активности полисахаридов от их структуры: чем больше степень разветвления, тем выше активность.

Доказана важная роль усиления антигенпрезентирующей функции макрофагов при азатиоприновой иммуносупрессии, повышения продукции противовоспалительных (ILIL-10) и снижения провоспалительного (IL-8) цитокинов мононуклеарными клетками тимэктомированных животных; угнетения супрессорной активности Т-лимфоцитов у иммунизированных животных; снижения продукции стимулированными макрофагами периферической крови здоровых доноров провоспалительных (IL-1, TNF-) цитокинов, стимуляции экспрессии маркеров Т-лимфоцитов (СD4) мононуклеарами здоровых доноров в механизме иммуномодулирующего действия сухого экстракта пятилистника кустарникового. Общим молекулярно-клеточным механизмом в иммуномодулирующем действии растительных средств является их способность стабилизировать мембраны иммунокомпетентных клеток, реализация которой связана с ингибированием процессов свободнорадикального окисления липидов и повышением активности ферментов антиоксидантной защиты организма.

Практическое значение. Полученные результаты вносят вклад в развитие биологии и ветеринарной медицины, поскольку они расширяют представления о механизмах развития вторичной иммунной недостаточности и аргументируют необходимость коррекции дисфункций иммунной системы организма животных и человека.

Результаты исследований дополняют представления о степени угнетающего действия различных факторов (в том числе цитостатика азатиоприна) на тимус, как центральный орган иммунной системы, и должны учитываться в комплексной оценке последствий этих воздействий на организм.

Экспериментально обоснована возможность и целесообразность коррекции растительными средствами вторичных иммунодефицитов, что позволяет рекомендовать их для лечения и профилактики иммунодефицитных состояний у животных и человека в качестве как самостоятельных кормовых и пищевых биологически активных добавок, так и биологически активных компонентов кормового рациона животных и продуктов профилактического назначения.

Результаты проведенных исследований включены в полный отчет по доклиническим испытаниям сухого экстракта пятилистника кустарникового, который представлен в Фармкомитет Минздравсоцразвития РФ для получения разрешения на его клиническое изучение в качестве лекарственного препарата, предназначенного для лечения и профилактики иммунодефицитных состояний, а также в отчеты по доклиническим испытаниям сухих экстрактов сабельника болотного, «Нефрофита», «Фитоуросепта».

Материалы исследований включены в учебное пособие «Основы иммунодиагностики и иммунокоррекции», рекомендованное Учебно-методическим объединением по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России в качестве учебного пособия для системы послевузовского профессионального образования врачей, и используются в учебном процессе на кафедрах общей патологии человека;

фармакологии, клинической фармакологии и фитотерапии медицинского факультета Бурятского государственного университета; анатомии, гистологии и патоморфологии Бурятской государственной сельскохозяйственной академии им. В.Р. Филиппова;

внутренних незаразных болезней, клинической диагностики и фармакологии Иркутской государственной сельскохозяйственной академии и Башкирского государственного аграрного университета. По результатам исследований получен 1 патент РФ (№ 2178709 от 27.01.2002 «Способ получения вещества, обладающего иммуномодулирующей активностью») и 3 Регистрационных удостоверения Минздравсоцразвития РФ на биологически активные добавки к пище – Экстракт пятилистника кустарникового (РУ № 77.99.11.3.У.3233.4.10), «Нефрофит» (РУ № 005449.Р643.07.2003) и «Фитоуросепт» (РУ № 005463.Р643.06.2003).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Особенности иммунодепрессивного действия цитостатика азатиоприна, антибиотика канамицина и туберкулостатиков; важная роль индукции свободнорадикальных процессов и связанной с этим деструкции мембранных структур иммунокомпетентных клеток в механизме развития вторичных иммунодефицитных состояний.

2. Морфофункциональное состояние центрального органа иммуногенеза - тимуса интактных животных под влиянием цитостатика азатиоприна, характеризующееся инволюцией, инверсией слоев и сосудистыми нарушениями, связанными, прежде всего, с уменьшением количества клеток лимфоидного ряда, а также жировым перерождением органа; восстановление нарушенной структуры тимуса в условиях коррекции сухим экстрактом пятилистника кустарникового.

3. Особенности иммуномодулирующего действия растительных средств:

моноэкстрактов (преимущественное влияние сухого экстракта пятилистника кустарникового в отношении клеточного, сабельника болотного – макрофагального и софоры желтоватой – гуморального звеньев иммунной системы) и многокомпонентных растительных средств (сухих полиэкстрактов «Иммунополифит», «Фитоуросепт», «Нефрофит»).

4. Особенности иммуномодулирующего действия индивидуальных соединений из лекарственных растений: моноглюкозида сирингарезинола из скорцонеры испанской, флаванонов из софоры желтоватой (софорафлаванон G и кураринон), а также полисахаридов.

5. Эффективность исследуемых растительных средств сопоставима с таковой препарата сравнения - экстракта элеутерококка колючего по отношению к основным звеньям иммунитета в условиях иммуносупрессии.

6. Важная роль усиления антигенпрезентирующей функции макрофагов, угнетения супрессорной активности Т-лимфоцитов, стимуляции экспрессии маркеров Тлимфоцитов (СD4), повышения содержания противовоспалительных цитокинов (IL-4, IL-10), снижения продукции провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-8, TNF-) в механизме иммуномодулирующего действия сухого экстракта пятилистника кустарникового; способность ингибировать процессы свободнорадикального окисления липидов как один из общих молекулярно–клеточных механизмов в действии растительных средств при экспериментальных вторичных иммунодефицитах.

Апробация материалов диссертации. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: VIII, IX, X, XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2001, 2002, 2003, 2004); Всероссийском конгрессе «Традиционная медицина-2000» (Москва, 2000); VI Всероссийской конференции по патологии клетки (с международным участием) (Москва, 2000); Международной научно-практической конференции «Флора, растительность и растительные ресурсы Забайкалья» (Новосибирск, 2000); Всероссийской научной конференции «Разработка и внедрение новых методов и средств традиционной медицины» (Москва, 2001);

Сибирском конкурсе молодых ученых «Терапия и фундаментальные науки – перспективы содружества в новом тысячелетии» (Новосибирск, 2001); V, VIII, Х, XI Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2002, 2007, 2011, Казань, 2009); II Международном конгрессе «Эндоэкологическая медицина. Терапия, оздоровление, профилактика в условиях кризиса экологии организма» (Москва-Халкидики, 2002); Международной научно-практической конференции «Химия и применение природных и синтетических биологически активных соединений» (Алматы, 2004); VI Симпозиуме по фенольным соединениям (Москва, 2004); Международной конференции «Дорно-орнийн анагаах ухааны хосолмол тогтолцоо» (Уланбатор, 2005); The Second International Symposium on Chemistry of Herbal Medicine and Mongolian Drug (Ulaanbaatar, 2006); Second International Сonference on «Traditional medicine: current situation and future status» (Ulaanbaatar, 2006);

III International Scientific Conference «Traditional medicine: a current situation and perspectives of development» (Ulan-Ude, 2008); Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология – междисциплинарные проблемы»

(Москва, 2008); Международном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008, 2011); The 4th International Symposium on Traditional Medicine and Innovative Drugs (Erdos, 2009); Межрегиональном форуме «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии – междисциплинарные проблемы» (Санкт-Петербург, 2010); International scientific conference «Current situation and future trends of drug research and development from natural sources» (Ulaanbaatar, 2010); 5th International symposium on present situation and future development of Mongolian traditional medicine (Ulaanbaatar, 2011);

Национальной конференции «Клиническая иммунология и аллергология – практическому здравоохранению» (Москва, 2012).

Связь задач исследований с проблемным планом НИР. Работа выполнена в Отделе биологически активных веществ ФГБУН ИОЭБ СО РАН в соответствии с комплексной научной программой «Создание информационного банка данных по тибетской медицине и разработка новых лекарственных препаратов» (№ государственной регистрации 01.9.40003183); интеграционным проектом СО РАН № «Научные основы разработки новых лекарственных средств. Перспективы использования возобновляемого сырья»; проектом № 146 «Разработка лекарственных и профилактических препаратов для медицины. Фундаментальные основы и реализация», утвержденным Президиумом СО РАН; Лаврентьевским конкурсом проектов СО РАН № 6.22 «Структурно-функциональное исследование биополимеров растительного и базидиального происхождения как соединений с иммуностимулирующей, противовоспалительной и антиоксидантной активностью».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 160 научных работ, из них 56 статей – в периодических изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ, в том числе 3 статьи – в зарубежных журналах; 1 монография, получен 1 патент РФ на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 280 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований (5 глав), обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, приложений. Работа иллюстрирована 64 таблицами и 38 рисунками, в том числе микрофотографиями. Список литературы включает 466 источников, из них отечественных и 128 иностранных.

MАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для проведения экспериментальных исследований использовали половозрелых мышей самцов линии СВА, 1475 гибридов F1 (СВАС57Вl/6) массой 18-20 г. и 480 белых крыс линии Wistar обоего пола массой 150-220 г. Животные находились в стандартных условиях содержания в виварии ФГБУН ИОЭБ СО РАН на обычном для указанных видов животных рационе (Приказ МЗ СССР № 1179 от 10.10.83 г.). Эксперименты проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.77 г.) и «Правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей». Эвтаназию животных осуществляли методом мгновенной декапитации под легким эфирным наркозом. Протокол исследования согласован с этическим комитетом Института общей и экспериментальной биологии СО РАН (протокол № от 19.04.2000).

Экспериментальный иммунодефицит моделировали введением мышам цитостатика азатиоприна (АЗ) и антибиотика канамицина (КН) в дозе 50 мг/кг ежедневно перорально в течение 5 дней; противотуберкулезных препаратов (ПТП) (изониазид, рифампицин вводили в дозе 10 мг/кг, пиразинамид – 25 мг/кг, стрептомицин – 15 мг/кг).

