На правах рукописи

Куликова Наталья Александровна

ЗАЩИТНОЕ ДЕЙСТВИЕ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ

ПО ОТНОШЕНИЮ К РАСТЕНИЯМ В ВОДНОЙ И ПОЧВЕННОЙ СРЕДАХ

В УСЛОВИЯХ АБИОТИЧЕСКИХ СТРЕССОВ

Специальности 03.00.16 – Экология и 03.00.27 –Почвоведение

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва-2008

Работа выполнена на факультете почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова

Научный консультант:

доктор химических наук, профессор Перминова И.В.

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, академик РАСХН Спиридонов Ю.Я.

Доктор химических наук, член-корреспондент РАН Тарасова Н.П.

Доктор биологических наук, профессор Щеглов А.И.

Ведущая организация: почвенный институт имени В.В. Докучаева РАСХН

Защита состоится 28 ноября 2008 г. в 14-30 на заседании Диссертационного Совета Д 501.001.55 по защите диссертаций на соискание учёной степени доктора наук по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ имени М.В. Ломоносова, д. 1, корпус 12 (биологический факультет), аудитория 389.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан_

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат биологических наук Н.В. Карташева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Возрастающая антропогенная нагрузка на окружающую среду обусловила возникновение такой глобальной задачи современности как целенаправленное регулирование нарушенного равновесия в экосистемах. Решение этой задачи включает в себя изучение детоксификации загрязняющих веществ и поиск безопасных средств защиты организмов от повреждающего действия токсикантов. В качестве таких средств защиты могут выступать природные физиологически активные соединения, к которым относятся гуминовые вещества (ГВ), содержащиеся во всех природных средах, включая природные воды, почвы, торфа, сапропели и угли. Образование ГВ представляет собой второй по масштабности после фотосинтеза процесс трансформации органического вещества в природе, в который вовлекается около 20 Гт углерода в год. ГВ выполняют ряд важных экологических функций в биосфере: аккумулятивную, транспортную, регуляторную, физиологическую и защитную. Особую актуальность в последнее время приобретает исследование защитной функции ГВ с целью ее дальнейшего практического применения, так как именно она отвечает за поддержание равновесия в экосистемах, подверженных сильной антропогенной нагрузке. Следовательно, установление механизма защитного действия ГВ позволит более эффективно использовать существующие гуминовые стимуляторы роста растений в сельском хозяйстве, а также указать пути к созданию нового поколения средств защиты растений на основе ГВ, например, гуминовых детоксикантов и биоактиваторов.

В настоящее время общепринятым является положение о том, что защитная функция ГВ в условиях химического стресса обеспечивается их способностью связывать загрязняющие вещества в комплексы, недоступные для живых организмов.

При таком понимании защитного действия ГВ практически игнорируется роль их физиологической активности в процессах детоксификации загрязненных сред. Кроме того, при таком подходе остаётся нерешённой проблема защитного действия ГВ в условиях других абиотических стрессов, таких неблагоприятная температура, недостаток влаги, засоление и др. Причиной этого является отсутствие систематических исследований по роли физиологической активности в защитной функции ГВ. Поэтому целью работы было изучить природу защитного действия ГВ по отношению к растениям во взаимосвязи с их физиологической активностью в условиях различных абиотических стрессов в водной и почвенной средах и предложить пути практического использования полученных знаний для создания средств защиты нового поколения на основе ГВ.

Цель работы Цель работы состояла в изучении природы защитного действия ГВ по отношению к растениям в водных и почвенных средах в условиях различных абиотических стрессов и оценке перспективности применения природных и модифицированных гуминовых препаратов в качестве средств защиты растений. В работе были поставлены следующие основные задачи:

выделить и охарактеризовать ГВ из различных природных сред;

изучить защитное действие ГВ и выявить его основные закономерности в условиях различных абиотических стрессов, включая присутствие токсикантов, железодефицитный хлороз, водный, солевой и температурный стрессы;

изучить взаимодействие ГВ с клетками и растениями и предложить концептуальную модель защитного действия ГВ;

оценить перспективность применения природных и модифицированных гуминовых препаратов в качестве средств защиты растений (детоксикантов, стимуляторов роста, корректоров хлороза, биоактиваторов).

