«ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НОВОГО ОБЕЗБОЛИВАЮЩЕГО СРЕДСТВА ПРОИЗВОДНОГО ИМИДАЗОБЕНЗИМИДАЗОЛА ...»

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«ВОЛГОГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ»

МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

РАЩЕНКО АНДРЕЙ ИГОРЕВИЧ

ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НОВОГО

ОБЕЗБОЛИВАЮЩЕГО СРЕДСТВА ПРОИЗВОДНОГО

ИМИДАЗОБЕНЗИМИДАЗОЛА

14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Научный руководитель Академик РАН Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор А.А. Спасов ВОЛГОГРАД Сокращения:

ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография ЦНС – центральная нервная система ЖКТ – желудочно-кишечный тракт, kappa, КОР – каппа-опиоидные рецепторы

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение…………………………………………………………………………….. Глава 1. Фармакология каппа-опиоидных препаратов. Фармакокинетика агонистов каппа-опиоидных рецепторов (обзор литературы)……...……… 1.1 Фармакологические свойства каппа-опиоидных средств………………...… 1.2 Фармакокинетические свойства каппа-агонистов………………...……...…. Глава 2. Материалы и методы исследования …………………………..……. 2.1 Материалы исследования……………………………………………….….…. 2.2 Методы исследования……………………………………………….………... 2.2.1 Хроматографические методы количественного определения соединения РУ-1205 в органах и тканях животных……………………………...…….……. Методы экстракции соединения РУ-1205 из биологического 2.2. материала…………….…………………………………………………...………. 2.2.3 Схемы проведения фармакокинетических исследований………...……… 2.2.4 Схема проведения биофармацевтических исследований …………...………. 2.2.5. Расчеты фармакокинетических параметров………………..…………… 2.2.6 Методы статистической обработки……………………………….………… Глава 3. Экспериментальная фармакокинетика соединения РУ-1205…..... 3.1 Валидационные параметры методов ВЭЖХ, используемых для определения соединения РУ-1205……………………………………………………………….. 3.2 Линейность фармакокинетических свойств…………………………………. 3.3 Фармакокинетические свойства соединения РУ-1205 при внутривенном введении………………………………………………………………………...….. 3.3.1 Фармакокинетика в плазме крови крыс…………………………………… 3.3.2 Распределение в органах и тканях крыс………………………………….. 3.3.3 Экскреция ……………...……………………………………..……………… 3.4 Фармакокинетические свойства соединения РУ-1205 при пероральном введении………………………………………………………………………..…... 3.4.1 Фармакокинетика в плазме крови крыс…………………….…………….. 3.4.2 Распределение по органам и тканях крыс………………………..………. 3.4.3 Экскреция ………………...……………………………….…………………. 3.5 Фармакокинетические свойства соединения РУ-1205 при подкожном введении………………………………………………………………...………….. 3.5.1 Фармакокинетика в плазме крови крыс…………………………….......... 3.5.2 Распределение по органам и тканям………………………………...…….. 3.5.3 Экскреция …………………………………………………………..…...…… 3.6. Зависимость фармакокинетических свойств от фармакодинамики……….. 3.6.1 Зависимость фармакодинамических свойств от фармакокинетики при пероральном введении…………………………………………………………..…. 3.6.2 Зависимость фармакодинамических свойств от фармакокинетики при подкожном введении…………………………………………………………….… 3.7 Метаболизм соединения РУ-1205…………………………………………….. 3.7.1 Определение путей метаболизма соединения РУ-1205 in silico…………. 3.7.2 Ферментативный, щелочной и кислотный гидролиз……………….…….. 3.7.3 Взаимодействие соединения РУ-1205 с тест-субстратами некоторых изоформ CYP450…………………………………………………………….....…... 3.8. Заключение…………………………………………………………………..… Глава 4 Исследование фармакокинетических свойств соединения РУ- в виде лекарственных форм…………………………………………………….. 4.1 Относительная биодоступность твердых лекарственных форм соединения РУ-1205…………………………………………………………………………..…. 4.1.1. Относительная биодоступность таблеток, покрытых оболочкой, соединения РУ-1205……………………………………………………………...… 4.1.2 Относительная биодоступность капсул соединения РУ-1205…………. 4.1.3 Межвидовые различия фармакокинетических свойств соединения Ру- при перораольном пути введения…………………………………………………. 4.2 Относительная биодоступность инъекционной лекарственной формы соединения РУ-1205……………………………………………………………….. 4.2.1 Относительная биодоступность инъекционной лекарственной формы соединения РУ-1205 при внутривенном пути введения…………………..…….. 4.2.2. Межвидовые различия фармакокинетических свойств соединения Рупри внутривенном пути введения………………………………………… 4.2.3 Относительная биодоступность инъекционной лекарственной формы соединения РУ-1205 при подкожном пути введения……………………..…… 4.3 Заключение……………………………………………………………..………. Глава 5 Обсуждение результатов………………………………………………. Выводы…………………………………………………………………..………… Список используемой литературы……………………………………………...

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Наиболее часто в клинической практике используют наркотические обезболивающие препараты, которые неселективно действуют на различные подтипы опиоидных рецепторов.

Однако, данные средства обладают рядом серьезных нежелательных реакций, дыхательного центра, обстипация и седация. Следует отметить, что при длительном использовании опиоидных анальгетиков развивается толерантность к обезболивающему эффекту, что в итоге приводит к необходимости повышать дозу применяемого препарата, а их свойство вызывать физическую и психическую зависимость может стать причиной сложной социальной адаптации после окончания терапии [Savage S.R., Kirsh K. L. et al, 2008]. В связи с этим, большое значение имеет разработка опиоидных обезболивающих средств, не вызывающих побочные эффекты, которые развиваются при активации -рецепторов [Kivell B., Prisinzano T.E., 2009]. К подобным веществам относятся соединения, обладающие каппа-агонистической активностью [Guzman D.S. 2011].

В результате исследований, проведенных на базе ВолгГМУ совместно с НИИ ФОХ Южного федерального университета, были выявлены вещества с каппа-агонистическими свойствами [Спасов А.А., Гречко О.Ю., 2007, Елисеева проявляет антиноцицептивные свойства и характеризуется агонистической активностью по отношению к каппа-опиоидным рецепторам [Спасов А.А. и др., 2013]. Так, было установлено, что в анальгетических тестах соединение РУразвивает обезболивающий эффект, ингибируемый специфическим неспецифическим блокатором опиодных рецепторов – налоксоном.

Необходимо отметить, что для оценки фармакодинамических параметров фармакокинетические свойства, такие как всасывание, распределение по органам и тканям, метаболизм и выведение [Каркищенко Н.Н. и др., 2001].

Знание данных процессов позволяет дать объективную оценку связи продолжительностью терапевтического действия, что может иметь большое значение для обоснованной разработки схем дозирования нового лекарственного средства и их корректировки [Смирнова Л.А. 2004].

фармакологических свойств соединения РУ-1205 и представляет собой экспериментальное изучение его фармакокинетических свойств при внутривенном, пероральном и подкожном введении в виде субстанции и лекарственных форм.

Степень разработанности. Применяемые в клинической практике опиоидные анальгетики характеризуются рядом нежелательных побочных эффектов, таких как: развитие пристрастия и привыкания, эйфория, угнетение дыхательного центра и др. Создание обезболивающих средств, лишенных данных побочных реакций, остается актуальной задачей. Подобные препараты создаются на основе агонистов каппа-опиодных рецепторов. На сегодняшний день на российском фармацевтическом рынке отсутствуют отечественные аналоги таких лекарственных средств. Кроме того, зарубежные каппа-агонисты (буторфанола тартрат, пентазоцин) обладают низкой биодоступностью при пероральном введении и применяются в основном в виде инъекций.

Цель исследования. Исследование фармакокинетических свойств нового обезболивающего вещества РУ-1205 и его лекарственных форм.

Задачи исследования Разработать метод количественного определения соединения РУв биологическом материале.

Изучить фармакокинетические свойства исследуемого вещества в плазме крови крыс при внутривенном пути введения.

Исследовать фармакокинетические свойства соединения РУ- при пероральном пути введения. Рассчитать значение абсолютной биодоступности.

Определить фармакокинетические свойства исследуемого вещества при подкожном введении. Рассчитать значение абсолютной биодоступности.

Исследовать распределение соединения РУ-1205 по органам и тканям крыс.

Изучить процессы экскреции субстанции соединения РУ-1205.

обезболивающими свойствами исследуемого вещества.

Исследовать возможный метаболизм соединения РУ-1205 in silico, а также in vivo по результатам взаимодействия изучаемого вещества со специфическими тест-субстратами цитохромов P450.

оболочкой, капсул соединения РУ-1205 при пероральном введении и его лиофилизата при внутривенном и подкожном путях введения. Рассчитать относительную биодоступность лекарственных форм изучаемого вещества.

определения соединения РУ-1205 в биологических тканях, исследованы фармакокинетические свойства при внутривенном, пероральном и подкожном путях введения у крыс, при этом определены основные параметры распределения и элиминации изучаемого вещества. Впервые были рассчитаны величины абсолютной биодоступности соединения при внесосудистых путях введения были изучены возможные процессы биотрансформации производного имидазобензимидазола. Впервые экспериментально определена зависимость фармакодинамических свойств соединения РУ-1205 от его фармакокинетики в плазме крови, оценены фармакокинетические свойства таблеток, покрытых оболочкой, капсул при пероральном пути введения, а также лиофилизата при внутривенной и подкожной инъекции соединения РУ-1205. Определены параметры относительной биодоступности лекарственных форм изучаемого вещества Теоретическая и практическая значимость работы. Получены данные о фармакокинетических процессах соединения РУ-1205 в организмах крыс и кроликов. Установлены принципиальные параметры – абсолютная биодоступность субстанции изучаемого вещества и относительная биодоступность его лекарственных форм при внутривенном, пероральном и фармакокинетическими и антиноцицептивными свойствами соединения РУа также получены данные о возможных путях его метаболизма.

Методология и методы исследования. Согласно поставленным задачам выбраны современные методические подходы, имеющиеся в ВолгГМУ. В качестве объекта исследования использованы субстанция соединения РУ- и его лекарственные формы, представленные в виде таблеток, покрытых оболочкой, капсул, а также лиофилизата. Основные методы исследования:

физико-химический высокоэффективная жидкостная хроматография биологическом материале); исследование конкурентного взаимодействия соединения РУ-1205 со специфическими тест-субстратами цитофхромов Р450;

компьютерный метод in silico (прогноз возможных метаболитов изучаемого вещества), статистический анализ результатов.