Изониазид, рифампицин, пиразинамид вводили животным в смеси перорально, стрептомицин – внутрибрюшинно. ПТП использовали в виде водного раствора ежедневно в течение 7 дней. Экспериментальный иммунодефицит, вызванный тимэктомией, воспроизводили на белых крысах линии Wistar массой 150-220 г. (Адамян Р.Х., 1975; Анисимова В.П. и др., 1985).

В качестве объектов исследования были использованы моноэкстракты из лекарственных растений и полиэкстракты – многокомпонентные растительные средства, а также индивидуальные соединения из лекарственных растений, полученные в лаборатории химико-фармацевтических исследований Отдела биологически активных веществ ФГБУН ИОЭБ СО РАН по новой щадящей и ресурсосберегающей технологии, позволяющей получить максимальный выход действующих веществ из растительного сырья:

1. Сухой экстракт из побегов пятилистника кустарникового (Pentaphylloides fruticosa (L.) O. Schwarz) (зарегистрирован как БАД к пище «Арура-тан» №8) (ЭПК). В состав экстракта входят флавоноиды, дубильные вещества конденсированного и гидролизуемого типа, фенолкарбоновые кислоты, полисахариды, тритерпеновые сапонины, кумарины, аминокислоты. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин – не менее 10%, дубильных веществ – не менее 25%.

2. Сухой экстракт из корней и корневищ сабельника болотного (Comarum palustre L.) (ЭСБ). В составе экстракта сумма полифенольных соединений, аминокислоты, полисахариды. Содержание суммы полифенольных соединений в пересчете на (+)катехин – не менее 40%.

3. Сухой экстракт из корневищ софоры желтоватой (Sophora flavescens Soland.) (ЭСЖ). Полученный экстракт представляет сумму экстрактивных веществ, представленных флавоноидами, тритерпенами и алкалоидами. Флавоноидный состав в основном представлен пренилированными производными флаванона и халкона.

Содержание суммы пренилированных флаванонов в пересчете на кураринон – не менее 10%.

4. Полиэкстракт «Иммунополифит» (условное название) представляет собой восьмикомпонентный сухой экстракт, полученный из корней солодки голой (Glycyrrhiza glabra L.) и вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.ex Spreng.) K.-Pol., семян льна обыкновенного (Linum usitatissimum L.), плодов лимонника китайского (Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.) и шиповника иглистого (Rosa L.), травы горца птичьего (Polygonum aviculare L.) и пустырника сердечного (Leonurus cardiaca L.), соцветий календулы лекарственной (Calendula officinalis L.) в соотношении 2,5:1,0:0,5:1,0:1,5:1,0:1,5:1,0 масс. частей. В составе экстракта идентифицированы флавоноиды (лютеолин, гиперозид, рутин, мирицетин), фенолкарбоновые кислоты (галловая, коричная, кофейная), высшие жирные кислоты, аминокислоты, аскорбиновая и органические кислоты (яблочная, лимонная). Содержание суммы флавоноидов в пересчете на гиперозид – не менее 1%, суммы фенилпропаноидов – не менее 3% в пересчете на кофейную кислоту.

5. Полиэкстракт «Нефрофит» (условное название) (зарегистрирован как БАД к пище «Арура-тан» №3) представляет собой четырехкомпонентный сухой экстракт, полученный из листьев ортосифона тычиночного (Orthosiphon stamineus Benth.) и толокнянки обыкновенной (Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng.), травы горца птичьего (Polygonum aviculare L.) и десмодиума канадского (Desmodium canadense (L.) DC.) в соотношении 4,0:2,0:3,5:0,5 масс. частей. Нефрофит содержит биологически активные вещества, относящиеся к различным классам химических соединений: флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, дубильные вещества, кумарины, сапонины, органические кислоты, фенологликозиды, витамины, микроэлементы и др. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин – не менее 1,5%, фенологликозидов – не менее 10% в пересчете на арбутин.

6. Полиэкстракт «Фитоуросепт» (условное название) (зарегистрирован как БАД к пище «Арура-тан» №4 - Фиточай «Байкальский-6») представляет собой сухой экстракт из следующих видов растительного сырья: травы горца птичьего (Polygonum aviculare L.), листьев толокнянки обыкновенной (Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng.), брусники обыкновенной (Vaccinium vitis-idaea L.), крапивы двудомной (Urtica dioica L.) и цветков календулы лекарственной (Calendula officinalis L.) в соотношении 3,0:2,0:2,0:1,5:1, масс. частей. В состав экстракта входит сумма экстрактивных веществ, представленных комплексом веществ полифенольной природы (апигенин, лютеолин, кверцитин, рутин, гиперозид, мирицетин, фенолкарбоновые кислоты: хлорогеновая, галловая;

фенологликозид: арбутин). Содержание флавоноидов – не менее 2% в пересчете на гиперозид, фенологликозидов – не менее 12% в пересчете на арбутин.

7. Индивидуальные соединения из лекарственных растений:

а) Лигнановый глюкозид из скорцонеры испанской (Scorzonera hispanica L.) моноглюкозид сирингарезинола (I). Штамм ВСКК-ВР №35 суспензионной культуры трансформированных клеток скорцонеры, полученный в ФГБУН «Сибирский институт физиологии и биохимии растений» СО РАН (депонирован и хранится во Всероссийской коллекции культур клеток высших растений ФГБУН «Институт физиологии растений им. Тимирязева» РАН под № 35), помимо других метаболитов, продуцирует комплекс лигнановых и неолигнановых глюкозидов, в который входят I, моноглюкозиды пинорезинола, медиарезинола (II) и 5-метокси-дегидродикониферилового спирта (III) (рис.1а).

б) флаваноны из софоры желтоватой (Sophora flavescens Soland.): софорафлаванон G и кураринон (рис.1б, в).

HOH2C

HO OH HO OH

Рис. 1. Структуры исследованных соединений: а – глюкозиды S. hispanica, б – софорафлаванон G, в – кураринон.

в) полисахариды из аира болотного (Acorus calamus L.), астрагала перепончатого (Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge), софоры желтоватой (Sophora flavescens Soland.), мяты перечной (Mentha piperita L.), зопника клубненосного (Phlomoides tuberosa (L.) Moench), шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi), кардамона настоящего (Elettaria cardamomum (L.) Maton), имбиря лекарственного (Zingiber officinale Roscoe.), лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.).

Растительные средства вводили опытным группам мышей в экспериментальнотерапевтических дозах 40-300 мг/кг перорально 1 раз в сутки в течение 14 дней.

Интактная группа животных получала по аналогичной схеме в соответствующем объеме очищенную воду. В качестве препарата сравнения использовали аптечный экстракт элеутерококка колючего жидкий (ЭЭК; ЗАО Вифитех) в объеме 5мл/кг перорально 1 раз в сутки в течение 14 дней после предварительного освобождения от спирта, а также аптечный препарат Иммунал (Sandoz) в объеме 5 мл/кг 1 раз в сутки в течение 14 дней. Препараты сравнения вводили в изоэффективных дозах. Контрольная группа животных с иммунодефицитом получала эквивалентный объем очищенной воды в аналогичном режиме.

Определение относительной массы и клеточности центральных и периферических органов иммунной системы проводили по общепринятой методике (Методические рекомендации..., 1992). Состояние клеточного иммунитета оценивали в реакциях гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) согласно стандартной методике локальной ГЗТ (Петров Р.В. и др., 1987). Исследование супрессорной активности Тлимфоцитов проводили в соответствии с (Методическими рекомендациями...,1989).

Состояние гуморального иммунитета оценивали по количеству антителообразующих клеток (АОК) (Cunningham A.J, 1965). Фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов (ПМ) мышей в отношении Staphyllococcus aureus исследовали in vitro по методике, описанной И.С. Фрейдлин (1976), при этом оценивали фагоцитарный индекс (количество макрофагов, поглотивших S. аureus, из 100 подсчитанных макрофагов) и фагоцитарное число (количество микробных клеток в одном макрофаге); в отношении частиц коллоидной туши – согласно (Руководство…, 2005). Исследование антигенпрезентирующей функции макрофагов проводили согласно методическим рекомендациям (Имельбаева Э.А., 1996). Поглотительную активность фагоцитов оценивали методом цитофлуориметрии на проточном цитофлюориметре Cytomics FC 500 (Beckman Coulter, США), используя в качестве объекта для фагоцитоза St. aureus, меченный зеленым флюорохромом флюоресцеин-5-изотиоцианатом (ФИТЦ).

Вычисляли фагоцитарный индекс – количество фагоцитов, поглотивших меченные микроорганизмы, к общему числу фагоцитов (Пинегин Б.В. и др., 2001). Продукцию активных форм кислорода оценивали цитофлуориметрически в тесте кислородного «взрыва», индуцированного классическим стимулятором – форбол-12-миристат-13ацетатом (ФМА) с флуорогенным субстратом дигидрородамином-123 (ДГР-123).

Активность нейтрофилов анализировали по интенсивности свечения красителя ДГРс помощью проточной цитометрии на проточном цитофлюориметре Cytomics FC 500. Определяли процент активированных нейтрофилов, а также показатели спонтанной и стимулированной интенсивности флуоресценции (Пинегин Б.В. и др., 2001). Пролиферативную активность Т- и В-лимфоцитов селезенки мышей изучали in vitro в реакции бластной трансформации в присутствии митогенов: конканавалина А (Кон А) и липополисахарида (ЛПС) по включению 3Н-тимидина с использованием сцинтилляционного счетчика Triathler (Hidex) согласно (Руководство…, 2005).

Определение влияния экстрактов на экспрессию кластеров дифференцировки на лимфоцитах человека проводили на проточном цитофлуориметре Epics XL-MCL (Beckman Coulter, США) с использованием стандартных наборов Immunotech (Франция). Выявляли следующие субпопуляции Т-лимфоцитов (CD3+): Т-хелперы (CD4+), цитотоксические лимфоциты (ЦТЛ) (CD8+), NK-клетки (CD16+) и B-клетки (CD19+). Продукцию провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, TNF-) макрофагами периферической крови здоровых доноров, а также содержание провоспалительных (ILIL-8, ФНО-) и противовоспалительных (IL-4, IL-10) цитокинов при экспериментальной иммунодепрессии, вызванной тимэктомией, определяли путем иммуноферментного анализа.

