На правах рукописи

Арифулин Евгений Альбертович

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ НУКЛЕОПРОТАМИНОВОГО

ХРОМАТИНА В СПЕРМАТОЗОИДАХ ЧЕЛОВЕКА

03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2012

Работа выполнена в отделе электронной микроскопии Научно-исследовательского института физико-химической биологии имени А. Н. Белозерского Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Поляков Владимир Юрьевич

Официальные оппоненты:

Коломиец Оксана Леонидовна доктор биологических наук, доцент, Институт общей генетики имени Н. И. Вавилова, заведующая лабораторией Бураков Владимир Владиславович кандидат биологических наук, доцент МГУ имени М. В. Ломоносова, старший научный сотрудник

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии имени академиков М. М. Шемякина и Ю. А.

Овчинникова РАН, Москва

Защита состоится «20» марта 2012 г. в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д.501.001.52 при Московском государственном университете имени М. В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, д.

1, корп. 12, МГУ, Биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова

Автореферат разослан « » февраля 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Калистратова Елена Николаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Известно, что геном эукариот имеет сложную иерархическую организацию, которая обеспечивается специфическим взаимодействием ДНК с различными классами белков.

В соматических клетках «низший» уровень компактизации создается за счет взаимодействия ДНК с тетрамером гистонов (Н2А, Н2В, Н3 и Н4), в результате формируются «элементарные» ДНП фибриллы, состоящие из дискретных нуклеопротеиновых частиц – нуклеосом (Demeret et al., 2001). Другой представитель гистонов – белок Н1 компактизует «элементарные» нуклеосомные фибриллы в ДНП фибриллы толщиной около 30 нм (Butler, 1984). В ряде работ описаны более сложные уровни организации хроматина соматических клеток эукариот (Zatsepina et al., 1983;

Prusov et al.,1983; Belmont et al., 1989), однако молекулярные механизмы, обеспечивающие их формирование, остаются мало изученными.

В процессе формирования мужских гамет у многих представителей эукариот каноническая нуклеогистоновая организация хроматина соматических клеток практически полностью перестраивается на молекулярном и структурном уровне.

Ремоделирование хроматина – многоступенчатый процесс, который инициируется на ранних стадиях дифференцировки сперматид и завершается после прохождения сперматозоидов через эпидидимус (Oliva, 2006). На начальных этапах дифференцировки соматический тип гистонов или их тестис-специфических вариантов замещается транзиторными белками (ТР1 и ТP2), которые, затем заменяются протаминами. В геноме человека в эквивалентных количествах экспрессируются 2 протамина – Р1 и Р2 (Balhorn et al., 1988). Протамины представляют собой базовые и строго специфические для спермиогенеза белки, они имеют домены, богатые аргинином и цистеином (Balhorn et al., 1992; Rooney et al., 2000). Высокий уровень аргинина создает положительный заряд молекул белков, что обеспечивает эффективное связывание протаминов с ДНК. Остатки цистеина участвуют в формировании многочисленных внутренних и внешних дисульфидных связей, необходимых для компактной упаковки ДНК в хроматине сперматозоидов.

В настоящее время в области изучения ремоделирования хроматина достигнут существенный прогресс, однако представления о макромолекулярной организации нуклеопротаминовых комплексов в хроматине сперматозоидов остаются во многом гипотетическими. По одной из гипотез фундаментальными структурными единицами нуклеопротаминового хроматина являются тороиды – кольцевые структуры толщиной около 20 нм, с внешним диаметром около 90 нм и внутренним диаметром около 15 нм (Ward, 1993; 2010). Основу тороидов составляют петлевые домены ДНК (средний размер около 46 kb), линкеры между индивидуальными тороидами ассоциированы с белками ядерного матрикса. Главный недостаток этой модели состоит в том, что формирование тороидальных структур наиболее убедительно продемонстрировано в системе in vitro. Существование тороидов в «нативном» или искусственно декомпактизованном хроматине сперматозоидов не документировано.

Кроме того, в некоторых работах показано, что нуклеопротаминовый хроматин имеет не тороидальную, а, скорее, иерархическую фибриллярно-глобулярную организацию.

Имеются также данные о наличии в хроматине сперматозоидов крупных ДНКсодержащих сферических комплексов диаметром около 300 нм и 500 нм (Sobhon et al., 1982а; Worawittayawong et al., 2008).

Отсутствие хорошо обоснованной и общепринятой модели структурной организации нуклеопротаминовых комплексов означает, что многочисленные данные по анализу молекулярных преобразований генома в условиях его ремоделирования трудно сопоставимы с представлениями о структурной реорганизации хроматина, сопровождающей этот процесс. Исследования в этой области чрезвычайно актуальны не только в теоретическом плане. В ряде работ показано, что нарушения в компактизации хроматина в сперматозоидах человека могут приводить к существенным нарушениям в нормальном развитии беременности, вплоть до ее преждевременного прерывания (Брагина и др., 2009).

Цель исследования. Идентифицировать уровни структурной организации нуклеопротаминового хроматина в сперматозоидах человека.

Задачи исследования.

Детально изучить структурную организацию ремоделирующегося хроматина на основных этапах спермиогенеза;

Изучить нуклеопротаминовые комплексы, полученные в результате искусственной деконденсации хроматина зрелых сперматозоидов;

Исследовать динамику декомпактизации нуклеопротаминового хроматина на модели гетерокарионов сперматозоид/соматическая клетка.

Научная новизна. Впервые на ультраструктурном уровне описана динамика ремоделирования хроматина в ядрах дифференцирующихся сперматозоидов человека как процесс поэтапного преобразования «элементарных» нуклеосомных ДНПфибрилл в фибриллярные нуклеопротаминовые структуры более высокого порядка организации.

Разработана и экспериментально обоснована модель гетерокарионов, полученных слиянием сперматозоидов с культивируемыми клетками.

