«Ю.Г. Базарнова ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ Учебное пособие Санкт-Петербург 2014 1 УДК 001.8:637.07 ББК 36-1 БАЗ17 Базарнова Ю.Г. Теоретические основы методов исследования пищевых ...»

Для многих псевдопластичных, или дилатантных, жидкостей подобная зависимость линейна и описывается уравнением где n – показатель степени этого закона; – кажущаяся вязкость, или коэффициент, консистенции.

Уравнение (8.2) называют степенным законом. Для ньютоновской жидкости n равно единице, а – ее вязкости. Для псевдопластичных жидкостей значение n составляет от нуля до единицы, тогда как в случае дилатантных жидкостей значение n больше единицы.

Пищевые продукты, течение которых можно описать с помощью кривых d (см. рис. 8.1), характеризуются наличием предела текучести, который нужно превысить, чтобы тело приобрело свойство текучести. Подобные материалы при низких значениях напряжения ведут себя как твердые тела, а при высоких значениях – как жидкости.

Для некоторых пищевых смесей (шоколад, кондитерские глазированные изделия) наличие предела текучести является необходимым условием использования определенной технологии.

При отсутствии быстрой кристаллизации или затвердевания покрытия величина предела текучести будет определять его толщину на вертикальной поверхности. Если масса покрытия, отнесенная к площади вертикальной поверхности продукта, т. е. напряжение сдвига, создаваемое самим покрытием, превосходит предел текучести, покрытие будет стекать с продукта.

Для математического описания кривых течения подобных продуктов предложены уравнения Кэссона (Casson) и Гершеля–Бакли (Herschel–Buckley) где у – предел текучести; и – константы.

Уравнение Кэссона широко используется в пищевой промышленности, в частности при производстве шоколада, где оно применяется для моделирования поведения расплавленных шоколадных масс. Уравнение Гершеля–Бакли является модификацией степенного закона за счет внесения поправки предела текучести.

Поскольку внутреннее трение – явление молекулярное, реологические свойства многих пищевых продуктов в значительной степени зависят от температуры. Например, измерения вязкости в температурном диапазоне от 20 до 25 °С показали, что при изменении температуры на один градус вязкость воды изменяется на 2,5 %, а вязкость растительных масел – на 10 %. Поэтому строгий температурный контроль является обязательным требованием для измерения вязкости.

Твердые тела, известные как идеально упругие, дают линейную зависимость между приложенным напряжением и возникающей деформацией. Эта зависимость, известная как закон Гука, характерна для идеально упругого тела:

где – напряжение сдвига, Па; G – модуль сдвига, Па; – деформация, являющаяся безразмерной величиной, здесь L0 – длина тела до деформации; L – после деформации.

Многие сложноструктурированные пищевые продукты обладают одновременно как вязкими, так и упругими свойствами, поэтому их называют вязкоупругими.

Термин «вязкоупругие» обычно применяют к твердым телам, в то время как термин «упруговязкие» используют для описания жидкостей, проявляющих подобные характеристики.

Линейная вязкоупругость – простейший случай вязкоупругого поведения, при котором отношение напряжения к деформации является только функцией времени и не зависит от величины напряжения и деформации.

Если скорость деформации образца постоянна и известна по величине, то накапливающееся напряжение вычисляют по формуле где t – время релаксации.

В случае нелинейной вязкоупругости механические свойства материалов зависят как от времени, так и от величины приложенного напряжения. Теоретическая сложность нелинейной вязкоупругости делает ее малопригодной для практического применения.

Инструментальные измерительные системы, используемые в пищевой реологии, можно условно разделить на фундаментальные и эмпирические.

Фундаментальные системы основаны на создании в материале строго заданного напряжения и измерении деформации (или скорости сдвига) либо измерении напряжения, создаваемого путем приложения строго определенной скорости сдвига.

Основываясь на геометрии приборов, фундаментальные измерительные системы можно разделить на две группы:

– капиллярные вискозиметры, принцип действия которых основан на использовании силы тяжести (гидростатического напора) или давления, создаваемого с помощью поршня либо сжатого газа;

– ротационные вискозиметры, в которых образец находится между вращающимися или колеблющимися поверхностями.

Эмпирические системы позволяют быстро получать результаты, но они произвольны, не строго определены, не имеют абсолютного стандарта и эффективны только для ограниченного числа пищевых продуктов. Как правило, такие измерительные системы используют для измерения деформации и течения при механической нагрузке, в целях последующего определения корреляционных связей с исследуемой характеристикой продукта.

Капиллярные вискозиметры (рис. 8.2) – простейший тип существующих вискозиметров, с помощью которых можно получить абсолютные значения вязкости для ньютоновских жидкостей и ограниченную информацию для жидкостей, подчиняющихся степенному закону [см. уравнение (8.2)].

Рис. 8.2. Вискозиметр Пинкевича (ВПЖТ-4, ВПЖ-4):

1 – трубка; 2 – капиллярная трубка; 3 – отводная трубка; 4 – расширение;

М1 и М2 – метки измерительной части вискозиметра При использовании капиллярных вискозиметров измеряемым параметром является время t, в течение которого фиксированный объем V исследуемой жидкости истекает через капиллярную трубку длиной L. Осевая часть образца жидкости и часть жидкости, контактирующей со стенками трубки, движутся с разными скоростями.

Жидкость течет по капилляру под воздействием силы тяжести, определяемой по разнице гидростатических напоров в двух резервуарах, имеющихся в стеклянном вискозиметре с U-образной трубкой, сжатого газа или плунжера (в капиллярных вискозиметрах высокого давления).

В целях определения расхода жидкости в капилляре или трубке для ньютоновских жидкостей используют уравнение, называемое законом Хагена–Пуазейля (Hagen–Poiseuille):

Уравнение (8.8) связывает скорость потока с создающим поток давлением, при этом многочисленные переменные такой системы представлены в уравнении через константы. Данное уравнение может быть преобразовано в уравнение где – коэффициент вязкости; р – разность давления в капилляре, Н·м2; d – диаметр капилляра, м; L – длина капилляра, м; Q – расход жидкости, вытекающей через капилляр, м3/с.

Поскольку для вискозиметров значения d и L являются фиксированными величинами, то, измеряя Q при известном р, можно вычислить коэффициент вязкости µ.

Рабочий объем жидкости V в капилляре также является фиксированной величиной, поэтому Q можно заменить на отношение V/t, где t – время истечения жидкости через капилляр.

Силой, создающей поток в стеклянном капиллярном вискозиметре с U-образной трубкой, является гидростатический напор, равный gh, где – плотность жидкости, g – гравитационная постоянная, h – разница уровней жидкости в резервуарах системы.

В случае U-образного вискозиметра уравнение (8.9) можно упростить и записать его в следующем виде:

где K – константа для данного прибора; – плотность исследуемой жидкости, кг/м3; t – время, которое требуется для прохождения жидкости через капилляр;

Константа, характеризующая капиллярные стеклянные вискозиметры, включает в себя фиксированные для каждого прибора величины и указывается производителем:

При работе с капиллярными вискозиметрами часто используют альтернативный (так называемый относительный) метод, при котором время истечения исследуемой жидкости через капилляр сравнивают со значениями, полученными для эталонной жидкости известной плотности. При одинаковых условиях отношение вязкости исследуемой и эталонной жидкостей будет равно отношению времени, которое требуется равным объемам этих жидкостей для прохождения через капилляр вискозиметра. Подобным образом эталонные жидкости можно использовать для вычисления или проверки значения K [см. уравнение (8.11)].

Приведенные выше уравнения традиционно используются не только для измерения вязкости, но и для определения скорости течения (расхода) жидкости в трубопроводе путем фиксации падения давления на некоторой секции трубопровода. Однако в случае жидких пищевых продуктов этот метод можно использовать лишь как приближенный, поскольку «неньютоновское поведение» жидких пищевых продуктов требует применения более сложных зависимостей.

Для описания течения сложных жидкостей используют различные варианты уравнения (8.8).

В случае жидкостей, подчиняющихся степенному закону, ламинарный поток через цилиндрическую трубку под действием разницы давлений р описывается следующим уравнением:

где n и k – константы степенного закона.

Часто используют вариант капиллярной вискозиметрии, в котором характеристикой вязкости служит продолжительность истечения определенного (стандартизованного) объема жидкости под действием собственного веса через калиброванный капилляр. Поскольку сопротивление протеканию жидкости по капилляру зависит не только от ее вязкости, в формулы, используемые для расчета, вводят поправки, которые учитывают возможные погрешности, связанные, например, с изменением кинетической энергии струи, с накоплением упругой энергии, разогревом системы.

В ротационном вискозиметре (реометре) исследуемый продукт помещают между двумя поверхностями, из которых одна вращается при проведении испытания (рис. 8.3).

Рис. 8.3. Коаксиально-цилиндрический вискозиметр:

общая схема (а) и различные профили дна – плоский, угловой и углубленный (б) Геометрия этих поверхностей может быть различной: в виде концентрических цилиндров, конуса и плоскости или пары параллельных плоскостей. В зависимости от способа управления вращением эти вискозиметры подразделяются на устройства с регулируемой (контролируемой) скоростью или с регулируемым напряжением.

В устройствах с регулируемой скоростью сдвига контролируют скорость вращения поверхности, а на измеряемой поверхности регистрируют переданный крутящий момент, тогда как в устройствах с регулируемым напряжением контролируемым параметром является крутящий момент, приложенный к одной из поверхностей, а регистрируют результирующую скорость вращения.

Изначально ротационные вискозиметры были запроектированы для проведения измерений при контролируемом напряжении или контролируемой скорости сдвига, однако в настоящее время имеются комбинированные устройства, позволяющие производить измерения в обоих режимах. Вискозиметр «Реотест-RV» (рис. 8.4) является одной из первых моделей этой марки.

Внутри станины 1 прибора установлен синхронный электродвигатель, соединенный с 12-ступенчатой коробкой передач, которая позволяет изменять частоту вращения внутреннего цилиндра 2 от до 1500 с–1. Крутящий момент от коробки передач передается ведущему валу 6 и далее через спиральную пружину 5 – ведомому валу 4, соединенному с внутренним цилиндром 2 муфтой. Наружный цилиндр 3 крепится к корпусу вискозиметра специальным зажимом.

В приборе имеется термостатирующий сосуд. Величина крутящего момента отсчитывается по шкале прибора 8, скорость вращения – по указателю 9. Измеритель моментов торсионного типа с омическими датчиками работает на принципе превращения механических усилий в электрические импульсы. Показания прибора 8 прямо пропорциональны крутящему моменту, а также напряжению сдвига и вязкости исследуемого материала. Частота вращения синхронного электродвигателя и, следовательно, внутреннего цилиндра 2 зависит от напряжения тока в сети. Отклонения от номинальной частоты 50 Гц фиксируются прибором 7.