Научная новизна На основании количественной оценки детоксифицирующих свойств ГВ в присутствии токсикантов показано, что защитное действие ГВ в почвенных средах обусловлено, прежде всего, образованием нетоксичных комплексов ГВ-токсикант, тогда как в водных средах значительный вклад может вносить собственная биологическая активность ГВ. В случае высоких констант связывания (тяжёлые металлы), ведущую роль в защитных свойствах ГВ играет образование нетоксичных комплексов ГВ-токсикант, тогда как при слабом химическом взаимодействии (гербициды) основную роль играет собственная физиологическая активность ГВ.

Установлено, что защитное действие ГВ по отношению к растениям в условиях абиотических стрессов более выражено в водных, чем почвенных средах, что связано со снижением доступности ГВ для растений.

Впервые показана перспективность использования модифицированных ГВ в качестве средств защиты растений нового поколения, а именно: хинон-обогащенных гуминовых производных – в качестве детоксикантов почв, гуматов железа – в качестве корректоров хлороза у растений, обогащённых кремнием ГВ – в качестве биоактиваторов.

Впервые проведена численная оценка кинетики поглощения ГВ растениями с использованием меченных тритием препаратов. Показано, что константы МихаэлисаМентен ГВ лежат в диапазоне, характерном для ионов и индивидуальных веществ, поступающих в растения, а максимальная скорость поглощения ГВ – на несколько порядков ниже. Установлено, что поступление ГВ в растения происходит по механизму активного транспорта и напрямую связано со скоростью метаболизма.

С использованием авторадиографии установлено, что ГВ аккумулируются преимущественно в корнях растений. Показано, что повышенное содержание ГВ наблюдается в апикальных участках корней и побегов.

Установлено, что ГВ, поступившие в растения, аккумулируются в липидной фракции. С использованием метода масс-спектрометрии ионного циклотронного резонанса с Фурье преобразованием впервые показано, что продукты метаболизма ГВ присутствуют в составе ненасыщенных жирных кислот. Предложена концептуальная модель защитного действия ГВ, основанная на их участии в липидном обмене растений.

Практическая значимость Выявленные основные закономерности защитного действия ГВ в условиях абиотических стрессов в водных и почвенных средах могут служить основой для создания нового поколения средств защиты растений на основе ГВ.

Установленные зависимости «структура – детоксифицирующие свойства ГВ»

могут быть использованы при выборе гуминовых препаратов, оптимальных для рекультивации почв, загрязненных гербицидами и тяжёлыми металлами.

Показана перспективность использования модифицированных ГВ, искусственно обогащённых кислородсодержащими функциональными группами, для детоксификации сред, загрязнённых тяжелыми металлами.

Продемонстрирована возможность использования гуминовых препаратов, обогащённых железом, для коррекции железодефицитного хлороза.

Показана перспективность использования обогащённых кремнием ГВ в качестве биоактиваторов растений в условиях солевого стресса.

Полученные значения констант связывания атразина ГВ могут быть использованы для расчета форм существования атразина в окружающей среде при построении моделей биогеохимического цикла и оценки степени загрязнения почв.

Полученные данные по взаимодействию атразина с почвами в присутствии лакказы могут быть использованы для разработки биотехнологических подходов к рекультивации почв, загрязнённых гербицидами сим-триазинового ряда.

На примере ГВ предложен способ исследования поглощения и распределениях в растениях сложных высокомолекулярных соединений природного происхождения с использованием меченных тритием препаратов.

Предложен способ обработки данных альгологического тестирования токсичности водных сред, позволяющий учитывать мешающее влияние ГВ.

