На правах рукописи

Дедков Андрей Анатольевич

СТРУКТУРНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ КАНДИДАТНЫХ ГЕНОВ

ПРИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

(БРОНХИАЛЬНАЯ АСТМА, АЛЛЕРГИЧЕСКИЙ РИНИТ,

АТОПИЧЕСКИЙ ДЕРМАТИТ) У ДЕТЕЙ

03.02.07 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва – 2012

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАЕН, заслуженный деятель науки РФ Иванов Владимир Петрович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Щипков Валерий Петрович доктор медицинских наук, профессор Петрин Александр Николаевич

Ведущая организация: Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Защита диссертации состоится «29» февраля 2012 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.05 в ФГБОУ ВПО Российский университет дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. МиклухоМаклая, дом 8.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, дом 6.

Автореферат размещен на сайте www.vak.ed.gov.ru Автореферат разослан «_» 20_г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент О.Б. Гигани

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В изучении патогенеза аллергических заболеваний многие вопросы остаются открытыми. Однако тот факт, что в основе формирования заболеваний лежит комплекс генетических и иммунных факторов, является неоспоримым. В то время как детальному описанию иммунологических реакций уделено уже достаточно много внимания, вопросы генетической предрасположенности остаются малоизученными. Выявить конкретную причину, вызывающую развитие бронхиальной астмы (БА), атопического дерматита (АД), аллергического ринита (АР), зачастую не представляется возможным. Большинство авторов относят их к мультифакториальным заболеваниям (МФЗ). В изучении генетической природы МФЗ в настоящее время все большее значение приобретает выявление в различных популяциях специфичных генов и средовых факторов, взаимодействие которых формирует устойчивость организма к изменяющимся условиям окружающей среды. В связи с этим наиболее интересными ДНК-маркерами для изучения токсикогенетической компоненты МФЗ являются полиморфные варианты генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков. Данная группа генов относится к «кандидатным» ввиду их участия в метаболизме медиаторов воспаления, оксидативном стрессе, детоксикации химических соединений. На сегодняшний день метаболические механизмы участия ФБК в аллергических реакциях изучены недостаточно. Основные научные исследования ведутся для атопической БА, и полученные результаты весьма противоречивы. Причиной этому может служить этнический фактор, эволюционно сложившийся именно в данной популяционной группе. В Курской области уже были проведены исследования на взрослой выборке больных БА, полученные результаты однозначно указывали на влияние данной группы генов на реализацию заболевания. В связи с чем изучение полиморфизма генов детоксикации у детей той же популяции, представляется актуальной темой. Полученные результаты могут помочь понять первопричину возникновения атопии и помочь в превентивной диагностике, не допуская клинически развернутой картины заболевания.

Цель исследования: провести комплексный анализ вовлеченности полиморфных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в формирование предрасположенности к аллергическим заболеваниям (бронхиальная астма, аллергический ринит, атопический дерматит) у детей.

Задачи исследования:

1. Провести анализ ассоциации аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов ФБК: I462V гена CYP1A1, H139R гена EPHX1, I105V гена GSTP1, +/del гена GSTT1, +/del гена GSTM1 с предрасположенностью к аллергическим заболеваниям у детей.

2. Изучить проявления полового диморфизма и возрастной манифестации в ассоциациях полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков при аллергических заболеваниях у детей.

3. Исследовать взаимодействия между различными классами генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и дать оценку их комплексного влияния на риск возникновения заболеваний.

4. Изучить вклад средовых факторов на реализацию наследственной предрасположенности к аллергическим заболеваниям у детей в зависимости от носительства генотипов ФБК.

5. Разработать регрессионные статистические модели индивидуального прогнозирования риска развития бронхиальной астмы, аллергического ринита, атопического дерматита у детей с учетом полового диморфизма на основании исследованных молекулярно-генетических маркеров и средовых факторов.

Научная новизна. Впервые проведен комплексный молекулярногенетический анализ вовлеченности генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков при различных нозологических формах детских аллергических заболеваний: бронхиальной астме, аллергическом рините и атопическом дерматите.