Для оценки влияния ксенобиотиков и фитосредств на процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) и состояние эндогенной антиоксидантной системы (АОС) организма использовали методы in vivo и in vitro. Концентрацию ТБК-активных продуктов определяли спектрофотометрически в сыворотке крови (Темирбулатов Р.А., Селезнев Е.И., 1981) и в гомогенате селезенки (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Д., 1977).

Содержание диеновых конъюгатов (ДК) в сыворотке крови определяли спектрофотометрическим методом (Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И., 1983). Для оценки состояния эндогенной АОС в сыворотке крови определяли активность ферментов: супероксиддисмутазы (СОД) (Чевари С. и др., 1985) и каталазы (Королюк М.А. и др., 1988). Оценку антиоксидантной активности фитосредств проводили с использованием ряда методов в условиях in vitro. Определение влияния испытуемых средств на скорость генерации супероксидного анион-радикала O2•-, осуществляли по Chen A.-S. с соавт. (2003). Способность к инактивации молекул NO определяли по методу Govindarajan R. с соавт. (2003). Общую антиоксидантную активность определяли по методу Preito с соавт. (1999). Антирадикальную активность определяли с использованием двух свободных радикалов: нейтрального радикала 1,1-дифенил-2пикрилгидразила (DPPH) и катион-радикала 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6сульфоновой кислоты) (ABTS•+) спектрофотометрическим методом по Seyoum A. с соавт. (2006) и Ding H. с соавт. (2010). Способность к хелатированию ионов Fe2+ выявляли спектрофотометрическим о-фенантролиновым методом (Оленников Д.Н. и др., 2008).

Гистоморфологические исследования тимуса проводили при помощи общепринятой методики (Коржевский О.Э., Гиляров А.В., 2010). Тимус извлекали спустя 5 дней после введения азатиоприна в дозе 50 мг/кг и на 5, 10, 15 сутки после введения ЭПК. Материал фиксировали в 10% нейтральном формалине с последующей стандартной спиртовой проводкой и заливкой в парафин. Из парафиновых блоков готовили срезы толщиной 4-6 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином. Исследование микроанатомии тимуса мышей проводили с помощью морфометрического метода. Для этой цели измеряли толщину капсулы, ширину коркового вещества. Мозговое вещество оценивали по 2-м параметрам длина (продольный разрез тимуса) и ширина (поперечный разрез тимуса). Измерения проводили при помощи микроскопа МБИ-3 при увеличении объектива 10, окуляра 10 с использованием окуляр-микрометра (Автандилов Г.Г., 1990), а также цифрового микроскопа DMW B1-223 (Motic, Германия) с использованием программного обеспечения Motic Images-2000.

Результаты исследований статистически обработаны общепринятыми методами для малой выборки с определением средней величины (М) и ошибки (m). Степень достоверности результатов исследований (Р) оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Различие между данными контроля и опыта считали достоверным при вероятности 95% (Р 0,05) (Сергиенко В.И., Бондарева И.Б., 2006).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика иммунодефицитного состояния, вызванного цитостатиком азатиоприном, антибиотиком канамицином и туберкулостатиками Полученные в работе данные свидетельствуют, что введение мышам АЗ, КН и ПТП сопровождается угнетением иммунной системы, характеризующимся существенными нарушениями ее морфофункционального состояния. Использование АЗ, КН и ПТП приводило к достоверному снижению относительных масс тимуса и селезенки в среднем на 30% по сравнению с данными в интактной группе. Наряду со снижением массы иммунных органов, под влиянием указанных веществ наблюдалось уменьшение их клеточности в среднем на 25-30% по сравнению с таковой в интактной группе.

Введение АЗ характеризовалось угнетением показателей клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунного ответа, что выражалось в снижении индексов реакций ГЗТ и РТПХ на 22% и 31% соответственно, абсолютного и относительного числа АОК на 56% и 60% соответственно, фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа на 60% и 49% соответственно по отношению к данным в интактной группе (табл.1).

Влияние ЭПК и ЭЭК на состояние основных звеньев иммунного ответа организма при (АЗ) АЗ+ЭПК 10527110839* 59831* 39,23,1* 3.40.2* 71,34,7* 9,01,1* AЗ+ЭЭК 9621110219* 42737* 36,42,5* 2.90.2* 65,22,7* 8,00,6* Примечание: здесь и далее * - различия достоверны при p 0.05 по сравнению с данными в контрольной группе, число животных в каждой группе (n=10).

Использование КН приводило к достоверному снижению индексов реакций ГЗТ и РТПХ на 31% и 35% соответственно, абсолютного и относительного числа АОК на 52% и 47% соответственно, фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа на 35% и 61% соответственно по отношению к данным в интактной группе (табл.2).

Полученные результаты о подавляющем действии КН на макрофагальное звено иммунного ответа подтверждает работа В.И. Ратникова, Е.А. Трениной (2000), в которой выявлено подавляющее действие -лактамных антибиотиков – тиенама и ретарпена на активность одного из сильнейших агентов микробицидных систем внутри фагоцитирующих клеток – эндогенной окиси азота (NO), дефицит которого является одной из главных причин незавершенности фагоцитоза. По мнению C.J. Pallister, K.L.

Lewis (2000), для большинства антибиотиков характерно угнетающее воздействие на микробицидные системы нейтрофилов и макрофагов. Вместе с тем, вопрос о взаимодействии антибиотиков и иммунной системы недостаточно изучен. В настоящее время выраженные иммуностимулирующие свойства установлены только у одного цефалоспоринового антибиотика III поколения – цефтазидима (прямое стимулирующее воздействие на функциональное состояние нейтрофилов). Некоторые макролиды (эритромицин, рокситромицин, спирамицин, азитромицин) в терапевтических дозах улучшают основные функции нейтрофилов – адгезию и хемотаксис, благодаря которым они проникают в очаг воспаления. Кроме того, макролиды и фторхинолоны снижают продукцию макрофагами цитокинов провоспалительной направленности – ИЛ-1 и ФНО- (Яковлев С.В., 1999). Однако в большинстве работ, посвященных изучению проблемы влияния антибактериальных препаратов на иммунную систему, полученные результаты свидетельствуют о подавляющих эффектах антибиотиков на состояние защитных сил организма (Смирнов В.С., Фрейдлин И.С., 2000; Хаитов Р.М.

и др., 2000; Krzystyniak R. et al., 1995; Pallister C.J., 2000).

Влияние ЭПК и ЭЭК на состояние основных звеньев иммунного ответа организма при Контрольная (КН) КН+ЭПК 704086186* 19317* 35,73,2* 2,80,1* 73,52,9* 8,61,2* КН+ЭЭК 666435234* 17814* 33,52,6* 2,30.1* 68,93,7* 7,41,0* Имеющиеся в литературе данные о воздействии ПТП на состояние иммунной системы организма отражают результаты исследований об их влиянии на отдельные звенья иммунитета - без комплексной оценки их действия на функционирование клеточного, гуморального звеньев иммунного ответа, систему фагоцитоза. При этом следует отметить разрозненный, неполный характер исследований: рассматривается действие лишь отдельных туберкулостатиков, данные об их совместном влиянии отсутствуют (Князева Л.И. и др., 1996; Александрова А.Е. и др., 1996). Нами установлено, что введение мышам смеси ПТП также приводило к достоверному снижению индексов реакций ГЗТ и РТПХ на 30% и 25% соответственно, абсолютного и относительного числа АОК на 44% и 32% соответственно, фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа на 38% и 63% соответственно по отношению к данным в интактной группе (табл.3).

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют об угнетающем действии АЗ, КН и ПТП на основные звенья системы иммунитета.

Большой теоретический и практический интерес представляют изменения в тимусе центральном органе иммуногенеза при действии целого ряда факторов окружающей среды. Воздействие этих факторов сопровождается изменениями клеточного состава тимуса, что, чаще всего, отражается на функциональной активности не только самого органа, но и иммунной системы в целом (Петров Р.В., 1982; Сапин М.Р., Этинген Л.Е., 1996).

Влияние ЭПК и ЭЭК на состояние основных звеньев иммунного ответа организма при иммуносупрессии у мышей, вызванной туберкулостатиками Контрольная (ПТП) Отсутствие в литературе сведений о влиянии АЗ на структуру тимуса - центрального органа иммуногенеза послужило поводом для исследования микроанатомии данного органа. При морфометрическом исследовании тимуса проводился анализ соотношения структурных компонентов, что, по мнению М.Р. Сапина (1988), позволяет лучше понять строение иммунных структур, сравнивать их между собой и оценивать их в динамике.

Полученные в работе данные убедительно показывают, что тимус обладает высокой морфофункциональными перестройками. Морфометрическими исследованиями удалось доказать, что воздействие АЗ вызывает резкие изменения в микроанатомии структурных компонентов тимуса. Так, у мышей после воздействия АЗ наблюдалось значительное уменьшение массы тимуса, что согласуется с исследованиями этого органа после однократного введения циклофосфана в работе Н.В. Масная (1998). Также отмечено значительное изменение на гистологических срезах площадей коркового, и, в особенности, мозгового вещества (рис.2). Это может быть объяснено массовой деструкцией лимфоидных клеток и нарушением процессов миграции лимфоцитов из тимуса. В некоторых случаях также выявлены изменения в плотности распределения клеток в функциональных зонах тимуса, что приводит к инверсии слоев. Подобные морфологические изменения в литературе отмечены при исследовании влияния на тимус мышей однократного гамма-облучения (Ерофеева Л.М. и др., 1998; Sapin et al., 1997). На нескольких гистологических срезах тимуса отмечено стирание границ между корковым и мозговым веществом. Кроме того, наблюдалось усиление процессов разрушения и реутилизации лимфоидных клеток в тимусе, увеличение относительного числа деструктивно измененных лимфоцитов во всех функциональных зонах органа.

