[
На правах рукописи
Кохан Виктор Сергеевич
Характеристика фенотипических особенностей нокаутных мышей с
направленной инактивацией генов семейства синуклеинов
03.01.04 – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учной степени
кандидата биологических наук
Черноголовка – 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологически активных веществ Российской академии наук и в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук.
Научный руководитель: кандидат биологических наук Нинкина Наталья Николаевна
Официальные оппоненты: Ярыгин Константин Никитич доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАМН, ФГБУ «ИБМХ»
РАМН, заведующий лабораторией Дейкин Алексей Васильевич кандидат биологических наук, ФГБУН Институт биологии гена РАН, научный сотрудник
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П.К.
Анохина» Российской академии медицинских наук
Защита состоится «12» апреля 2012 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 001.010.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича» Российской академии медицинских наук (ФГБУ «ИБМХ»
РАМН) по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, 10 стр. 8.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ИБМХ» РАМН.
Автореферат разослан «_»2012 года.
Ученый секретарь диссертационного совета, к.х.н. Е.А.Карпова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Белки синуклеины участвуют в патогенезе целого ряда нейродегенеративных заболеваний. В частности, нарушение метаболизма синуклеина является важным звеном патогенеза болезни Паркинсона, деменции с диффузными тельцами Леви, мультисистемной атрофии, некоторых форм болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных состояний. Заболевания, в основе которых лежит патологическая агрегация синуклеинов, получили общее название синуклеинопатий. Синуклеинопатии часто сопровождаются психоэмоциональными и когнитивными расстройствами. Интенсивное изучение семейства синуклеинов позволило получить многочисленные данные о роли синуклеинов в патологических процессах, однако не привели к окончательному пониманию нормальной функции этих белков. В настоящее время имеются данные о роли синуклеинов в рециркуляции синаптических везикул и функционировании моноаминергической нейромедиаторной передачи, получены данные, указывающие на их возможную шаперонную активность. При этом мало изученным остатся вопрос об участии синуклеинов в регуляции функций высшей нервной деятельности, модуляции психо-эмоциональных состояний – таких процессов, патологическое нарушение которых часто сопровождает течение синуклеинопатий.
Генетически модифицированные животные в настоящее время широко используются в качестве модельных систем для изучения функций синуклеинов.
На данный момент создано множество как клеточных, так и животных трансгенных и нокаутных по генам синуклеинов моделей для изучения нормальных функций этих белков и для разработки терапевтических средств для лечения заболеваний с нарушением нормальных функций синуклеинов.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение эффектов хронического нарушения функции пресинаптических белков синуклеинов с использованием линий нокаутных мышей, в геноме которых инактивированы гены -синуклеина, -синуклеина, -синуклеина или все три члена семейства одновременно. В задачи работы входило:
1. Исследование влияния хронического нарушения функции синуклеинов на метаболизм дофамина в нигростриарной системе нокаутных по генам - и синуклеинов стареющих мышей.
2. Анализ содержания синаптических маркерных белков в стриатуме нокаутных по генам - и -синуклеинов стареющих мышей.
3. Изучение локомоторной и амфетамин-индуцированной локомоторной активностей - и -синуклеин-нокаутных мышей разных возрастных групп с целью оценки состояния их дофаминергической системы.
4. Исследование влияния недостаточности синуклеинов на эмоциональный статус и когнитивные способности мышей.
Научная новизна работы. В ходе выполнения работы впервые:
показано, что отсутствие -синуклеина приводит к снижению уровня дофамина и его метаболита, гомованилиновой кислоты, в стриатуме стареющих модельных мышей;
установлено, что дефицит -синуклеина ведт к уменьшению содержания амфифизина и синаптотагмина в стриатуме стареющих мышей, что является указанием на нарушение синаптической пластичности;
показано, что в условиях хронической недостаточности синуклеинов изменяется функциональное состояние дофаминергической нейромедиаторной системы при старении;
показано, что истощение нормальной функции синуклеинов сопровождается нарушением когнитивной функции и изменениями в эмоциональном статусе модельных животных.