Электронномикроскопический анализ сперматид на поздних стадиях дифференцировки и эксперименты по декомпактизации ядер зрелых сперматозоидов в гетерокарионах показали, что «элементарной» структурной единицей нуклеопротаминового хроматина являются фибриллы толщиной около 8 нм, которые на конечном этапе ремоделирования формируют фибриллярные «макрокомплексы»

толщиной 40-60 нм – нуклеопротаминовые хромонемы.

Удаление из нуклеопротаминового хроматина части белков и разрыв дисульфидных связей позволило выявить элементы спиральной упаковки «элементарных» нуклеопротаминовых фибрилл в фибриллярных макрокомплексах (нуклеопротаминовых хромонемах). Этот факт косвенно свидетельствует о возможной кардинальной «переупаковке» хроматина на последних стадиях ремоделирования.

На основании полученных данных предложена динамическая модель организации нуклеопротаминового хроматина в сперматозоидах человека.

Практическое значение. Проблема целостности генома и структуры хроматина сперматозоидов имеет большое практическое значение для диагностики и лечения мужского бесплодия, повышения эффективности методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) и предотвращения передачи генетических дефектов при их использовании, особенно при инъекции сперматозоида в яйцеклетку (ИКСИ).

Апробация работы. Результаты работы представлены на Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработка по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», Москва; XVI Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра», Санкт-Петербург; 10-ом Юбилейном российском научнообразовательном форуме в рамках одноименной 10-й Юбилейной международной медицинской выставки «Мужское здоровье и долголетие», Москва.

Основные результаты работы были доложены на семинарах отдела электронной микроскопии НИИ ФХБ им. А. Н. Белозерского МГУ и кафедры клеточной биологии и гистологии биологического факультета МГУ.

Публикации. По теме диссертации опубликована 3 печатные работа в журнале, рекомендованном ВАК.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 123 страницах, включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Материал диссертации содержит 29 рисунков и одну таблицу. В списке цитируемой литературы приведены 115 источников, из низ 3 в отечественных и 112 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Используемые сокращения DMEM (ДМЕМ) - Dulbecco's Modified Eagle's Medium; BSA (БСА) – Bovine serum albumin; PEG (ПЭГ) 1500 – polyethylene glycol с молекулярной массой 1500 Да;

DTT (ДТТ) – Dithiothreitol; FA (ФА) – formaldehyde; GA (ГА) – glutaraldehyde; PBS – Phosphate buffered saline; PBST – PBS с добавлением 0,05% Tween; SSC – salinesodium citrate; Tris (ТРИС) – tris(hydroxymethyl)aminomethane; BrdU (БрдУ) – 5-bromodeoxyuridine; EdU – 5-ethynyl-2'-deoxyuridine; FU – 5-Fluorouridine; DABCO – Diazobicyclooctane; DAPI – 4';6-Diamidino-2-phenylindole.

Образцы эякулята человека Суспензии сперматозоидов здоровых доноров предоставлены для исследования клиникой ЭКО АльтраВита, г. Москва. После забора образцы спермы подвергали очистке от не клеточных компонентов, соматических клеток и неподвижных сперматозоидов с использованием препарата PureCeption Sperm Separation Media (SAGE Media, США) по методике, рекомендованной производителем. Для экспериментов использовали криоконсервированные образцы эякулята, замороженные с использованием криопротектора SpermFreez (FertiPro N. V., Бельгия).

Биопсии семенников человека Материал биопсий предоставлен для электронно-микроскопического исследования ФГУ «Эндокринологический научный центр», г.Москва. Для экспериментов использовали тестикулярные биопсии пациентов с азооспермией (отсутствие сперматозоидов в эякуляте).

Культура клеток Клетки линии VERO (эпителий почки африканской зелёной мартышки) культивировали во флаконах емкостью 50 мл на среде DMEM (ПанЭко, Россия) с добавлением 1% по объему смеси антибиотиков и антимикотиков (Sigma) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США), в атмосфере с 5%-ным содержанием СО2 при температуре 37°С. Для проведения экспериментов клетки высаживали на квадратные 12х12 или круглые диаметром 24 мм покровные стёкла, а так же пластиковые чашки с адгезивным покрытием (Costar Corning, США) диаметром 3,5 см и культивировали до достижения необходимой плотности монослоя.

Получение клеточных гетерокарионов Для обеспечения проникновения сперматозоидов внутрь соматических клеток была модифицирована процедура, описанная в работе Elsevier, Ruddle, 1976.

Предварительно, с помощью камеры Горяева, проводили оценку концентрации сперматозоидов в суспензии и процент подвижных клеток. В эксперименте использовали суспензию с концентрацией сперматозоидов 2-20 млн/мл. Далее суспензию наслаивали на растущие на покровных стёклах клетки и осаждали сперматозоиды центрифугированием 10 минут при 1000g. Для удаления не осаждённых сперматозоидов клетки промывали в двух сменах PBS.

Слияние индуцировали, инкубируя клетки 1 минуту в 50%-ном р-ре PEG на PBS.

Отмывали PEG тремя сменами PBS и инкубировали клетки в среде культивирования при 37 С от 3 до 6 часов. Для удаления большей части не проникших сперматозоидов клетки отделяли от субстрата раствором Версена (ПанЭко, Россия) и центрифугировали суспензию при 200g в течение 1 минуты. Осадок ресуспендировали в минимальном объёме среды культивирования. Далее суспензию разбавляли средой культивирования в 4 – 100 раз и высаживали клетки в чашки Петри со стеклами для дальнейшего культивирования.

Фиксация препаратов для световой микроскопии.

Для выявления функционирующих митохондрий клетки до фиксации инкубировали 30 минут в среде культивирования содержащей 0,01M MitoTracker Red (Moleсular Probes, США).

Клетки фиксировали при помощи 3,7%-ного р-ра FA (Sigma) на PBS 15 минут при 37С, избыток фиксатора отмывали двумя сменами PBS по 5 минут.