Положения, выносимые на защиту различие в эффективности защитного действия ГВ по отношению к растениям в условиях различных абиотических стрессов в водных и почвенных средах;

основные закономерности поглощения ГВ растениями и распределения в них;

положение о неспецифической природе защитного действия ГВ и его концептуальная модель;

возможность усиления защитных свойств гуминовых препаратов путем направленного введения функций, способствующих снятию абиотических стрессов.

Апробация Отдельные части работы были представлены на Международных конференциях студентов и аспирантов «Ломоносов-96» и «Ломоносов-98» (Москва, 1996, 1998); на 16-ом Всемирном конгрессе по почвоведению (Монпелье, 1998), 9-ой ежегодной конференции SETAC-Europe (Лейпциг, 1999); 10, 11, 12 и 13-ой международных конференциях IHSS в 1997 (Анахейм, США), 2000 (Тулуза, Франция), 2002 (Бостон, США) и 2006 (Карлсруэ, ФРГ); научно-практическом семинаре при поддержке НАТО «Use of humates to remediate polluted environments: from theory to practice»

(Звенигород, 2002); II Московском международном конгрессе по биотехнологии «Состояние и перспективы развития» (Москва, 2003); научно-практической конференции «Современные проблемы тканевой терапии и перспективы использования БАВ» (Одесса, 2003); 12-м международном симпозиуме по загрязнению окружающей среды (Анталия, 2003); 4-м съезде Докучаевского общества почвоведов (Новосибирск, 2004); на Международной научной конференции «Современные проблемы загрязнения почв» (Москва, 2004); Всероссийской конференции «Экспериментальная информация в почвоведении: теория и пути стандартизации» (Москва, 2005); международной конференции «Biocatalysis-2005:

fundamentals and application» (Санкт-Петербург, 2005); 10 и 11 симпозиумах северного отделения IHSS «Character of natural organic matter and its role in the environment» в 2005 (Рига, Латвия) и 2007 (Йонсуу, Финляндия); 3 и 4 Всероссийских конференциях «Гуминовые вещества в биосфере» в Санкт-Петербурге (2005) и Москве (2007); Российской конференции по радиохимии (Дубна, 2006); научной конференции Ломоносовские чтения (Москва, 2006); VII конгрессе Итальянского отделения IHSS (2007); на XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 59 работ, включая 28 статей (из них 10 в журналах, рекомендованных ВАК), 1 патент и 30 тезисов международных и всероссийских конференций.

Личный вклад автора Диссертационная работа является результатом многолетних (1997-2008 гг) исследований автора. Автору принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, развитию и проверке экспериментальных подходов, предложенных в работе, а также в обсуждении, оформлении и обобщении полученных результатов.

Экспериментальная работа выполнена автором самостоятельно и в соавторстве с российскими и зарубежными коллегами. В совместных исследованиях личный вклад автора заключался в постановке задачи, в непосредственном участии и руководстве при проведении экспериментальной работы, в интерпретации полученных результатов и оформлении их в виде публикаций.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Выделение и характеристика ГВ различных природных сред Отличительной особенностью ГВ является стохастический характер, обусловленный особенностями их образования в результате отбора биотермодинамически устойчивых структур. Как следствие, к фундаментальным свойствам ГВ относятся нестехиометричность состава, нерегулярность строения, гетерогенность структурных элементов и полидисперсность. Поэтому для ГВ неприменимо понятие молекулы, а вероятную схему их строения представляют с помощью структурной ячейки – минимального по размеру фрагмента молекулы, который содержит все важнейшие структурные единицы. Сложность строения ГВ хорошо иллюстрирует гипотетическая структурная формула ГВ почв, опубликованная в 1970 г. Кляйнхемпелем (рис. 1.1). Указанная формула представляет собой попытку одновременно сохранить детальное описание структуры ГВ и показать ее статистический характер. Это достигается за счет чрезмерной громоздкости формулы, в которой автор приводит практически все возможные элементы структуры и способы их сочленения. Данная формула наиболее полно отражает набор структурных фрагментов ГВ, хотя она неоднократно подвергалась критике, в частности, в связи с чрезмерно высоким содержанием азота.