Пределы измерения: вязкости – от 10–2 до 104 Па · с; скорости сдвига – от 0,1667 до 1,458·103 с–1; напряжения сдвига – от 12 до 3·103 Па;

температуры – от 30 до 150 °С. Погрешность измерений составляет ±3 % (для ньютоновских жидкостей).

1. Дать характеристику реологических методов исследования пищевых продуктов.

2. Перечислить основные понятия реологии.

3. Что такое вискозиметрия?

4. В чем состоят особенности измерения деформации пищевых смесей?

5. В чем состоят особенности измерения вязкости пищевых смесей?

6. Дать краткое описание основных типов вискозиметров.

9. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ

СВОЙСТВ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

Методы исследования люминесцентных свойств вещества основаны на измерении интенсивности свечения (люминесценции) атомов, ионов, молекул при их возбуждении различными видами энергии. При люминесценции происходит испускание света возбужденными частицами:

Переходя в более низкое энергетическое состояние, частица испускает квант света – люминесцирует.

Главным преимуществом измерительных люминесцентных методов является низкий предел обнаружения (менее 10–8 %), в связи с чем методы исследования люминесцентных свойств пищевых продуктов хорошо зарекомендовали себя в качестве экспресс-оценки их доброкачественности.

9.1. Теоретические основы люминесценции Люминесценция характеризуется длительностью возбужденного состояния, которая для различных веществ имеет определенную среднюю величину. Средняя длительность возбужденного состояния определяется свойствами возбужденной частицы и воздействием на нее окружающей среды.

В зависимости от вида источника возбуждения различают термолюминесценцию, редиолюминесценцию, хемилюминесценцию и др.

Чаще всего источником возбуждения люминесценции является свет оптического диапазона ультрафиолетовых и видимых частот, в этом случае явление называют фотолюминесценцией. В зависимости от времени пребывания частиц в возбужденном состоянии различают флуоресценцию и фосфоресценцию.

Флуоресценция – кратковременное свечение ( = 10–710–10 с), которое продолжается только при облучении. Если источник возбуждения устранить, то свечение прекращается мгновенно или не более чем через 10–3 с.

Фосфоресценция – более длительное свечение ( = 10–310–2 с), которое продолжается после отключения источника излучения.

Важной характеристикой люминесценции является квантовый выход, который показывает, насколько эффективно в исследуемом веществе энергия возбуждения преобразуется в люминесценцию.

Квантовый выход L определяется отношением числа излученных квантов возбуждающего света Nf к числу поглощенных веществом квантов света Na:

Размер квантового выхода зависит от концентрации люминесцирующего вещества, температуры, присутствия посторонних примесей. Уменьшение величины L под влиянием этих факторов получило название тушения люминесценции. Оно начинается с некоторой «пороговой» концентрации вещества С0.

Зависимость квантового выхода от концентрации вещества имеет экспоненциальный характер:

где 0 – выход люминесценции при бесконечном разбавлении.

Величина С0 (моль/л) и константа k зависят от природы люминесцирующего вещества. При условии C C0 L = 0.

О концентрации люминесцирующего вещества можно судить по интенсивности его свечения If, которая пропорциональна количеству поглощенной веществом энергии Ia и квантовому выходу L:

Значение Ia можно вычислить из уравнения (9.3).

Зависимость интенсивности люминесценции If от концентрации вещества имеет вид где I0 – интенсивность люминесценции при бесконечном разбавлении;

– молярный коэффициент экстинкции (светопоглощения) вещества, л(моль · см); l – толщина поглощающего слоя, см.

Поскольку, l, I0 – величины постоянные для данного вещества, то при условии С С0 уравнение (9.4) принимает вид Таким образом, зависимость интенсивности люминесценции вещества от его концентрации имеет линейный характер. Эту зависимость используют для количественных определений в люминесцентном анализе.

Одна из основных закономерностей люминесценции заключается в том, что спектр люминесценции (его форма и положение) не зависит от длины волны возбуждающего света.

Согласно правилу Стокса–Ломмеля, максимум спектра излучения вещества всегда сдвинут по отношению к максимуму его спектра поглощения в область больших длин волн.

На рис. 9.1 показаны спектры поглощения и излучения (А) и схема энергетических уровней молекулы тирозина (Б).

Рис. 9.1. Спектры поглощения и излучения (А) и схема энергетических уровней молекулы тирозина (Б) Закон Стокса–Ломмеля выполняется для большинства веществ, поэтому сдвиг максимума спектра люминесценции относительно максимума спектра поглощения дает возможность отфильтровать рассеянную часть возбуждающего света, примешивающегося к люминесценции.

9.2. Применение люминесцентных методов для определения доброкачественности Люминесцентный анализ включает визуальные наблюдения люминесценции или ее регистрацию с помощью приборов. В зависимости от поставленных целей и задач исследования, способов возбуждения и регистрации люминесценции используются различные методы и приемы анализа.

Различают две группы люминесцентных методов – люминесцентные методы обнаружения и физико-химические люминесцентные методы.

Люминесцентные методы обнаружения в основном используются в качестве тестовых экспресс-методов, так как они не требуют количественных измерений и связанных с ними усложнений. К этой группе методов относятся люминесцентный видовой и сортовой анализ, с помощью которого по цвету и яркости свечения устанавливают вид и сорт пищевых продуктов, а также люминесцентную диагностику, заключающуюся в обнаружении начальных признаков порчи пищевых продуктов, наличия примесей, загрязнений и т. д.

Визуальные наблюдения за цветом люминесценции могут быть использованы для диагностики порчи плодов и овощей, определения сорта муки и мяса, обнаружения природы молочных продуктов, пищевых жиров, установления безвредности некоторых продуктов питания.

Здоровый картофель на разрезе имеет желтую флуоресценцию, которая при поражении картофеля фитофторой становится интенсивно голубой, при подмораживании – белой, при поражении кольцевой гнилью – зеленоватой. При появлении вирусных заболеваний цвет люминеции может быть различным и проявляться в сосудистой части клубня.

По изменению цвета флуоресценции свежих плодов и овощей можно обнаружить начало их порчи на очень ранней стадии. Люминесцентный анализ эффективен при сортовом отборе плодов и овощей, направляемых на хранение, а также предназначенных для длительного транспортирования или консервирования.

Некоторые различия по цвету люминесценции имеют растительные масла. Флуоресцентным методом можно обнаружить примесь минеральных масел в растительных. Топленые животные жиры – говяжий, свиной, бараний не флуоресцируют, в то время как коровье масло имеет канареечно-желтый цвет флуоресценции, а маргарин – голубой. Этот признак позволяет определить примесь маргарина в животных жирах. С помощью люминесцентного анализа можно устанавливать также степень окисленности пищевых жиров.

Визуальным наблюдением за люминесценцией можно характеризовать степень свежести яичных продуктов. Например, свежие куриные яйца с белой скорлупой имеют интенсивную красную флуоресценцию, при хранении цвет флуоресценции становится голубым.

В процессе хранения куриных яиц с темной скорлупой в люминесценции появляются голубовато-фиолетовые тона.

С помощью качественного люминесцентного анализа можно определить вид мяса и дать ориентировочную оценку его сортности.

Мышечная ткань мяса животных обладает собственной флуоресценцией красновато-коричневых тонов, причем для мышц говядины характерны бархатистые темно-красные оттенки, для баранины – темно-коричневые, для свинины – светло-коричневые.

При порче мяса изменяется цвет его флуоресценции. На первой стадии порчи на темно-красном флуоресцирующем фоне мышечной ткани говядины появляются зеленые точки, которые расширяются по мере углубления порчи продукта. Несвежие мышцы флуоресцируют темно-красным цветом со сплошным зеленым налетом.

К группе физико-химических люминесцентных методов относятся качественный люминесцентный анализ, с помощью которого устанавливают качественный состав исследуемого продукта, строение и свойства отдельных компонентов, а также количественный люминесцентный анализ, в задачи которого входит определение количественного содержания отдельных компонентов продукта или соотношения его составных частей.

Количественный флуоресцентный анализ основан на выявлении зависимости между интенсивностью флуоресценции и концентрацией люминесцирующего вещества. Этот метод применяется в тех случаях, когда способностью к люминесценции обладает только определяемое вещество. В противном случае определению должны предшествовать операции по выделению и очистке определяемого вещества или маскированию примесей специальными реагентами.

Удобно проводить сравнение интенсивности люминесценции раствора неизвестной концентрации с эталонными растворами.

По концентрации вещества в эталонах рассчитывают содержание вещества в пробе. Можно использовать также предварительно построенный калибровочный график, однако этот метод менее надежен, поскольку интенсивность люминесценции зависит от множества факторов. Поэтому при осуществлении измерений интенсивности люминесценции очень важным является создание идентичных условий для исследуемого и стандартного растворов.

Для количественных определений применяют люминесцентные фотометры, которые часто называют флуориметрами или флуорометрами (рис. 9.2).

Рис. 9.2. Принципиальная схема флуориметра:

1 – источник УФ-излучения; 2 – первичный светофильтр; 3 – кювета с исследуемым образцом; 4 – вторичный светофильтр; 5 – фотоэлемент;

6 – электронный усилитель; 7 – миллиамперметр Сила тока, возникающего в цепи фотоэлемента, пропорциональна световому потоку люминесценции, падающему на фотоэлемент.

Предварительная градуировка шкалы прибора позволяет измерять интенсивность люминесценции без использования эталонов.

Фотоэлектрические измерения интенсивности люминесценции позволяют судить о степени свежести рыбы и мяса.

Предложены люминесцентные параметры свежести рыбы в области 360–365 нм. В соответствии с этими параметрами рыбу делят на два типа. К первому типу относят виды рыб со слабыми люминесцентными свойствами: карп, судак, щуку, треску, окунь; ко второму типу – виды рыб с выраженными люминесцентными свойствами, например палтус.

Ниже приведены значения интенсивности люминесценции и критерии свежести рыбы различных типов.

Сомнительной свежести ………………. 60–80 120– Усовершенствованный люминесцентный фотометр, предназначенный для определения свежести рыбы, позволяет проводить экспресс-анализ непосредственно на поверхности тушек и может быть использован при сортировке рыбы по качеству.

С помощью количественного люминесцентного анализа можно определять концентрацию исследуемого вещества в растворе.

Люминесценция широко используется для определения белков и жиров в молоке, а также витаминов группы В и фолиевой кислоты в пищевых продуктах.