Массовая деструкция клеток тимуса после воздействия гидрокортизона и -облучения описана также в работах (Сапин М.Р. и др., 1981; Григоренко Д.Е. и др., 1997; Ерофеева Л.М. и др., 1998). В корковом веществе отмечены крупные разрастания фибробластов, так называемых фибробластических валиков, что является проявлением повреждения лимфоидной ткани действующим агентом - иммунодепрессантом АЗ.

АЗ +ЭПК (10 сутки) АЗ + ЭПК (15 сутки) Описанный нами комплекс изменений в микротопографии тимуса сопровождается значительным уменьшением количества и диаметра тимических телец. По мнению некоторых авторов (Калинин В.С., 1979; Одинокова В.А., Смирнов В.Б., 1980), это способствует снижению функциональной активности тимуса. Также отмечено увеличение толщины капсулы за счет ее разрыхления, в некоторых местах наблюдались скопления жировых клеток, что может свидетельствовать о начинающемся жировом перерождении органа. Подобные явления описаны М.Р. Сапиным и др. (1991) в тимусе крыс в условиях стрессовых воздействий, а также Л.М. Ерофеевой (1995) при действии диметилсульфата. Сосудистое русло мозгового вещества занимает на срезе площадь намного большую, чем в контроле, что выражается увеличенными просветами сосудов и их полнокровием. Опираясь на это, можно предположить, что утолщение капсулы и расширение сосудов в тимусе есть неспецифическая реакция и является проявлением общего адаптационного процесса в органах иммунной системы. Однако в органах иммунной системы этот процесс имеет различную функциональную нагрузку. Так, в лимфатических узлах, по мнению Е.Е. Шаровой (1989), это направлено на повышение барьерно-фильтрационной и «резервуарной» функции. В тимусе же, по нашему мнению, описанные адаптационные преобразования связаны с усилением распада и миграцией лимфоцитов из органа. С учетом данных литературы результаты наших исследований позволяют утверждать, что описанные структурные изменения в тимусе носят неспецифический характер и свидетельствуют о снижении функциональной активности иммунной системы организма при действии АЗ.

Таким образом, введение АЗ, КН и ПТП сопровождается угнетением основных звеньев иммунной системы; использование АЗ приводит к резкому изменению морфофункционального состояния тимуса интактных животных. Установлено, что наиболее выраженное иммунодепрессивное действие оказывает АЗ, в большей степени угнетая гуморальное и макрофагальное звенья иммунного ответа, тогда как КН и ПТП наиболее выраженное иммунодепрессивное действие проявляют в отношении макрофагального звена иммунитета.

Среди причин, вызывающих иммунодефицитные состояния, важное значение имеет интенсификация процессов липидной пероксидации. При различных патологических состояниях организма, когда усилен процесс генерации реакционноспособных, весьма токсичных перекисных радикалов и активных форм кислорода, повреждаются не только те структуры, которые метаболически подлежат инактивации, но и весьма важные структурные и функциональные белки и липиды, ферментные и мембранные системы клеток, приводя к метаболическому хаосу, подавлению функциональной активности иммунокомпетентных клеток, нарушению иммунного ответа, к возникновению иммунопатологических и аутоиммунных процессов (Григорян Л.С.,1987; Конопля Е.Н., Прокопенко Л.Г.,1997). По современным представлениям, свободные радикалы участвуют в регуляции клеточной пролиферации, индуцируют транскрипцию определенных генов и могут служить «триггером» - пусковым моментом апоптоза (Хансон К.П., 1999). В связи с этим особое значение приобретают полученные нами данные о том, что общим молекулярно-клеточным звеном в патогенезе иммунодефицитных состояний, независимо от этиологии, являются нарушения структурной и функциональной целостности биомембран в результате индукции процессов свободнорадикального окисления липидов и снижения активности системы антиоксидантной защиты организма, что было подтверждено фактами увеличения концентрации продуктов свободнорадикального окисления липидов (ДК, МДА) в сыворотке крови и гомогенате селезенки при экспериментальных иммунодефицитах, вызванных АЗ, КН и ПТП. Более выраженная индукция процессов ПОЛ наблюдалась при канамициновой иммуносупрессии, о чем свидетельствует повышение содержания продуктов пероксидации липидов (ДК и МДА) соответственно в 3,5 и 2,1 раза по сравнению с аналогичными показателями у интактных животных. Кроме того, под влиянием КН происходило снижение активности ферментов антиоксидантной защиты организма (каталазы и СОД) на 57 и 42% соответственно по сравнению с данными в интактной группе животных.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что индукция процессов свободнорадикального окисления липидов играет важную роль в патогенезе иммунодефицитных состояний независимо от природы повреждающих факторов.

Коррекция растительными лекарственными средствами экспериментальных вторичных иммунодефицитов В последние годы пристальное внимание исследователей привлекают иммуномодулирующие эффекты, вызываемые препаратами природного происхождения. Они, как правило, нетоксичны и эффективны при длительном применении в небольших дозах. Преимущество лекарственных растений заключается в том, что они действуют на организм всем комплексом содержащихся в них веществ. В связи с этим необходим поиск и создание новых эффективных иммунокорригирующих лекарственных препаратов, полученных с использованием современных технологий, позволяющих извлечь максимальное количество действующих веществ из растительного сырья, примером чего могут являться сухие экстракты, к преимуществу которых относятся стойкость при хранении, удобство при приеме больными. Сухие экстракты представляют собой легкорастворимые в воде или водно-спиртовых смесях комплексы биологически активных веществ, удобные в дозировании и стандартизации.

Отечественные лекарственные растения, характеризующиеся удовлетворительными природными запасами и обладающие широким фармакотерапевтическим эффектом, являются наиболее перспективными для создания на их основе лекарственных препаратов. К таким растениям относятся пятилистник кустарниковый, сабельник болотный, софора желтоватая. Высокая эффективность лекарственных средств, созданных на основе указанных растений, при воспалительных процессах и аллергических заболеваниях (атопических дерматозах), в патогенезе которых существенное значение имеют нарушения иммунологической реактивности организма, предполагает наличие у них иммуномодулирующей активности (Баханова Е.М., 2001;

Евстропов А.Н. и др., 2005; Коровкина Г.В. и др.,1971; Марков П.А., Никитина И.Р., 2005; Николаева И.Г., 1997; Попов С.В. и др., 2007; Cheng H. et al., 2006; Kim D. et al., 2002; Suo Z. et al., 2009). Данные обстоятельства послужили основанием для выбора указанных видов растений в качестве объектов исследования на предмет наличия у них иммунокорригирующих свойств. Кроме того, в предварительных сериях экспериментов из 20 исследованных нами растительных объектов (отвары астрагала перепончатого, лишайника кладины звездчатой, горечавки холодной, поповника сибирского, зопника клубненосного; сока каллизии душистой; настой цветков лилии малорослой; настойка корней молочая Фишера; сухие экстракты пятилистника кустарникового, бадана толстолистного, сабельника болотного, софоры желтоватой, ортилии однобокой, панцерии шерстистой, какалии копьевидной, горечавки холодной, горечавки бородатой, зубчатки обыкновенной, астрагала перепончатого, лапчатки белой) в отношении первичного иммунного ответа в реакции антителообразования указанные средства проявляли наиболее выраженную иммуномодулирующую активность. Также в результате фармакологического скрининга в качестве объектов исследования нами были выбраны многокомпонентные растительные средства: сухие полиэкстракты «Иммунополифит», «Фитоуросепт», «Нефрофит» из 23 изученных многокомпонентных фитосредств (отвары «Диг-да-ши-тан», «Камфора-25», «Арура-тан-7»; настойки «Тантон», «Гум-Брум», «Кардекаим», «Пентафитон», «Иммунофит», сухие экстракты «Семь драгоценных» («Норбу-дун-тан»), «Вентрофит», «Иммунополифит», «Фитоуросепт», «Ши-Жид» («Гастротон»), «Нефрофит», «Гепатон», «Диабефит», «Фитопрост», «Байкальский-7», «Тиреотон», «Трионорм», «Аркосител», «Флаворен», «Адаптон-6»). На основании предварительно проведенного фармакологического скрининга можно заключить, что иммуномодулирующий эффект сухих экстрактов несколько превосходит таковой отваров и настоек, что объясняется особенностями технологий их получения, которые позволяют извлекать большее количество биологически активных веществ из растений в сравнении с отварами и настоями.

Как показали экспериментальные исследования, применение ЭПК, ЭСБ, ЭСЖ, «Иммунополифита», «Фитоуросепта», «Нефрофита» позволило выявить их выраженную иммуномодулирующую активность, выражающуюся в достоверном увеличении массы и клеточности иммунных органов, а также показателей клеточного, гуморального иммунитета и фагоцитоза макрофагов на фоне иммуносупрессии, вызванной введением АЗ.

Использование ЭПК при иммунодепрессиях, вызванных АЗ, КН и ПТП, способствовало восстановлению нарушенных функций иммунной системы организма, о чем свидетельствовало повышение числа АОК, индексов реакций ГЗТ и РТПХ, фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа (табл. 1, 2, 3).

Нами определены особенности иммуномодулирующего действия испытуемых средств и их фармакотерапевтическая направленность при иммунодепрессиях.

Показано, что ЭПК наиболее эффективен в отношении клеточного звена, что клеточноопосредованных иммунных реакций ГЗТ и РТПХ в условиях азатиоприновой иммунодепрессии, угнетении супрессорной активности Т-лимфоцитов у иммунизированных животных; увеличении пролиферативной активности Тлимфоцитов у интактных мышей, стимуляции экспрессии маркеров Т-лимфоцитов (СD4+) мононуклеарами здоровых доноров При оценке влияния ЭПК на пролиферативную активность Т- и В-лимфоцитов селезенки интактных мышей in vitro использовали его в концентрациях 0,3; 3,0 и мкг/мл. ЭПК в концентрации 3,0 мкг/мл стимулирует пролиферацию Т-лимфоцитов в 1,5 раза и не оказывает существенного влияния на пролиферацию В-лимфоцитов в реакции бластной трансформации в присутствии митогенов (табл.4).