Пермеабилизировали клетки в 0,5%-ном р-ре Triton X-100 на PBS 10 мин при комнатной температуре и отмывали тремя сменами PBS по 5 минут. Ядра клеток окрашивали р-ром DAPI (Sigma) на PBS в концентрации 0,1 мкг/мл в течение минут и отмывали двумя сменами PBS по 5 минут. Препараты заключали в MOVIOL (Calbiochem) c добавлением DABCO (Sigma) в концентрации 50 мг/мл.

Функциональный анализ хроматина сперматозоидов в гетерокариотических системах Репликацию ДНК в клетках выявляли при помощи набора Click-iT EdU Alexa Fluor 555 (Invitrogen, США). Для одновременного мечения новосинтезированной ДНК и РНК клетки инкубировали в среде культивирования, содержащей 20 мкМ EdU и мкМ FU, в течение 10 мин при 37С. Затем препараты пермеабилизировали 0,005% Triton X-100 на PBS в течение 5 мин при комнатной температуре и сразу фиксировали в 3,7% FA на PBS 10 мин, так же при комнатной температуре. После отмывки от фиксатора клетки инкубировали 30 минут в PBS c 1% BSA.

Реакцию выявление меченой ДНК проводили согласно протоколу производителя набора. Для последующего выявления меченой РНК клетки помещали в раствор антител против BrdU (Sigma, клон BU-33, разведение 1:100) на PBST с добавлением 0,1% BSA. Клетки инкубировали в растворе антител 60 минут при комнатной температуре, а затем отмывали в трёх сменах PBST с 0,1% BSA по 5 минут каждая.

Далее препарат инкубировали 60 минут при комнатной температуре в растворе поликлональных антител против иммуноглобулинов мыши (Sigma, разведение 1: на PBST с 0,1% BSA), конъюгированных с флуорохромом Alexa 488. После повторения процедуры отмывки от антител, препараты дополнительно контрастировали DAPI в течение 10 минут и заключали в MOVIOL.

При выявлении ламинов использовали стандартную фиксацию для световой микроскопии. Далее клетки инкубировали 60 мин при комнатной температуре в растворе антител против ламинов A, C (клон Jol 2, Hutchison, разведение 1:20 на PBST c 0,1% BSA). Дальнейшая процедура окраски вторыми антителами и последующей обработки препарата аналогична описанной выше.

Детектирование разрывов ДНК в хроматине сперматозоидов Для выявления разрывов ДНК в хроматине сперматозоидов использовали набор DeadEnd Fluorimetric TUNEL system (Promega). Согласно протоколу производителя клетки фиксировали 3,7% FA на PBS 20 минут при +4 С, отмывали от фиксатора двумя сменами PBS по 5 минут и пермеабилизировали в 0,2% Triton X-100 на PBS минут. Далее клетки тщательно отмывали в трёх сменах PBS по 5 минут и проводили реакцию мечения разрывов ДНК в течение часа при 37С. Для ингибирования реакции мечения клетки инкубировали в 2хSSC 20 минут. После трёхкратной отмывки в PBS по 5 минут препараты окрашивали DAPI и заключали в MOVIOL по стандартной методике.

Искусственная деконденсация хроматина сперматозоидов Суспензию сперматозоидов наносили на стёкла, покрытые полилизином и осаждали центрифугированием 10 минут при 1000g. После осаждения пермеабилизировали мембраны клеток 0,5% раствором Triton Х-100 на 50 мМ ТРИСHCl (pH 7,6) 5 минут. Далее препараты промывали 50 мМ ТРИС-HCl и либо фиксировали, либо обрабатывали деконденсирующим раствором, содержащим 0, мг/мл гепарина и 5 мМ DTT в течение 10-25 минут. Отмывку от деконденсирующего раствора и фиксацию проводили на 50 мМ ТРИС. Для световой микроскопии препараты фиксировали 3,7% FA 15 минут, а для электронной - 2,5% GA в течение часов.

Препараты для свето-микроскопического исследования окрашивали DAPI и заключали в MOVIOL, а для электронно-микроскопического - обрабатывали по стандартной методике заключения в эпоксидную смолу и приготовления ультратонких срезов.

Изучение препаратов и регистрация результатов Полученные препараты изучали и фотографировали в оптическом микроскопе Carl Zeiss Axiovert 200M, оборудованном объективом Plan-Neofluar 100x с числовой апертурой 1,3 и цифровой камерой Hamamatsu Orca-II ERG-2 (размер пиксела 6,45х6,45 мкм), управляемом программным комплексом AxioVision v4.3.

Полученные изображения обрабатывали в программах ImageJ v1.44p и Adobe Photoshop v7.0 LE (Adobe Inc, США). Трехмерную деконволюцию серий оптических срезов осуществляли по алгоритму Constrained Iterative Filter с помощью соответствующего модуля из комплекта поставки демонстрационной версии программы AxioVision v3.1 (Carl Zeiss, Германия).

Электронно-микроскопические исследования Для электронно-микроскопического исследования клетки фиксировали 2,5% рром GA на буфере Зеренсена или какодилатном буфере (в случае биопсий) в течение минимум 60 минут (минимум сутки для биопсий). Далее клетки заключали в Эпон согласно процедуре, включающей обезвоживание в серии спиртов повышающейся концентрации, обезвоживание ацетоном, пропитку в трех сменах смеси эпон-ацетон с повышающейся долей Эпона. Полимеризацию проводили при 60°С в течение минимум 48 часов.

Ультратонкие срезы толщиной 60-100 нм получали на ультрамикротоме Reichert Jung Ultracut E с использованием стеклянных ножей. Материал на срезах контрастировали водным 1% р-ром ацетата урана 30 минут и реактивом Рейнольдса 10 минут.