Белки молока обладают собственной (первичной) флуоресценцией в УФ-области спектра. Интенсивность люминесценции в максимуме 340–350 нм пропорциональна концентрации белков в молоке.

Витамин В1 (тиамин, или аневрин) не обладает собственной (первичной) флуоресценцией, однако в щелочной среде он легко окисляется с образованием тиохрома, растворы которого в щелочной среде флуоресцируют синим цветом с максимумом при 460–470 нм.

Для определения витамина В1 навеску продукта подвергают гидролизу. Если в продукте тиамин содержится преимущественно в свободном виде, то ограничиваются кислотным гидролизом. Для определения связанной формы витамина В1 проводят ферментативный гидролиз. Из раствора тиамин выделяют адсорбцией на стеклянной хроматографической колонке, заполненной силикагелем, с последующим элюированием витамина В1 из адсорбента кипящим подкисленным раствором КСl. Затем тиамин окисляют щелочным раствором К3Fe(CN)6 до тиохрома. Спиртовый раствор тиохрома отделяют и измеряют интенсивность люминесценции с помощью флуорометра, снабженного первичным светофильтром, который пропускает УФ-излучение в диапазоне 320–390 нм, и вторичным светофильтром с полосой пропускания 400–580 нм.

Витамин В2 присутствует в пищевых продуктах в четырех формах: в виде свободного рибофлавина, мононуклеотида и флавинадениндинуклеотида рибофлавина, а также прочно связанного с белком нуклеотида. Нейтральные водные или спиртовые растворы свободного рибофлавина и его мононуклеотида флуоресцируют желто-зеленым цветом, полоса флуоресценции находится в области 513–613 нм с максимумом при 565 нм.

Флуоресцентные методы незаменимы для обнаружения и количественного определения полициклических ароматических углеводородов (ПАУ). Определение бензпиррена и других канцерогенных ПАУ проводят по тонкой структуре спектра флуоресценции при низких значениях температуры.

Первичной флуоресценцией обладают также некоторые пестициды, например варфалин, потозон, индолинуксусная кислота, нафтилацетат и др. Пестициды, не обладающие первичной люминесценцией, в том числе ДДТ, метоксихлор, альдрин, хлордан, гептахлор и другие, могут быть химическим путем переведены во флуоресцирующие соединения. Например, инсектицид 0,0-диэтил-0-нафтилимидотиофосфат можно определить с помощью люминесцентных методов, предварительно окислив его во флуоресцирующее соединение.

1. Дать краткое описание основных характеристик люминесценции.

2. Что такое фосфоресценция?

3. Что такое флуоресценция?

4. Перечислить методы люминесцентного анализа и привести примеры их применения для определения доброкачественности пищевого сырья.

5. Привести примеры применения флуориметрического анализа для оценки свежести пищевых продуктов.

10. ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

Электрохимические методы исследования основаны на изучении процессов, протекающих на поверхности электрода или в электродном пространстве электролитической ячейки.

Любой электрический параметр, например потенциал, сила тока, сопротивление, функционально связанный с концентрацией анализируемого вещества, может служить аналитическим сигналом, если они измерены с достаточной точностью.

При отсутствии электрического тока в замкнутой гальванической цепи на межфазной границе устанавливается равновесие, потенциал достигает равновесного значения. Если через ячейку проходит электрический ток, то на границе раздела фаз протекают химические реакции, сопровождающиеся окислением или восстановлением компонентов системы.

В состав электролитической ячейки входят два электрода – индикаторный, или рабочий, электрод и электрод сравнения.

Электрод, используемый как датчик, является индикаторным. Индикаторный электрод должен быстро и обратимо реагировать на изменение концентрации определяемого иона.

Электрод сравнения служит для создания измерительной цепи и определения потенциала рабочего или индикаторного электрода.

На практике обычно и индикаторный электрод, и электрод сравнения погружают в анализируемый раствор. Иногда оба электрода размещают в одном корпусе. В этом случае их помещают в стеклянный цилиндр, заполненный раствором электролита, который отделен от анализируемого раствора диафрагмой.

Возможно использование двух видов электрохимических методов – прямых и титриметрических.

Прямые электрохимические методы основаны на зависимости аналитического сигнала и химического состава вещества.

В титриметрических электрохимических методах аналитический сигнал служит для определения точки эквивалентности. Поэтому их целесообразно использовать в тех случаях, когда зависимость между аналитическим сигналом и составом вещества имеет сложный характер.

В табл. 10.1 приведена классификация электохимических методов анализа согласно измеряемому параметру электрохимической ячейки.

Классификация электрохимических методов по измеряемому параметру электрохимической ячейки Удельная электропроводность, См I ~ 1000 Гц Кондуктометрия С помощью электрохимических методов можно определять концентрацию исследуемого компонента в пробе с точностью от 10 – до 1 моль/л.

Кондуктометрический метод используют в двух разновидностях: как прямую кондуктометрию и как кондуктометрическое титрование.

Метод прямой кондуктометрии основан на нахождении зависимости между электропроводностью и концентрацией исследуемого иона в растворе. Недостаток метода состоит в том, что электропроводность зависит от ионной силы раствора.

Кондуктометрическое титрование основано на кислотно-основном равновесии раствора. При титровании сильной кислоты сильным основанием электропроводность раствора сначала резко уменьшается, так как уменьшается количество ионов водорода в растворе. Точка эквивалентности соответствует минимальному значению электропроводности раствора, после чего происходит ее возрастание.

Аналогично при титровании слабого основания (или слабым основанием) точку эквивалентности определяют по излому кривой титрования. Если излом на кривой не выражен, то линейные участки кривой с обеих сторон от предполагаемого излома продлевают, а точкой эквивалентности считают точку их пересечения.

Достоинством кондуктометрического титрования относительно индикаторного метода является большая объективность, возможность титрования мутных и окрашенных растворов, для которых визуализация перехода окраски индикатора затруднена или невозможна.

Потенциометрический (ионометрический) метод основан на определении зависимости между электродным потенциалом и концентрацией (активностью) определяемых ионов.

В основу потенциометрического метода положено уравнение Нернста:

где Е – электродный потенциал в данных условиях, эВ; Е0 – стандартный электродный потенциал при температуре 298 К и активности (концентрации) всех веществ, входящих в уравнение полуреакции, равной 1 моль/дм3; R – универсальная газовая постоянная, R = 8,31 Дж(моль · К); F – постоянная Фарадея, F = 96 500 Кл/моль;

n – число электронов, принимающих участие в данной полуреакции;

aокисл – произведение активности всех веществ в системе, находящихся в окисленной форме (левая часть полуреакции); aвосст – произведение активности всех веществ в системе, находящихся в восстановленной форме (правая часть полуреакции).

При низкой ионной силе раствора вместо активности с достаточной точностью можно использовать значения молярной концентрации веществ.

Таким образом, электродный потенциал пропорционален логарифму активности (концентрации) реагирующих веществ. Между тем, чтобы измерить потенциал электрода, необходимо создать электрохимическую ячейку, в которой потенциал измерительного электрода будет зависеть от концентрации исследуемого вещества, а потенциал электрода сравнения известен или легко определяется в ходе контрольного опыта. В этом случае ЭДС (разность потенциалов) тоже будет пропорциональна логарифму активности (концентрации) исследуемого вещества.

На рис. 10.1 показана установка для потенциометрических определений.

В качестве электродов сравнения чаще всего используют каломельный (Е0 = 0,2241 эВ) и хлоридсеребряный (Е0 = 0,198 эВ) электроды (рис. 10.2).

Рис. 10.1. Установка для проведения потенциометрических измерений Рис. 10.2. Схема электролитической ячейки, состоящей из водородного и каломельного электродов Хлоридсеребряный электрод представляет собой тонкую серебряную проволоку, покрытую слоем хлорида серебра и погруженную в раствор хлорида калия.

Для определения рН растворов в качестве индикаторных электродов используют водородный либо стеклянный электрод. В стеклянном электроде, как и в хлоридсеребряном, имеется серебряная проволока, покрытая хлоридом серебра и погруженная в раствор 0,1 М соляной кислоты. Электрод отделен от измерительной системы стеклянной мембраной, проницаемой только для ионов водорода.

Если рН раствора выше рН электрода, то ионы водорода переходят в раствор, заряжая электролит внутри мембраны отрицательно, а вне мембраны – положительно. Избыток отрицательного заряда электролита вызывает сдвиг равновесия полуреакции, при этом анионы хлора связываются с металлическим серебром в хлорид серебра, сообщая электроду избыточный отрицательный заряд. Таким образом, потенциал стеклянного электрода пропорционален рН раствора.

При измерениях рН следует иметь в виду, что эта величина связана с активностью ионов водорода, а не с их равновесной концентрацией. Поэтому при выполнении измерений целесообразно использовать стандартные растворы с известным значением рН.

В качестве таких растворов используют:

– раствор тригидрооксалата калия КН3 (С2О4)2 · 2 Н2О; С = 0,05 М (pH 1,680);

– насыщенный раствор гидротартрата калия (рН 3,557);

– раствор гидрофталата калия; С = 0,05 М (рН 4,008);

– смесь растворов КН2РО4 и Nа2НРО4, для каждого из которых С = 0,025 М (рН 6,865);

– раствор тетрабората натрия Nа2В4О7 · 10 Н2О; С = 0,011 М (рН 9,180);

– насыщенный раствор гидроксида кальция (рН 12,454).

Кроме указанных растворов, используют буферные смеси, имеющие целочисленные значения рН.

В настоящее время получили распространение ионоселективные электроды, принцип действия которых подобен стеклянному электроду. В них используются кристаллические или ионообменные мембраны, а также жидкие ионообменники. Они обеспечивают установление разности потенциалов между внутренним вспомогательным электродом и внешним раствором, которая обусловлена присутствием иона, находящегося в равновесии с мембраной.

Однако для успешного проведения потенциометрических определений с помощью ионоселективных электродов необходимо сначала использовать прием маскировки мешающих ионов, например осаждение.

В случае прямых потенциометрических определений измеряемым параметром является ЭДС ячейки, с помощью которой определяют логарифм концентрации исследуемого иона. Зачастую линейная зависимость ЭДС и логарифма концентрации реагирующих веществ отсутствует, поэтому перед определением проводят градуировку прибора либо строят градуировочный график.

Метод потенциометрического титрования не требует установления точной зависимости между концентрацией исследуемого иона и ЭДС ячейки. Чаще всего метод используют для потенциометрических определений кислотности.