Установлены гены, полиморфные варианты которых ассоциировались с повышенным риском развития БА (GSTP1, GSTM1), а также АД (GSTP1, GSTT1).

Выявлен выраженный половой диморфизм генотипов генов ФБК, ассоциировавшихся с предрасположенностью к БА у мальчиков (del/del GSTT1, del/del GSTM1, 105IV GSTP1), АД у мальчиков (del/del GSTT1) и у девочек (462IV CYP1A1), а также установлено модулирующее влияние на возраст манифеста рассмотренных заболеваний. Получены новые данные о взаимодействиях генотип-среда, формирующие предрасположенность к повышенному риску развития бронхиальной астмы у детей, подвергающихся фактору пассивного курения.

Практическая значимость работы. Полученные в ходе исследования данные о взаимосвязях генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков при аллергопатологии в детском возрасте рекомендуются к применению врачамиаллергологами и врачами медико-генетических консультаций для прогнозирования, разработки индивидуальных лечебных мероприятий и предотвращения дальнейшего развития патологии.

1. Генетическими маркерами подверженности к бронхиальной астме у детей являются генотип 105IV гена GSTP1, del/del гена GSTM1 и отсутствие дикого генотипа 105II гена GSTP1. Фактором генетической предрасположенности к атопическому дерматиту – мутантный генотип 105VV гена GSTP1, делеционный генотип ded/del гена GSTT1.

2. Для мальчиков повышенный риск развития бронхиальной астмы ассоциируется с генотипами: del/del гена GSTT1, del/del гена GSTM1, 105IV гена GSTP1, а атопического дерматита с del/del гена GSTT1. Для девочек повышенный риск атопического дерматита ассоциирован с присутствием генотипа 462IV гена CYP1A1.

3. Для раннего развитие бронхиальной астмы характерно наличие генотипов: del/del гена GSTM1, del/del гена GSTT1, атопического дерматита, мутантного генотипа 105VV гена GSTP1. Позднее развитие БА ассоциировано с генотипом: 105IV гена GSTP1, АД с делеционным генотипом del/del гена GSTT1, для АР поздний возраст начала заболевания сочетается с отсутствием функционального генотипа 462II гена CYP1A1.

4. Предрасположенность к повышенному риску БА у детей определяется сочетанием средового фактора (табачный дым) и наличием определенных генотипов: 139RR гена EPHX1, 105IV гена GSTP1.

5. Установленные комбинации генотипов определяют повышенный риск возникновения. Установленные межгенные различия были обусловлены накоплением среди больных главным образом вариантных генотипов обеих фаз биотрансформации.

Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на научных конференциях: Итоговой научной сессии КГМУ и отделения медикобиологических наук Центрально-Черноземного научного центра РАМН (Курск, 2008, 2009), Международной научной конференции молодых ученых медиков (Курск, 2008, 2009, 2010), 2-го Международного конгресса «Иммунитет и болезни» (Москва, 2007), Международной дистанционной научной конференции «Инновации в медицине» (Курск, 2008, 2009, 2010), Межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Молодежная наука и современность» (Курск, 2009, 2010). По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК Минобрнауки РФ для публикации результатов диссертационных исследований по медицинским наукам.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 работ в центральной и местной печати, в том числе в 3 изданиях, рекомендуемых ВАК для публикаций материалов докторских и кандидатских диссертаций.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, библиографического списка и приложений. Работа изложена на 92 страницах машинописного текста, содержит 29 таблиц. Библиографический список используемой литературы включает 198 источников, 101 из которых – зарубежный.