Практическая значимость. Характеристика линий мышей с направленной инактивацией генов семейства синуклеинов, выполненная в рамках данной работы, позволила выявить новые аспекты физиологических функций белков синуклеинов. Установленные нарушения рециркуляции синаптических везикул, а также гомеостаза дофамина в нигростриарной системе в отсутствии -синуклеина могут служить новой фармакологической мишенью при терапии синуклеинопатий. Полученные данные о роли синуклеинов в формировании психо-эмоционального статуса и развитии когнитивных способностей позволяют объяснить нарушение этих функций при нейродегенеративных процессах, что может быть использовано не только для отбора препаратов – корректоров расстройств настроения и ноотропных веществ, но и для дальнейшего изучения генетических основ поведения. Охарактеризованные линии мышей с инактивированными генами - и -синуклеинов могут быть применены в качестве моделей при изучении новых аспектов нейродегенерации, сопровождающей синуклеинопатии.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на 3-й Международной конференции "Новейшие научные достижения" (София, Болгария, 2010), на 14-ой Мультидисциплинарной международной конференции по нейронаукам и биопсихиатрии "Стресс и поведение" (Санкт-Петербург, Россия, 2010), на Всероссийской молоджной школе-конференции "Нейробиология интегративных функций мозга" (СанктПетербург, Россия, 2011), на конференции по научному направлению Российской академии наук "Фундаментальные науки – Медицине" в 2011 году, на 19-ом Международном конгрессе по болезни Паркинсона и сопутствующим заболеваниям (Шанхай, Китай, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 4 статьи в периодических изданиях, включнных в перечень ВАК, и публикаций в сборниках докладов научных конференций.
Структура и объм работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 157 страницах, иллюстрирована 31 рисунком и 9 таблицами. Список цитированной литературы включает 285 источников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальные животные. В работе использовали линии генетически модифицированных мышей с направленной инактивацией генов -синуклеина (KO), -синуклеина (-KO) или -синуклеина (-KO) на генетическом фоне C57Bl6J (Charles River Laboratories, США). Линия мышей с тройной делецией генов -, - и -синуклеинов (-KO) была получена путм перекрстного скрещивания нокаутных по каждому из синуклеинов животных. Контрольные животные, не содержащие модификаций генома (WT), были на том же генетическом фоне.Генотипирование. Геномную ДНК выделяли из биопсий уха или хвоста исследуемого животного методом фенольной экстракции. Генотипирование проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим разделением фрагментов в агарозном геле.
денатурирующего полиакриламидного гель-электрофореза (ПААГ) по Лэммли и инкубировали 5 мин при 1000C. Для каждого образца объединяли материал, полученный как минимум от 4-x животных. Общий белок в лизатах определяли методом Бредфорда. Оценку содержания - и -синуклеинов проводили в тканях чрной субстанции и прилежащих участках среднего мозга. Оценку содержания остальных белков проводили в тканях стриатума. Анализируемые образцы (в пересчте на 10 мкг общего белка) разделяли в 8%-, 12%-, 16%- или 18%-ном ПААГ. После разделения в геле белки переносили на Hybond-P мембрану (Amersham, Великобритания) в приборе для полусухого электроблоттинга, после чего мембрану инкубировали с первичными антителами против исследуемых белков:
-синуклеина (поликлональные, клон SK23 разведение 1:500), синуклеина (поликлональные, клон AB5334P, Chemicon, США, разведение 1:1000), тирозингидроксилазы (TH) (моноклональные, клон TH-2, Sigma, разведение 1:5000), транспортера дофамина (DAT) (поликлональные, Sigma, разведение 1:500), амфифизина (моноклональные, клон 15, BD Transduction Laboratories, США, разведение 1:10000), синаптофизина (моноклональные, клон 2, BD Transduction Laboratories, разведение 1:25000), синаптотагмина (моноклональные, клон ASV48, QED, США, разведение 1:5000), SNAP- (моноклональные, клон 20, BD Transduction Laboratories, разведение 1:1000), CSP (поликлональные, Santa Cruz, разведение 1:1000), глиального фибрилярного кислого белка (поликлональные Sigma, разведение 1:500). В качестве внутренних контролей использовали антитела против тубулина (моноклональные, клон DM1A, Sigma, США, разведение 1:10000), -актина (моноклональные, клон ACSigma, США), или глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GFAP) (моноклональные, клон 6C5, Santa Cruz Biotechnology, США). Детекцию проводили методом хемилюминесценции. Количественную оценку содержания белка осуществляли с помощью программного обеспечения AlphaImager (AlphaInnotech Corporation, США).