Положения, выносимые на защиту:

(2-морфолиноэтил)-2-(4-фторфенил)имидазо[1,2-]бензимидазола лабораторным шифром РУ-1205 в биологическом материале. Изучаемое вещество определяется на хроматографе с УФ-детектором при длине волны нм. Температура термостатирования колонки 50 С. Мобильная фаза:

ацетонитрил:КН2РО4 (рН=5,0) 1:1 (v:v). Скорость потока мобильной фазы – мл/мин. При этом чувствительность метода составила - 0,5 мкг/мл. Средняя ошибка измерения – 11,85 %, а воcпроизводимость и повторяемость метода % и 20 % соответственно;

При внутривенном введении в дозе 10 мг/кг соединение РУ- циркулирует в плазме крови крыс на протяжении 12 часов. Установлено, что пик концентрации наблюдается через 5 минут после введения и составляет 1, мкг/мл. Экскретируется преимущественно почками на протяжении 72 часов;

При пероральном введении в дозе 50 мг/кг изучаемое вещество наблюдается в плазме крови крыс на протяжении 12 часов. Выявлено, что максимальная концентрация наблюдается через 1 час после начала эксперимента и составляет 1,04 мкг/мл. Величина абсолютной биодоступности при данном пути введения у крыс составляет 37,34 %. Выводится преимущественно через почки в течение 96 часов;

При подкожном введении в дозе 50 мг/кг соединение РУ- циркулирует в плазме крови крыс на протяжении 12 часов. Максимальная концентрация наблюдается через 30 минут после введения и составляет 10, мкг/мл. Величина абсолютной биодоступности при подкожной инъекции составляет 49,02 %. Экскретируется в основном почками на протяжении часов;

Время достижения максимальной концентрации соединения РУв крови крыс опережает время наступления максимального обезболивающего эффекта при пероральном введении на 3 часа и при подкожном – на 30 минут;

соединения РУ-1205 составила: для таблеток, покрытых оболочкой - 105,3 ± 11,70 %; для капсул - 109,53 ± 6,76 %; для лиофилизата при внутривенном введении - 98,72 ± 8,72 %; для лиофилизата при подкожном введении - 81,94 ± 10,12 %.

Внедрение результатов исследования. Данные о фармакокинетических и фармакодинамических свойствах нового агониста -опиоидных рецепторов используются в лекционном материале на кафедре фармакологии, кафедре фармакологии и биофармации ФУВ, кафедре фармацевтической химии Волгоградского государственного медицинского университета,. В работе НИИ фармакологии ВолгГМУ, Волгоградского научного медицинского центра применяется метод количественного определения соединения РУ-1205.

Связь темы исследования с проблемным планом фармацевтических фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу» в рамках госконтракта № 11411.1008700.13.090 от 13.09.2011 по теме «Доклинические исследования лекарственного средства с каппа-опиоидной агонистической активностью на основе производного имидазобензимидазола».

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность экспериментальных исследований, выполненных на большом количестве крыс и кроликов. Использованы современных методы и методические подходы для изучения фармакокинетических процессов, высокотехнологичное статистической обработки результатов с использованием параметрических и непараметрических критериев.

фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012); IV Всероссийском научно-практическом семинаре для молодых ученых с международным участием «Современные проблемы медицинской химии.

Направленный поиск новых лекарственных средств», Волгоград 2012; первой всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Проблемы разработки новых лекарственных средств» (Москва, 2013); XVIII Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области, 2013 г;

70,71,72-й итоговой научных конференциях студентов и молодых ученых Волгоградского государственного медицинского университета, Волгоград 2012, 2013, 2014 гг.; IV Всероссийская научная конференция студентов и аспирантов с международным участием «молодая фармация – потенциал будущего»

(Санкт-Петербург, 2014).

По теме диссертации опубликовано 16 работ, в том числе 3 в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных Минобрнауки РФ.

Личный вклад автора.

Автором самостоятельно проведен поиск и анализ зарубежных и отечественных источников литературы по теме: «Фармакодинамика и фармакокинетика каппа-агонистов». Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования по изучению фармакокинетических свойств нового конденсированного производного бензимидазола – соединения РУ-1205: решения поставленных задач, обсуждения результатов, разработке практических рекомендаций. Автору принадлежит ведущая роль в проведении экспериментальных исследований на всех его этапах. При написании диссертационной работы автором лично выполнен сбор первичных данных, статистическая обработка, анализ и обобщение полученных результатов, формулировка выводов и практических рекомендаций, оформление рукописи.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 107 страницах машинописного текста и состоит отечественные и зарубежные источники.

Работа иллюстрирована 17 таблицами и 20 рисунками.

ГЛАВА 1. ФАРМАКОДИНАМИКА И ФАРМАКОКИНЕТИКА

АГОНИСТОВ КАППА-ОПИОДНЫХ РЕЦЕПТОРОВ (ОБЗОР

ЛИТЕРАТУРЫ) Купирование болевого синдрома является ключевым фактором в современной медицине [Reid K.J., Harker J. et al, 2011]. Несмотря на наличие значительного количества анальгетических препаратов, до сих пор не решен вопрос эффективного и безопасного лечения боли [Richards N., McMahon S.B.].

В клинической практике наиболее часто применяют опиоидные антиноцицептивные средства [Katz N., Benoit C.]. Каудилл-Слосберг один из первых продемонстрировал что применение опиоидов выросло в два раза с 8% в 1980 году до 16% в 2000 году [Caudill-Slosberg M.A., Schwartz L.M., Woloshin S. Et al. 2004]. В другом исследовании выявлено, что в 2007 году рецептов на опиоиды было выписано 29 % взрослого населения США [Centers for Disease Control and Prevention. Adult use of prescription opioid pain medications, 2010]. В США с 1999 по 2010 год применение морфина выросло с 96 мг до 710 мг на человека [Laxmaiah M., et al., 2012]. Однако, в результате исследований было обнаружено, что 40% послеоперационных больных сообщали о неполном облегчении боли при приеме опиоидов, а половина пациентов с неизлечимыми заболеваниями имели умеренную или сильную боль во время последних дней жизни [Brennan F., Daniel B. Carr, M. Cousins, 2007]. Недостаточная анальгезия при использовании наркотических обезболивающих средств часто происходит из-за намеренного применения заниженных доз. Это связано с возможным развитием наркомании или из-за присутствия типичных побочных эффектов, характерных для данных препаратов [Kaye A.M., Kaye A.D., Lofton E.C., 2013].

Наркотические анальгетики обеспечивают облегчение боли через действие на мю, каппа и/или дельта рецепторы, которые распределены по центральной и периферической нервной системе. Активация каждого из типов рецепторов характеризуется развитием специфических реакций. Так, например, при активации -опиодных рецепторов характерны следующие эффекты: аналгезия, седативный, противокашлевый эффекты, эйфория, зависимость, угнетение дыхания, миоз, запор [Laxmaiah M., et al., 2012; Плелинцев М., 2012]; при активации каппа-рецепторов – аналгезия, седативный эффект, дисфория, миоз, менее выраженное, чем у мю-агонистов, угнетение дыхательного центра [Плелинцев М., 2012; Carlezon W.A. Jr. Et al., 2009]; и при активации дельтаопиоидных рецепторов – аналгезия, стимуляция дыхания, дисфория, галлюцинации и тахикардия [Плелинцев М., 2012]. Наиболее часто в клинической практике используют препараты, которые неселктивно действуют на опиоидные рецепторы [Seddon R. Savage et al, 2008]. Однако, активация рецепторов вызывает ряд серьезных побочных эффектов (табл 1.1) – наркогенный потенциал, эйфория, тошнота, рвота, головокружение, седативный эффект, когнитивные дисфункции, зуд, потливость, обстипация и респираторная депрессия [Lahmaiah M., Salahadin A., Sairam At. et al. 2012].

Последний связан с непосредственным влиянием наркотических анальгетиков на дыхательный центр. Респираторные депрессии характеризуются снижением объема вдыхаемого воздуха, урежением частоты дыхания и гипоксией [Shahrokh C. Bagheri, 2014]. Существуют серьезные доказательства того, что даже низкие дозы морфина - 40 мг или 50 мг в сутки могут вызвать передозировку и привести к летальному исходу [Laxmaiah M., Salahadin A., 2012]. С этим связано почти 15 000 летальных исходов в год, число которых возросло с увеличением количества выписываемых рецептов на опиоидые анальгетики [Manchikanti et al. 2012].

Существует также значительная обеспокоенность по поводу опиоидной зависимости и толерантности.[Brennan F., Daniel B., Carr M. Cousins, 2007].

При длительном использовании наркотических анальгетиков развивается необходимости повышать дозу применяемого препарата [Seddon R. Savage et al, 2008]. Физическая зависимость проявляется в результате резкого прекращения поступления вещества в организм, при снижения его концентрации в крови или при использовании антагониста [ASAM, 2001].

Побочные эффекты, характерные для неселктивных агонистов опиоидных рецепторов (Источник: Канадское руководство по эффективному и безопасному использованию опиатов при хронической неонкологической боли.

2010) По сравнению с агонистами мю-опиоидных рецепторов, у каппаагонистов реже встречаются такие побочные эффекты как: дыхательная депрессия, и тошнота, а также для них не характерна зависимость [Seddon R.

Savage, M.D..et al., 2008]. По мнению ряда исследователей именно каппарецепторная система является самой перспективной с точки зрения клинической проблемы боли и ее облегчения [Елисеева Н.В., 2010].

ФАРМАКОДИНАМИКА КАППА-ОПИОИДНЫХ АГОНИСТОВ

По литературным данным [Smith H.S. 2012; Осипова Н.А. 1998] агонисты фармакологических реакций, в том числе и анальгетический ответ.

анальгетического эффекта агонистов каппа-опиоидных рецепторов зависит от типа раздражителя. Максимальный эффект наблюдается при воздействии на организм механических и химических раздражителей. Однако, при тепловом воздействии наблюдается наименьшее развитие обезболивания. Агонисты каппа-опиоидных рецепторов обладают также противовоспалительной активностью и эффективны при артрите [Kaye A.M. 2013; Bileviciute-Ljungar, I.

2006]. Следует отметить, что на развитие антиноцицептивного эффекта каппаагонистов существенное влияние оказывает половой признак, однако, при купировании воспалительных реакций отличий установлено не было [Walker J.S. 2003]. Также установлено, что данные препараты оказывают мощное обезболивающее действие при развитии висцеральной боли [Riviere P.J. 2004].

Активация каппа-опиоидных рецепторов также приводит к развитию противозудного [Inan S. 2004], диуретического эффектов [Barber A. 1997;

DeHaven-Hudkins D.L. 2004], нейропротекторного действия [Tortella F.C. 1994] и модуляции иммунного ответа [McCarthy L. 2001], а также подавление ВИЧ- экспрессии [Peterson P.K., 2001]. Агонисты каппа-опиоидных рецепторов могут использоваться в качестве средств, снижающих последствия абстинентного синдрома после приема морфина [Munro T.A. 2012]. Однако, наличие дисфории и седации у данных препаратов (U-50,488, спирадолин, бремазоцин и др.) ограничивает их клиническое использование [Pfeiffer A. 1987, Mello N.K. 2000].

Важно отметить, что каппа-агонисты снижают мезолимбический уровень дофамина и, тем самым, могут использоваться в качестве антагонистов кокаина. Таким образом, данные препараты являются потенциальными средствами для лечения наркоманий [Mello N.K. 2000]. Однако, следует отметить, что применение каппа-агонистов в качестве антинаркотических средств целесообразно только в случае купирования острой тяги к кокаину. Это обусловлено тем, что при хроническом приеме лигандов каппа-рецепторов возможно развитие реакций, подобных тем, которые вызывает кокаин [McLaughlin J.P. 2005, Negus S.S. 2004].

На сегодняшний день разработан целый ряд лигандов каппа-опиоидных рецепторов. Однако из селективных агонистов данных рецепторов ни один препарат не нашел применения в клинической практике [Aldrich V. J., 2009].

Применяемые в клинике анальгетические препараты являются смешанными агонистами-антагонистами опиоидных рецепторов [Barber A. 1997, DeHavenHudkins D.L. 2004].