При исследовании влияния ЭПК на экспрессию поверхностных молекул лимфоцитов периферической крови здоровых доноров установлено, что данное средство стимулирует экспрессию маркеров Т-лимфоцитов (СD4) (табл.5).

Полученные факты свидетельствуют о том, что компоненты, присутствующие в пятилистнике кустарниковом, вмешиваются в процесс активации Т-лимфоцитов. Нами предполагается, что одним из возможных механизмов подобного действия может являться способность взаимодействовать с рецепторами к IL-2 на мембране лимфоцитов, что приводит к усилению экспрессии соответствующих кластеров дифференцировки. Установленная нами стимуляция клеточного звена иммунной системы мышей под влиянием ЭПК подтверждается исследованиями С.Ч. Гончиковой и др. (2002), в которых установлено выраженное стимулирующее влияние ЭПК на состояние клеточного иммунитета больных туберкулезом.

Влияние ЭПК на экспрессию мембранных маркеров лимфоцитов периферической Вариант опыта В следующей серии экспериментов нами изучено влияние ЭПК на антигенпрезентирующую функцию макрофагов мышей на фоне АЗ. Известно, что клетки перитонеального экссудата, содержащие 80-85% фагоцитирующих моноцитов, способны индуцировать иммунный ответ к эритроцитам барана в сингенном организме после захвата антигена. При этом динамика накопления АОК соответствует динамике развития этого процесса в условиях иммунизации нативным антигеном (Галактионов В.Г., Анфалова Т.В., 1974).

Влияние ЭПК на антигенпрезентирующую функцию макрофагов было изучено на животных, находящихся в состоянии иммунодепрессии, вызванной АЗ. Трансплантация интактным мышам клеток перитонеального экссудата от иммунизированных ЭБ мышей-доноров, получавших АЗ, сопровождалась угнетением гуморального иммунного ответа, что выражалось в уменьшении количества АОК как в абсолютных значениях, так и при расчете на 106 спленоцитов в 2,8 и 2,3 раза, соответственно, по сравнению с данными в интактной группе (табл.6).

Влияние ЭПК на антигенпрезентирующую функцию макрофагов мышей на фоне В сериях опытов с введением иммунизированным мышам-донорам, подвергнутым воздействию АЗ, ЭПК и трансплантацией от последних перитонеальных макрофагов сингенным мышам-реципиентам происходило повышение выраженности гуморального иммунного ответа, что выражалось в увеличении абсолютного и относительного числа АОК в 2,8 и 2,6 раза, соответственно, по сравнению с данными в группе животных, получавших АЗ.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что в реализации иммуномодулирующих свойств исследуемого экстракта имеет значение стимуляция иммунорегуляторной функции макрофагов. Кроме того, было изучено влияние ЭПК на функциональное состояние макрофагов периферической крови человека по параметрам продукции макрофаг-специфических цитокинов IL-1, IL-6 и TNF-. Под влиянием ЭПК происходило снижение провоспалительных цитокинов IL-1 и TNF- в 2,3 и 1, раза соответственно по сравнению с контролем. Стимулирующего или ингибирующего влияния ЭПК на синтез и секрецию IL-6 клетками не обнаружено (табл.7). Одним из возможных механизмов ингибирующего действия ЭПК на экссудативную фазу воспаления, установленного в работах М.М. Арьяевой (1998) и Л.Г. Буровой (2004), является выявленное нами снижение секреции провоспалительных цитокинов.

Влияние ЭПК на продукцию провоспалительных цитокинов макрофагами В экспериментах на тимэктомированных животных нами также отмечено снижение продукции провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-8, ФНО-) под влиянием ЭПК.

Так, содержание IL-1 в группе, получавшей данный экстракт, снижается в 1,4 раза (с 7,88±0,38 пг/мл группы контроля до 5,68±0,46 пг/мл), а концентрации IL-8 и ФНО- - в 1,5 раза (IL-8: с 7,27±0,35 пг/мл группы контроля до 4,73±0,44 пг/мл; ФНО-: с 7,44±0,32 пг/мл группы контроля до 4,97±0,45 пг/мл). Кроме того, ЭПК значительно повышает продукцию противовоспалительных цитокинов: IL-4 – с 5,10±1,20 пг/мл группы контроля до 10,50±0,97 (в 2,1 раза), IL-10 – с уровня менее 1 пг/мл до 9,60±1, пг/мл. Аптечный препарат Иммунал изменяет содержание цитокинов только в отношении IL-4, увеличивая его продукцию в 1,9 раза по сравнению с контролем.

Однако, несмотря на важность усиления антигенпрезентирующей функции макрофагов в реализации стимулирующего влияния ЭПК на антителообразование, а также снижения содержания провоспалительных цитокинов, повышения содержания противовоспалительных цитокинов, лишь одним этим действием не исчерпывается спектр его иммунорегуляторных эффектов. В связи с этим проведен анализ роли негативного контроля иммунного ответа в проявлении иммуномодулирующего действия изучаемого экстракта. Существующие представления о Т-лимфоцитах с супрессорной функцией имеют большое значение для современной иммунологии, ветеринарии и клинической медицины. Целый ряд патологических состояний, таких как аллергия и аутоиммунные нарушения, обусловлены, по современным представлениям, недостаточностью именно Т-супрессорного звена, в то время как иммунодефициты считаются следствием выраженной супрессорной активности Т-лимфоцитов (Ding J.E., Chan-Ching L.,1988; Moller G.,1988). Адоптивный перенос Т-лимфоцитов с супрессорной активностью, индуцированных в группах мышей, получавших исследуемый экстракт, дает информацию о другой важной стороне механизма его действия (Ляшенко В.А. и др., 1988; Eardley et al., 1983).

На фоне значительного уменьшения абсолютного и относительного содержания АОК (в 3,2 и 2,7 раза, соответственно) в селезенке мышей после переноса суспензий клеток с супрессорной активностью по сравнению с контролем, наблюдается увеличение количества АОК на селезенку и при расчете на 106 спленоцитов (в 3,4 и 3, раза, соответственно) в тех сериях опытов, где доноры клеток с супрессорной активностью получали ЭПК. Последнее свидетельствует об угнетении исследуемым экстрактом супрессорной активности Т-лимфоцитов (табл.8).

Влияние ЭПК на супрессорную активность Т-лимфоцитов у мышей Примечание: 1 - по сравнению с контролем, 2 - по сравнению с контролем супрессии.

Следовательно, снижение супрессорной активности Т-лимфоцитов при введении донорам ЭПК позволяет считать указанную зависимость существенным моментом в реализации стимулирующего действия экстракта на антителогенез. Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о важной роли влияния ЭПК на антигенпрезентирующую функцию макрофагов, содержание провоспалительных и противовоспалительных цитокинов и функцию Т-лимфоцитов с супрессорной активностью в реализации его иммуномодулирующего действия.

Полученные данные об иммуномодулирующей активности ЭСЖ свидетельствуют о его более выраженном действии на гуморальное звено иммунного ответа, что выражается в увеличении количества антителообразующих клеток более чем в 2 раза и стимуляции пролиферативной активности В-лимфоцитов в 1,5 раза по сравнению с контролем. Эффективность ЭСЖ, по-видимому, можно объяснить совокупным действием комплекса биологически активных веществ, преимущественно, флавоноидов и полисахаридов, обладающих выраженными иммуномодулирующими свойствами.

Наши данные согласуются с данными Л.А. Горбачевой и др. (1992), из которых известно, что плоды софоры японской стимулируют В-звено иммунитета, при этом, суммарное извлечение из зрелых плодов достоверно стимулирует гуморальный иммунный ответ в 3,9 раза и недозрелых - в 6 раз. Кроме того, нами установлено, что ЭСЖ восстанавливает клеточное и макрофагальное звенья иммунного ответа при азатиоприновой иммуносупрессии.

Данные об иммуномодулирующем действии ЭСБ позволяют заключить, что указанное средство оказывает наиболее выраженный эффект в отношении макрофагального звена иммунного ответа при азатиоприновой иммуносупрессии, что выражается в увеличении поглотительной способности перитонеальных макрофагов в отношении S. aureus (фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа). Отмечено, что ЭСБ не оказывает значимого влияния на поглотительную активность нейтрофилов периферической крови здоровых доноров в отношении S. aureus, меченного зеленым флюорохромом ФИТЦ in vitro (количество фагоцитирующих нейтрофилов не изменялось по сравнению с таковым в контрольной группе) (рис.3).

Кроме того, при исследовании влияния ЭСБ на продукцию активных форм кислорода нейтрофилами периферической крови здоровых доноров установлено, что указанное средство значимо не изменяет процент ФМА-активированных нейтрофилов, продуцирующих активные формы кислорода, по сравнению с данными в контрольной группе (рис.4).

Использование ЭСБ достоверно снижает интенсивность флуоресценции нейтрофилов в 1,5 раза по сравнению с введением в систему классического стимулятора ФМА, индуцирующего кислородный «взрыв» (табл.9). Данный эффект может быть обусловлен антиоксидантными свойствами экстракта благодаря преимущественному содержанию в нем веществ фенольной природы.

Поскольку указанное средство достоверно не подавляло, но и не стимулировало в вышеописанных моделях функции фагоцитов, можно предположить, что эффект данного средства может быть обусловлен прямой антибактериальной активностью.

Полученные данные о влиянии ЭСБ на макрофагальное звено иммунного ответа согласуются с данными В.С. Смирнова, И.С. Фрейдлин (2000) о выраженном влиянии извлечений из сабельника болотного на функции фагоцитов. Кроме того, нами установлена способность ЭСБ восстанавливать клеточное и гуморальное звенья иммунного ответа при азатиоприновой иммуносупрессии.

а) контроль (спонтанная флюоресценция) б) ФМА (стимулированная флюоресценция) кислорода).