Определение содержания дофамина и его метаболитов. В возрасте 24- месяцев проводили эвтаназию экспериментальных животных путм введения летальной дозы пентобарбитала натрия внутрибрюшинно. Препарирование головного мозга и диссекцию стриатума проводили на льду. Ткани стриатума дезинтегрировали ультразвуком с использованием насадки 3 мм в течение 3 сек, перед проведением дезинтеграции к каждому образцу добавляли 95 мкл 0,4 M HClO4 и 5 мкл раствора N--5-HT с концентрацией 40 мкг/мл (внешний стандарт).
После ультразвуковой обработки образцы центрифугировали при 20000 g 25 мин при 40С. Осадок замораживали и сохраняли для количественной оценки общего белка с помощью стандартного BCA protein assay reagent kit (Pierce, США).
Супернатант использовали для анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Использовали обращнно-фазовую колонку (4.6x150 мм Microsorb C18, Varian). Детекцию проводили на приборе Decade II ECD (Antec Leyden, Нидерланды).
Поведенческие модели и тесты. Для оценки двигательной активности, когнитивных функций и эмоционального статуса использовали стандартные поведенческие тесты с некоторыми модификациями.
Амфетамин-индуцированный локомоторный ответ. Локомоторную активность регистрировали в установке Аctivity cage (Ugo Basile, Италия). В течение первых 30 мин мыши позволяли адаптироваться к новой обстановке, затем вводили внутрибрюшинно водный раствор амфетамина 0.8 мг/мл из расчта 4 мг/кг и регистрировали двигательную активность в течение 90 мин.
Оценку исследовательской активности, тревожности и депрессивноподобного поведения проводили с помощью следующих тестов: новая клетка (камера 21.5x27.5 см), тмно-светлая камера (OpenScience, Россия), О-образный приподнятый лабиринт (OpenScience, Россия), открытое поле (TruScan, CoulBourn instruments, США), подвешивание за хвост (Т-образный штатив с перекладиной на высоте 30 см), Т-образный лабиринт (высота стенок 12 см, ширина аллеи 5 см).
Оценку когнитивных способностей проводили с помощью следующих методик: узнавание нового объекта и новой локации объекта, выработка условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ), выработка условного рефлекса активного избегания (УРАИ, электростимул: однополярные прямоугольные импульсы напряжением 30 В и частотой 100 Гц, условный стимул: свет), водный лабиринт Морриса.
Статистическая обработка. Статистическую обработку результатов проводили с помощью статистического пакета Statistica 8.0 (StatSoft Inc., США).
Первоначально проводили проверку статистических гипотез распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка. В зависимости от принятой гипотезы распределения признака и анализируемых групп статистическую обработку проводили с помощью параметрического t-критерия Стьюдента для зависимых или независимых выборок, непараметрических U-критерия Манна-Уитни или Tкритерия Вилкоксона.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Формирование репрезентативных групп экспериментальных животных.На первом этапе была проведена работа по созданию репрезентативных экспериментальных групп мышей разного возраста и соответствующих генотипов, которые формировались в соответствии с результатами генотипирования (рис. 1).
Рисунок 1. Генотипиование: анализ ПЦР-фрагментов в агарозном геле.
Анализ содержания -синуклеина и -синуклеина в тканях мозга нокаутных мышей. В тканях мозга -KO мышей содержание -синуклеина не отличалось существенно от такового в мозге WT мышей. В тканях мозга -KO также не выявлено заметного повышения содержания -синуклеина (рис. 2).
Таким образом, полученные нами в нокаутных моделях данные не являются результатом компенсаторного повышенного содержания в клетке одного из синуклеинов.
Анализ уровня дофамина и его метаболитов в стриатуме. Одной из центральных задач данного исследования являлось изучение состояния синапсов дофаминергических нейронов (DA-нейроны) у стареющих животных и выявление патологических изменений, развивающихся с возрастом при нарушении функции синуклеинов. Поскольку синапсы DA-нейронов чрной субстанции мозга лежат в стриатуме, было проанализировано содержание дофамина (DA), 3,4диоксифенилуксусной (DOPAC) и гомованилиновой (HVA) кислот в этой морфологической области мозга.
«