Так, к классу смешанных опиоидных агонистов–антагонистов относятся два препарата – пентазоцин и буторфанол, которые являются агонистами k- и антагонистами –опиоидных рецепторов. Как агонисты k–рецепторов, эти опиоиды вызывают менее выраженную анальгезию, чем морфин, и имеют несколько иной спектр побочных эффектов (преобладает седация, реже проявляются тошнота, головокружение, депрессия дыхания). Будучи антагонистами –рецепторов, опиоиды этого класса могут ослаблять или устранять действия классических опиоидных агонистов, включая анальгезию [Лебедева, Р.Н. 1998, Осипова Н.А. 1998, WHO Expert Committee on Drug Dependence 2003].

Буторфанола тартрат является агонистом каппа- и слабым антагонистом мю-опиоидных рецепторов. При исследовании радиолигандного связывания было показано, что буторфанол взаимодействует как с -, так и с опиоидными рецепторами [WHO Expert Committee on Drug Dependence 2006]. В результате взаимодействия с каппа-рецепторами у него сильно выражены анальгетические свойства и седация, а при мю-антагонистическом действии буторфанол ослабляет основные побочные эффекты наркотических анальгетиков и в меньшей степени влияет на дыхание и кровообращение. По своему анальгетическому потенциалу он уступает морфину, но превосходит действие тримепередина. В доклинических исследованиях буторфанол проявляет анальгетическую активность на различных экспериментальных моделях при введении крысам и приматам. В клинике буторфанол используется для лечения умеренной и сильной острой боли при ожогах, почечных коликах и в хирургии. Послеоперационное использование буторфанола вызывает обезболивание у 89% пациентов в течение двух дней после оперативного вмешательства. Буторфанол в виде парентеральных инъекций может быть использован в терапии хронической боли в онкологической и неврологической внутримышечном введении каждые 3-4 часа в течение 2-34 недель оценивали у 63 больных с хроническим болевым синдромом в связи с злокачественными заболевания и обнаружили, что высокий уровень обезболивания наблюдается у 51% больных и умеренно выраженная аналгезия - у 30% пациентов [WHO Expert Committee on Drug Dependence 2006]. Буторфанол в дозе 0,07 мг/кг при в/м введении не оказывает отрицательного действия на тонус и моторику ЖКТ, является препаратом выбора после операции в абдоминальной хирургии. Не вызывает физической и психической зависимости [Guzman D.S. 2014].Со стороны сердечно-сосудистой системы буторфанол не изменяет частоту сердечных сокращений и кровяное давление. Однако показано, что некоторые параметры сердечно-сосудистой системы могут быть изменены под его воздействием. Буторфанол в дозе 0,025 мг / кг при внутривенном введении увеличивает давление в легочной артерии, диастолическое давление, системное артериальное давление и сердечный индекс [WHO Expert Committee on Drug Dependence 2006].

Характерной особенностью -агонистов является их способность относительно резко увеличивать диурез. Так, буторфанол умеренно повышает диурез у крыс и мышей, но гораздо меньше, чем этилкетоциклазоцин или U50,488, которые являются полными агонистами -рецепторов [Leander J.D.

1987,. Horan P.J. 1989] Однако, при экспериментах на приматах повышение диуреза не наблюдалось [Butelman E.R. 1995]. Это наблюдение согласуется с понятием, что буторфанол может быть частичным агонистом -опиоидных рецепторов и имеет большую -рецепторную активность у грызунов, чем у приматов. Существуют данные, что буторфанол может вызывать различное по силе обезболивание в зависимости от полового признака. В частности, половые различия наблюдаются у грызунов и приматов после введение буторфанола, который является более мощным и эффективным у самцов, чем у самок [Guzman D.S. 2014]. Половые различия в поведении могут возникнуть в результате эффектов циркулирующих в организме половых гормонов или генетических различий во время формирования половых хромосом [Russell S.E.

2013].

Буторфанол, как морфин и бупренорфин, проявляет дозозависимую релаксацию мышц, блокируемую налоксоном у макак-резусов [Woods J.H.

1985]. Однако более поздние исследования показали, что мягкая седация или расслабление мышц наблюдалось только у буторфанола и морфина [Butelman et Такие -агонисты как MR 2033, U50, 488 и этилкетокезацин al. 1995].

проявляют гораздо большее расслабление мышц, и седативный эффект, чем морфин, бупренорфин или буторфанол [WHO Expert Committee on Drug Dependence 2006]. В клинике наиболее частый побочный эффект -агонистов – седация – наблюдается у 43 % принимающих данные препараты. Также характерны головокружение и тошнота – у 19 % и 13 % соответственно [Bethesda M.D: 2005].

Пентазоцин, который является агонистом - и частичным антагонистом опиоидных рецепторов, часто применяется для купирования болевого синдрома в акушерстве и гинекологии, так как обладает свойством незначительно угнетать дыхательный центр [Carlezon, W.A. 2009].

Антиноцицептивный эффекты пентазоцина проявляется значительно выше у самцов, чем у самок мышей в тестах «горячая пластина», «уксусные корчи», «формалиновая алгезия» и «tail-flick». Эти половые различия проявляются у гетерозиготных мышей, лишенных гена -опиоидного рецептора. Однако половые различия антиноцицептивных эффектов пентазоцина у мышей дикого типа могут быть незаметны [Mogil J.S. 2003, Craft R.M. 2001, Ide S. 2011]. Было показано, что U50488H, селективный агонист рецептора и другие подобные опиоиды, например, U-69593 и бремазоцин являются более эффективными, у самцов, чем у самок [Ide S. 2011]. Кроме того, самки мышей могут дифференцированно реагировать в тестах боли на различных этапах их эстрального цикла [Mogil J.S. 2000]. Однако, в противоположность выше сказанному, существуют некоторые противоречивые исследования с участием людей, в результатах которых сообщается, что послеоперационной боли были выше у женщин, чем у мужчин [Gear R.W. 1996, 1999].

За прошедшие три десятилетия были потрачены значительные усилия на поиск и изучение селективных каппа-агонистов. В 1980-х годах несколько научно-исследовательских программ рассматривали избирательные агонисты каппа-опиоидных рецепторов в качестве потенциальных средств лечения боли [Von Voigtlander P.F. 1982, Szmuszkovicz J. 1982, Inui S. 2012, Nemoto T. 2013].

Предполагалось, что такие препараты обладают болеутоляющими свойствами и лишены побочных эффектов морфиноподобных веществ - физической зависимости и угнетения дыхания. Синтез и изучение аналогов арилацетамида привели к созданию мощного класса агонистов КОР. В частности, в 1982 году выявлен селективный агонист каппа-опиодных рецепторов U-50, [Szmuszkovicz j. 1982]. Впоследствии был синтезирован целый ряд соединений, избирательно действующих на каппа-опиоидные рецепторы [Nemoto T. 2013].

Примерами таких веществ являются: U62,066 (спирадолин); U69,593 и CI- (энадолин) [Wadenberg M.L. 2003]. Установлено, что данные препараты характеризуются антиноцицептивными свойствами в экспериментальных моделях на животных. Однако, в дальнейшем у производных арилацетомида были выявлены побочные эффекты, проявляющиеся в виде психосоматических расстройств [Nemoto T. 2013]. Впоследствии эти соединения начали использоваться только в доклинических исследованиях [Carlezon W.A. 2009].

Дальнейший поиск селективных агонистов КОР выявил соединения с тирозинглицин-дипептидным основанием, структура которых лежит в основе эндогенных опиоидов. Представителем данного класса соединений является препарат налфурафина гидрохлорид (лабораторный шифр TRK-820) [Nemoto T.

2013]. Существуют также агонисты каппа-опиоидных рецепторов, являющиеся производными растений. Наиболее известный представитель – сальвинорин А [Inan S. 2009].

Сальвинорин А - один из первых селективных каппа-опиоидных агонистов. Соединение представляет собой активный компонент растения шалфей наркотический - Salvia divinorum [Wang et al. 2005? Prisinzano T.E 2008]. В результате ранее проведенных исследований было установлено, что сальвинорин А является мощным и высокоселективным агонистом каппаопиоидных рецепторов и характеризуется большей эффективностью, чем синтетические каппа-агонисты – U-50,488 и U-60,593 [Carlezon W.A. 2006].

Сальвинорин А при системном введении вызывает изменение в поведении крыс. Так, в тесте свободного плавания, часто используемого для изучения депрессивных свойств у животных [Cryan et al. 2002 ], было установлено, что под влиянием сальвинорина А в диапазоне доз 0,125-2 мг/кг увеличивалось время неподвижного состояния у крыс по отношению к контролю [Butelman E.R. 2004, Carlezon W. A. 2009, Zhang Y. 2005]. Также выявлено, что соединение U-60,593 проявляет подобные эффекты в аналогичных тестах [Mague S.D. 2003, Todtenkopf M.S. 2004 ]. Учитывая, что сальвинорин А мало или вообще не связывается с другими типами рецепторов в головном мозге, по полученным в экспериментах данным можно предположить, что стимуляция каппа-рецепторов может привести к развитию депрессии [Carlezon W.A. 2006, Zhang Y. 2005]. Механизмы, лежащие в основе данного эффекта, не ясны.

Возможно сальвинорин А, селективно действуя на каппа-рецепторы, влияет на функционирование дофаминовой системы. Предполагается, что мезолимбическая дофаминовая система, участвующая в формировании настроения, модулируется норадренергической и серотониновой системами, а также эндогенными опиатами [Carlezon W.A. 2006, Simonson B. 2014].

Последние могут оказывать существенные влияния на настроение человека [Sheffler D.J. 2003, Simonson B. 2014]. В ранее проведенных исследованиях было выявлено, что синтетические каппа-агонисты (U-50,488 или динорфина) при системном или интрацеребровентрикулярном введении снижают внеклеточные концентрации дофамина [Devine D.P. 1993; Maisonneuve I.M.

1994]. Предполагается, что каппа-опиоидные рецепторы локализуются на окончаниях дофаминовых нейронов, где способны регулировать высвобождение дофамина [Margolis E.B. 2003]. С помощью полученных данных появилась возможность поднять вопрос об использовании в клинике селективных каппа-агонистов в качестве антидепрессантов и средств для лечения наркоманий [Pliakas A.M. 2001, Mague S.D. 2003]. Однако, в исследованиях с участием людей было показано, что сальвинорин А вызывает галлюциногенный эффект в дозе 500 мг [Butelman E.R. 2004].

Активация каппа-опиоидных рецепторов традиционными агонистами, такими как U-50,488, U-69,593 и сальвинорином А в экспериментальных моделях приводила к развитию таких побочных эффектов как седация, дисфория и депрессии [Wee S. 2009; Morani A.S. 2009], что ограничивает их клиническое использование. Было установлено, что у сальвинорина А менее выражены нежелательными реакциями, но более короткое время действия[Butelman E.R 2009, Teksin Z.S. 2009, Ranganathan M. 2012]. В связи с чем, некоторые исследователи [Prisinzano T.E. 2008, Lovell K.M. 2011], используя его уникальную структуру, синтезировали новые соединения, обладающие селективностью по отношению к каппа-опиоидным рецепторам.