Поскольку ЭДС ячейки, состоящей из стеклянного электрода, линейно зависит от рН, кривая титрования будет максимально приближена к классической (теоретической) кривой титрования, для которой определение точки эквивалентности поддается расчету.

В случае проблем с фиксацией точки эквивалентности, например при очень малом скачке титрования, выполняют построение дифференциальной кривой, максимум которой соответствует точке эквивалентности.

При правильном выборе измерительного электрода потенциометрическое титрование можно проводить даже в тех системах, для которых методы кондуктометрического и индикаторного титрования неприменимы.

Вольтамперометрический (полярографический) метод основан на том, что электрический ток в электрохимической ячейке возникает только в случае разряда ионов в электролите. Соответственно, если увеличивать потенциал рабочего электрода, то сила тока будет возрастать линейно, однако его величина будет очень мала. При достижении разности потенциалов, достаточной для разряда, на полярограмме фиксируют резкое возрастание силы тока (скачок). Положение этого скачка характеризует природу разряжаемого вещества (деполяризатора). Если концентрация исследуемого вещества в растворе велика, то после скачка сила тока в ячейке будет значительно выше начальной. Область применения полярографии для количественных определений ограничена использованием очень разбавленных растворов деполяризатора.

Для снижения сопротивления в систему вносят фоновый раствор – электролит высокой концентрации, деполяризуемый, как правило, значительно раньше исследуемого вещества. В такой системе поляризационная кривая будет иметь характерный пик, высота которого прямо пропорциональна концентрации деполяризатора.

Для осуществления вольтамперометрического титрования используют специальные электроды – рабочий (индикаторный) электрод и электрод сравнения.

В качестве рабочих используют электроды с малой поверхностью, чаще всего платиновый, графитовый или ртутный. Отдельно следует упомянуть ртутно-капельный электрод, рабочей поверхностью которого является ртутная капля, вытекающая из капилляра, в связи с чем поверхность рабочего электрода постоянно обновляется, что обеспечивает максимальную точность метода. В этом случае метод называют полярографией. Поверхность электрода сравнения достаточно большая, а его потенциал поддерживается постоянным и условно принимается равным нулю.

1. Охарактеризовать принципы классификации электрохимических методов анализа.

2. Дать характеристику кондуктометрических методов исследования.

3. Дать характеристику потенциометрических методов исследования.

4. Привести описание индикаторных электродов и электродов сравнения.

5. Привести краткое описание принципов измерения активной кислотности (рН) пищевых продуктов.

6. Дать характеристику вольтамперометрических методов исследования.

11. СПЕКТРАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

Спектральные методы анализа основаны на взаимодействии электромагнитного излучения (квантов света) с веществом.

Спектральный анализ с высокой точностью характеризует состав вещества, отличается высокой избирательностью, универсальностью и чувствительностью. С его помощью можно исследовать любые вещества в различных агрегатных состояниях. Практическая значимость спектральных аналитических методов заключается в возможности осуществления автоматического контроля измеряемых параметров.

Электромагнитное излучение представляет собой вид энергии, который распространяется со скоростью света (3 ·108 м/с в вакууме) и имеет двойственную природу – волновую и квантовую. Электромагнитное излучение характеризуется электрическим и магнитным векторами, которые колеблются в двух взаимно перпендикулярных плоскостях.

Волновые характеристики электромагнитного излучения – длина волны (м) и частота излучения (с–1).

Длина волны характеризует расстояние между двумя точками, колеблющимися в одной фазе, и изменяется в широких пределах:

от 10–12 м до 102 м.

Частота электромагнитного излучения – это число полных волновых циклов за 1 с (или число длин волн в 3 108 м):

Квантовая характеристика электромагнитного излучения Е, Дж/моль, – это энергия квантов света (фотонов):

где h – постоянная Планка, h = 6,63 · 10–34 Дж · с.

Спектральные методы позволяют регистрировать и исследовать сигналы в различных областях спектра электромагнитного излучения. В табл. 11.1 приведены классификация спектральных методов исследования согласно процессам, индуцируемым воздействием электромагнитного излучения на вещество, а также волновые и квантовые характеристики излучения.

Радиочастотная:

ЯМР-спектроскопия ЭПР-спектроскопия вращательная спектроскопия ИК-спектроскопия в молекулах оптическая спектроскопия валентных рентгеновская спектроскопия внутренних ядерная гамма-резонансная ядер спектроскопия Совокупность фотонов, испускаемых или поглощаемых при переходе атома или молекулы из одного энергетического состояния в другое, соответствует спектральной линии.

Совокупность длин волн электромагнитного излучения (спектральных линий), относящихся к определенному атому (молекуле), называется спектром данного атома (молекулы).

Помимо длины волны спектральная линия имеет еще одну очень важную характеристику – интенсивность.

Интенсивность спектральных линий зависит от вероятности электронных переходов и от заселенности уровней, начальных для этих переходов. Очевидно, что чем больше число возбужденных атомов (молекул), тем более интенсивна спектральная линия. Поглощение или испускание квантов веществом можно преобразовать в характеристический сигнал, дающий информацию о его качественном и количественном составе. При этом частота (длина волны) излучения отражает качественный состав вещества, а интенсивность аналитического сигнала пропорциональна количественному составу определяемого компонента.

В практике спектрального анализа интенсивность спектральных линий измеряют относительно интенсивности спектральных линий вещества, выбранного в качестве эталона.

В зависимости от характера взаимодействия излучения с веществом и способа его регистрации различают следующие виды спектрального анализа:

– атомную спектроскопию – анализ, основанный на регистрации спектров испускания предварительно возбужденных атомов (атомноэмиссионная спектроскопия) и спектров поглощения атомов в основном состоянии (атомно-абсорбционная спектроскопия);

– молекулярную абсорбционную спектроскопию – анализ спектров поглощения электромагнитного излучения после прохождения его через раствор исследуемого вещества.

Атомная спектроскопия широко используется для качественного и количественного анализа элементного состава пищевых продуктов. Метод основан на поглощении или испускании рентгеновского, видимого или УФ-излучения.

Методы атомной спектроскопии отличаются высокой избирательностью, чувствительностью, скоростью. Во всех случаях характер образующихся спектров обусловлен квантовыми переходами внешних (валентных) или внутренних электронов атома из одного энергетического состояния в другое.

Наиболее отличительные свойства атомных спектров – их дискретность (линейчатая структура) и индивидуальный характер – делают такие спектры опознавательным признаком атомов данного элемента. Эту особенность атомных спектров используют для идентификации элементов в анализируемой пробе.

Концентрацию анализируемого элемента в пробе определяют путем измерения интенсивности отдельных спектральных линий, называемых аналитическими.

Для получения спектра эмиссии частицам анализируемого вещества необходимо сообщить дополнительную энергию. С этой целью пробу вносят в источник излучения, где она нагревается и испаряется. Вследствие высокой температуры источника молекулы вещества диссоциируют на атомы, которые при столкновениях с электронами ионизируются и возбуждаются:

В возбужденном состоянии атомы могут находиться около 10–8 с.

Переходы с различных возбужденных уровней на основной приводят к появлению в спектре испускания серии спектральных линий, соответствующих этим электронным переходам. Например:

Атомизация …………………………. NaCl Na + Cl Возбуждение ………………………... Na Na*(3s 3p) Излучение …………………………... Na* Na + h (3p 3s) Электронные переходы с вышележащих уровней на основной называют резонансными, причем резонансный переход с близлежащего возбужденного уровня соответствует, как правило, наиболее яркой линии спектра.

Возможность тех или иных переходов определяется квантовомеханическими правилами отбора. Помимо основного требования по совпадению между поглощаемой энергией и энергией перехода, запрещенными являются переходы с изменением спина электрона.

Кроме того, электронные переходы разрешены только между теми орбиталями, для которых различие орбитальных квантовых чисел равно единице. Наконец, запрещенными являются переходы, при которых происходит возбуждение более чем одного электрона.

Количество разрешенных электронных переходов определяет число линий в спектре элемента и, следовательно, его сложность, что, в свою очередь, оказывает влияние на простоту выполнения качественного эмиссионного спектрального анализа.

Принцип метода пламенной фотометрии заключается в распылении исследуемой пробы с помощью сжатого воздуха в высокотемпературном пламени.

Излучение направляют в спектральный прибор, где его пропускают через светофильтр или монохроматор. Попадая на детектор (фотоэлемент), излучение вызывает фототок, который после усиления измеряют регистрирующим прибором.

Повышение температуры пламени увеличивает интенсивность спектральных линий, а следовательно, увеличивает чувствительность анализа. Температура пламени используемых газовых смесей составляет:

Для определения концентрации вещества методом атомноэмиссионной фотометрии пламени необходимы эталоны, химический состав и физические свойства которых должны быть как можно ближе к составу и свойствам анализируемых проб.

Для количественных определений строят градуировочный график, представляющий зависимость величины фототока I (мкА) от концентрации определяемого элемента С (мкг/мл).

Независимо от выбранного способа определения концентрации элемента предварительно устанавливают наличие линейной зависимости между током и концентрацией. Метод используют для определения примерно 50 элементов. Чувствительность метода фотометрии пламени составляет около 10–3 мкг/мл (щелочные металлы) и 10–1 мкг/мл (другие элементы).

Сущность метода атомно-абсорбционной спектрометрии заключается в измерении поглощения резонансного излучения невозбужденными атомами определяемого элемента, которые находятся в газовой фазе, и определении функциональной зависимости интенсивности поглощения от концентрации определяемого элемента в анализируемой пробе.

Через анализируемую пробу, помещенную в высокотемпературное пламя, пропускают монохроматический свет. Энергию источника подбирают таким образом, чтобы она точно соответствовала энергии резонансного электронного перехода. Очевидно, что поглощать энергию источника будут атомы, находящиеся в основном состоянии.

На рис. 11.1 показана принципиальная схема атомно-абсорбционного спектрофотометра.

Рис. 11.1. Схема двухлучевого атомно-абсорбционного спектрофотометра:

1 – лампа с полым катодом; 2 – модулятор; 3 – зеркало; 4 – щелевая горелка;

5 – пламя; 6 – тонкая пластинка; 7 – входная щель монохроматора;

8 – дифракционная решетка; 9 – выходная щель; 10 – фотоумножитель;

В настоящее время в качестве источников света для атомноабсорбционного анализа используют газоразрядные лампы, спектр испускания которых совпадает со спектром определяемого атома.

Конструкция ламп такова, что в спектре испускания интенсивно проявляются спектральные линии атомов, входящих в состав материала катода или веществ, специально помещенных в полость катода.

Обычно каждая лампа для атомно-абсорбционного анализа дает спектр испускания атомов какого-либо одного элемента. Поэтому при определении нескольких элементов в пробе необходимо иметь набор ламп для различных элементов.