Изучение и обработка электронно-микроскопических данных Изучали и фотографировали полученные препараты на электронных микроскопах Hitachi HU-11В, HU-12B и 700H (Япония). Для дальнейшей обработки негативы сканировали в монохромном режиме с разрешением 1200 точек на дюйм (472 точки на сантиметр) и глубиной представления цвета 16 бит. Сканирование осуществляли с помощью слайд-сканнера (Epson Perfection 4990 PHOTO).

Сканированные изображения обрабатывали и монтировали в программе Adobe Photoshop v7.0.

Точное увеличение микроскопов определяли с помощью препарата частиц латекса диаметром 262 нм.

1. Динамика структурных преобразований хроматина в Для изучения динамики ремоделирования хроматина были исследованы образцы спермы инфертильных доноров, в эякуляте которых присутствовали сперматиды на различных стадиях дифференцировки и материал тестикулярных биопсий, взятый у доноров с азооспермией (отсутствие сперматозоидов в эякуляте). В связи с тем, что электронномикроскопический анализ показал, практически, полную идентичность в организации сперматид, полученных двумя использованными подходами, в этом разделе излагаются данные только по анализу биопсийного материала.

Первая стадия спермиогенеза В качестве «репера» для идентификации стадий спермиогенеза использовали акросомный комплекс. Стадию определяли по протяженности акросомы и по ее структуре. На первой стадии спермиогенеза хроматин сперматид имеет рыхлую фибриллярную структуру с редкими вкраплениями конденсированного материала (Рис. 1а). Наиболее часто встречаются фибриллы толщиной около 15 нм, переходящие в одиночные или сблоченые гранулы диаметром до 25 нм. Кроме того, в ядре присутствуют многочисленные фибриллы толщиной около 8 нм, как лежащие отдельно, так и соединённые с гранулами или более толстыми фибриллами. Ещё одним характерным элементом для ядер ранних сперматид являются крупные плотные глобулы диаметром 30-35 нм, располагающиеся, преимущественно, на периферии ядер. Вокруг таких глобул, как правило, имеется область рыхлого материала.

Вторая стадия спермиогенеза На второй стадии созревания ядро сперматиды уменьшается в размере и приобретает вытянутую форму. Как и на предыдущей стадии, в ядре присутствуют фибриллы толщиной 8 и 15 нм, однако их становится существенно меньше (Рис. 1б).

В то же время, возрастает количество гранул диаметром 20-25 нм, которые часто формируют сходные по толщине короткие толстые фибриллы. Сохраняются зоны пониженной плотности хроматина, в которых преобладают тонкие фибриллы. Как и на предыдущей стадии, хотя и в меньшем количестве, в ядре присутствуют крупные плотные одиночные глобулы, окружённые областью рыхлого материала. Диаметр таких глобул составляет 45-50 нм, что примерно в полтора раза больше, чем диаметр сходных по структуре глобул в более ранних сперматидах.

Третья стадия спермиогенеза По мере созревания хроматин сперматид становится визуально более плотным, однако до третьей стадии спермиогенеза включительно это, по-видимому, не приводит к появлению структур более высокого порядка. Если на первой стадии спермиогенеза в ядре преобладали тонкие фибриллы толщиной 8 и 15 нм, то к третьей стадии их почти не остаётся (Рис. 1в). Основным структурным мотивом здесь являются фибриллы и глобулы толщиной 25 нм. Наиболее плотные участки хроматина сходны по структуре с агрегатами глобул, выявляемыми на предыдущей стадии. На третьей стадии созревания, в ядре всё ещё сохраняются участки низкой плотности хроматина, где преобладают тонкие фибриллы. Количество крупных глобул диаметром 40-50 нм, на этой стадии значительно меньше, чем на предыдущих.

Четвёртая/пятая стадия спермиогенеза В рамках данного исследования не было произведено чёткого деления на четвёртую и пятую стадии спермиогенеза, так как характер упаковки хроматина на этих двух стадиях не имеет принципиальных отличий.

Хроматин сперматид на этом этапе созревания кардинально отличается от хроматина более ранних сперматид тем, что имеет чётко выраженную глобулярную структуру (Рис. 1г). От глобул диаметром 50-60 нм радиально расходятся тонкие, около 8 нм толщиной, фибриллы, заполняющие всё пространство между глобулами.

Материал внутри глобул имеет гетерогенную плотность и в ряде случаев можно идентифицировать тонкие фибриллы толщиной 8 нм. На пятой стадии созревания в ядре сохраняются области низкой плотности хроматина, где толщина структурных элементов меньше, чем в остальном ядре.

Шестая стадия спермиогенеза При переходе от пятой стадии спермиогенеза к шестой ядра сперматид приобретают фибриллярно-глобулярную структуру. Хроматин сперматид на последней изученной в работе стадии спермиогенеза имеет плотную структуру (Рис.

1д), близкую к структуре хроматина зрелых сперматозоидов (Рис. 2а). Основным отличием являются тонкие протяжённые области рыхлого материала между конденсированными блоками хроматина. Главным структурным мотивом в ядрах поздних сперматид являются фибриллярные макрокомплексы толщиной около 40 нм, а так же более крупные глобулы диаметром около 60 нм. Пространство между крупными хроматиновыми блоками заполнено тонкими фибриллами толщиной около 8 нм. Как и на предыдущих стадиях в ядре сперматиды имеется область с низкой плотностью материала, сходная по размеру с вакуолями в зрелых сперматозоидах.

В целом, полученные данные позволяют описать ремоделирование хроматина в ядрах формирующихся сперматозоидов как процесс последовательного замещения нуклеопротаминовые структуры более высокого порядка организации.