Так, например, было показано, что сальвинорин В в доклинических исследованиях проявляет эффекты, аналогичные сальвинорину А, при этом побочные эффекты, характерные для последнего, зарегистрированы не были [Prevatt-Smith K.M. 2011]. По результатам анальгетических исследований было выявлено, что сальвинорин В характеризуется более продолжительным антиноцицептивным эффектом в тесте электрического отдергивания хвоста у мышей [Simonson B. 2014]. Кроме того, данное соединение приблизительно в 10 раз активнее сальвинорина А в исследованиях in vitro [Munro T.A. 2008] и in vivo на грызунах [Baker L.E. 2009]. Также установлено, что сальвинорин В, как и его природный аналог, ослабляет наркотический эффект кокаина [Simonson B. 2014].

По данным литературы [Inan S. 2006, 2009] другой селективный агонист каппа-опиоидных рецепторов - налфурафин - изначально выступал как антиноцицептивный препарат, однако в дальнейшем было обнаружено его противозудное действие. Также было показано, что налфурафин, как и соединение U-50,488, ингибирует эффект встряхивания головой по типу «мокрой собаки» и абдоминальные корчи у крыс, вызванные ицилином.

Предполагается, что налфурафин блокиурет ицилин-индуцированное высвобождение глутамата в спинном стриатуме и, тем самым, ингибирует вышеуказанные эффекты. В то же время, агонисты периферических каппаопиодных рецепторов не вызывают подобных реакций [Werkheiser J.L. 2007].

При анализе ранее проведенных исследований было отмечено, что агонисты каппа-опиодных рецепторов индуцируют диурез у животных и человека. Каппа-агонисты вызывают мочегонный эффект у мышей, крыс, собак, обезьян и людей. В частности, при введении налфурафина (0.005-0. мг/кг), сальвинорина B (0,1-10 мг/кг) и соединения U-50,488 (0.625-5 мг/кг) увеличивается диурез у крыс. В тоже самое время, сальвинорин А не оказывает диуретического эффекта [Inan S. 2009]. Отсутствие мочегонного эффекта у сальвинорина А объясняется непродолжительностью его действия. Также было высказано предположение, что сайт взаимодействия сальвинорина А с каппаопиоидными рецепторами отличается от его аналогов [Prisinzano T.E. 2008].

Стоит отметить, что увеличение диуреза происходит без увеличения экскреции ионов Na+ [Gottlieb H.B. 2005]. Например, было показано, что норфуларфин вызывает диурез без электролитного дисбаланса у крыс – при исследовании нескольких доз преапарата уровень сывороточного натрия оставался в пределах физиологической нормы. Более того, при инъекции норфуларфина в течение дней объем экскретируемой мочи оставался на постоянном уровне, что подтверждает отсутствие толерантности к диуретическому эффекту [Inan S.

2009].

Соединение U-60,593 проявляет антиноцицептивный эффект. Так, было показано, что в анальгетическом тесте «уксусные корчи» данное вещество оказывало выраженное анальгетическое действие. Однако, в тесте свободного плавания оно вызывает депрессию у экспериментальных животных [Negus S.S.

2010].

Побочные эффекты, вызываемые центрально действующими агонистами КОР, привели к необходимости поиска и изучения лигандов, влияющих на периферические рецепторы [DeHaven-Hudkins D.L. 2004, Riviere P.J. 2004].

Одним из первых препаратов подобного действия является федотоцин, который изначально выступал как средство, применяемое при синдроме раздраженного кишечника и диспепсии [Delvaux M. 2001]. В дальнейшем данный препарат оказался недостаточно эффективным, и его клиническое применение было приостановлено [Callahan M. J. 2002].

клинические испытания и оказался также эффективным при синдроме раздраженного кишечника и диспепсических расстройствах. Однако было выявлено, что в больших дозах (более 10 мг) азимадолин развивает сильную болевую реакцию, хотя появление данного эффекта не опосредовано влиянием на опиоидные рецепторы [Aldrich V.J. 2009].

На сегодняшний день существуют также агонисты каппа-опиоидых рецепторов, имеющие пептидное строение. Наибольший интерес из данного класса соединений представляет производное динорфина А – соединение ЕYoshino H. 1990]. Анальгетическая активность данного пептида была изучена на обезьянах [Butelman E.R. 2004] и грызунах [Takahiro N. 1991]. В результате исследований селективности соединения Е-2078 было установлено, что в развитии анальгетического ответа ключевую роль играют именно каппаопиоидные рецепторы [Nakazawa T. 1991]. Также было показано, что Е- повышает уровень пролактина в сыворотке и индуцирует диурез. Однако аналог динорфина А проникает через ГЭБ и вызывает типичные побочные эффекты непептидных каппа-агонистов [Butelman E. R. 1999].

характеризуется более высокой селективностью в отношении каппарецепторов. Данное соединение проявляет анальгетическую активность в тестах уксусные корчи и горячая пластина у мышей при подкожном и интратекальном введении. В дальнейшем было установлено, что антиноцицептивная реакция опосредована влиянием соединения как на каппа-, так и на мю-опиоидные рецептороы [Aldrich V.J. 2009].

По литературным данным [Гречко О.Ю. 2007, Елисеева Н.В. 2010], соединения из нового класса конденсированных производных бензимидазола могут являться агонистами каппа-опиоидных рецепторов. Так, было выявлено вещество под лабораторным шифром РУ-1205. Установлено, что для данного соединения характерна анальгетическая активность на различных моделях ноцицептивных реакций, вызванных термическими (тест горячая пластина – супраспинальный уровень болевой чувствительности), электрическими (тест отдергивания хвоста – спинальный уровень организации болевой чувствительности) и химическими (тест уксусные корчи – периферический уровень организации болевой чувствительности) стимулами. Для соединения РУ-1205 наиболее выраженная антиноцицептивная активность характерна в тесте «горячая пластина». Следует отметить, что уровень обезболивающего эффекта превосходит таковой у буторфанола тартрата в диапазоне доз 0,01 - мг/кг. Каппа-опиоидный механизм действия соединения РУ- подтверждается блокированием анальгетической реакции селективным блокатором -рецепторов норбиналторфимином [Спасов А.А. 2013].

Соединение РУ-1203 является близким по структуре и активности соединению РУ-1205. Было установлено, что соединение РУ-1203 в диапазоне доз 0,01-1 мг/кг на различных экспериментальных ноцицептивных моделях проявляет выраженную анальгетическую активность, по некоторым показателям превышающую препарат сравнения буторфанола тартрат.

Анальгетический эффект исследуемого соединения на 90% блокировался неселективным антагонистом опиоидных рецепторов налоксоном, что подтверждает опиоидергический механизм его обезболивающего действия.

Установлено, что соединение РУ-1203 обладает мембранотропным действием.

Так, было выявлено, что под влиянием данного вещества происходит дозозависимое снижение натриевых, кальциевых и калиевых ионных токов.

Вероятно, это обусловлено взаимосвязанным функционированием каппарецепторов и ионных каналов. [Елисеева Н.В. 2009]. По литературным данным [Su X. et al., 2002] соединение U-50,488 и препарат бремазоцин также подавляют высокопороговые Ca2+ токи в сенсорных нейронах ободочной кишки крысы.

ФАРМАКОКИНЕТИКА КАППА-ОПИОИДНЫХ АГОНИСТОВ

Для облегчения сильной или умеренной боли буторфанола тартрат вводят внутримышечно или внутривенно [Vachharajani N.N. 1997]. При инъекционных путях введения препарат активно распределяется по органам и тканям, а также связывается с белками плазмы крови приблизительно на 80 %. Буторфанол быстро проникает через плацентарный барьер, а также распространяется в грудное молоко [WHO Expert Committee on Drug Dependence, 2006]. При пероральном приеме данный препарат подвергается активному метаболизму в печени и его абсолютная биодоступность составляет порядка 5 %. При внутривенном введении радиоизотопов буторфанола выявлено, что в моче определяется только 5 % неизмененного препарата. При дальнейшем исследовании метаболизма было установлено, что буторфанол подвергается первой и второй фазе биотрансформации [Vachharajani N.N. 1997]. Так, было гидроксибуторфанол, норбуторфанол и глюкоронидные конъюгаты [Gaver R.C.

1980].

биодоступности была разработана трансназальная лекарственная форма фармакокинетических исследований было показано, что после данного типа введения буторфанол определяется в плазме крови на протяжении 24 часов.

Максимальная концентрация препарата наблюдается через 30-60 мин после однократного введения и составляет 0,9-1,04 нг/мл [WHO Expert Committee on Drug Dependence 2006]. При этом период полувыведения составляет порядка часов [Boulton D.W. 2002]. Установлено, что абсолютная биодоступность буторфанола тартрата при интраназальном введении составляет 70 % [Shyu W.

C. 1993].

трансназального введения была выявлена только гидроксилированная форма исходного соединения. Было показано, что более продолжительный период полувыведения гидроксибуторфанола характеризует более медленные процессы элиминации данного соединения [Vachharajani N. N. 1997]. При исследовании обезболивающей активности метаболитов буторфанола установлено, что они не проявляют данного фармакологического эффекта [WHO Expert Committee on Drug Dependence 2006].

При исследовании фармакокинетических свойств пентазоцина было выявлено, что данный препарат после внутривенного введения циркулирует в плазме крови человека на протяжении 6 часов [Pittman K. A. 1974]. Период полувыведения пентазоцина составляет порядка 2 часов [Pittman K. A. 1974, Yeh S.Y. 1986]. При внутримышечном введении препарата наблюдается быстрая фаза всасывания и длительная элиминация. Так, было показано, что при введении в мышцу 40 мг пентазоцина максимальная концентрация наблюдалась уже через 15 мин. По литературным данным [Yeh S.Y. 1986] установлено, при в/м введении пентазоцин также циркулирует в плазме крови на протяжении 6 часов. При пероральном применении данный препарат хорошо всасывается из ЖКТ. Максимальная концентрация наблюдается через 2 часа после начала эксперимента. Однако после попадания в печень подвергается активному метаболизму – абсолютная биодоступность составляет порядка 20 % [Tegeder I, 1999].

Пентазоцин подвергается достаточно активному метаболизму. Так, было фармакокинетической кривой пентазоцина в плазме крови после прохождения через печеночный барьер составляет всего 14 % от исходной. Данные по экскреции подтвердили эти результаты – суммарно с мочой выводится 13 % от первоначальной дозы неизменного вещества [Pittman K.A. 1974]. В процессе метаболизма образуются гидроксилированные и окисленные формы пентазоцина, которые в дальнейшем экскретируются в виде конъюгатов [Pittman K.A. 1974, Tegeder I, 1999]. Накопленный фактический материал позволяет заключить, что при пероральном применении препарата наблюдаются значительные межличностные различия в скорости метаболизма [Tegeder I, 1999]. С помощью этих данных можно объяснить изменение анальгетической активности пентазоцина в зависимости от индивидуума [Hoskin P.J. 1991]. Согласно литературным данным [Tegeder I, 1999] экскретируется пентазицон в основном почками – порядка 30 % - в виде конъюгатов с глюкуроновой кислотой.

Селективный агонист каппа-опиоидных рецепторов растительного происхождения сальвинорин А характеризуется короткой продолжительностью действия, что обосновывается его фармакокинетическими свойствами [Schmidt, M.D. 2005]. По литературным данным [Teksin Z.S. 2009], было установлено, что данное соединение после внутрибрюшинного введения циркулирует в плазме крови на протяжении 4 часов, при этом в головном мозге обнаруживается только на протяжении 1 часа исследования, а его максимальная концентрация в данном органе наблюдается через 10 минут, чем можно объяснить быстрое начало галлюциногенного эффекта. В результате предварительно проведенных исследований было установлено, что Сальвинорин А является субстратом Ргликопротеинового транспортера и характеризуется высоким аффинитетом к нему, однако, несмотря на это, данное соединение характеризуется высокой степенью липофильности (XlogP = 2.3) [Prisinzano T.E. 2005, Babu K.M. 2008,], что объясняет высокую скорость преодоления ГЭБ [Teksin Z. S. 2009].