При выполнении атомно-абсорбционного анализа выбирают в спектре испускания резонансную линию и определяют ослабление ее интенсивности при прохождении излучения через слой поглощающих атомов. Для отделения выбранной спектральной линии от других линий в спектре испускания источника излучения применяют монохроматор.

Метод атомно-абсорбционной спектрометрии высокоэкспрессен, характеризуется низкими пределами обнаружения – от 0, до 0,005 мкг/мл и позволяет определять более 60 элементов с погрешностью до 5 %.

11.2. Молекулярная абсорбционная спектроскопия Метод молекулярной абсорбционной спектроскопии основан на поглощении электромагнитного излучения молекулами анализируемого вещества.

Молекулярные спектры поглощения в отличие от атомных состоят из более широких полос, так как представляют собой сумму различных типов переходов молекулы из основного состояния в возбужденное.

В молекулярных спектрах поглощения заложена обширная и ценная информация о природе и состоянии молекулы в целом, поэтому молекулярная спектроскопия широко применяется для установления качественного (ИК-спектроскопия) и количественного (фотометрия) состава вещества.

Молекулярный абсорбционный анализ используют главным образом для определения компонентов, характеризующих пищевую и биологическую ценность продуктов (белков, углеводов, жиров, витаминов, кислот, минеральных веществ и др.), а также для оценки глубины процессов, протекающих при производстве и хранении продуктов (гидролиза, окисления, денатурации).

В зависимости от используемой области спектра излучения внешнего источника различают:

– УФ-спектроскопию – абсорбционный анализ в ультрафиолетовой области спектра (10–400 нм);

– спектроскопию в видимой области спектра (400–780 нм);

– ИК-спектроскопию – абсорбционный анализ в инфракрасной области спектра (от 0,8 до 100 мкм).

По характеру регистрируемого излучения, технике измерений и используемой аппаратуре в абсорбционном анализе выделяют:

– колориметрический метод – основан на ослаблении (уменьшении) интенсивности излучения, прошедшего через исследуемый раствор, определяемой визуально относительно стандартного раствора;

– фотоколориметрический метод – основан на поглощении прошедшего через светофильтр излучения и фотоэлектрической регистрации светового потока после его прохождения через исследуемый раствор;

– спектрофотометрический метод – отличается от фотоколориметрического метода тем, что через исследуемый раствор пропускается последовательно излучение каждого из участков спектра, т. е.

монохроматическое излучение.

На рис. 11.2 показана схема однолучевого фотометра для проведения фотоколориметрических измерений.

Рис. 11.2. Схема однолучевого фотоэлектроколориметра:

1 – источник света; 2 – линза; 3 – светофильтр; 4 – кювета с раствором сравнения; 4 – кювета с исследуемым раствором; 5 – фотоэлемент;

При поглощении излучения молекулы переходят в возбужденное состояние:

Этот процесс сопровождается переходом валентных электронов на более высокоэнергетические электронные уровни. Электронные переходы связаны с поглощением строго определенных порций энергии, которая колеблется от 100 до 600 кДж/моль.

Помимо электронных переходов, в молекуле происходят колебательные переходы, связанные с изменением длин связей и валентных углов, так как ядра атомов не фиксированы, а также вращательные переходы, связанные с вращением молекулы как отдельной частицы вокруг определенных осей.

Существование у каждого из электронных состояний молекулы колебательных и вращательных уровней энергии приводит к тому, что электронный переход в спектре оказывается представленным не одной линией (как в случае атомов), а сложной системой линий, принадлежащих разным электронно-колебательно-вращательным переходам (рис. 11.3).

Рис. 11.3. Схема энергетических уровней двухатомной молекулы:

а и б – электронные уровни; ' и " – квантовые числа колебательных уровней;

Таким образом, молекулярный спектр представляет собой серию близколежащих спектральных линий. Волновое число линии такого спектра описывается выражением где эл – разность электронных энергий молекулы в минимумах поверхности потенциальной энергии молекулы; кол и вр – разность энергий, соответствующая для колебательных и вращательных уровней.

Основным законом, используемым в количественном абсорбционном анализе, является закон Ламберта–Бугера–Бера, связывающий интенсивность света, прошедшего через слой раствора светопоглощающего вещества, с концентрацией вещества и толщиной светопоглощающего слоя:

где I, I0 – интенсивность падающего света и прошедшего света, квант/(с · см2); – молярный коэффициент экстинкции (светопоглощения) вещества при длине волны, л/(моль · см); С – концентрация вещества в растворе, моль/л; l – толщина светопоглощающего слоя, см.

Отношение интенсивности падающего и прошедшего через исследуемый раствор света называют пропусканием Т, а отрицательный десятичный логарифм пропускания – оптической плотностью D:

Преобразуя выражение (11.2), получаем Оптическая плотность (светопоглощение) зависит от природы вещества и растворителя, температуры и длины волны возбуждающего света и используется в количественном абсорбционном анализе.

Спектр поглощения вещества представляет собой графическую зависимость оптической плотности от длины волны (частоты) возбуждающего света и характеризуется положением максимума max, которое определяет энергию электронного перехода.

Этапы количественного фотометрического анализа включают:

– перевод определяемого вещества в окрашенную форму;

– получение спектра поглощения исследуемого вещества и выбор спектральной области, соответствующей максимуму полосы поглощения определяемого компонента;

– получение зависимости оптической плотности раствора от концентрации вещества, взятого в качестве стандарта при длине волны max;

– определение концентрации вещества.

Закон Ламберта–Бугера–Бера применим только для монохроматического света, пучок которого должен проходить через раствор строго параллельно. Для устранения явлений рассеивания и преломления света, искажающих результаты фотометрических измерений, используют прозрачные растворы умеренных концентраций.

Источниками ошибок в абсорбционном анализе являются недостаточная монохроматизация света и процессы полимеризации, агрегации и образования окрашенных комплексов в исследуемом растворе, искажающие точность фотометрических измерений.

Допустимое отклонение температуры опыта составляет около ±2 С.

11.3. Молекулярный абсорбционный анализ Молекулярный абсорбционный анализ в инфракрасной (ИК) области спектра принципиально не отличается от анализа в ультрафиолетовой и видимой областях. В основе его лежит взаимодействие вещества с электромагнитным излучением больших длин волн.

Излучение с длиной волны от 2,5 до 500 мкм ( – от до 200 см–1) вызывает изменение длин связей и валентных углов.

Такое излучение сообщает молекуле энергию, достаточную только для электронных переходов между вращательными и колебательными уровнями.

ИК-спектры большинства сложных органических веществ включают значительный набор полос поглощения, относящихся к различным функциональным группам.

ИК-спектроскопия оказывается полезной в качестве дополнительного метода при проведении идентификации веществ после хроматографического разделения сложных смесей, поскольку ИК-спектр более точно характеризует вещество, чем температура плавления, показатель преломления или плотность. При этом наличие эталонов не является обязательным, достаточно сопоставить полученные результаты с имеющимися в литературе справочными данными. Для этого необходима только информация, к какому классу относится определяемое вещество.

Колебания атомов в молекуле называют нормальными, если центр тяжести молекулы не смещается, т. е. молекула не испытывает поступательного движения. Нормальные колебания связанных атомов подразделяют на два основных вида – валентные и деформационные.

Если при колебании происходит изменение длин связей, а углы между ними изменяются незначительно, то колебания называются валентными и обозначаются.

Если наблюдается заметное изменение углов связей, а длины связей изменяются мало, то колебания относят к деформационным и обозначают. Деформационные колебания обусловлены меньшими затратами энергии, чем валентные, поэтому им соответствуют полосы, отвечающие меньшим волновым числам.

Интенсивность полос поглощения в ИК-спектрах зависит от электроотрицательности атомов. Так, полосы поглощения веществ, состоящих только из атомов углерода и водорода, являются слабыми, так как разница электроотрицательности этих атомов мала (н = 2,1;

с = 2,5).

Полосы поглощения, относящиеся к связям, соединяющим атомы, электроотрицательность которых значительно различается между собой, например атомы углерода и азота или углерода и кислорода, обычно довольно интенсивны. Интенсивные полосы используют для идентификации функциональной группы только в том случае, если они проявляются в области, характерной для данной группы. Такие полосы называются характеристическими полосами, или характеристическими частотами.

Характеристическая частота ОН-группы – 3630–3610 см–1, а карбонильной группы С=О – 1900–1580 см–1. Однако каждый класс карбонильных соединений дает полосы поглощения в узком интервале частот. Например, муравьиный альдегид – в интервале 1745–1740 см–1, а альдегиды жирных кислот – в интервале 1740–1720 см–1.

Сложные эфиры насыщенных жирных кислот характеризуются полосами поглощения в области 1750–1735 см–1, а ароматические эфиры – в области 1730–1715 см–1. Инфракрасный спектр аминокислот характеризуется полосами поглощения, присущими обеим функциональным группам их молекул: карбоксильной (в области 1600–1560 см–1) и аминогруппы (в области 3130–3030 см–1).

На колебание атомов в молекуле оказывают воздействие соседние атомы и связи, поэтому положение и интенсивность характеристических полос функциональных групп могут изменяться.

Вследствие этого в справочных таблицах максимуму характеристической полосы поглощения соответствует интервал частот. Изменение положения полосы поглощения в зависимости от окружения данной группы в молекуле используется для установления строения вещества.

Исследование вещества методом ИК-спектроскопии включает три этапа: подготовку образца, регистрацию спектра и его расшифровку.

В качестве растворителей чаще всего используют четыреххлористый углерод или сероуглерод. Многие вещества, не растворяющиеся в этих растворителях, фотометрируют в виде суспензий в вазелиновом масле, тонких пленках, образующихся после испарения растворителей, или прессованных таблеток с бромидом калия.

Инфракрасные спектры являются полным и однозначным источником информации о составе и структуре молекул, благодаря чему ИК-спектроскопия широко используется для идентификации и определения строения сложных органических соединений в пищевых продуктах. При проведении качественного анализа смесей их компоненты идентифицируют путем сопоставления ИК-спектров исследуемого вещества со спектром эталона.

Количественные определения основаны на измерении интенсивности поглощения, которая зависит от концентрации вещества, в соответствии с законом Бугера–Ламберта–Бера.

Количественный анализ проводят методом градуировочного графика, который строят по какой-либо характеристической полосе, или методом внутреннего стандарта. Используя эталоны с известным содержанием определяемого вещества, можно установить его содержание в анализируемой пробе.