Личный вклад автора. Диссертационная работа представляет собой законченный, самостоятельно выполненный труд автора. Все представленные в диссертации результаты получены лично Дедковым А.А. на базе лаборатории медицинской генетики кафедры биологии, медицинской генетики и экологии ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ, им проанализированы отечественные и зарубежные источники по теме диссертации, получены и обобщены результаты исследования, проведена статистическая обработка и анализ полученных данных. В работах, выполненных в соавторстве, использованы результаты исследований с долей личного участия автора 75-95%.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал исследования. Материалом для исследования послужила выборка детей, постоянно проживающих на территории Курской области. Всего было рассмотрено 450 случаев аллергических заболеваний. Из них 150 детей страдали бронхиальной астмой, 150 - аллергическим ринитом, 150 атопическим дерматитом. Молекулярно-генетический анализ проводился на базе лаборатории медицинской генетики кафедры биологии, медицинской генетики и экологии Курского государственного медицинского университета. Клиниколабораторные исследования проводились на базе областной детской клинической больницы г. Курска.

Методы исследования. Молекулярно-генетический метод. Выделение геномной ДНК осуществляли из замороженной (-20°С) венозной крови стандартным двухэтапным методом фенольно-хлороформной экстракции. Лейкоциты, осажденные дважды с PBS центрифугированием, лизировали в ТЕ-буфере протеиназой К в присутствии 0,4% додецилсульфата натрия. Клеточную суспензию инкубировали в течение ночи в термостате при температуре 42°С. Геномную ДНК экстрагировали из клеточного лизата в 3 этапа: сначала фенолом, насыщенным 10 мМ Трис-HCl (рН=8,0) (1:1), затем фенолом и хлороформом (по одному объему фенола и хлороформа на два объема надосадочной жидкости) и последний раз хлороформом (1:1). ДНК преципитировали 96% этанолом, высушивали, растворяли в ТЕ-буфере, замораживали и хранили при -20°С. Амплификацию фрагментов ДНК методом полимеpазной цепной pеакции (ПЦР) проводили в 12 мкл реакционной смеси, содержащей 0,5 мкл образца геномной ДНК. Смесь для амплификации включала: 67 мМ Трис-HCl pH=8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мкМ ЭДТА, 2,0-7,0 мМ MgCl2, 1 мМ -меркаптоэтанола, 1 мМ каждого dNTPs (dATP, dCTP, dTTP и dGTP), 15 нМ каждого из праймеров и 1 е.а. Taq-полимеразы. Амплификацию проводили на многоканальном термоциклере «Терцик» (НПО «ДНК-Технология», Москва). Обработка продуктов ПЦР проводилась специфическими рестриктазами согласно протоколам, описанным производителями ферментов. После инкубации рестрикционной смеси проводили разделение фрагментов ДНК с помощью электрофореза. В зависимости от размера разделяемых фрагментов ДНК использовали агарозный гель различной концентрации 0,8-3,5%, приготовленный на основе ТВЕ буфера (0,089 М Трис-НСl, 2 мМ ЭДТА, 0,089 М борная кислота), а также 6-8% ПААГ (соотношение акриламид : метиленбисакриламид 29 : 1). После электрофореза окрашенные этидиумбромидом гели визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете на приборе компьютерной видеосъемки GDS-8000 (UVP Inc, США) с помощью программного аналитического пакета LabWorksTM v4. (США). В рамках проводимого исследования изучали 5 полиморфизмов 5 генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков: CYP1A1 (I462V), EPHX (H139R), GSTM1 (+/0), GSTT1 (+/0), GSTP1 (I105V).

Клинико-лабораторные методы. Первичная постановка диагноза осуществлялась на основе общеклинического обследования, проводимого квалифицированными специалистами на базе областной детской клинической больницы г. Курска.

Вся исследуемая выборка также подвергалась общеклиническому исследованию: общий анализ крови, общий анализ мочи, анализ кала на яйца гельминтов и соскоб со слизистой прямой кишки на энтеробиоз, ЭКГ.

Комплекс клинико-лабораторных методов диагностики: постановка кожных скарификационных проб с набором неинфекционных аллергенов (бытовых, клещевых, пищевых, пыльцевых) у детей старше 2 лет. Общий уровень IgЕ определяли с помощью иммуноферментного анализа.