При рассмотрении химической структуры сальвинорина А можно предположить, что данный препарат является субстратом ферментов семейства CYP450, а также способен связываться с глюкуроновой кислотой. В процессе исследований метаболизма сальвинорина А in vitro было установлено, что следующие изоформы ферментов семейства CYP450 могут принимать участие в биотрансформации данного соединения - CYP2D6, CYP1A1, CYP2C18 и CYP2E1 [Teksin Z. S. 2009].

Синтетический селективный агонист каппа-опиоидных рецепторов Uхарактеризуется различными фармакокинетическими свойствами у самок и самцов при внутрижелудочном введении крысам. Так, было установлено, что в течение эксперимента у самок отмечались большие концентрации соединения U-50,488 в плазме крови, чем у самцов – площадь под фармакокинетической кривой у крыс женского пола превышает данный показатель у мужского в три раза. Максимальная концентрация данного вещества наблюдалась через 15 минут после введения, при этом у самок ее значение превосходило таковое у самцов приблизительно в два раза. Также было показано, что при пероральном введении соединения отмечались большие значения абсолютной биодоступности у самок, чем у самцов крыс [Russell S. E.

2013]. Однако, период полувыведения соединения U-50,488 не имеет отличий у обоих полов и составляет в среднем 2,5 часа. Также концентрации вещества в головном мозге у самцов и самок носят схожий характер [Gandhi M. 2004, Russell S. E. 2013]. Причины данных различий в фамракокинетике соединения U-50,488 между полами неизвестны. Предполагалось, что они обусловлены различным по силе сродством к транспортерам в организме животных и людей.

Однако, в дальнейшем было установлено, что соединение U-50,488 не является субстратом Р-гликопротеинового транспортера [Russell S. E. 2013].

Селективный агонист периферических каппа-опиодных рецепторов – азимадолин после перорального введения крысам абсорбируется из ЖКТ в среднем на 80 % [Kramer H.J. 2000, Camilleri M. 2008]. При приеме внутрь у людей максимальная концентрация препарата отмечается через 30 минут – часа после введения 5 мг. Период полувыведения составляет порядка 5,5 часов [Camilleri M. 2008]. Биодоступность при данном пути введения составляет порядка 14 %, 6 % и 40 % у крыс, обезьян и людей соответственно [Bagnol D.

1997]. Следует отметить, что относительная биодоступность азимадолина у людей была немного выше при приеме с пищей, чем натощак. При исследовании распределения установлено, что значительная концентрация азимадолина отмечается в органах элиминации – печени и почках и не обнаруживается в головном мозге [Camilleri M. 2008].

Метаболизм соединения у животных аналогичен таковому у людей. Было установлено, что основной метаболит, обнаруженный в плазме, является продуктом второй фазы биотрансформации – конъюгатом азимадолина с глюкуроновой кислотой [Camilleri M. 2008]. Однако первая фаза метаболизма также характерна для данного препарата. Так, в результате исследований было показано, что ферменты CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 и CYP3A4 семейства циотхромов CYP450 принимают активное участие в метаболических реакциях азимадолина. Экскреция азимадолина происходит в основном через ЖКТ в виде метаболитов.

Изучение фармакокинетических свойств соединения РУ- основывалось на ранее проведенных исследованиях некоторых производных бензимидазола. (ритмидазол, эноксифол, амфедазол, соединение РУ-64, диабенол, бемитил, дибазол). По результатам исследований данных препаратов было установлено, что наиболее выражено их биотрансформация происходит под воздействием изоформ CYP3A. Предполагается, что в метаболизм также вовлечены изоформы CYP2B1 и CYP2B2. Установлено, что ни для одного из соединений не характерно взаимодействие с изоформами CYP2C. При анализе компьютерного прогноза метаболизма производных бензимимдазола. было выявлено, что для препарата эноксифол характерно образование конъюгатов с глюкуроновой кислотой. По-видимому, это связано с присутствием необходимых функциональных групп (-ОН) в составе молекулы. Для соединения РУ-64 характерно гидроксилирование ароматических ядер.

Наиболее характерная реакция для производных бензимидазола - образование N-оксидов. Таким образом, для производных бензимидазола наиболее характерны реакции первой фазы биотрансформации [Л.А. Смирнова, 2004].

Субстанция соединения РУ-1205 – 9-(2-морфолиноэтил)-2-(4фторфенил)имидазо[1,2-]бензимидазол, синтезирована в НИИ ФОХ Южного федерального университета под руководством старшего научного сотрудника, к.х.н. В. А. Анисимовой1. Содержание чистого вещества не менее 99,46%.

Белый кристаллический порошок, гигроскопичный. Легко растворим в кислоте муравьиной концентрированной, мало растворим в воде и в спирте этиловом 95%, практически не растворим в ацетоне и хлороформе Рис. 2.1 Структурная формула соединения РУ-1205. Молекулярная масса 437,3 г/моль.

Таблетки соединения РУ-1205, покрытые оболочкой, состава - 9-(2морфолиноэтил)-2-(4-фторфенил)имидазо[1,2-]бензимидазол – 0,011; лактоза – 0,02; лудипресс – 0,1669; магния стеарат – 0,002 – разработаны и изготовлены в ГБУ "НИИ фармакологии имени В.В. Закусова" РАМН г. Москва под двояковыпуклые таблетки, покрытые оболочкой, белого цвета.

Инъекционная лекарственная форма соединения РУ-1205 в виде лиофилизата, состава - 9-(2-морфолиноэтил)-2-(4-фторфенил)имидазо[1,2бензимидазол – 0,05г; манит - 2,65г – разработана и изготовлена в ГБУ "НИИ фармакологии имени В.В. Закусова" РАМН г. Москва под руководством д.ф.н., Выражаем искреннюю признательность старшему научному сотруднику, к.х.н. В.А. Анисимовой за синтез и предоставление субстанции для работы.

Выражаем искреннюю признательность заведующему лабораторией технологии лекарственных форм НИИ фармакологии РАМН г. Москвы, д.ф.н., проф. Б.М. Пятину за создание и предоставление для исследования таблетированных форм.

профессора Б. М. Пятина. Визуально - масса белого цвета, упакованная во флаконы темного стекла объемом 2 мл.

Лекарственные формы разработаны в рамках проведения ФЦП «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу» по государственному контракту № 11411.1008700.13.090 от 13.09.2011. «доклинические исследования лекарственного средства с каппа-опиоидной агонистической активностью на основе производного имидазобензимидазола». Шифр «2.1.

Имидазобензимидазол 2011»

Исследования проводились с использованием следующих реактивов и лекарственных препаратов: ацетонитрил (УФ200, Россия), калия фосфат однозамещенный, гидроксид натрия, цитрат натрия производства «Мосреаквти» (Россия) гексенал (ООО «МедПро Инк», Латвия), хлоралгидрат (ООО «МедПро Инк», Латвия), алпразолам («Органика», Новокузнецк, таблетки 0,001), мидазолам (Dormicum, «Roche», Швейцария, 0,5 % раствор в ампулах по 3 мл).

Эксперименты были выполнены на оборудовании: ВЭЖХ хроматограф LC-20 (Shimadzu, Япония), хроматографические колонки SUPELCOSIL LC- (Sigma, США), гомогенизатор (IKA Ultra Turbax, Германия), центрифуга (Elmi, Латвия), ультразвуковая баня (Серьга, Россия), метаболическая камера «Термопласт» (Италия), электростимулятор лабораторный ЭСЛ-2 (Россия).

Исследование фармакокинетики соединения РУ-1205 проводилось на белых беспородных крысах-самцах массой 200 ± 20 г, 20 белых беспородных мышах-самцах массой 25,0-30,0 г и на 30 кроликах-самцах породы шиншилла массой 2,5-3 кг, полученных из питомника РАМТН, Москва. Животные содержались в условиях вивария на стандартной диете (гранулированный комбикорм, гранулы 5 мм, ГОСТ 51899-02), при 12-ти часовом световом режиме с соблюдением правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ З 51000.3-96 и 1000.4-96), а также правил и Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997). На момент проведения исследований животные были здоровыми, изменений поведения, аппетита, режима сна и бодрствования обнаружено не было. За 12 ч до эксперимента животные не получали пищу без ограничения доступа к воде. Все эксперименты выполняли согласно заключению этической экспертизы (протокол № 155-2012 от 23 марта 2012 года, Региональный Независимый Этический Комитет).

2.2.1 Хроматографические методы количественного определения соединения Для количественного определения соединения РУ-1205 в биологическом материале использовали оригинальный метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ-детектором на хроматографе Shimadzu. Условия хроматографирования: аналитическая колонка SUPELCOSIL LC-18 - 100 х 4, мм, диаметр частиц 5 мкм. Колонку термостатировали при 50 0С. Подвижная фаза: раствор А и раствор В в соотношении 1:1. Раствор А: 50 мМ раствор однозамещенного фосфата калия рН=5,0, оттитрованный 0,5 М раствором NaOH; раствор В: ацетонитрил. Скорость потока подвижной фазы – 1 мл/мин.

Перед хроматографированием подвижную фазу дегазировали на ультразвуковой бане и фильтровали. Детектирование проводили при длине волны 205 нм. Время удерживания при данных условиях составило 8,00 – 8, мин.

2.2.2 Методы экстракции соединения РУ-1205 из биологического материала Животных выводили из эксперимента методом декапитации. Кровь стабилизировали 5 % цитратом натрия. Преципитацию белков и экстракцию изучаемых соединений производили ацетонитрилом из плазмы крови, мочи, а также из 20% водных гомогенатов кала, органов и тканей крыс в соотношении 1:2. Затем образцы встряхивали 10 минут, центрифугировали в течение минут при 10000 об/мин, после чего надосадочную жидкость отбирали и вводили в инжектор хроматографа с объемом петли 20 мкл.

Степень извлечения соединения РУ-1205 из биологических проб составила не менее 90 %. При этом не наблюдалось зависимости степени экстракции от концентрации соединения в пробе.

2.2.3 Схемы проведения фармакокинетических исследований Фармакокинетические исследования выполнялись согласно методическим рекомендациям по проведению доклинических исследований фармакокинетики лекарственных средств д.м.н, профессора В.П. Жердева [под редакцией Миронова А.Н.].

Внутривенное введение. Соединение РУ-1205 вводили однократно внутривенно в хвостовую вену крыс в дозе 10 мг/кг. Забор проб крови осуществляли после декапитации животных через 5, 10, 20, 40 минут и через 1, 2, 4, 8 и 12 часов после введения, а также через 5 минут после введения изотонического раствора натрия хлорида контрольной группе животных.

Зависимость концентрации соединений от времени изучалась в плазме крови, которую получали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 минут.

Распределение соединения в организме крыс изучали в органе потенциального действия – головном мозге; в тканях с сильной васкуляризацией – сердце, легких и селезенке; с умеренной васкуляризацией – мышце (musculus quadriceps femoris) и слабой васкуляризацией - сальнике, а также в органах, обеспечивающих элиминацию - печени и почках. Для проведения исследований органы измельчали и гомогенизировали до образования 20% водного гомогената.