HOOC HOOCOH

OH COOH

O O O OH NH O

Рис. 1.1. Гипотетический структурная формула ГВ почв [Kleinhempel D.//AlbrechtThaer-Archiv., 1970, 14(1), pp.3-14.].

Как видно из приведенной структурной формулы, по своей химической природе ГВ представляют собой нерегулярные сополимеры ароматических оксиполикарбоновых кислот с включениями азотсодержащих и углеводных фрагментов. Указанное строение – наличие каркасной части, т.е. ароматического углеродного скелета, замещенного алкильными и функциональными группами, среди которых преобладают карбоксильные, гидроксильные и метоксильные, и периферической части, обогащенной полисахаридными и полипептидными фрагментами, – является общим для ГВ всех источников происхождения.

Отсутствие адекватного аналитического обеспечения и методологических подходов к анализу и численному описанию строения ГВ привело к тому, что, определение класса ГВ до сих пор основано на способе их экстракции из природных объектов, а общепринятая классификация – на процедуре фракционирования. ГВ подразделяют на гумин (нерастворим во всем диапазоне рН), гуминовые кислоты (ГК, нерастворимы при рН < 2) и фульвокислоты (ФК, растворимы во всем диапазоне рН).

Последние два класса объединяют под общим названием гумусовые кислоты. Эта схема дополняется иногда также выделением гиматомелановых кислот (ГМК), отделяемых воздействием на сырой осадок ГК этанолом.

В связи с тем, что ГВ характеризуются нестехиометричностью состава, нерегулярностью строения и гетерогенностью структурных элементов, для проведения исследований необходимо было создать представительную выборку препаратов ГВ с широким разнообразием состава и свойств, адекватную стохастическому характеру объекта. Всего в работе было использовано 66 препаратов ГВ из различных природных источников, включая торфа, почвы, угли, природные воды и донные отложения, а также 36 препаратов модифицированных ГВ. ГВ были охарактеризованы методами элементного анализа, 13С ЯМР-спектроскопии и эксклюзионной хроматографии (табл. 1.1).

Исследованные препараты значительно отличались по элементному составу и структурным характеристикам. Наибольшее содержание углерода и наименьшее кислорода было отмечено для ГК углей и торфов. Эти же препараты характеризовались самым высоким содержанием ароматических фрагментов.

Максимальное содержание кислорода было отмечено для препаратов ГВ природных вод, минимальное – для ГВ торфов. Наименьшими молекулярными массами МW характеризовались ГВ природных вод; наибольшими – торфов.

Табл. 1.1 Химическая характеристика использованных препаратов ГВ CHP-PH-PC250-А 0.86 0.45 Разнообразие свойств использованных в работе препаратов проиллюстровано диаграммой ван Кревелена (рис. 1.2), отражающей распределение ГВ по степени их ненасыщенности (атомное отношение Н/С) и обогащённости кислородом (атомное отношение О/С).

Рис. 1.2. Диаграмма ван Кревелена для исследованных в работе препаратов ГВ.

Как видно из представленных на рис.1.2 данных, ГВ, выделенные из углей и природных вод, характеризуются достаточно узкими диапазонами значений H/C и O/C и образуют достаточно хорошо обособленные группы. ГВ почв и торфов, напротив, образуют смешанную группу с широким разбросом этих показателей. В целом можно отметить, что использованные в работе ГВ характеризовались разбросом значений атомных отношений H/C и O/C 0.62-1.20 и 0.21-1. соответственно, что позволяет сделать вывод о представительности созданной выборки препаратов.