Метод ИК-спектроскопии используют для определения жирнокислотного состава молока и молочных продуктов и контроля содержания пестицидов и гербицидов в этих продуктах.

Инфракрасную спектроскопию применяют для определения качества масла и жира при хранении. Окислительная порча жиров связана с образованием гидроперекисей и соединений, содержащих карбонильную группу.

В ИК-спектре жиров и масел имеются характеристические полосы поглощения, связанные с деформационными колебаниями СН-группы (2900, 1470–1390 см–1) и группы С=О (1770–1730 см–1).

Положение полос во времени не изменяется. При этом степень окисленности жира отражается на интенсивности поглощения полосы карбонильной группы, тогда как интенсивность поглощения в области частот СН-группы остается неизменной. В связи с этим для количественного определения соединений, содержащих карбонильную группу, можно применить метод внутреннего стандарта с использованием в качестве такового полосы поглощения СН-группы (2900 см–1).

Интенсивность полос поглощения групп С=О и –СН, найденную по спектру, выражают в единицах оптической плотности, а степень окисленности (СО) жира находят из соотношения где DС=О – оптическая плотность на полосе группы С=О; DС–Н – оптическая плотность на полосе группы С–Н.

1. Привести примеры применения спектральных методов для анализа состава и свойств пищевых продуктов.

2. Дать описание метода атомно-эмиссионной спектроскопии.

Привести примеры применения для анализа пищевых продуктов, указать точность метода.

3. Дать описание метода атомно-абсорбционной спектроскопии.

Привести примеры применения для анализа пищевых продуктов.

Указать точность метода.

4. Перечислить основные методы молекулярного абсорбционного анализа.

5. Закон Бугера–Ламберта–Бера и его применение для количественного анализа пищевых смесей.

6. Область применения закона Бугера–Ламберта–Бера и основные этапы фотометрического анализа.

7. Выбор области для спектральных определений, подготовка проб к анализу.

8. Особенности молекулярного абсорбционного анализа в ИК-области спектра. Примеры применения для анализа пищевых продуктов.

12. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

Впервые термин хроматография был использован российским биологом Михаилом Семеновичем Цветом в 1903 г. для описания разработанного им метода разделения компонентов хлорофилла на бумаге.

В настоящее время хроматография представляет собой самый распространенный и совершенный метод разделения смесей, атомов, изотопов, молекул, всех типов изомерных молекул, включая оптические изомеры, макромолекул (синтетических полимеров и биополимеров), ионов, устойчивых свободных радикалов, комплексов, ассоциатов, микрочастиц.

Хроматография является уникальным методом анализа сложных многокомпонентных смесей, препаративным и промышленным методом выделения веществ в чистом виде. Кроме того, хроматография представляет собой мощную отрасль научного приборостроения.

Ни один аналитический метод не может конкурировать с хроматографией по универсальности применения и эффективности разделения многокомпонентных смесей. На современных газохроматографических капиллярных колонках в условиях одного эксперимента могут быть идентифицированы и количественно определены более 1000 индивидуальных компонентов.

Хроматография изучает термодинамику состояния двухфазных систем газ–жидкость, жидкость–жидкость и жидкость–твердое тело, сверхкритическое и жидкокристаллическое состояния веществ; исследует природу межмолекулярных взаимодействий, кинетику процессов внутреннего и межфазного массообмена, процессы комплексообразования, ассоциации и образования соединений, стереохимию органических соединений и многое другое.

В связи с исключительной многогранностью понятия «хроматография» оно не может быть охвачено одним единственным определением. В категориях «явление, процесс, метод, наука» хроматографию предложено определять как:

– явление образования, движения и изменения концентрационных зон веществ (частиц) в условиях массообмена между несмешивающимися и движущимися относительно друг друга фазами или на границе раздела этих фаз;

– процесс дифференцированного многократного перераспределения веществ или частиц между несмешивающимися и движущимися относительно друг друга фазами;

– метод разделения смесей веществ или частиц, основанный на различии в скоростях их перемещения в системе несмешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз;

– науку о межмолекулярных взаимодействиях и переносе частиц вещества в системе несмешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз.

В общем случае хроматография – это наука о принципах и методах разделения и количественного и качественного анализа веществ по принципу различия размеров, зарядов, массы, полярности их частиц в потоке на границе нескольких гетерогенных сред (газ– твердое тело, жидкость–твердое тело, газ–жидкость, несмешивающиеся жидкости и т. д.).

Хроматографические методы анализа классифицируют также по системе несмешивающихся фаз, принципу разделения, форме проведения процесса, способу проведения эксперимента и другим признакам (рис. 12.1).

По форме проведения процесса различают колоночную, бумажную и тонкослойную хроматографию. В колоночной хроматографии разделение проводят на хроматографической колонке. В бумажной хроматографии разделение осуществляют на специальной фильтровальной бумаге, в тонкослойной – на стеклянной или пластмассовой пластинке, на которую нанесен адсорбент.

В табл. 12.1 приведена классификация хроматографических методов анализа согласно системе несмешивающихся фаз.

Афинная хроматография Распределительная Ионообменная хроматоография Классификация хроматографических методов Жидкость–твердое тело Ионообменная Жидкость–твердое тело Гель-хроматография Диффузия Одностадийным процессом хроматографического разделения является экстракция.

12.1. Теоретические основы экстракции Распределение растворенного вещества между двумя несмешивающимися жидкостями характеризуется коэффициентом распределения D.

Если вещество Х находится в водной и органической фазах, то между фазами устанавливается равновесие:

Суммарную концентрацию вещества Х, учитывающую все формы вещества в органической фазе, можно представить следующим образом:

суммарную концентрацию вещества в водной фазе – [X]водн = [X]водн + [X+]водн + [X–]водн + [X2]водн.

Отношение суммарных концентраций вещества Х в органической и водной фазах называют концентрационным коэффициентом распределения вещества Х.

Используют также массовый коэффициент распределения:

Поскольку [X] = m/V, то соотношение между DС и Dm можно записать следующим образом:

Если Vорг = Vводн, то DC = Dm.

Зная коэффициент распределения, можно рассчитать долю вещества, извлеченного органическим растворителем из водной фазы:

Тогда доля вещества, оставшегося в водной фазе, Если в результате однократной экстракции вещество извлекается не полностью, прибегают к многократной экстракции.

После первой экстракции органическую фазу отделяют, а водный раствор смешивают с новой порцией экстрагента. Эту операцию можно повторить несколько раз. Тогда доля вещества, оставшегося в водной фазе после n-й экстракции, Молярная доля вещества, экстрагированного в органическую фазу, Если молярная доля экстрагированного вещества составляет 99,9 %, можно считать, что экстракция проведена полностью.

В случае, если доля экстрагированного вещества составляет 90 %, необходимо провести двух-, трехкратную экстракцию.

Если экстрагированного вещества существенно меньше, то необходимо провести многостадийный процесс. Многостадийными процессами являются противоточная экстракция и элюентная (распределительная) хроматография.

12.2. Способы хроматографического разделения Хроматографическое разделение можно осуществлять тремя методами: фронтальным, вытеснительным и элюентным.

Фронтальный метод наиболее прост. Через хроматографическую колонку с сорбентом непрерывным потоком пропускают раствор исследуемой смеси веществ или газовую смесь. В результате сорбент насыщается компонентами смеси.

Данный метод предусматривает непрерывный ввод в колонку разделяемой смеси компонентов (А + В + С). При этом из колонки сначала выходит чистый растворитель, затем компонент А, обладающий самым малым сродством к неподвижной фазе и поэтому слабее удерживающийся. Затем из колонки выходит смесь компонентов (А + В) и, наконец, когда неподвижная фаза насыщается компонентом С, выходит раствор, содержащий смесь всех трех компонентов (А + В + С).

Если пропускать жидкость или газ, выходящие из колонки, через детектор концентраций и наносить его показания в течение всего опыта на график, то полученная выходная кривая будет ступенчатой (рис. 12.2).

Рис. 12.2. Выходная кривая фронтального анализа:

Несмотря на простоту проведения хроматографирования, фронтальный метод не нашел широкого применения, поскольку не дает полного разделения компонентов анализируемой смеси. Однако этот метод весьма эффективен для препаративного выделения чистых веществ из образца при условии, что эти вещества удерживаются на колонке слабее других компонентов пробы.

Типичные примеры применения фронтального анализа: очистка и умягчение воды ионообменными материалами; очистка воздуха активированным углем от отравляющих веществ в противогазах и вентиляционных фильтрах химических предприятий; концентрирование ценных веществ из сточных промышленных вод металлургических предприятий; очистка лекарственных препаратов и пищевых продуктов с помощью ионообменников и т. д.

Вытеснительный метод отличается от фронтального тем, что после введения пробы исследуемой смеси колонку промывают растворителем или газом-носителем, к которым добавляют растворимое вещество (в жидкостной хроматографии) или вещество в газообразном состоянии (в газовой хроматографии). Это вещество должно адсорбироваться сильнее любого из компонентов разделяемой смеси.

Оно называется вытеснителем, поскольку, обладая наибольшей сорбируемостью, вытесняет более слабо сорбирующиеся компоненты разделяемой смеси.

Благодаря эффекту адсорбционного вытеснения, открытому М.С. Цветом, происходит вытеснение компонентов из адсорбента в последовательности, соответствующей их адсорбируемости, и компоненты разделяются. При этом зоны компонентов движутся по слою адсорбента с одинаковой скоростью, соприкасаясь между собой, по направлению к выходу из колонки.

К моменту полного насыщения адсорбента вытеснителем детектор запишет ступенчатую выходную кривую, отличающуюся от кривой фронтального анализа тем, что каждая ступень соответствует чистому компоненту.

Трудности выбора концентрации вытеснителя, взаимная диффузия на границе зон, препятствующая получению на выходе из колонки чистых компонентов разделяемой смеси, а также длительность процесса разделения затрудняют использование этого метода в аналитических целях. Однако для препаративных целей метод не потерял значения, так как возможность применения таких высокоактивных и доступных адсорбентов, как активированный уголь, позволяет достигнуть высокой производительности. Достоинством метода является также отсутствие размываемости зон.

Для разделения многокомпонентных смесей чаще всего применяют элюентный, или проявительный, метод, поскольку он не имеет указанных недостатков фронтального и вытеснительного методов.

Хроматографическое разделение этим методом основано на том, что отдельные компоненты образца имеют разное сродство с подвижной и неподвижной фазами и по мере продвижения растворителя по колонке происходят распределение и перераспределение компонентов между этими фазами. Исследуемую смесь вводят в колонку в виде порции раствора или газа, а не непрерывно. После введения такой порции колонку промывают растворителем или газом-носителем (проявителем или элюентом).