Пероральное и подкожное введение. Соединение РУ-1205 вводили однократно перорально и подкожно крысам в дозах 50 мг/кг. Забор крови осуществляли после декапитации через 30 минут и через 1, 2, 4, 8, 12 часов после введения. Распределение соединения после внутрижелудочного и подкожного введений осуществляли в органе-мишени – головном мозге, в органах, обеспечивающих элиминацию – печени и почках, а также в жировой ткани. Для проведения исследований органы измельчали и гомогенизировали до образования 20% водного гомогената.

Кровь стабилизировали 5% раствором натрия цитрата.

Содержание соединения РУ-1205 определяли также в моче и кале. Сбор проб экскретов осуществляли в метаболических камерах через 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72 и 96 часов после введения. Образцы кала измельчали с образованием 20 % водного гомогената.

Методы исследования метаболизма Прогноз возможных метаболитов соединения РУ-1205 проводили под руководством д.б.н. П. М. Васильева с помощью программы «PALLAS 3.00»

(CompuDrug Chemistry Ltd.). Для подробного изучения влияния соединения РУна систему цитохрома Р450 использовались тесты взаимодействия с гексеналом (изоформы CYP2C9, CYP2B1 и CYP2B2) [Omiecinski C.J. et al., 1999; Nebert D.W. et al., 2002], мидазоламом (изоформы CYP3A1 и CYP2C) [Kotegawa T. 2000] и алпразоламом (изоформы CYP3A1) [Никитин Н.А., 2002].

Для изучения влияния соединения РУ-1205 на вторую фазу биотрансформации использовался тест хлоралгидратного сна, так как хлоралгидрат является тестсубстратом глюкоронилтрансферазы. [Лакин К.М. и др., 1981].

Гексенал в виде водного раствора вводили внутрибрюшинно крысам в дозе 70 мг/кг. Хлоралгидрат вводили крысам внутрибрюшинно в виде раствора в дозе 70 мг/кг. Алпразолам вводили внутрибрюшинно мышам в виде суспензии на твине-85, в дозе 50 мг/кг, мидазолам – внутрибрюшинно мышам в дозе 80 мг/кг.

Для определения связи соединения РУ-1205 с эндогенными кислотами производили ферментативный, кислотный и щелочной гидролиз проб мочи.

Полученные пробы инкубировали с -глюкуронидазой и арилсульфатазой, выделенных от Helix pomatia (Boehringer Mannheim, Германия) в 0,1М ацетатном буфере (pH 5,0) в течение 24 часов при температуре 37 С [Thomas B.F. et al., 1999]. Щелочной гидролиз производили добавлением 5М раствора NaOH и инкубацией при 37 С в течение 2 часов [Dix K.J. et al., 1999].

Кислотный гидролиз производили добавлением 5М раствора HCl и инкубацией при 37 С в течение 2 часов [Manini P. et al., 1999].

Изучение взаимосвязи фармакокинетики и фармакодинамики2.

обезболивающий тест. Проведение экспериментов по исследованию уровня болевой чувствительности проводили на модели электрического раздражения хвоста [Carrol N. M., Lim P. K., 1960]. Через 30 минут после введения исследуемого вещества проводилось раздражение корня хвоста биполярными подкожными электродами при помощи электростимулятора лабораторного ЭСЛ-2 прямоугольными импульсами длительностью 10 мсек, частотой стимуляции 100 Гц при продолжительности 1 сек. При этом регистрировались величины болевых порогов, выражаемые в вольтах, и соответствующие анальгетического эффекта судили по изменению амплитуды напряжения, подаваемого на электроды. Соединение РУ-1205 вводили перорально в дозе мг/кг и подкожно в дозе 1 мг/кг. Сравнение эффекта изучаемого вещества производилось по отношению к изменениям в контрольной группе животных (вводился физиологический раствор в аналогичном объеме). Корреляцию между фармакокинетическими и обезболивающими свойствами соединения РУ-1205 описывали в виде зависимости антиноцицептивного эффекта от концентрации вещества в плазме крови.

2.2.4 Схема проведения биофармацевтических исследований Внутривенное введение. Введение субстанции соединения РУ-1205 и инъекционной лекарственной формы, в виде лиофилизата, осуществлялись в краевую ушную вену кроликов в одинаковой дозе 10 мг/кг. Забор проб крови Эксперименты выполнены совместно с аспирантом кафедры фармакологии Д. М. Штаревой.

производился через 5, 10, 20, 40 минут, 1, 2, 4, 8 и 12 часов после внутривенного введения.

Пероральное введение. Субстанцию соединения РУ-1205 и твердую лекарственную форму, в виде таблеток, покрытых оболочкой, вводили перорально в одинаковой дозе 50 мг/кг. Забор проб крови производился через 15, 30 минут, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 и 72 часа после введения.

Подкожное введение. Введение субстанции соединения РУ-1205 и инъекционной лекарственной формы, в виде лиофилизата, осуществляли подкожно кроликам в одинаковой дозе 25 мг/кг. Забор проб крови производился через 15, 30 минут, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 и 72 часа после введения.

Перед введением субстанции или лекарственных форм соединения РУу животных брали пробы крови для выявления фоновых пиков.

При всех трех путях введения кровь, после сбора, стабилизировали 5% раствором натрия цитрата.

2.2.5. Расчеты фармакокинетических параметров Для оценки фармакокинетических свойств изучаемых лекарственных веществ рассчитывали ряд параметров.

1. Площадь под фармакокинетической кривой концентрация – время (AUC) является основным фармакокинетическим параметром и характеризует биологическую доступность лекарственного средства. Данный параметр рассчитывали модельно – независимым методом статистических моментов (Пиотровский В., 1986) в программе Microsoft Excel.

где 2. Общий (кажущийся) клиренс (cl), отражающий скорость освобождения от препарата единицы объма биожидкости, как отношение дозы (D) к AUC:

3. Константа элиминации (Kel), характеризующая снижение концентрации препарата на конечном (моноэкспоненциальном) участке фармакокинетической кривой:

Cmax и Tmax – максимальная концентрация и время ее достижения, Cпосл и Tпосл – последнее значение концентрации и время е определения.

4. Общий (кажущийся) объм распределения (Vd), под которым понимают такой объм, при распределении в котором, препарат имел бы ту же концентрацию, что и в плазме крови, как отношение клиренса (cl) к константе элиминации (Kel):

5. Период полувыведения (T1/2), отражающий время, в течении которого концентрация ЛВ в крови снижается вдвое:

6. Среднее время удерживания, характеризующее среднее время пребывания в организме молекулы препарата (MRT):

AUMC – площадь под кривой произведение времени на концентрацию лекарственного вещества-время.

использовалось вычисление тканевой доступности (ft), определяемой отношением значения AUC в ткани к соответствующей величине AUC в крови.

Абсолютная биодоступность рассчитывалась как отношение AUC при пероральном и подкожном введении к AUC при внутривенном введении лекарственного вещества крысам.

Относительная биодоступность рассчитывалась как отношение AUC субстанции к AUC лекарственной формы при соответствующем введении лекарственного вещества кроликам.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием парного t-критерия Стьюдента, критерия Манна-Уитни (Newman-Keulstest) с использованием табличного редактора Microsoft Excel и пакета прикладных программ «GraphPad Prism 5.00» с предварительной проверкой выборки на нормальность распределения.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ФАРМАКОКИНЕТИКА

СОЕДИНЕНИЯ РУ- Неотъемлемой частью изучения фармакологических свойств новых биологически активных соединений является исследование их фармакокинетических параметров [Е.В. Иванникова, В.П. Жердев и др. 2013].

Известно, что скорость фармакокинетических процессов во многом определяет эффект лекарственного средства [В.И. Сергиенко, Р. Джелифф и др. 2005]. Все эти процессы взаимосвязаны и взаимозависимы [Н.Н. Каркищенко 2001].

Знание фармакокинетических свойств фармакологического средства дает возможность обосновать выбор путей и методов его введения, определить ткани, в которые оно проникает наиболее интенсивно, установить его основные пути элиминации. Фармакокинетические данные, полученные в эксперименте на животных, необходимы для установления зависимости «концентрация– эффект», что может быть использовано для прогнозирования действия фармакологического средства у человека. Кроме того, по результатам экспериментального изучения фармакокинетики фармакологического средства возможно предсказать концентрацию препарата в крови и таким образом, выбрать ориентировочную схему дозирования, которая может быть затем уточнена в ходе клинических исследований [А.А. Фирсов, В.П. Жердев и др., 2012].

3.1 Валидационные параметры методов ВЭЖХ, используемых для определения соединения РУ- Используя разработанный метод количественного определения (см. глава 2) были получены хроматограммы стандартных водных и плазменных растворов соединения РУ-1205 (Рис. 3.1, 3.2).

Рис. 3.1 Хроматограмма соединения РУ-1205 в водном растворе.

Концентрация соединения РУ-1205 - 5 мкг/мл, время удерживания – 8,00 – 8, мин.

Рис. 3.2 Хроматограмма соединения РУ-1205 в плазме крови крыс.

Концентрация соединения РУ-1205 - 5 мкг/мл, время удерживания – 8,00 – 8, мин.

абсолютной калибровки. Зависимость площадей пиков от концентрации соединения РУ-1205 анализировалась методом регрессионного анализа в диапазоне концентраций от 0,5 до 25 мкг/мл. По каждому значению концентрации проводилось 5 параллельных измерений. В результате было установлено, что калибровочные кривые носят линейный характер, с коэффициентом аппроксимации (R2) равным 0,99 (рис. 3.3).

Валидация метода проводилась согласно «Guideline on bioanalytical method validation» (EMEA, 2012). По полученным результатам измерений были рассчитаны точность и прецизионность (средняя ошибка измерения). Данные представлены в таблице 3.1.

Рис. 3.3 Зависимость площади под хроматографическим пиком от концентрации соединения РУ-1205.

Обозначения: по оси абсцисс – концентрация соединения РУ-1205, мкг/мл; по оси ординат – площадь под хроматографическим пиком, mAU*мин.

Валидационные характеристики метода ВЭЖХ количественного определения соединения РУ- Номинальная Были определены внутридневные процентные колебания (повторяемость метода), которые не превышали 20% в изучаемых диапазонах концентраций.

Междневные процентные колебания (воспроизводимость метода) для изучаемого соединения не превышали в основном 15% (Таблица 3.2).

При повторном проведении анализа, после 72 часов хранения стандартных растворов соединения при комнатной температуре, а также при изучении влияния процессов замораживания и таяния, средние абсолютные процентные колебания находились в тех же пределах, показывая стабильность исследуемого вещества.

Основные аналитические параметры метода ВЭЖХ количественного определения соединения РУ-1205.

Внутридневные колебания Междневные колебания (воспроизводимость) Порог количественного определения 500 нг/мл 3.2 Линейность фармакокинетических свойств соединения РУ- При проведении исследований было выявлено, что основной параметр, характеризующий степень биологической доступности препарата, площадь под фармакокинетической кривой, увеличивается с увеличением дозы линейно.

Значения максимальной концентрации также имеют статистически значимые отличия в зависимости от дозы. При внутривенном введении крысам изучаемого соединения в дозах 1, 10 и 50 мг/кг коэффициент аппроксимации имеет значение 0,98 (Рис. 3.4).

Рис. 3.4 Зависимость значения площади под фармакокинетической кривой соединения РУ-1205 от величин доз при внутривенном введении крысам.