Глава 2. Исследование защитного действия ГВ методами биотестирования:

метрологическая характеристика и количественное описание детоксифицирующих свойств 2.1. Метрологическая характеристика использованных методов биотестирования Несмотря на высокий уровень существующих в настоящее время инструментальных методов, при проведении исследований, связанных с биологическими объектами, неизбежно применение биотестирования, позволяющего получать интегральную оценку воздействия на живые организмы различных факторов окружающей среды. При использовании методов биотестирования необходимо принимать во внимание нерешенную проблему достоверности получаемых результатов, связанную с неизбежной погрешностью метода и высокой гетерогенностью свойств, характерных для биологических объектов. Получение надёжных, научно обоснованных результатов было достигнуто правильным планированием структуры исследования. Одним из обязательных этапов является планирование объема выборки, позволяющего получать данные, отвечающие заданной точности. Выбор необходимого размера выборки n проводили как:

где s – стандартное отклонение, tP – коэффициент Стьюдента для вероятности P и объеме выборки в предварительных экспериментах m, IP выбираемая экспериментатором максимальная разница между истинным и выборочным средним, выраженная в процентах. Для наших исследований необходимые объемы выборки рассчитывали для Ip = 5 и 10% и P = 90, 95 и 99%. Результаты расчётов для основных методов биотестирования, использованных в работе, приведены в табл. 2.1.

Табл. 2.1. Необходимые объемы выборки при проведении биотестирования использованными методами при различных значениях максимально допустимого отклонения среднего значения от истинного Ip и вероятности P Тест-отклик Метод проростков Альгологическое биотестирование Лабораторно-вегетационные эксперименты Полевые эксперименты При проведении биотестирования в работе использовали объёмы выборок, рассчитанные для Ip = 5% при вероятности P = 99%. Исключение составили полевые эксперименты, для которых рассчитанные необходимые объёмы выборки колебались в пределах от 251 до 900 даже при Ip = 10%. Поэтому определение объёма выборок при проведении полевых экспериментов осуществляли на основании производственных возможностей.

2.2. Количественное описание детоксифицирующих свойств ГВ Защитное действие ГВ по отношению к живым организмам в присутствии токсикантов различных классов, т.е. явление детоксификации, ранее отмечалось многими исследователями. Тем не менее, большинство работ посвящено исключительно констатации наблюдаемого явления, в то время как проблема его количественной характеристики, направленная на поиск его взаимосвязи со структурными параметрами ГВ, их собственным действием на организмы и связующей способностью по отношению токсикантам практически не проводились.

Для количественной оценки защитных свойств ГВ в присутствии токсикантов (обычно в данном случае используют термин «детоксифицирующих») нами был использован подход, основанный на использовании коэффициента детоксификации D и константы детоксификации KOCD, определяемых из данных токсикологических экспериментов. Достоинством коэффициента детоксификации D является то, что он отражает изменение уровня токсичности Т в присутствии ГВ (ТТ+ГВ) по сравнению с токсичностью Т в их отсутствие (ТТ), учитывая при этом возможное изменение тестотклика под влиянием собственного воздействия ГВ. Принимая, что:

где R0 – тест-отклик в контроле (без токсиканта и ГВ); RТ – тест-отклик в присутствии Т; RГВ тест-отклик в присутствии ГВ; RТ+ГВ тест-отклик в присутствии токсиканта и ГВ, получаем:

При условии, что чувствительность тест-организмов к собственному действию ГВ не изменяется в присутствии токсиканта, использование коэффициента D позволяет охарактеризовать детоксифицирующий эффект ГВ, обусловленный только связыванием токсиканта в нетоксичные комплексы, на фоне их стимулирующего воздействия на тест-объект. Поэтому, зная зависимость коэффициента D от концентрации ГВ (т.н. кривую детоксификации), можно рассчитать константу детоксификации KOCD. Преимущество данного параметра при оценке детоксификации по сравнению с коэффициентом D состоит в том, что если последний позволяет получить точечную оценку детоксификации, то KOCD является характеристикой детоксифицирующей способности ГВ во всем диапазоне концентраций. При этом его физический смысл аналогичен константам связывания, определяемым в химических экспериментах. Для вывода уравнения данной константы запишем уравнение связывания токсиканта ГВ:

Долю токсиканта, находящегося в свободном состоянии, можно выразить через соответствующую константу связывания:

В условиях, когда токсичность раствора прямо пропорциональна концентрации токсиканта, токсичность в его присутствии будет выражаться следующим образом:

где k – коэффициент пропорциональности.