Для больных БА в возрасте старше 6 лет проводилось исследование функции внешнего дыхания и пикфлоумерия. Отдельно у больных АР проводилась риноцитоскопия для выявления тканевой эозинофилии.

Данный комплекс методов позволил выявить не только признаки наличия аллергопатологии, но и полностью дифференцировать диагноз.

Генетико-статистические методы. Статистический анализ полученных данных проводился на ПК с использованием пакета прикладных программ Statistiсa 6.0 фирмы StatSoft Inc. (США) и MS Excel (Реброва О.Ю., 2006). Для оценки соответствия распределений генотипов ожидаемым значениям при равновесии Харди-Вайнберга (РХВ) в выборке и сравнении с частотами аллелей и генотипов разных групп проводили с помощью критерия 2 Пирсона, при условии, когда объем выборки не превышал 10 случаев, использовали критерий с поправкой Йетса. Ожидаемую гетерозиготность рассчитывали по Nei. Об ассоциации аллелей или генотипов с предрасположенностью к заболеваниям судили по величине отношения шансов (OR) - показателю, отражающему, во сколько раз вероятность оказаться в группе «случай» (больные) отличается от вероятности оказаться в группе «контроль» (здоровые) для носителя изучаемого генотипа. Межгенные взаимодействия изучали методом сопоставления частот парных сочетаний генотипов в группах больных и здоровых с расчетом критерия 2 и OR. Анализ взаимодействий генотип-среда проводился методом сопоставления величин отношения шансов (OR), рассчитанных для индивидуальных генотипов в группах, сформированных по критерию наличия (ORf+) или отсутствия (ORf-) средового фактора риска. Метод логистической регрессии использовался для оценки влияния полиморфных генов ФБК на риск развития аллергической патологии, ее клинические симптомы и особенности течения и развитие осложнений.

Результаты и обсуждение собственных исследований 1. Сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов ФБК в детерминации аллергических заболеваний (БА, АР, АД) у детей При анализе частот аллелей полиморфных вариантов генов контрольной группы с тремя нозологическими формами аллергических заболеваний, была выявлена ассоциация вариантного аллеля 105Val гена GSTP1 с предрасположенностью к БА (OR=1,57 95%CI 1,11–2,22, p=0,01) и АР (OR=0,65 95%CI 0,44–0,95, p=0,03). Распределение частот генотипов исследуемых полиморфизмов и их соответствие популяционному равновесию Харди-Вайнберга (РХВ) проводилось раздельно в трех группах больных аллергическими заболеваниями и группе здоровых детей. Распределение генотипов в группе больных БА соответствовало ожидаемому при равновесии РХВ (р>0,05). С повышенным риском БА ассоциировалось наличие гетерозиготного генотипа 105IV гена GSTP1(OR=1,69 95%CI 1,06–2,70, p=0,03), делеционного полиморфизма del/del GSTM1 (OR=1,72 95%CI 1,07–2,75, p=0,02) а также отсутствие дикого, гомозиготного генотипа 105II гена GSTP1 (OR=1,91 95%CI 1,21–3,02, p=0,01), полиморфизма + GSTM (OR=1,72 95%CI 1,07–2,75, p=0,02). Мутантный генотип 139RR гена EPHX был несколько повышен у больных бронхиальной астмой, но не достигал статистически значимых различий (p=0,08).

В группе больных АР распределение генотипов соответствовало ожидаемому при равновесии РХВ (р>0,05). У детей, больных АР, наблюдалась тенденция в ассоциации дикого генотипа 462II гена CYP1A1 с предрасположенностью к заболеванию, которая не достигала статистически значимой разницы (OR=1,80 95%CI 0,94–3,44, p=0,08). Для большинства полиморфизмов в группе больных АД, распределение генотипов находилось в соответствии с РХВ (р>0,05). Однако для полиморфизма 105IV гена GSTP1 отмечалось отклонение от РХВ (p=0,001), обусловленное повышением уровня фактической гетерозиготно-