Обозначения: по оси абсцисс – доза соединения РУ-1205, мг/кг; по оси ординат – площадь под фармакокинетической кривой, мг/кг*ч.

внутривенном введении.

В результате проведенного исследования были получены усредненные фармакокинетические профили зависимости концентрации препарата в плазме крови крыс от времени (Рис. 3.5). Так, было выявлено, что при внутривенном введении соединение циркулирует в плазме крови на протяжении 12 ч. Кривая носит моноэкспоненциальный характер. В начальный момент времени наблюдается максимальное значение концентрации, затем происходит резкое снижение ее уровня.

зависимости концентрации соединения в плазме крыс от времени показывают низкие значения периода полувыведения и среднего времени удерживания в организме одной молекулы препарата. Кажущийся объем распределения превышает реальный объем организма крыс более чем в 7 раз, что предполагает неравномерное распределение соединения в тканях. Из полученных данных видно, что исследуемое вещество подвергается длительному процессу элиминации, о чем свидетельствует значение периода полувыведения, а также среднее время удерживания (табл. 3.3).

с, мкг/мл Рис. 3.5 Содержание соединения РУ-1205 в плазме крови крыс после внутривенного введения в дозе 10 мг/кг (n=5; x±SD).

Обозначения: по оси абсцисс – время, ч; по оси ординат – концентрация соединения РУ-1205, мкг/мл.

Фармакокинетические параметры соединения РУ - 1205 в плазме крови крыс при внутривенном введении в дозе 10 мг/кг Фармакокинетические параметры распределения соединения РУ-1205 в органах и тканях крыс представлены в таблице 3.4. Препарат хорошо и быстро проникает через гематоэнцефалический барьер. В мозге, органе потенциального действия, соединение РУ - 1205 появляется через 5 минут после введения в максимальной концентрации 11,07 мкг/г, затем постепенно снижается, определяясь до 14 часа исследования. Высокие показатели периода полувыведения и среднего времени удерживания свидетельствуют о низкой скорости снижения концентрации соединения в головном мозге.

В сальнике отмечается сходная тенденция, с большой тропностью к этим тканям. Однако максимальная концентрация соединения РУ-1205 в жировой ткани наблюдается через 40 минут. Время циркуляции 12 часов. Значения среднего времени удерживания и длительности периода полувыведения не превышают таковые в плазме крови.

В легких, селезенке и сердце вещество определяется в относительно меньших количествах. В данных органах максимальная концентрация отмечается через 5 минут после введения. При этом значения среднего времени удерживания и периода полувыведения значительно ниже таковых в плазме. В легких и сердце соединение РУ-1205 циркулирует на протяжении 4 часов, в селезенке на протяжении 8 часов.

Соединение РУ-1205 определяется в высоких концентрациях в почках и печени - органах элиминации. В обоих органах вещество определяется на протяжении 12 и 14 часов соответственно для почек и печени. Однако тканевая доступность в почках практически в два раза ниже, чем в печени.

Максимальная концентрация вещества в печени превышает таковую в почках практически в 4 раза. В результате анализа полученных фармакокинетических параметров можно сделать вывод, что в данных органах протекают интенсивные процессы элиминации изучаемого соединения.

Для мышечной ткани характерна низкая тканевая доступность. В данном органе вещество циркулирует на протяжении 1 часа.

исследуемых органах и тканях, причем в распределении препарата прослеживается значительная гетерогенность. Соединение имеет наибольшую тропность к головному мозгу, печени, и жировой ткани, что, по-видимому, определяется его высокой липофильностью. Значительные количества вещества определяются в селезенке, почках, сердце и легких. В меньшей степени соединение накапливается в мышечной ткани.

Фармакокинетические параметры распределения соединения РУ-1205 в органах и тканях при внутривенном введении крысам в дозе 10мг/кг.

При изучении экскреции было выявлено, что соединение определяется в моче уже на второй час исследования, выделение достигает максимального уровня к 24 часу и определяется в моче до 72 часов (Рис 3.6). При этом более 90 процентов экскретируемого соединения выделяется в первые 48 часов после введения. В результате полученных данных было установлено, что с мочой выделилось всего около 0,5 % неизмененной субстанции от общего количества введенного препарата. Почечный клиренс составил 0,003 л/час, внепочечный значительно превышает ренальный и составляет 0,67 л/час. В кале соединение обнаруживается только через 12 часов после введения.

Кумулятивно при данном пути экскреции вывелось порядка 0,2 % неизменного вещества. При хроматографических условиях, разработанных для соединения РУ-1205, на хроматограммах не было обнаружено дополнительных пиков. Несмотря на высокую интенсивность процессов элиминации соединения РУ-1205, суммарный вклад процессов экскреции неизмененной субстанции составляет только 0,7 % от введенной дозы, что может свидетельствовать о выраженной способности вещества подвергаться процессам биотрансформации в организме крыс.

Рис. 3.6 Кумулятивная экскреция почками и через ЖКТ соединения РУпри внутривенном введении крысам в дозе 10 мг/кг.

Обозначения: по оси абсцисс – время, ч; по оси ординат – количество соединения РУ-1205, мкг.

пероральном введении.

3.4.1 Фармакокинетика в плазме крови крыс.

В результате проведенного исследования были получены усредненные фармакокинетические профили зависимости концентрации изучаемого вещества в плазме крови крыс от времени (Рис. 3.7). Было обнаружено, что кривая имеет фазу повышения концентрации или фазу всасывания, в течение которой происходит достижение максимальной концентрации в плазме крови.

Вторая часть фармакокинетической кривой, характеризующая элиминацию соединения РУ-1205, носит момноэкспоненциальный характер. При введении внутрь исследуемое вещество быстро всасывается из ЖКТ, пик концентрации наблюдается через 1 ч после введения. При этом максимальная концентрации при пероральном введении уступает таковому показателю при внутривенном, несмотря на то, что при введении внутрижелудочно вводилась пятикратно превышающая доза. Соединение РУ-1205 определяется в плазме крови на свидетельствует значение периода полувыведения и показатель среднего времени удерживания одной молекулы (табл. 3.5). Кажущийся объем распределения превышает реальный объем организма крыс в 37,7 раз, что свидетельствует о депонировании и неравномерности распределения в органах и тканях. Величина абсолютной биодоступности при пероральном введении составила 37,34 %.

с, мкг/мл Рис. 3.7 Содержание соединения РУ-1205 в плазме крови крыс после перорального введения в дозе 50 мг/кг (n=5; x±SD).

Обозначения: по оси абсцисс – время, ч; по оси ординат – концентрация соединения РУ-1205, мкг/мл.

Фармакокинетические параметры соединения РУ-1205 в плазме крови крыс при пероральном введении в дозе 50 мг/кг Фармакокинетические параметры распределения соединения РУ-1205 в органах и тканях крыс при пероральном введении субстанции соединения РУпредставлены в таблице 3.6. В результате проведенного исследования гематоэнцефалический барьер в концентрациях ниже пороговых [А.А. Спасов, 2013]. В органах элиминации – печени и почках, соединение определяется в течение 12 и 8 часов соответственно. Значение параметра тканевой доступности практически не отличается от такового при внутривенном введении.

В сальнике отмечается содержание РУ-1205 на протяжении 2 часов, при этом максимальная концентрация наблюдается через 1 час после введения и составляет 9,23 мкг/мл.

Таким образом, при пероральном введении соединение РУ-1205 обладает наибольшей тропностью к почкам. Фармакокинетические параметры исследуемого вещества при данном пути введения несколько отличаются от внутривенного. В частности, при приеме внутрь наибольшая концентрация наблюдается в почках, чем в печени. В сальнике максимальная концентрация не отличается при обоих путях введения, однако при пероральном введении по времени исследуемое соединение циркулирует в 5 раз меньше.

Фармакокинетические параметры распределения соединения РУ-1205 в органах и тканях при пероральном введении крысам в дозе 50 мг/кг.

При изучении экскреции было выявлено, что соединение определяется в моче уже на второй час исследования, выделение достигает максимального уровня к 48 часу и определяется в моче до 96 часов (Рис 3.8). При этом более 90 процентов экскретируемого соединения выделяется в первые 60 часов после введения. В результате полученных данных было установлено, что с мочой выделилось всего около 0,52 % неизмененной субстанции от общего количества введенного препарата. Почечный клиренс составил 0,003 л/час, внепочечный значительно превышает ренальный и составляет 2,36 л/час. В кале соединение обнаруживается только через 12 часов после введения.

Кумулятивно при данном пути экскреции вывелось порядка 0,02 % неизменного вещества. При хроматографических условиях, разработанных для соединения РУ-1205, на хроматограммах не было обнаружено дополнительных пиков. Несмотря на высокую интенсивность процессов элиминации соединения РУ-1205, суммарный вклад процессов экскреции неизмененной субстанции составляет только 0,61 % от введенной дозы, что может свидетельствовать о выраженной способности вещества подвергаться процессам биотрансформации в организме крыс.

Ме, мкг Рис. 3.8 Кумулятивная экскреция почками и через ЖКТ соединения РУпри пероральном введении крысам в дозе 50 мг/кг.

Обозначения: по оси абсцисс – время, ч; по оси ординат – количество соединения РУ-1205, мкг.

подкожном введении.

В результате проведенного исследования были получены усредненные фармакокинетические профили зависимости концентрации препарата в плазме крови крыс от времени (Рис. 3.9). При данном пути введения на графике отмечается фаза всасывания из места введения. Максимальная концентрация наблюдается через 30 минут после инъекции и составляет 13,54 мкг/мл. После моноэкспоненциальный характер, предполагая первоначальную быструю фазу распределения, сменяющуюся более медленной фазой элиминации и выходом на плато. Соединение определяется в плазме до 12 часа исследования.

Основные фармакокинетические параметры, рассчитанные по зависимости концентрации соединения в плазме крови крыс от времени представлены в таблице 3.7. Площадь под фармакокинетической кривой при подкожном введении незначительно превосходит данный параметр при внутривенно введении. Однако период полувыведения и среднее время удерживания в организме крыс в два раза ниже при введении под кожу, что свидетельствует о более быстрой элиминации соединения. Кажущийся объем распределения свидетельствует о депонировании и неравномерности распределения в органах и тканях. Величина абсолютной биодоступности при подкожном введении составила 49,02 %.

с, мкг/мл Рис. 3.9 Содержание соединения РУ-1205 в плазме крови крыс после подкожного введения в дозе 50 мг/кг (n=5; x±SD).

Обозначения: по оси абсцисс – время, ч; по оси ординат – концентрация соединения РУ-1205, мкг/мл.

Фармакокинетические параметры соединения РУ-1205 в плазме крови крыс при подкожном введении в дозе 50 мг/кг Фармакокинетические параметры распределения соединения РУ-1205 в органах и тканях крыс при подкожном введении субстанции соединения РУпредставлены в таблице 3.8. В результате проведенного исследования было установлено, что изучаемое вещество обнаруживается в головном мозге – органе потенциального действия – в высоких концентрациях. Исследуемое вещество обнаруживается в головном мозге на протяжении 12 часов.

В печени и почках соединение определяется также в течение 12 часов.

Значение параметра тканевой доступности несколько уступает данному параметру при внутривенном введении.

Площадь под фармакокинетической кривой исследуемого вещества в органах и тканях крыс при данном пути введения примерно в два раза превышает данный показатель в плазме крови, а для головного мозга характерно отличие практически в три раза. Также было отмечено, что более высокие концентрации исследуемого вещества наблюдаются в печени, чем в почках.