Токсичность токсиканта в присутствии ГВ аналогично можно записать как:

Подставляя (2.7) и (2.8) в уравнение (2.8), получаем:

Выражая долю несвязанного токсиканта через концентрацию ГВ на основании зависимости KOC от (2.6), получаем:

K OC D C ГВ

Фигурирующую в данном уравнении константу, определяемую видом зависимости эффекта детоксикации от концентрации ГВ, мы назвали константой детоксификации – KOCD. Она будет эквивалентна константе химического связывания в случае, если величина эффекта детоксикации D зависит только от концентрации свободной формы токсиканта. На практике KOCD можно рассчитать путем аппроксимации экспериментальных зависимостей D от концентрации ГВ уравнением (2.10). Поэтому результаты всех токсикологических экспериментов представляли в виде соответствующих кривых детоксификации.

Глава 3. Защитное действие ГВ в условиях гербицидного стресса 3.1. Защитное действие ГВ в условиях гербицидного стресса в водной среде В качестве модельного гербицида для создания гербицидного стресса использовали атразин – представитель класса сим-триазиновых гербицидов, ингибиторов фотосинтеза. Выбор был обусловлен высокой устойчивостью этого гербицида в окружающей среде.

Изучение связывающей способности ГВ по отношению к гербициду показало, что диапазон изменения констант связывания атразина ГВ составил 110–575 л/кг ОC (табл. 3.1), что хорошо согласуется результатами предыдущих исследований и свидетельствует о незначительном взаимодействии атразина с ГВ.

Табл. 3.1. Константы связывания KOC атразина ГВ различного происхождения Полученные значения KОС использовали для выявления взаимосвязи между связывающей способностью и структурой ГВ (табл. 3.1 и 1.1). Корреляционный анализ показал наличие связи KОС с CAr и CAr/CAlk – параметрами, характеризующими степень ароматичности ГВ. Коэффициенты корреляции r для пар переменных «CAr KОС» и «CAr/CAlk - KОС» составили 0.91 и 0.87. Наличие данной взаимосвязи подтверждает важную роль ароматических фрагментов ГВ в процессе взаимодействия с атразином. Коэффициент корреляции между MW препаратов ГВ и KОС составил 0.73. Это может свидетельствовать о преимущественном связывании атразина с высокомолекулярными фракциями ГВ.

Для исследования детоксифицирующей способности ГВ по отношению к атразину в водной среде были выбраны препараты ГВ торфов (PHF-TTL, PHF-THH) и ОВ водных экстрактов этих же торфов (PDOM-TTL, PDOM-THH), что было обусловлено максимальными различиями в свойствах данных препаратов. При биотестировании в качестве тест-объекта использовали растения мягкой пшеницы Triticum aestivum L., а в качестве тест-отклика – интенсивность фотосинтеза растений, которую оценивали по отношению Y100/Yn замедленной флуоресценции (ЗФ), характеризующему скорость транспорта электронов, где Y100 – интенсивность ЗФ при интенсивности возбуждающего света 100%, Yn – интенсивность ЗФ при интенсивности возбуждающего света n%.

Проведенные эксперименты показали, что внесение ГВ и ОВ водных экстрактов торфов в биотестируемую систему способствовало снижению токсичности атразина во всех исследованных концентрациях. Однако наблюдаемые эффекты были невелики: значение коэффициента D варьировалось в пределах 0.2-0.6, т.е полного снятия токсичности не наблюдали. Значения констант связывания KOCD, рассчитанные на основании полученных данных согласно уравнению (2.10), приведены в табл. 3.2.