в) ФМА+ЭСБ (в % - нейтрофилы, продуцирующие активные формы кислорода) Влияние ЭСБ на интенсивность флуоресценции фагоцитов периферической ФМА (стимулированная флуоресценция) 11,230, Установленный нами в эксперименте иммуномодулирующий эффект многокомпонентных растительных средств «Иммунополифита», «Фитоуросепта» и «Нефрофита» (увеличение числа АОК, индексов реакций ГЗТ, РТПХ; фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа в среднем в 1,7-2,5 раза по сравнению с уровнем супрессии) обусловлен широким разнообразием содержащихся в них биологически активных веществ (БАВ), преимущественно, флавоноидов, дубильных веществ, полисахаридов, витаминов и др.

Усилия большого количества ученых во всем мире направлены на поиск соединений, которые могли бы стать эффективными лигандами рецепторов иммунокомпетентных клеток с целью специфической и неспецифической стимуляции функций данных клеток при иммунодефицитных состояниях.

При исследовании иммуномодулирующей активности фракций, полученных из софоры желтоватой (этилацетатной, полисахаридной, хлороформной и спиртовой) установлено наиболее выраженное влияние полисахаридной фракции, содержащей водорастворимые полисахариды с доминирующей группой а-4,6-глюканов, и этилацетатной, в которой отмечено высокое содержание полифенольных веществ:

флаванонов (кушенол А, изокураринон, кураридин, софорафлаванон G, кураринон, изоксантогумол). Эти данные позволяют утверждать, что за иммуномодулирующий эффект ЭСЖ ответственны содержащиеся в нем полисахариды и флавоноиды. Так, получены данные по влиянию на состояние иммунной системы организма полисахаридов, выделенных из растительного сырья, и флавоноидов софоры желтоватой (софорафлаванон G, кураринон).

При исследовании иммуномодулирующей активности полисахаридов из аира болотного, астрагала перепончатого, софоры желтоватой, мяты перечной, зопника клубненосного, шлемника байкальского, кардамона настоящего, имбиря лекарственного, лиственницы сибирской установлено, что данные соединения обладают выраженной эффективностью в отношении клеточного, гуморального иммунного ответа и фагоцитоза макрофагов в условиях азатиоприновой иммуносупрессии. Стимуляция функциональной активности макрофагов – характерное свойство большинства растительных полисахаридов. Возможно, что макрофаги являются основными клетками в организме, через которые эти полисахариды реализуют свои иммуномодулирующие свойства. Растительные полисахариды специфически связываются на поверхности макрофагов с теми же рецепторами (CD14, CR3, Toll-подобные рецепторы, скэвенджер-рецепторы), что и микробные полисахариды. В соответствии с данными R.L. Modlin (2002), Toll-подобные рецепторы являются эволюционно консервативными «сенсорами», с помощью которых макрофагальные клетки обнаруживают полисахаридные антигенные детерминанты.

Рецепция растительных полисахаридов вызывает активацию транскрипционного фактора NF-kappaB, который транслоцируется в ядро макрофагов и промотирует транскрипцию более 100 различных генов. Именно селективная или направленная активация транскрипционного фактора NF-kappaB через Toll-подобные или другие рецепторы, как нам видится, является молекулярной основой создания новых иммуномодулирующих средств.

Рецепция макрофагами растительных полисахаридов, по-видимому, является не единственным путем активации этих клеток. Другой путь может заключаться в неспецифическом связывании макрофагами полисахаридов и последующем их пиноили фагоцитозе. В этом случае растительные полисахариды становятся объектами внутриклеточной атаки со стороны лизосомальных ферментов. В отличие от крахмала и гликогена, большинство вышеуказанных полисахаридов трудно расщепляется ферментными системами высших животных. Незавершенность внутрифагосомного переваривания растительных полисахаридов, вероятно, может служить дополнительным сигналом активации макрофагов.

Особый интерес представляют полученные нами данные по установлению зависимости степени выраженности иммуномодулирующей активности растительных полисахаридов от их структуры: чем больше степень разветвления, тем выше активность полимера. Например, глюканы кардамона настоящего со степенью разветвления (Kbr ) 38,2 и 46.1% проявляют наиболее выраженное действие, тогда как глюканы астрагала перепончатого (Kbr = 0%) и аира болотного (Kbr =7,8%) обладают меньшей эффективностью (рис.5).

Действие испытуемых агентов можно объяснить изменением содержания, так называемых, вторичных мессенджеров, которыми являются циклические нуклеотиды:

циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) и циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ). При этом повышение содержания цГМФ усиливает, а увеличение концентрации цАМФ, напротив, угнетает иммунный ответ (Goldberg N.D. et al., 1976).

Флавоноиды являются ингибиторами цГМФ фосфодиэстеразы, угнетая, таким образом, катаболизм цГМФ и приводя к повышению содержания этого циклического нуклеотида (Ruckstuhl M., Landry Y.,1981). Из этого следует, что растения, содержащие флавоноиды, обладают потенциальной способностью к иммуномодуляции. К таким растениям относятся пятилистник кустарниковый, сабельник болотный, софора желтоватая. Многокомпонентные растительные средства «Иммунополифит», «Фитоуросепт», «Нефрофит» также содержат в своем составе полифенольный комплекс, являющийся их основным действующим началом.

На основании проведенных исследований по оценке иммуномодулирующих свойств флавоноидов, выделенных из софоры желтоватой, установлено, что два доминирующих пренилированных флаванона (софорафлаванон G и кураринон) обладают выраженным иммунопротекторным действием, увеличивая число АОК и интенсивность реакции ГЗТ по сравнению с уровнем супрессии (табл.10).

на антителообразование и выраженность реакции ГЗТ Нами также установлена выраженная иммуномодулирующая активность лигнанового моноглюкозида сирингарезинола из культивируемых клеток скорцонеры испанской в отношении основных звеньев иммунного ответа при азатиоприновой иммуносупрессии, на способ получения которого получен патент РФ (№ 2178709 от 27.01.2002 «Способ получения вещества, обладающего иммуномодулирующей активностью»). Введение мышам глюкозида приводило к увеличению числа АОК в раза и индекса реакции ГЗТ - в 2 раза по сравнению с уровнем супрессии. Испытуемое соединение по выявленному иммуномодулирующему эффекту превосходит препарат сравнения – ЭЭК. Необходимо отметить, что в состав действующих веществ элеутерококка входят диглюкозид сирингарезинола и моноглюкозид сирингина (Оводов Ю.С. и др., 1965, 1967). Иммуномодулирующие свойства последнего были описаны в публикации (Bohm B. et al., 1979). У всех этих веществ в их молекулах присутствует фрагмент, заключенный в рамку на формуле I. Есть основания предположить, что этот фрагмент играет роль иммунотропного фармакофора (рис.1а).

Наши данные по исследованию иммуномодулирующей активности полифенольных соединений и полисахаридов согласуются с данными работы О.С. Борсук и др. (2011), в которой установлено, что курсовое введение мышам полифенольных и полисахаридных соединений, полученных из календулы лекарственной, крапивы двудомной и сафлора красильного, оказывает стимулирующее влияние на гуморальный, клеточный иммунный ответ и неспецифическую резистентность организма, а также способствует коррекции иммуносупрессии, вызванной введением цитостатика циклофосфана.

На основании проведенных исследований по выявлению иммуномодулирующей активности индивидуальных соединений из лекарственных растений можно заключить, что полифенольные соединения и полисахариды являются основными эффективными иммунокорректорами, что позволяет проводить целенаправленный поиск новых эффективных и безопасных иммунокорригирующих препаратов среди веществ растительного происхождения, содержащих в значительных количествах указанные БАВ.

Изменение структуры и функции биологических мембран лимфоцитов является одним из возможных способов модуляции иммунного ответа (Смирнов Л.Д., Сускова В.С.,1989). Перспективной областью исследований является поиск иммуномодуляторов среди синтетических и природных антиоксидантов. Они могут влиять на физикохимические и биологические свойства мембран, а также ограничивать активацию свободнорадикальных реакций, которые играют существенную роль в стимуляции эффекторных клеток иммунитета. Влияние антиоксидантов на молекулярный, клеточный и медиаторный механизмы регуляции иммунной системы обеспечивается наличием у них иммунотропных свойств (Эмануэль Н.М.,1968). По мнению А.В.

Караулова (2002), на сегодняшний день антиоксидантная терапия является пока единственным реальным механизмом воздействия на процессы повреждения ДНК с последующим развитием апоптоза лимфоцитов при заболеваниях, связанных с избыточной продукцией активных форм кислорода. В пользу этого утверждения свидетельствует достижение специфического эффекта восстановления нарушенных функций того или иного звена иммунитета под действием препаратов с антиоксидантной активностью, установленного в работе У.Г. Бочкарева, Ю.В. Сергеева (2000). Как известно, фенольные соединения растительного происхождения (в том числе содержащиеся в комплексе биологически активных веществ испытуемых средств) являются антиоксидантами и при введении в организм инициируют изменения в направлении повышения антиоксидантного потенциала тканей. Очевидно, при этом имеет место непосредственное взаимодействие фенольных антиоксидантов с биополимерами клетки, в итоге которого достигается «разрядка» возбужденных электронных и радикальных состояний последних с восполнением электронных вакансий. В этом процессе полифенолы выступают в роли донора (Громов С.А. и др.,1990). Один из возможных механизмов иммунопротективного действия исследуемых растительных средств на основные звенья иммунной системы в условиях иммуноподавляющего действия АЗ, КН и ПТП связан с наличием у них выраженной антиоксидантной активности. Известно, что ЭПК обладает антиоксидантными свойствами, о чем свидетельствует ингибирующее действие его на процессы ПОЛ в сыворотке крови и гомогенате печени благодаря высокому содержанию в нем комплекса полифенольных соединений (Арьяева М.М.,1998; Николаев С.М.,1991).