2. Структурные комплексы нуклеопротаминового хроматина в искусственно декомпактизованных ядрах сперматозоидов Итогом ремоделирования хроматина, которое завершается в эпидидимусе, является формирование морфологически гомогенных ядер (Рис. 2а). Возникает вопрос, сохраняют выявленные структурные комплексы хроматина (глобулы и фибриллы) свою индивидуальность в зрелых сперматозоидах, или на конечных этапах дифференцировки происходит «переупаковка» хроматина, кардинально изменяющая его структуру. Для ответа на этот вопрос в работе использовали два подхода: метод «дифференциальной деконденсации» хромосом в буферных системах, не содержащих двухвалентных катионов (Zatsepina et al., 1983), и широко применяемый в настоящее время для деконденсации хроматина сперматозоидов метод восстановления дисульфидных групп дитиотрейтолом, с частичной экстракцией белков гепарином (Mudrak et al., 2005).

Деконденсация хроматина в буфере, не содержащем двухвалентных катионов В качестве среды для искусственной декомпактизации хроматина использовали буфер 50 мМ Tris-HCl, не содержащий двухвалентных катионов.

Для ультраструктурного анализа контрольные образцы фиксировали по стандартной методике, принятой в электронной микроскопии: 2,5% глутаровым альдегидом на какодилатном буфере. В этих условиях фиксации хроматин сперматозоидов выглядит, как плотная гомогенная структура, в которой не удаётся визуализировать дискретных элементов (Рис. 2а). В то же время, после фиксации предварительно пермеабилизированных сперматозоидов в деконденсирующем буфере, хроматин приобретает четко выраженное фибриллярное строение (Рис. 2б).

Деконденсация хроматина, в целом, происходит равномерно по всему объёму головки сперматозоида, хотя в местах наибольшей плотности встречаются крупные хроматиновые блоки различного размера. Основным структурным мотивом в этих условиях являются гетерогенные по толщине (20 - 40 нм) фибриллы и глобулы диаметром около 60 нм. Таким образом, можно допустить, что удаление двухвалентных катионов из хроматина сперматозоидов приводит к частичной «реконструкции» нуклеопротаминовой фибриллы, которая характерна для конечных стадий спермиогенеза.

Деконденсация хроматина под действием гепарина и дитиотрейтола В ранних и современных работах для декомпактизации нуклеопротаминового хроматина различные деконденсирующие агенты добавлялись либо к пермеабилизированным, либо к нативным сперматозоидам (Sobhon et al., 1981;

Sobhon et al., 1982а; Sobhon et al., 1982б; Hud et al., 1993; Allen et al., 1993).

Полученные результаты крайне противоречивы, что, по-видимому, связано с неконтролируемым восстановлением дисульфидных групп и неспецифическим удалением белков из объема ядер. В связи с тем, что в буфере, не содержащем двухвалентных катионов, наблюдается частичная «реконструкция»

нуклеопротаминовых фибрилл, задача этой части работы – определить характер упаковки ДНК именно на этом уровне компактизации. Таким образом, в качестве исходного субстрата для воздействия деконденсирующих агентов и последующего микроскопического анализа были использованы пермеабилизированные в 50 мМ TrisHCl сперматозоиды.

Полученные данные показали, что после обработки таких сперматозоидов раствором, содержащим 0,05 мг/мл гепарина и 5 мМ дитиотрейтола, на препаратах выявляются сперматозоиды, демонстрирующие два типа реакции на деконденсирующее воздействие.

В первом случае происходит значительное набухание ядер сперматозоидов, при этом градиент интенсивности флуоресценции после окрашивания DAPI сохраняется.

На светооптическом уровне в хроматине таких сперматозоидов какие-либо структурные мотивы не выявляются.

В то же время, по данным электронномикроскопического анализа, обработка гепарином и дитиотрейтолом приводит к значительным изменениям в организации исходных 40 нм фибрилл: их максимальная и минимальная толщина уменьшается, преимущественно находясь в интервале от 10 до 30 нм (Рис. 2в). В целом, плотность хроматина увеличивается от периферии к центральной области ядер, где сохраняются крупные блоки конденсированного материала.

Во втором случае наблюдается экструзия хроматина из ядер, что, по-видимому, связано с прогрессирующей деструкцией ядерной оболочки и/или с нарушениями акросомального комплекса, возникающими в ходе пермеабилизации клеток. В пользу этого говорит тот факт, что при увеличении времени воздействия до 25 минут количество сперматозоидов с частично разрушенными ядрами увеличивается, однако их внешний вид остаётся прежним.

Электронно-микроскопический анализ показал, что структура экструзированного хроматина различается в разных зонах ядер. В их базальной области декомпактизованный хроматин представлен как тонкими фибриллами толщиной 7-8 нм, так и более крупными фибриллярными комплексами переменной толщины, в ряде случаев, формирующими подобие спиралей. По мере удаления от базальной части ядра плотность хроматина нарастает. Тем не менее, за исключением зон с максимальной плотностью хроматина, в нём выявляются глобулы диаметром около 50 нм. В зоне экструзии плотный хроматин резко переходит в рыхлую сеть фибрилл и блоков различного размера.

Рис. 2 Искусственная деконденсация хроматина сперматозоидов (верхний ряд – увеличение х10000, нижний ряд – х30000).

а – контроль, фиксация 2.5% глутаровым альдегидом на какодилатном буфере: гомогенная структура хроматина;

б – фиксация 2.5% глутаровым альдегидом на 50 мМ Tris-HCl: фибриллы и глобулы толщиной 20, 40 и 60 нм;

в – фиксаци 2.5% глутаровым альдегидом на 50 мМ Tris-HCl после воздействия в 0,05мг/мл гепарина и 5мМ дитиотрейтола (время инкубации 15 минут):

фибриллы 10 и 30 нм.

3. Декомпактизация хроматина сперматозоидов, слитых с Для изучения структуры нуклеопротаминового хроматина большой интерес представляют данные по декомпактизации ядер сперматозоидов, интродуцированных в культивируемые клетки (Meel, Pearson, 1979). Авторы цитированной работы преследовали цель изучить на этой модели динамику реактивации сперматозоидов, связанную с заменой протаминов на гистоны, которая в норме осуществляется после слияния сперматозоида с яйцеклеткой. Для того, чтобы получить эффект реактивации, предварительно обрабатывали сперматозоиды дитиотрейтолом, а затем с помощью инактивированного вируса сендай осуществляли процедуру слияния.