Растворитель, проходящий через колонку, называют элюентом, а процесс вымывания из колонки растворенного вещества пропусканием чистого растворителя – элюированием. В результате компоненты перемещаются по колонке с различной скоростью и разделяются на полосы, которые продвигаются к выходу из колонки.

На выходе из колонки детектор непрерывно фиксирует концентрацию компонентов, а связанный с ним регистрирующий прибор записывает выходную кривую в виде ряда пиков, число которых соответствует числу разделенных компонентов (рис. 12.3).

Рис. 12.3. Выходная кривая проявительного анализа:

А, В, С – разделяемые вещества; Е – растворитель (элюент или проявитель) Проявительный метод получил широкое применение как в жидкостной, так и газовой хроматографии. При правильном выборе условий разделения компоненты смеси выходят из колонки в чистом виде, их можно выделить для исследования.

Качественный и количественный состав анализируемой смеси можно определить простым измерением объемов удерживания и площадей пиков анализируемых компонентов на полученной хроматограмме. Каждый пик хроматограммы соответствует отдельному компоненту, а площадь каждого пика характеризует его относительное содержание в пробе.

12.3. Теоретические основы хроматографического Основным количественным выражением скорости движения частиц через колонку служит время удерживания tR или объем удерживания VR.

Основным количественным выражением неравномерности распределения вещества между фазами является число теоретических тарелок n или высота, эквивалентная теоретической тарелке Н.

Время удерживания tR – это время, необходимое для элюирования вещества до достижения его максимальной концентрации.

Скорость миграции вещества из колонки выражают отношением l/tR, где l – длина колонки.

Время, необходимое для выхода из колонки вещества, не задерживаемого неподвижной фазой, называют мертвым временем tm. При этом скорость движения вещества, не задерживаемого неподвижной фазой, составляет l/tm.

Отношение скорости движения по колонке растворенного вещества Ui к скорости движения подвижной фазы U называют индексом удерживания, или фактором запаздывания R:

Вместо показателя времени удерживания вещества на колонке tR можно использовать показатель объема удерживания VR – объема элюента, прошедшего через колонку от момента ввода пробы до момента выхода определяемого вещества в максимальной концентрации. Объем удерживания рассчитывают по формуле При этом для элюента объем удерживания где Vm – рабочий объем колонки.

Объем удерживания компонента VR за вычетом рабочего объема колонки называют исправленным объемом удерживания:

Аналогично рассчитывают исправленное время удерживания:

Исправленное время удерживания – это время, в течение которого определяемый компонент находится в неподвижной фазе.

В подвижной фазе все вещества, независимо от времени удерживания, находятся в течение tm.

Отношение исправленного времени удерживания к мертвому времени, определяемое экспериментально, пропорционально отношению количества компонента в неподвижной фазе к количеству этого же компонента в подвижной фазе. Это отношение представляет собой массовый коэффициент распределения, или, как его обычно называют в хроматографии, фактор емкости K:

где Vs и Vm – объемы неподвижной и подвижной фаз.

Если выражение (12.11) подставить в уравнение (12.10), то получим или Умножая почленно уравнение (12.16) на скорость движения подвижной фазы, получаем При условии Vs = Vm K = Ds и выражение (12.17) можно записать в виде Используя выражение (12.12), получаем Таким образом, объем удерживания пропорционален коэффициенту распределения и объему неподвижной фазы.

Параметры удерживания вещества можно рассчитать, зная коэффициент его распределения для данной хроматографической системы.

Уравнения (12.18) и (12.19) называются основными уравнениями хроматографии.

12.4. Модель теоретической тарелки Модель теоретической тарелки основывается на представлении о том, что хроматографическая колонка состоит из отрезков, в каждом из которых достигается равновесное распределение вещества между фазами.

Длину одного отрезка колонки называют высотой Н, эквивалентной одной теоретической тарелке (ВЭТТ). Число таких отрезков или число теоретических тарелок n характеризует размывание пиков и является мерой эффективности колонки.

Величины Н и n взаимосвязаны:

При анализе многокомпонентных смесей количественной мерой их разделения служит разрешение кривых удерживания для двух наиболее трудно разделяемых соединений.

Разрешение R1, 2 определяется следующим соотношением:

где W1 и W2 обозначают ширину хроматографических пиков компонентов 1 и 2 (рис. 12.4).

Удовлетворительное разрешение компонентов 1 и 2 достигается в том случае, если площадь перекрывания составляет около 0,1 %, а разрешение R1, 2 = 1,5.

Рис. 12.4. Разрешение хроматографических пиков компонентов 1 и Другим критерием разделения компонентов является фактор разделения :

где D1 и D2 – меньший и больший коэффициенты распределения.

Чем больше величина, тем полнее происходит хроматографическое разделение данных веществ. Если фактор разделения велик ( = 510), то полное разделение достигается на колонке с небольшим числом n, если мал, то для разделения требуется высокоэффективная колонка с большим числом теоретических тарелок n.

Между числом теоретических тарелок n, разрешением R1, и фактором разделения существует взаимосвязь:

Зная требуемую степень разрешения компонентов R1,2 и фактор разделения, можно рассчитать число теоретических тарелок n, необходимое для их разделения.

Для эффективного разделения многокомпонентных смесей необходимо соблюдать следующие условия:

1. Равновесие между подвижной и неподвижной фазами должно устанавливаться достаточно быстро, твердый носитель должен быть пористым и состоять из небольших однородных частиц сферической формы.

2. Для устранения влияние факторов, приводящих к размыванию пиков, колонка должна быть плотно и равномерно заполнена и иметь достаточное число теоретических тарелок.

3. Режимы хроматографического разделения следует подбирать таким образом, чтобы значения коэффициентов распределения были не слишком малы и не слишком велики. В случае, если значения коэффициентов распределения малы, компоненты быстро проходят через колонку и плохо разделяются. При больших значениях коэффициентов распределения увеличивается время элюирования и происходит размывание пиков.

В газовой хроматографии в качестве подвижной фазы используется инертный газ.

Неподвижной фазой в газоадсорбционной хроматографии (ГАХ) является активное дисперсное твердое вещество, в газожидкостной (ГЖХ) – слой жидкости, нанесенный на твердый носитель.

Принцип газохроматографического анализа сводится к следующему. Через колонку, заполненную неподвижной фазой, непрерывно пропускают инертный газ, называемый газом-носителем. В этот газ у входа в колонку вносят в виде пара небольшое количество анализируемой смеси. Вследствие различий в сорбируемости или растворимости в стационарной жидкой фазе компоненты смеси передвигаются по колонке с различной скоростью. На выходе из колонки устанавлен детектор, регистрирующий изменение какого-либо физического свойства газового потока. Использование автоматизированной системы детектирования позволяет получить хроматографическую кривую. В качестве газа-носителя обычно используют либо инертные газы (гелий, аргон, азот), либо водород.

Насадочные колонки заполняют неподвижной фазой, которая тонким слоем покрывает их внутреннюю поверхность. В качестве неподвижной фазы в ГАХ используют твердые полярные и неполярные сорбенты: активный уголь, силикагель, алюмосиликаты, сополимеры стирола и дивинилбензола, хромосорб.

В ГЖХ колонку заполняют гранулированным твердым носителем, на который наносят слой нелетучей жидкой фазы. Твердые носители – это пористые гранулированные вещества, обладающие химической и каталитической инертностью, механической прочностью, термостабильностью и хорошей смачиваемостью жидкой фазой.

Большинство твердых носителей – диатомиты, состоящие на 90 % из SiO2 и химически модифицированные действием силанов (диметилдихлорсилана, триметилхлорсилана и др.) для уменьшения адсорбционной активности.

Неподвижная жидкая фаза в ГЖХ должна быть практически нелетучей при температуре колонки, термостойкой, химически инертной, хорошо растворять компоненты образца. При этом необходимо, чтобы значения коэффициента распределения компонентов смеси попадали в определенный интервал.

Для разделения неполярных компонентов применяют неполярные жидкости, например парафины.

Для разделения полярных компонентов, например спиртов и аминов, используют полярную неподвижную фазу (этиленгликоль).

Разделение компонентов с близкой полярностью, значения температур кипения которых заметно различаются, не представляет особых затруднений.

Для разделения веществ с разной полярностью и близкими значениями температуры кипения подбирают неподвижную фазу, селективно удерживающую какие-либо компоненты благодаря дипольному взаимодействию, возникновению водородных связей, комплексообразованию и т. д.

При разделении компонентов смесей методом ГЖХ важное значение имеет толщина слоя неподвижной фазы. С увеличением толщины слоя увеличивается время удерживания. Слой жидкости, покрывающий диатомитовые носители, составляет обычно от 2 до 10 % от объема носителя.

Скорость перемещения различных компонентов по колонке зависит не только от природы фаз, но и от температуры колонки, которая имеет большое значение для эффективности разделения.

Область рабочих температур составляет от –100 до 450 С. Выбранная температура должна поддерживаться с точностью до ±0,1 С.

Для хроматографического разделения выбирают температуру, несколько более высокую, чем средняя температура кипения образцов. При разделении компонентов с широким интервалом температур кипения температуру повышают (непрерывно или скачками).

На выходе из колонки компоненты смеси в порядке их элюирования поступают в детектор. В детекторе химические, физические или физико-химические параметры газового потока преобразуются в электрический сигнал. Чаще всего в газовой хроматографии используют детектор теплопроводности (катарометр) и пламенноионизационный детектор.

Метод газовой хроматографии не позволяет автоматически идентифицировать пики на хроматограмме. Качественный анализ компонентов проводят по характеристикам удерживания – tR, VR, VR, которые сравнивают с характеристиками удерживания эталонов. При анализе сложных смесей природных соединений и биологических материалов эталоны зачастую отсутствуют, а ряд компонентов может быть неизвестен. В этом случае компоненты выделяют на выходе из колонки и анализируют каким-либо методом. Чаще всего используют ИК-спектроскопию и масс-спектроскопию.

Количественный анализ в газовой хроматографии основан на том, что при строгом соблюдении ряда условий (постоянство скорости потока газа-носителя и температуры колонки, правильная методика ввода пробы и т. д.) площадь хроматографического пика S или его высота h пропорциональны концентрации соответствующего компонента.

Газовая хроматография применяется для качественного и количественного определения жирных кислот, аминокислот, спиртов, сахаров, липидов, фосфолипидов пищевых продуктов, а также различных ароматических веществ, обусловливающих вкус, запах и аромат плодов и овощей. Кроме того, метод газовой хроматографии используют для анализа загрязнения питьевой воды и пищевых продуктов, в том числе для определения хлорсодержащих пестицидов.