Учитывая, что одним из механизмов повреждения мембран иммунокомпетентных клеток при иммунодефицитных состояниях является инициация процессов пероксидации липидов и принимая во внимание антиоксидантные свойства флавоноидов, содержащихся в исследуемых средствах, представляло интерес исследовать влияние моноэкстракта ЭПК и многокомпонентного растительного средства «Нефрофит» на процессы ПОЛ и активность эндогенной АОС при экспериментальных иммуносупрессиях. Так, под влиянием ЭПК и «Нефрофита»

происходило снижение содержания продуктов ПОЛ - ДК, МДА в сыворотке крови и гомогенате селезенки (в среднем на 30% по сравнению с контролем), а также повышение активности ферментов АОЗ организма - каталазы, СОД (в среднем на 40% по сравнению с контролем) при экспериментальных иммуносупрессиях. Выраженная антиоксидантная активность исследуемых средств подтверждается в сериях экспериментов, проведенных с использованием витральных методов. Так, получены данные о выраженной антирадикальной активности ЭПК по отношению к супероксидному анион-радикалу O2•-, ABTS•+-катион-радикалу, радикалам NO, DPPH;

отмечена его высокая общая антиоксидантная емкость и выраженная хелатирующая способность. Таким образом, полученные данные о выраженной антиоксидантной активности испытуемых средств позволяют предположить, что одним из важных аспектов их иммунопротекторного действия является способность ингибировать процессы ПОЛ и стимулировать активность эндогенной АОС, тем самым, стабилизируя мембраны иммунокомпетентных клеток, по-видимому, за счет антиоксидантных, мембраностабилизирующих свойств, преимущественно, полифенольных соединений, входящих в состав испытуемых лекарственных средств. Данные о выраженной антиоксидантной активности полифенольных соединений представлены в работах ряда авторов (Сыров В.Н. и др., 1987; Тутельян В.А. и др., 2003; Антошина С.В. и др., 2005;

Heim K.E. et al., 2002; Pietta P.-G., 2000; Prochzkov D. et al., 2011; Williams R.J. et al., 2011).

Полученные данные впервые обнаруживают не только изменения, происходящие в тимусе мышей сразу после воздействия АЗ, но и последующую динамику изменения морфофункционального состояния органа после введения растительного лекарственного средства - ЭПК. Изучение в динамике параметров функциональных зон тимуса на 5, 10 и 15 сутки после введения ЭПК на фоне Аз выявило изменения, направленные на восстановление архитектоники тимуса. Так, на 5 и 10 сутки эксперимента наблюдается небольшое уменьшение толщины капсулы по сравнению с тем же показателем в группе животных, подвергнутых иммунодепрессии. Однако данная величина остается намного выше контрольного уровня. На 15 сутки эксперимента толщина капсулы, существенно уменьшенная по сравнению с ее изменениями в остром опыте, приближается к контрольным значениям, но полного восстановления данной структуры не происходит. Что касается коркового и мозгового вещества, то частичное восстановление данных структурных компонентов тимуса начинается уже на 5 сутки после введения ЭПК, а к 10 и, в особенности, 15 суткам эксперимента корково-мозговое соотношение максимально приближено к показателям в интактной группе. Результаты исследования влияния ЭПК на показатели размеров структурных компонентов тимуса мышей, подвергнутых действию АЗ, представлены на рис. 2. Разрастания фибробластов в корковом веществе в виде валиков, характерные для опыта с введением АЗ, наблюдаются еще на 5 сутки после введения ЭПК, но уже в виде отдельных, небольших скоплений. На 10 и 15 сутки их наличие не выявлено. На 10 и сутки после введения ЭПК в корковом и мозговом веществе отмечено много мелких сосудов, вокруг которых можно видеть концентрические скопления лимфоидных клеток, что свидетельствует, по-видимому, о высокой миграции клеток и повышении проницаемости сосудов согласно (Серов В.В., Шехтер А.Б., 1981; Хэм А., Кормак Д., 1983). В мозговом веществе количество и диаметр телец Гассаля во все сроки эксперимента были близки к таковым у интактных животных. Обобщая приведенные результаты исследования, можно отметить, что из всех структурных компонентов тимуса мозговое вещество и капсула являются наиболее лабильными. Они в первую очередь подвергаются изменениям. В меньшей степени претерпевают изменения корковое вещество, сосудистая система и тельца Гассаля.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов нами выявлена высокая степень перестройки структуры тимуса мышей в ответ на действие АЗ. Это не может не отразиться на строении и функционировании периферических органов лимфоидной системы, о чем убедительно показано в работах некоторых авторов (Григоренко Д.Е., 1987,1988,1991; Григоренко Д.Е. и др., 1997; Сапин М.Р., Ерофеева Л.М. и др., 1997;

Сапин М.Р., Федоренко Б.С., 1997; Шарова Е.Е., 1989). Выявленная динамика изменений микроанатомии тимуса мышей в результате действия иммунодепрессанта АЗ и последующего введения им ЭПК направлена на восстановление функциональной активности данного органа. Полученные результаты исследования по влиянию ЭПК на микроанатомию тимуса мышей, находящихся в состоянии иммунодепрессии, с помощью морфометрического метода, подтверждают выявленные нами в иммунологических методах иммунокорригирующие свойства ЭПК.

Представляло интерес сравнить активность исследуемых растительных средств с таковой аптечного препарата – ЭЭК. При этом было установлено, что исследуемые средства по выявленному иммуномодулирующему эффекту сопоставимы с таковым экстракта элеутерококка, а по некоторым свойствам (в отношении антителообразования и фагоцитоза макрофагов) они имеют преимущество (табл.1). Это связано, повидимому, с тем, что исследуемые фитосредства созданы на основе современной щадящей ресурсосберегающей технологии, которая обеспечивает максимальную экстракцию действующих биологически активных веществ и наиболее точную их дозировку при применении. Исследуемые экстракты, так же, как и экстракт элеутерококка, не изменяют показатели реакций клеточного, гуморального иммунного ответов и фагоцитоза макрофагов у интактных мышей. Это свойство изучаемых экстрактов очень важно, поскольку оно присуще лишь истинным иммуномодуляторам, обладающим активностью только в условиях повреждения иммунитета.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные в настоящей работе данные свидетельствуют об угнетающем действии АЗ, КН и ПТП на функциональное состояние иммунной системы мышей. Установлено, что наиболее выраженное иммунодепрессивное действие оказывает АЗ, в большей степени угнетая гуморальное и макрофагальное звенья иммунного ответа, тогда как КН и ПТП наиболее выраженное иммунодепрессивное действие проявляют в отношении макрофагального звена иммунитета. Введение мышам АЗ вызывает нарушения морфофункционального состояния иммунной системы, характеризующиеся резким изменением микроанатомии центрального органа иммуногенеза - тимуса интактных животных. Молекулярно-клеточным механизмом в развитии указанных вторичных иммунодефицитных состояний является индукция свободнорадикальных процессов, снижение активности эндогенной АОС и связанная с этим деструкция мембранных структур иммунокомпетентных клеток независимо от природы повреждающего фактора.

Исследование иммунокорригирующей активности растительных средств – ЭПК, ЭСЖ и ЭСБ при экспериментальных иммуносупрессиях выявило их эффективность по отношению к основным звеньям иммунного ответа. Определены особенности иммуномодулирующего действия испытуемых средств и их фармакотерапевтическая направленность при иммунодепрессиях. Показано, что ЭПК наиболее эффективен в отношении клеточного звена, ЭСЖ - гуморального звена, ЭСБ - макрофагального звена иммунного ответа. Эффективность многокомпонентных растительных средств - сухих экстрактов «Иммунополифит», «Фитоуросепт», «Нефрофит» при экспериментальных иммуносупрессиях обусловлена широким разнообразием содержащихся в них БАВ, преимущественно, флавоноидов, дубильных веществ, полисахаридов, витаминов и др.

Установлена выраженная иммуномодулирующая активность индивидуальных соединений из лекарственных растений: моноглюкозида сирингарезинола из скорцонеры испанской, флаванонов из софоры желтоватой (софорафлаванон G и кураринон), а также полисахаридов из растительного сырья при экспериментальной иммунодепрессии. Установлена зависимость степени выраженности иммуномодулирующей активности полисахаридов от их структуры: чем больше степень разветвления, тем выше активность полимера.

Испытуемые растительные средства по выявленному иммунокорригирующему эффекту сопоставимы с таковым препарата сравнения - ЭЭК. Они, так же, как и ЭЭК, не оказывают существенного влияния на показатели реакций клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунного ответа у интактных мышей, что характерно для истинных иммуномодуляторов, эффективных при нарушениях функционального состояния иммунной системы.

Впервые исследованы не только изменения, происходящие в центральном органе иммуногенеза - тимусе в условиях воздействия АЗ, но и последующая динамика изменения морфофункционального состояния органа после введения мышам растительного средства - ЭЭК. Установлена важная роль усиления антигенпрезентирующей функции макрофагов при азатиоприновой иммуносупрессии, повышения продукции противовоспалительных (IL-4, IL-10) и снижения провоспалительного (IL-8) цитокинов мононуклеарными клетками тимэктомированных животных; угнетения супрессорной активности Т-лимфоцитов у иммунизированных животных; снижения продукции стимулированными макрофагами периферической крови здоровых доноров провоспалительных (IL-1, TNF-) цитокинов, стимуляции экспрессии маркеров Т-лимфоцитов (СD4) мононуклеарами здоровых доноров в механизме иммуномодулирующего действия сухого экстракта пятилистника кустарникового.

Показано, что общим молекулярно–клеточным механизмом в действии растительных средств при экспериментальных вторичных иммунодефицитах является их способность стабилизировать мембранные образования клеток, реализация которой связана с ингибированием свободнорадикальных процессов и повышением активности эндогенной АОС под влиянием комплекса полифенольных соединений и полисахаридов, входящих в состав испытуемых лекарственных средств.

Полученные результаты обобщают и конкретизируют роль активации свободнорадикальных реакций в патогенезе иммунодефицитных состояний, обосновывают новый подход к фармакотерапии и фармакопрофилактике иммунодефицитных состояний, заключающийся в использовании лекарственных средств, обладающих антиоксидантными и иммуномодулирующими свойствами, а также содержащих, преимущественно, вещества фенольной природы и полисахариды.