Фармакокинетические параметры распределения соединения РУ-1205 в органах и тканях при подкожном введении крысам в дозе 50 мг/кг.

При изучении экскреции было выявлено, что соединение определяется в моче уже на второй час исследования, выделение достигает максимального уровня к 40 часу и определяется в моче до 72 часов (Рис 3.10). При этом более 90 процентов экскретируемого соединения выделяется в первые 48 часов после введения. В результате полученных данных было установлено, что с мочой выделилось всего около 0,4 % неизмененной субстанции от общего количества введенного препарата. Почечный клиренс составил 0,001 л/час, внепочечный значительно превышает ренальный и составляет 1,38 л/час. В кале соединение обнаруживается через 12 часов после введения. Кумулятивно при данном пути экскреции вывелось порядка 0,18 % неизменного вещества. При хроматографических условиях, разработанных для соединения РУ-1205, на хроматограммах не было обнаружено дополнительных пиков. Несмотря на суммарный вклад процессов экскреции неизмененной субстанции составляет только 0,68 % от введенной дозы, что может свидетельствовать о выраженной способности вещества подвергаться процессам биотрансформации в организме крыс.

Рис. 3.10 Кумулятивная экскреция соединения РУ-1205 через почки и ЖКТ при подкожном введении крысам в дозе 50 мг/кг.

Обозначения: по оси абсцисс – время, ч; по оси ординат – количество соединения РУ-1205, мкг.

3.6 Зависимость фармакодинамических свойств от фармакокинетики соединения РУ- 3.6.1 Зависимость фармакодинамических свойств от фармакокинетики При исследовании обезболивающих свойств соединения РУ-1205 было выявлено, что анальгетический эффект отмечается уже через 15 минут после введения, затем увеличивается и достигает максимума через 4 часа после введения, после чего плавно снижается и выходит на плато (Рис. 3.11). При этом продолжительность антиноцицептивного действия наблюдалась в течение 12 часов. Максимальная концентрация исследуемого вещества в плазме крови отмечалась через 1 час после введения. При этом отмечались стадии всасывания и элиминации с последующим выходом концентрации на плато.

При сопоставлении фамракокинетических и обезболивающих свойств было обнаружено, что разница в максимальном эффекте и пике концентрации особенностями прохождения соединения РУ-1205 через гематоэнцефалический и печеночный барьер. Следует отметить, что при данном пути введения изучаемое соединение проникает в головной мозг в концентрациях ниже пороговых. Накопленные данные позволяют сделать вывод о том, что при метаболиты, обладающие анальгетическими свойствами.

Рис. 3.11 Зависимость порога болевой чувствительности (в % по отношению к контролю) от содержания соединения в плазме крови и времени после перорального введения крысам.

Обозначения: по оси абсцисс – время (часы), по левой оси ординат – изменение порога болевой чувствительности (% по отношению к контролю), по правой оси ординат – концентрация соединения в плазме крови (мкг/мл).

3.6.2 Зависимость фармакодинамических свойств от фармакокинетики При подкожном введении соединение РУ-1205 на модели электрического раздражения проявляло выраженную анальгетическую активность с максимальным эффектом через 2 часа после ведения. Антиноцицептивный эффект сохранял статистически значимые величины по отношению к контрольной группе животных до 4 часов экспериментального исследования.

При данном пути введения соединение РУ-1205 циркулирует в плазме крови на протяжении 12 ч. Максимальная концентрация наблюдается через мин после введения, после чего происходит резкое снижение ее значения.

Начиная со второго часа исследования, концентрация соединения РУ- находится в состоянии равновесия.

При изучении взаимосвязи фармакокинетических и обезболивающих свойств отмечается разница во времени достижения пика концентрации и максимального антиноцицептивного эффекта соединения РУ-1205, что можно объяснить особенностями прохождения через гематоэнцефалический барьер.

Также было отмечено, что через 8 часов исследования наблюдается повторное незначительное увеличение анальгетического эффекта, в то время как концентрация находится в состоянии равновесия (рис.3.12). Данные результаты свидетельствуют о возможном наличии активных метаболитов.

Рис. 3.12 Зависимость порога болевой чувствительности (в % по отношению к контролю) от содержания соединения в плазме крови и времени после подкожного введения крысам.

Обозначения: по оси абсцисс – время (часы), по левой оси ординат – изменение порога болевой чувствительности (% по отношению к контролю), по правой оси ординат – концентрация соединения в плазме крови (мкг/мл).

3.7 Метаболизм соединения РУ- 3.7.1 Определение путей метаболизма соединения РУ-1205 in silico При проведении компьютерного прогноза возможных химических структур метаболитов соединения РУ-1205 было определено, что образуются в основном продукты окислительных реакций – метаболиты 1, 4, и 7. Для изучаемого вещества характеры также реакции гидроксилирования – метаболиты 2, 3 и 6. У метаболита № 6 отмечен отрыв морфолинового цикла.

Следует отметить, что во всех образующихся соединениях сохраняется фторфенильный радикал, участвующий в развитии обезболивающего эффекта.

Для всех метаболитов, кроме № 6 и № 5 характерно сохранение морфолинового радикала, который также участвует в развитии анальгетической реакции.

Таким образом, было отмечено, что соединение РУ-1205 подвергается в основном реакциям окисления и в частности - гидроксилирования.

Возможные метаболиты соединения РУ-1205, полученные по результатам прогноза в программе «PALLAS 3.00».

3.7.2 Ферментативный, щелочной и кислотный гидролиз При всех трех путях введения после проведения ферментативного, щелочного и кислотного гидролизов мочи и кала на хроматограммах, при разработанных хроматографических условиях, не было обнаружено дополнительных пиков.

3.7.3 Взаимодействие соединения РУ-1205 с тест-субстратами некоторых При исследовании продолжительности сна под влиянием специфических тест-субстратов некоторых изоформ системы CYP450 было выявлено, что статистически значимо изменяются мидазоламовый, алпразоламовый и гексеналовый типы снов (табл. 3.9). При этом первый из них соединение РУукорачивает, а последующие – пролонгирует. Однако, наиболее существенное изменение снотворного эффекта тест-субстратов наблюдается при фармакологическом взаимодействии изучаемого вещества с алпразоламом и гексеналом. В тесте с хлоралгидратом, который подвергается активному конъюгированию с глюкуроновой кислотой во вторую фазу метаболизма, не было обнаружено статистически значимых изменений времени сна.

Необходимо также отметить, что изоформы CYP2B1 и CYP2B2 отвечают главным образом за гидроксилирование ксенобиотиков, а СYP3A1 и CYP2C9 – за их окисление [Кукес В.Г., 2012].

Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что соединение РУ-1205 подвергается активному метаболизму под воздействием микросомальных ферментов печени. При этом, скорее всего, образуются оксиленные и гидроксилированные метаболиты. Реакциям метаболизма второй фазы – конъюгирования – изучаемое фамаркологическое вещество, вероятно, не подвергается. Полученные в ходе экспериментов in vitro данные подтверждаются также результатами компьютерного прогноза.

Изменение продолжительности сна крыс, вызванного специфическими тест-субстратами системы CYP450, на фоне предварительного перорального введения соединения РУ-1205 в дозе 1 мг/кг Хлоралгидрат Глюкоронилтрансфераза 71,48±7,14 59,59±4,45 -21,87 % * - статистически значимо по отношению к контролю (р0,05) по tкритерию Стьюдента.

3.8 Заключение Разработанный метод количественного определения соединения РУ- в биологических пробах является валидированным, селективным и чувствительным, что позволяет эффективно использовать его для проведения фармакокинетических исследований.

В диапазоне доз от 1 до 50 мг/кг фармакокинетика изучаемого вещества является линейной, что подтверждается данными регрессионного анализа.

Коэффициент аппроксимации составляет 0,98.

При внутривенном введении соединение обнаруживается в плазме крови через 5 минут после введения и циркулирует в ней на протяжении 12 часов исследования. Распределяется по всем изученным органам и тканям организма крыс, обладая наибольшей тропностью к головному мозгу – органу мишени, печени и почкам, а также к жировой ткани. В данных органах отмечаются более высокие концентрации, чем в плазме крови. Меньшие количества обнаруживаются в высоковаскуляризированных тканях – сердце, легких и селезенке. Наименьшие количества отмечаются в мышечной ткани.

Экскретируется в основном почками на протяжении 72 часов. Суммарное количество неизмененного вещества, выведенного из организма составило порядка 0,7 % от введенной дозы.

При пероральном введении исследуемое вещество подвергается процессам абсорбции, выходу на максимальное значение, стадией элиминации и дальнейшим состоянием равновесия. Максимальное значение концентрации соединения РУ-1205 через 1 час после введения. Изучаемое вещества циркулирует в плазме крови на протяжении 12 часов. При этом в крови отмечаются низкие концентрации неизмененного вещества, относительно введенной дозы, что подтверждает возможное прохождение соединения через печеночный барьер. Абсолютная биодоступность субстанции соединения РУсоставляет 37,34 %. Распределяется в органы элиминации – печень и почки, а также в жировую ткань. Необходимо отметить, что при пероральном пути введения соединение РУ-1205 проникает через гематоэнцефалический барьер в концентрации меньшей, чем порог определения. Экскретируется преимущественно почками на протяжении 96 часов. Суммарно при данном пути введения выводится 0,61 % от введенной дозы.

При подкожном введении для соединения РУ-1205 в плазме крови крыс характерны также процессы всасывания из места введения, достижение максимальной концентрации через 30 минут после инъекции и носит моноэкспоненциальный характер снижения концентрации. Абсолютная биодоступность субстанции соединения РУ-1205 составляет 49,02 %.

Распределяется в головной мозг, печень и почки с высокой степенью тропности к данным органам. Экскретируется преимущественно почками. Суммарно неизмененного вещества при данном пути введения выводится 0,68%.

В результате анализа данных зависимости фармакокинетических свойств соединения РУ-1205 от обезболивающего эффекта при пероральном и подкожном путях введения установлено, что время достижения максимального значения и пиковой концентрации в плазме крови существенно отличаются.

Необходимо отметить, что при подкожном введении на 8 часу исследования наблюдается вторая волна анальгетического эффекта без возрастания концентрации в плазме крови. При внутрижелудочном введении отмечается, что значительный антиноцицептивный эффект наблюдается даже при отсутствии неизмененного соединения в центральной нервной системе.

В процессе изучения возможных метаболитов соединения РУ-1205 было задействовано три метода. При прогнозе метаболизма изучаемого вещества in silico были выявлены 7 возможных метаболитов, которые являются продуктами реакций окисления и, в частности – гидроксилирования. При этом было отмечено, что у 6 молекул в химической структуре сохранены фрагменты, возможно, участвующие в развитии анальгетического действия.

На втором этапе исследования метаболизма соединения РУ-1205 была предпринята попытка получить базовую химическую структуру изучаемого вещества при проведении ферментативного, кислотного или щелочного гидролиза в экскретах крыс. Однако при дальнейшем хроматографическом исследовании на хроматограммах не было выявлено пиков, характеризующих исходную структуру.

специфическими тест-субстратами изоформ Р450 было выявлено, что продуктами реакций биотрансформации соединения РУ-1205 также служат окисленные формы метаболитов. Наиболее вероятно образование гидроксилированных производных.