В нашей работе модель гетерокариотических клеток была использована по следующим причинам, прямо не связанным с реактивацией сперматозоидов. Вопервых, логично допустить, что культивируемые клетки не имеют специализированной системы, позволяющей эффективно удалять протамины из хроматина мужского пронуклеуса в цитоплазме ооцитов. Во-вторых, ДНК нуклеопротаминового хроматина, по определению, должна быть защищена от агрессивной внутриклеточной среды, в том числе и от действия нуклеаз (Carrell et al., 2007). И, в-третьих, известно, что окислительно-восстановительный потенциал цитозоля клетки способствует восстановлению атомов серы цистеиновых остатков (Oku, Sakai, 2011). Таким образом, можно предположить, что введение в культивируемые клетки нативных, не обработанных дитиотрейтолом, сперматозоидов должно, сопровождаться только декомпактизацией нуклеопротаминового хроматина, но не его реактивацией.

Морфологические и функциональные особенности гетерокариотической системы: сперматозоид/соматическая клетка Слияние нативных сперматозоидов с культивируемыми клетками проводили посредством инкубации в течение 1 минуты в 50%-ном растворе полиэтиленгликоля на фосфатном буфере. В результате формировались клеточные гетерокарионы, содержащие от одного до трёх сперматозоидов.

Для наблюдений за судьбой сперматозоидов в составе гибридных клеток препараты фиксировали через различные промежутки времени после индукции слияния (от 1 часа до 6 суток). Проникновение сперматозоидов в соматические клетки начинается через три часа после индукции слияния. При этом первые полностью проникшие в клетки сперматозоиды, регистрируются только через шесть часов. В дальнейшем, происходит постепенное увеличение доли проникших сперматозоидов, однако единичные сперматозоиды, лежащие вне клеток, присутствуют на препаратах вплоть до шестых суток с момента индукции слияния.

После проникновения сперматозоидов внутрь соматических клеток постепенно изменяется форма и размеры их ядер, которые приобретают округлую форму и на четвёртые сутки после слияния достигают размеров, близких к размерам ядер клетокреципиентов. При этом в ядрах сперматозоидов, слившихся с соматическими клетками, изменяется оптическая плотность материала, контрастируя с окружающей цитоплазмой. В тех же условиях, сперматозоиды, лежащие вне клетки, но вплотную примыкающие к её оболочке, имеют тёмную центральную область, более светлую периферию и яркий светлый ореол вокруг головки.

Результаты изучения препаратов, окрашенных DAPI, позволяют предположить, что одна из причин изменения светопреломления - деконденсация хроматина сперматозоидов, которая сопровождается увеличением размеров их ядер. По интенсивности окрашивания сперматозоиды в составе гибридов занимают промежуточное положение между интерфазным ядром и митотическими хромосомами. В то же время, хроматин сперматозоидов, находящихся вне клетки, флуоресцирует заметно ярче митотических хромосом. Для ответа на вопрос, сопровождается ли процесс декомпактизации хроматина функциональной реактивацией генома были поставлены эксперименты в ходе которых выявляли синтез ДНК и РНК в гибридных клетках. Инкубация клеток в среде, содержащей смесь меченых нуклеотидов (EdU, FU), конкурирующих с каноническими нуклеотидами при синтезе нуклеиновых кислот, позволяет раздельно выявить в одних и тех же клетках новосинтезированную ДНК и РНК. До четвёртых суток включительно не было выявлено признаков синтетической активности в ядрах сперматозоидов, в то время как ядра клеток-реципиентов включали оба типа меченых нуклеотидов.

Так как на ультраструктурном уровне вокруг ядер сперматозоидов, проникших в соматические клетки, обнаруживаются элементы ядерной оболочки, было проведено иммуноцитохимическое выявление ламинов А и С. Полученные, в ходе этого эксперимента, результаты свидетельствуют о том, что ядра сперматозоидов не обладают полноценной ядерной оболочкой, выявляемой в соматических ядрах гетерокарионов при помощи антител против ламинов. Таким образом, анализ ядер нативных сперматозоидов, слитых с культивируемыми клетками, показывает, что в полученных клеточных гибридах не происходит функциональная реактивация генома сперматозоидов, однако нуклеопротаминовый хроматин способен к декомпактизации.

Разрывы ДНК в хроматине сперматозоидов в контроле и после слияния с культивируемыми клетками.

Известно, что на начальных этапах дифференцировки в ядрах ранних сперматид наблюдаются множественные разрывы ДНК, индуцированные активностью топоизомеразы, которые, по-видимому, необходимы для топологических перестроек ремоделирующегося хроматина (Akama et al., 1999; Kierszenbaum, 2001; Carrell et al., 2007). Впоследствии, эти разрывы репарируются, однако даже в эякуляте здоровых доноров выявляется небольшое количество (около 1 – 5%) дефектных по этому признаку сперматозоидов. Причины появления сперматозоидов с разрывами ДНК до настоящего времени не выяснены, однако, в медицинской практике тест на наличие разрывов ДНК (TUNEL) широко используется и является важной характеристикой «качества» эякулята.

В использованном образце спермы (контроль) разрывы ДНК детектируются только в 50% сперматозоидов. Оказалось неожиданным, что после формирования гетерокарионов (на 1-3 сутки после слияния), разрывы ДНК выявляются в ядрах всех исследованных сперматозоидов, внедренных в клетки.

При этом характер окрашивания и общая яркость свечения варьирует. Было выделено два основных паттерна распределения разрывов ДНК: гомогенное окрашивание всего ядра сперматозоида и окрашивание периферии акросомного полюса. При этом не было отмечено случаев выявления разрывов ДНК в ядрах и хромосомах клеток-реципиентов.