Наличие выраженных иммуномодулирующих свойств у исследуемых растительных лекарственных средств при экспериментальных иммуносупрессиях позволяет рекомендовать их для включения в практику с целью профилактики и лечения иммунодефицитных состояний животных и человека, а также проводить иммунокорригирующих препаратов растительного происхождения.

ВЫВОДЫ

1. Введение животным цитостатика азатиоприна, антибиотика канамицина и туберкулостатиков: изониазида, рифампицина, пиразинамида, стрептомицина приводит к угнетению функционального состояния иммунной системы организма, что выражается в снижении показателей клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунного ответа (массы и клеточности тимуса и селезенки, абсолютного и относительного числа АОК; индексов реакций ГЗТ и РТПХ, фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа по сравнению с данными в интактной группе животных); при этом наиболее выраженное иммунодепрессивное действие оказывает азатиоприн, в большей степени угнетая гуморальное и макрофагальное звенья иммунного ответа, тогда как канамицин и противотуберкулезные препараты наиболее выраженное иммунодепрессивное действие проявляют в отношении макрофагального звена иммунитета. Установлена важная роль индукции свободнорадикальных процессов, снижения активности эндогенной антиоксидантной системы организма и связанной с этим деструкции мембранных структур иммунокомпетентных клеток независимо от природы повреждающего фактора в механизме развития вторичных иммунодефицитных состояний.

2. Введение классического иммунодепрессанта цитостатика азатиоприна вызывает резкие изменения морфофункционального состояния центрального органа иммуногенеза - тимуса мышей, характеризующиеся инволюцией, инверсией слоев и сосудистыми нарушениями, связанными, прежде всего, с уменьшением количества клеток лимфоидного ряда, а также жировым перерождением органа.

3. Курсовое введение животным сухого экстракта пятилистника кустарникового в экспериментально-терапевтических дозах в условиях иммуносупрессии нормализует морфофункциональное состояние тимуса, что выражается в восстановлении структурных компонентов тимуса.

4. Растительные средства – моноэкстракты (сухой экстракт пятилистника кустарникового, сабельника болотного и софоры желтоватой) в экспериментальнотерапевтических дозах обладают выраженными иммуномодулирующими свойствами при экспериментальной азатиоприновой иммунодепрессии, что выражается в увеличении показателей клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунного ответа. Определены особенности иммуномодулирующего действия испытуемых средств и их фармакотерапевтическая направленность при иммунодепрессиях: сухой экстракт пятилистника кустарникового наиболее эффективен в отношении клеточного звена иммунного ответа, сухой экстракт софоры желтоватой гуморального звена, сухой экстракт сабельника болотного - макрофагального звена иммунного ответа.

5. Установлена важная роль усиления антигенпрезентирующей функции макрофагов при азатиоприновой иммуносупрессии, повышения продукции противовоспалительных (IL-4, IL-10) и снижения провоспалительного (IL-8) цитокинов мононуклеарными клетками тимэктомированных животных; угнетения супрессорной активности Тлимфоцитов у иммунизированных животных; снижения продукции стимулированными макрофагами периферической крови здоровых доноров провоспалительных (IL-1, TNF-) цитокинов, стимуляции экспрессии маркеров Т-лимфоцитов (СD4) мононуклеарами здоровых доноров в механизме иммуномодулирующего действия сухого экстракта пятилистника кустарникового.

6. Многокомпонентные растительные средства (сухие полиэкстракты «Иммунополифит», «Фитоуросепт», «Нефрофит») способны отменять супрессивное действие азатиоприна на клеточноопосредованные иммунные реакции, антителогенез и фагоцитоз макрофагов, что выражается в увеличении индекса реакции ГЗТ, абсолютного и относительного числа АОК, фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа. Эффективность их обусловлена широким разнообразием содержащихся в них биологически активных веществ, преимущественно, флавоноидов, дубильных веществ, полисахаридов, витаминов и др.

7. Индивидуальные соединения из лекарственных растений: лигнановый моноглюкозид сирингарезинола из скорцонеры испанской, флаваноны из софоры желтоватой (софорафлаванон G и кураринон), а также полисахариды из аира болотного, астрагала перепончатого, софоры желтоватой, мяты перечной, зопника клубненосного, шлемника байкальского, кардамона настоящего, имбиря лекарственного, лиственницы сибирской обладают иммуномодулирующими свойствами при экспериментальной азатиоприновой иммунодепрессии. Установлена зависимость степени выраженности иммуномодулирующей активности полисахаридов от их структуры: чем больше степень разветвления, тем выше активность полимера.

8. Испытуемые растительные средства по выявленному иммунокорригирующему эффекту сопоставимы с таковым препарата сравнения - экстракта элеутерококка колючего, а по некоторым свойствам (в отношении антителообразования и фагоцитоза макрофагов) они имеют преимущество. Исследуемые средства, так же, как и экстракт элеутерококка, не оказывают существенного влияния на показатели реакций клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунного ответа интактных мышей, что присуще лишь истинным иммуномодуляторам, обладающим активностью только в условиях повреждения иммунитета.

9. Общим молекулярно–клеточным механизмом в иммуномодулирующем действии растительных средств является их способность стабилизировать мембраны иммунокомпетентных клеток, реализация которой связана с ингибированием процессов свободнорадикального окисления липидов (снижение содержания продуктов пероксидации липидов – ДК, МДА в сыворотке крови и гомогенате селезенки), а также повышением активности ферментов антиоксидантной защиты организма (увеличение активности каталазы, СОД) за счет антиоксидантных, мембраностабилизирующих свойств, преимущественно, полифенольных соединений и полисахаридов, входящих в состав испытуемых лекарственных средств.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1.Рекомендуется изучение структурно-функциональных особенностей одного из центральных органов иммуногенеза - тимуса животных в качестве чувствительных и адекватных показателей, отражающих состояние вторичной иммунной недостаточности организма (комплекс структурных изменений и морфометрических данных тимуса может служить критерием при морфологической диагностике выраженности иммунодефицитов).

2. Результаты проведенных исследований по иммунокорригирующему действию растительных лекарственных средств позволяют рекомендовать их для включения в практику с целью профилактики и лечения иммунодефицитных состояний животных и человека в качестве как самостоятельных кормовых и пищевых биологически активных добавок, так и биологически активных компонентов кормового рациона животных и продуктов профилактического назначения.

3.Полученные данные по иммуномодулирующему действию указанных фитосредств позволяют рекомендовать их к применению зооветспециалистами и руководителями животноводческих хозяйств, арендных подразделений для снижения отрицательного воздействия на организм стресс-факторов и профилактики заболеваемости в осеннезимний период при выращивании молодняка сельскохозяйственных животных; для предупреждения острых расстройств пищеварения у новорожденных телят и поросят.

4.Выявленные в ходе выполнения работы данные по направленности в действии растительных моноэкстрактов в отношении того или иного звена иммунного ответа открывают возможность селективной фармакологической иммуномодуляции при заболеваниях, связанных с расстройством определенных функций иммунной системы организма.

5.При фармакотерапии вторичных иммунодефицитных состояний следует отдавать предпочтение лекарственным растительным средствам, обладающим выраженным антиоксидантным свойством и содержащим, преимущественно, вещества фенольной природы и полисахариды.

6.Данные, полученные в ходе анализа иммуномодулирующего действия отдельных фракций, полученных из лекарственных растений, а также индивидуальных соединений – флавоноидов и глюканов являются достаточным основанием для рассмотрения флавоноидов и полисахаридов как перспективных источников для разработки новых иммуномодулирующих лекарственных средств.

7.Полученные результаты могут быть использованы в экспериментальной работе лабораторий научно-исследовательских учреждений, кафедр биологических, медицинских и ветеринарных факультетов высших учебных заведений, занимающихся изучением механизмов развития вторичных иммунодефицитов и вопросами коррекции иммунопатологических состояний природными средствами.

8. Полученные результаты обобщают и конкретизируют роль активации свободнорадикальных реакций в патогенезе иммунодефицитных состояний, обосновывают новый подход к фармакотерапии и фармакопрофилактике иммунодефицитных состояний, что позволяет использовать данные материалы при написании соответствующих разделов руководств, учебно-методических изданий, монографий по патологии, морфологии животных, фармакологии, фитотерапии, иммунологии и патофизиологии, а также в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий на биологических, медицинских и ветеринарных факультетах высших учебных заведений.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Nikolaev S.M. Immunomodulating properties of Tibetan medicine multicomponent phytopreparations / S.M. Nikolaev, V.B. Khobrakova, S.V. Tsyrempilov // Acta Pharmacologica Sinica. - 2006. – V 27. - P.285.

2. Olennikov D.N. Polysaccharides from Fabaceae. V. -Glucan from Sophora flavescens roots / D.N. Olennikov, A.V. Stolbikova, A.V. Rokhin, V.B. Khobrakova, L.M.

Tankhaeva // Chemistry of Natural Compounds. - 2011. - Vol.47. - №1. - P.1-6.

3. Olennikov D.N. Carbohydrates from Lamiaceae. VIII. -Glucane from Scutellaria baicalensis roots / D.N. Olennikov, A.V. Stolbikova, A.V. Rokhin, V.B. Khobrakova // Chemistry of Natural Compounds. - 2011. - Vol.47. - №2. - P.190-193.

Статьи в периодических изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ 4. Хобракова В.Б. Иммуномодулирующие свойства сухого экстракта из побегов Pentaphylloides fruticosa (L.) O. Schwarz / В.Б. Хобракова, С.Д. Жамсаранова, С.М.

Николаев, С.Н. Лебедева, О.Д. Цыренжапова, И.Г. Николаева // Растительные ресурсы. - 2000. - Т. 36. - вып. 1. - С. 45-53.

5. Гончикова С.Ч. Влияние сухого экстракта пятилистника кустарникового на иммунодепрессии, вызванной противотуберкулезными препаратами / С.Ч.

Гончикова, В.Б. Хобракова, О.Д. Цыренжапова // Бюлл. физиологии и патологии дыхания. - 2001. - Вып. 10. - С. 29-31.