К основным достоинствам метода относятся: сравнительная простота аппаратурного оформления; высокая скорость выполнения анализа; возможность определения с большой точностью микроколичеств веществ, не определяемых другими методами; возможность автоматизации анализа, что позволяет использовать его для оперативного мониторинга производственных процессов.

Качественный и количественный анализ жирно-кислотного состава пищевых продуктов – наиболее простой метод качественной идентификации неизвестной смеси жирных кислот по относительной величине времени (объема) удерживания.

Метод газовой хроматографии позволяет с высокой точностью проводить количественный скрининг-анализ насыщенных и ненасыщенных жирных кислот; определять содержание летучих жирных кислот в сыре, сливочном масле, мясе, колбасных изделиях.

В настоящее время используются методики газохроматографического определения пестицидов (альдрина, гексахлорана, гептахлора, ДДТ, ДДД, ДДЭ и др.) в овощах, фруктах, молоке и молочных продуктах.

Метод газовой хроматографии позволяет анализировать содержание изомерных форм токоферола в растительных маслах, а также триацилглицеринов, аминокислот, углеводов (после их перевода в летучие производные) и ароматобразующих веществ в пищевых продуктах.

12.6. Жидкостная хроматография Метод жидкостной хроматографии распространен довольно широко благодаря большому числу ее разновидностей. В настоящее время различают бумажную, тонкослойную, колоночную жидкожидкостную и жидкотвердофазную (адсорбционную) хроматографию, а также хроматографию высокого давления, которая представляет собой наиболее прогрессивный метод разделения и является разновидностью адсорбционной хроматографии.

В бумажной хроматографии (БХ) разделение смесей проводят на специальной хроматографической бумаге, изготовленной из особо чистой целлюлозы. Для этого бумагу обрабатывают реагентом, дающим с разделяемыми компонентами окрашенные соединения, компоненты при этом проявляются в виде пятен.

Метод БХ применяют для идентификации и разделения очень малых количеств веществ. Для идентификации веществ используют фактор Rf, который равен отношению расстояния, пройденного веществом а, к расстоянию, пройденному растворителем b:

Значение а зависит от природы вещества, значение Rf – от природы растворителя и может изменяться от 0,00 до 1,00. Высокая эффективность разделения соответствует значениям Rf от 0,1 до 0,7.

Для количественного анализа смесей методом бумажной хроматографии пятна компонентов вырезают вместе с участком бумаги, помещают в походящий растворитель и полностью элюируют, затем колориметрируют или фотометрируют. Кроме обычной, одномерной, используют и двухмерную БХ. Этим методом разделяют смеси, разделить которые с помощью одного растворителя затруднительно.

Метод БХ используется для разделения всех классов органических соединений. При разделении сахаров, фенольных соединений, сложных смесей аминокислот, пептидов, алкалоидов, антибиотиков методом БХ можно достичь хороших результатов.

С помощью метода бумажной хроматографии определяют содержание фенола в копченых продуктах. Методом двухмерной БХ можно исследовать углеводный и аминокислотный состав растительного сырья.

Достоинства данного метода состоят в исключительной простоте выполнения анализа, возможности использования небольшого количества образцов (до нескольких микрограммов) и его высокой чувствительности. Однако он достаточно трудоемок и требует специальной подготовки проб, поэтому не может быть использован в качестве скрининг-метода.

С точки зрения методических особенностей эксперимента тонкослойная хроматография (ТСХ) является наиболее простым препаративным методом хроматографии, сочетающим в себе универсальность, высокую чувствительность, быстроту и простоту выполнения анализа. Благодаря простоте аппаратурного оформления, наглядности и четкости разделения, а также надежности идентификации компонентов смесей метод ТСХ предоставляет широкие возможности для проведения экспресс-анализа пищевых продуктов.

Тонкослойную хроматографию можно рассматривать как разновидность бумажной хроматографии. Вместо свободно свисающих полос бумаги используют стеклянные пластинки, на которые тонким слоем наносят подходящий сорбент, или уже готовые подложки с закрепленным на них слоем сорбента.

На стартовую линию пластинки наносят анализируемую смесь, край пластинки погружают в систему растворителей ниже стартовой линии. По мере продвижения растворителя по пластинке происходит разделение компонентов смеси благодаря действию сил адсорбции, распределения, ионному обмену или совокупности всех перечисленных процессов.

Для разделения липофильных веществ в ТСХ применяют следующие сорбенты: силикагель, окись алюминия, ацетилированную целлюлозу, полиамиды. Для разделения гидрофильных веществ используют целлюлозу, целлюлозные ионообменники, кизельгур, полиамиды.

Самый распространенный сорбент – силикагель обладает высокой адсорбционной способностью. При распределительном механизме разделения слой силикагеля пропитывается гидрофильной или гидрофобной фазой. Силикагель адсорбирует ненасыщенные, ароматические или полярные молекулы благодаря образованию водородных связей. Избирательность разделения компонентов смесей на силикагеле увеличивается при добавлении неорганических соединений, например NaNO3. Силикагель химически инертен, что обеспечивает его стабильность, имеет хорошую адгезию к стеклу, фольге, полимерам, что дает возможность получать тонкие, ровные, механически прочные слои на различных подложках.

Выбор растворителя, как правило, осуществляют эмпирически с учетом полярности разделяемых компонентов и полярности растворителей.

В адсорбционной хроматографии используют элюотропный ряд, в котором растворители расположены в порядке возрастания элюирующей способности:

гексан гептан циклогексан CCl4 C6H6 CHCl диэтиловый эфир этилацетат пиридин ацетон Вещества с липофильным характером разделяют на полярном адсорбенте с малополярным растворителем, например петролейным эфиром, бензином или бензолом.

При выборе состава подвижной фазы в качестве основы чаще всего выбирают неполярный растворитель и добавляют к нему небольшое количество полярного растворителя. Растворитель элюирует органические соединения из сорбента в зависимости от строения вещества, а также от типа и числа функциональных групп.

При разделении смесей методом распределительной ТСХ неподвижной фазой обычно является вода, а подвижной – не смешивающийся с ней менее полярный органический растворитель, к которому добавляют воду или который насыщают водой.

При выборе растворителя в распределительной ТСХ также можно использовать элюотропный ряд, в котором растворители расположены относительно их способности к образованию водородных связей. В начале такого ряда расположены гидрофильные (полярные) соединения, в конце – гидрофобные (липофильные, или неполярные).

Например, для анализа свободных аминокислот методом распределительной ТСХ используют растворители, содержащие воду, а также полярный органический растворитель, например метанол, этанол, ацетон и др.

Суспензию тонкоизмельченного адсорбента с добавкой связующего вещества специальным распылителем наносят на пластинку.

После высушивания пластинка готова к употреблению.

Раствор образца наносят на пластинку микропипеткой в виде пятен на расстоянии 1,5–2 см от нижнего края пластинки. Конец пластинки помещают в элюирующий раствор таким образом, чтобы он не касался пятен пробы. Компоненты образца поднимаются по пластинке с различной скоростью, что обусловливает их разделение. Эффективность разделения компонентов оценивают так же, как и в БХ, посредством измерения Rf.

При использовании метода разделения в тонком слое рекомендуют использовать эталонные вещества – «свидетели», которые наносят на пластинку рядом с анализируемой пробой.

Большинство хроматографируемых соединений бесцветны, поэтому для их детектирования применяют различные методы.

Флуоресцирующие соединения можно обнаружить с помощью УФ-излучения, но основной метод детектирования – обработка хроматограмм различными реагентами.

Существует ряд общих реагентов, к числу которых относятся следующие: 90 %-й раствор серной кислоты; смесь дихромата калия и серной кислоты; раствор йода в этаноле или хлороформе; родамин В;

реагенты, применяемые для конкретных классов соединений, например нингидрин в этаноле – для аминокислот и аминов.

Чаще всего окраска проявляется сразу после опрыскивания, иногда – после нагревания.

Количественный анализ проводят двумя способами. Первый способ – это прямое определение, которое осуществляют непосредственно на пластинке. Измерение площади пятна и фиксация интенсивности окраски пригодны только для полуколичественных определений. Для количественных определений используют методы денситометрии, спектрофотометрии и флуорометрии.

Второй способ предусматривает экстракцию соединения с пластинки либо прямым элюированием, либо соскабливанием пятна с адсорбентом и последующим извлечением компонента. Для последующего определения компонента в растворе используют в основном спектрофотометрию.

С помощью метода ТСХ определяют фракционный состав липидов (фосфатиды, моно- и диглицериды, стерины, свободные ЖК, триглицериды, углеводороды и др.). Фракционирование фосфолипидов осуществляют на силикагеле.

С помощью ТСХ проводят разделение и идентификацию каратиноидов в плодах и овощах и определение изомерных форм токоферолов в растительных маслах. Также ее используют для определения остаточного количества пестицидов (хлорофоса в овощах, фруктах, зерне, молоке, мясе) и микотоксинов (афлатоксинов) в пищевых продуктах.

Разделение углеводов в пищевых продуктах осуществляют на целлюлозе и силикагеле.

Адсорбционная хроматография – старейший хроматографический метод, в основе которого лежит различие в равновесном распределении компонентов смеси между неподвижной фазой (адсорбентом) и подвижной жидкой фазой. Это распределение зависит от характера и прочности адсорбции каждого компонента, которые, в свою очередь, определяются природой адсорбента, адсорбируемого вещества и подвижной фазы.

Для выбора условий хроматографического разделения и анализа смесей большое значение имеет изотерма адсорбции каждого из компонентов.

Изотерма адсорбции Лэнгмюра выражает зависимость количества адсорбированного вещества от его концентрации в растворе при состоянии равновесия и при постоянной температуре.

На поверхности адсорбента находятся активные центры, способные фиксировать молекулы адсорбированного вещества. Каждый элементарный участок поверхности способен фиксировать только одну молекулу, в результате чего на поверхности адсорбента образуется мономолекулярный слой. Процесс адсорбции обратим. Между поверхностью адсорбента и средой устанавливается адсорбционное равновесие.

При выводе изотермы адсорбции предполагается, что адсорбируемые молекулы должны удариться о поверхность адсорбента и попасть на незанятые места. Поскольку сила ударов о поверхность адсорбента пропорционально концентрации компонента в растворе, то вероятность попадания его молекул на свободное место равна числу этих мест.

В качестве адсорбентов используют силикагель, оксид алюминия, сульфат магния, древесный уголь, полиамид. Размер частиц адсорбента составляет 0,05–0,5 мм; удельная площадь поверхности – 100–600 м2/г.