Хотя существенная часть сперматозоидов, лежащих вне клеток, содержит разрывы ДНК, характер окрашивания их ядер на разрывы ДНК имеет ряд существенных отличий. Во-первых, разрывы ДНК выявляются только примерно в половине всех сперматозоидов. Во-вторых, яркость окрашивания сперматозоидов, не включенных в клетку, заметно ниже, чем в гибридах.

На более поздних сроках (4-6 сутки после индукции слияния) ситуация коренным образом изменяется: в популяции появляются клетки, в которых выявляются крупные ядра сперматозоидов без разрывов ДНК.

Электронно-микроскопический анализ ядер сперматозоидов, внедренных в культивируемые клетки.

Через 48 часов после индукции слияния в цитоплазме клеток-реципиентов можно обнаружить только ядра сперматозоидов, тогда как, элементы акросомального комплекса, митохондрии и центриоли не выявляются. В некоторых гетерокарионах на благоприятных сечениях можно идентифицировать элементы частично деградирующего жгутика. Принципиально важно, что вокруг отдельно лежащих ядер не удается обнаружить плазматических мембран. Эти данные показывают, что ядра сперматозоидов включаются в состав цитоплазмы клеток-реципиентов. При этом хроматин сперматозоидов может существенно различаться по характеру компактизации. Условно, можно выделить два основных типа ядер. Ядра сперматозоидов первого типа характеризуется более высокой плотностью, чем ядра клеток-реципиентов (Рис. 3а). На границе хроматина и цитоплазмы присутствуют протяжённые структуры толщиной около 20 нм, напоминающие элементы оболочки.

На малом и большем увеличении в хроматине сперматозоида выявляются рыхлые фибриллярные комплексы переменной толщины от 50 до 300 нм (Рис. 3а).

«Элементарной» структурой таких комплексов являются гладкие фибриллы толщиной около 8 нм, иногда лежащие параллельно. Пространство между комплексами заполнено фибриллами сходной толщины. На тангенциальных сечения, выявляемых на периферии ядра «элементарные» фибриллы располагаются более компактно, чем в центральной области.

Сперматозоиды второго типа имеют более декомпактизованный хроматин. В этом случае структура ядра сперматозоида сравнима по плотности с ядром соматической клетки (Рис. 3б). Как и в предыдущем случае в ядре преобладают гладкие фибриллы толщиной около 8 нм. Отдельные фибриллы, формируют зоны локального сгущения, где иногда выявляются розеточные структуры. Сохраняются участки парных, параллельно лежащих фибрилл.

Для достижения большей декомпактизации хроматина внедренных сперматозоидов были изучены гибриды, зафиксированные спустя 6 суток после индукции слияния.

Плотность ядра сперматозоида в данном случае меньше, чем плотность ядра соматической клетки (Рис. 3в). Хроматин сперматозоида, как и на более ранних сроках, представлен рыхлой сетью «элементарных» фибрилл. Однако в данном случае фибриллы имеют переменную толщину от 7 до 10 нм. На периферии хроматина выявляются элементы ядерной оболочки. Особенно четко ядерная оболочка визуализируется в кариоплазматических инвагинациях.

Тот факт, что выявленная структурная реорганизация хроматина строго специфична для гетерокариотических систем, подтверждается ультраструктурным анализом сперматозоидов, заведомо находившихся вне клетки. В таких сперматозоидах наблюдается, практически, полная деградация цитоплазматических структур, однако нуклеопротаминовый хроматин сохраняет относительно высокую степень компактизации.

Рис. 3 Гетерокарионы с различной плотностью хроматина (слева увеличение х10000, справа – х30000).

а – плотность хроматина сперматозоида выше, чем у интерфазного ядра (стрелками и звёздочкой отмечены фибриллярные комплексы): двойные и одиночные гладкие фибриллы толщиной 8 нм;

б – плотность хроматина сперматозоида сравнима с хроматином интерфазного ядра (стрелками отмечены элементы оболочки, окружностями – розеточные структуры): гладкие фибриллы толщиной 8 нм иногда, формирующие розеточные структуры;

в – плотность хроматина сперматозоида меньше, чем у интерфазного ядра:

фибриллы толщиной 7-10 нм.

В структурном отношении процесс ремоделирования хроматина в дифференцирующихся сперматозоидах человека можно условно разделить на 3 этапа:

декомпактизация, замещение гистонов протаминами и рекомпактизация.

Первый этап, связанный с ацетилированием гистонов и включением транзиторных белков, завершается полной декомпактизацией хроматина.

На втором этапе, связанном с заменой гистонов на протамины, в ядрах дифференцирующихся сперматид возникают локальные участки компактизации, представленные глобулярными «макрокомплексами». Основываясь на данных иммуноцитохимии (Prigent et al., 1996), можно предположить, что высокая электронная плотность этих комплексов создается за счет концентрации белков (транзиторных белков и/или белков ядерного матрикса, в том числе, топоизомеразы), и протаминов, замещающих эти белки. Ограниченное время существования этих комплексов показывает, что они являются скорее транзиторными элементами, чем структурно-функциональными доменами хроматина. На этом основании глобулярные «макрокомплексы» можно условно назвать «фабриками ремоделирования».

На третьем этапе, этапе компактизации, структурная организация хроматина существенно перестраивается. Транзиторные глобулярные комплексы значительно уменьшаются в размерах, границы между ними «размываются», в результате хроматин приобретает преимущественно фибриллярную форму, с толщиной фибрилл около 40 нм. По аналогии с известными субдоменами нуклеогистонового хроматина интерфазных ядер (Zatsepina et al., 1983), мы называем фибриллы толщиной 40 нм в ядрах сперматид и сперматозоидов «нуклеопротаминовыми хромонемами».

Эксперименты по гибридизации сперматозоидов с культивируемыми клетками показывают, что основу нуклеопротаминовых хромонем составляют «элементарные»

фибриллы толщиной около 8 нм.

Завершается этап компактизации в эпидидимусе, где нуклеопротаминовый хроматин за счет формирования межмолекулярных дисульфидных связей переходит в состояние однородной по плотности массы, в которой не удается идентифицировать отдельных структурных элементов. По-видимому, в этом процессе существенную роль играют ионы магния, так как их удаление из среды инкубации приводит к «обратной» реконструкции 40 нм фибрилл.

Попытки реконструировать глобулярные комплекса с помощью искусственной декомпактизации ядер зрелых сперматозоидов не привели к положительному результату. После экстракции части протаминов и восстановления дисульфидных групп, глобулярные структуры в составе нуклеопротаминового хроматина не выявляются, что свидетельствует о «переупаковке» хроматина после завершения работы «фабрик ремоделирования».

Полученные в работе данные позволяют предложить динамическую модель организации нуклеопротаминового хроматина в сперматозоидах человека (Рис. 4).

Возникает вопрос, как предложенная модель согласуются с современными представлениями об организации нуклеопротаминового хроматина. К сожалению, в доступной литературе, практически, отсутствуют данные о структуре хроматина в дифференцирующихся сперматидах человека, фиксированных in situ. Наши наблюдения полностью соответствую фотографиям, представленным в работах Prigent et al., (1996; 1998), однако авторы не акцентировали внимание не структурных аспектах проблемы.

Что касается искусственно декомпактизованного хроматина, то в этой области разброс данных настолько велик, что отдельные работы трудно сопоставимы (см.

таблицу). Как правило, после искусственной деконденсации в хроматине выявляется иерархия фибрилл: тонкие (от 6 до 30 нм) и толстые (от 45 до 120 нм). Такой разброс данных, по-видимому, связан с использованием различных деконденсирующих реагентов и/или объектов исследования. Наиболее популярная в настоящее время тороидальная модель упаковки нуклеогистонового хроматина (Ward, 1993; 2010) основана на экспериментах in vitro и не имеет убедительных экспериментальных подтверждений.

Рис. 4 Схема, иллюстрирующая структурные перестройки нуклеопротаминового хроматина в предложенной модели.

Гипотетические уровни упаковки

ВЫВОДЫ

Электронномикроскопический анализ сперматид на поздних стадиях дифференцировки и эксперименты по декомпактизации ядер зрелых сперматозоидов в гибридных клетках показали, что «элементарной»

структурной единицей нуклеопротаминового хроматина являются фибриллы толщиной около 8 нм.

Формирование глобулярных структур на этапе замещения гистонов промежуточными белками и протаминами свидетельствует в пользу существования в хроматине ранних и средних сперматид субкомпартментов «высшего» порядка, предположительно, соответствующих ранее описанным розеточным структурам.

Конечным этапом ремоделирования хроматина является формирование фибриллярных макрокомплексов толщиной 40-60 нм – нуклеопротаминовых хромонем с элементами спиральной организации;

Искусственная декомпактизация зрелых сперматозоидов в буфере с низкой ионной силой, лишённом двухвалентных катионов, позволяет «реконструировать» уровень нуклеопротаминовых хромонем, но не дискретных глобулярных структур средних сперматид.

Удаление из нуклеопротаминового хроматина части белков и восстановление дисульфидных групп приводит к выявлению элементов спиральной упаковки «элементарных» нуклеопротаминовых фибрилл в фибриллярных макрокомплексах (нуклеопртаминовых хромонемах). Этот факт косвенно свидетельствует о возможной кардинальной «переупаковке» хроматина на последних стадиях ремоделирования;

На основании полученных данных предложена динамическая модель организации нуклеопротаминового хроматина в сперматозоидах человека.

Автор выражает благодарность всем сотрудникам отдела электронной микроскопии НИИ ФХБ им А. Н. Белозерского за участие и поддержку, оказанную в ходе выполнения работы. Отдельная благодарность Голышеву Сергею Александровичу за руководство, обучение методам и содействие в получении результатов, Брагиной Елизавете Ефимовне за оказанную помощь в получении материала для исследования, Кирееву Игорю Игоревичу за продуктивные обсуждения, смелые гипотезы и новые методики, Глебу Ивановичу Кирьянову за своевременно поданные идеи, Шевалю Евгению Валерьевичу за деятельную помощь и конструктивную критику.

За предоставленные для исследования образцы эякулята и биопсий, автор выражает благодарность Витязевой Ирине Ивановне, заведующей отделением ВРТ ФГУ «Эндокринологический научный центр» и Яковенко Сергею Александровичу, генеральному директору клиники ЭКО АльтраВита.

Особая благодарность выражается Лазареву Алексею и Евгению Павловичу Сенченкову за поддержание в рабочем состоянии электронных микроскопов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Е. А. Арифулин, Е. Е. Брагина, В. А. Замятнина, Е. Г. Волкова, Е. В. Шеваль, С. А. Голышев, А. Н. Прусов, Л. Н. Кинцурашвили, Г. И. Кирьянов, В. Ю. Поляков Компактизация ДНК в сперматозоидах человека. I. Динамика изменений компактизации нуклеогистонного и нуклеопротаминного хроматина в дифференцирующихся сперматидах. Онтогенез. (В печати) 2) Е. Е. Брагина, Е. А. Арифулин, С. А. Голышев. Разработка диагностических критериев патологии мужского бесплодия на основе особенностей молекулярных и структурных модификаций инактивированного хроматина сперматозоидов. // Тезисы Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработка по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы».

3) Е. А. Арифулин, Е. Е. Брагина, В. А. Замятнина, Е. В. Шеваль, С. А. Голышев, Л. Н. Кинцурашвили, Г. И. Кирьянов, А. Н. Прусов, В. Ю. Поляков. Динамика изменений компактизации нуклеогистонного и нуклеопротаминного хроматина в дифференцирующихся спермиях. // Тезисы XVI Всероссийского симпозиума «Структура и функции клеточного ядра».