Табл. 3.2. Эффективные константы связывания KOCD атразина ГВ в водной среде Как видно из табл. 3.2, значения KOCD в 2-10 раз превышали значения KOC (табл. 3.1), причем для препаратов ОВ водного экстракта торфа это различие было более выражено, чем для препаратов ГВ. Кроме того, значения KOCD возрастали при уменьшении MW препаратов ГВ, в то время как для значений KOC была отмечена обратная тенденция. Таким образом, несмотря на близкие значения, константы взаимодействия KOC и KOCD по-разному зависели от свойств ГВ, т.е. детоксификация и связывание атразина определялись различными процессами. Подтверждением этому является также установленная взаимосвязь для пар переменных «О/С – KOCD» и «Н/С – KOCD», коэффициент корреляции для которых составил 0.94 и 0.96, соответственно, в то время как для KOC подобной взаимосвязи отмечено не было.

На основании полученных данных можно высказать предположение, что связывание атразина ГВ не является основным фактором, определяющим детоксификацию атразина. Для установления причины детоксификации атразина ГВ необходимо было провести дополнительные эксперименты, при этом в качестве тестобъектов следовало выбрать более простую, чем целый организм, систему. Поэтому для оценки защитного действия ГВ в качестве тест-объекта была использована одноклеточная водоросль Chlorella pyrenoidosa. Тест-откликом служили показатели Fi/Fm и Fv/Fm кривой индукции флуоресценции, характеризующие фотосинтетическую активность водоросли. При этом первый показатель зависит только от концентрации специфических ингибиторов фотосинтеза (т.е. атразина), а изменение отношения Fv/Fm может происходить вследствие широкого ряда причин и характеризует состояние водоросли в целом. Так как ГВ обладают собственной флуоресценцией, а их присутствие существенно сказывается на величинах Fv/Fm, предварительно были проведены эксперименты, направленная на оценку мешающего влияния ГВ. На основании полученных данных был предложен способ расчёта показателей Fi/Fm и Fv/Fm кривой индукции флуоресценции с учётом собственной флуоресценции ГВ.

Согласно нашим первоначальным предположениям, связывание атразина ГВ должно было привести к снижению концентрации свободного гербицида и, как следствие, уменьшению токсичности атразина. Для проверки этой гипотезы первоначально регистрацию токсичности атразина проводили сразу после внесения предварительно приготовленной смеси атразина с ГВ. Время взаимодействия ГВ и атразина составляло от 1 ч до 7 с. Было установлено, что присутствие ГВ не влияло на показатель Fi/Fm, т.е. взаимодействие атразина с ГВ в условиях эксперимента крайне незначительно или отсутствует.

В связи с тем, что детоксификация в присутствии ГВ может быть обусловлена не только связыванием токсиканта, но также их собственным действием на организмы, то необходимо было провести эксперименты с ненулевой экспозицией. Проведение таких экспериментов позволило регистрировать «суммарную» детоксификацию атразина в присутствии ГВ, обусловленную вышеупомянутыми причинами. В качестве тест-отклика использовали показатель Fv/Fm. Было установлено, что внесение ГВ приводило к снижению токсичности атразина (рис. 3.1). В большинстве случаев кривые детоксификации имели S-образную форму с выходом на плато при концентрации ГВ 30 мг/л. Исключение составили препараты водных экстрактов из торфа PDOM-THH и PDOM-TTL, для которых наблюдали линейную зависимость D от концентрации ГВ.

Рис. 3.1. Кривые детоксификации атразина ГВ различного происхождения.

Рассчитанные значения KOCD атразина ГВ (табл. 3.3) варьировались в пределах 5.0104–1.9106 л/кг ОС, превышая на 2 порядка аналогичные величины, полученных в экспериментах с растениями. ГВ водных вытяжек почв обладали наибольшей детоксифицирующей способностью по отношению к атразину. Близкими к ним значениями KOCD характеризовались ГК угля и чернозема. Препараты ФК почв практически не снижали токсичность атразина.

Сравнение KОС и KОСD (табл. 3.1) показало, что KОСD в среднем на два-три порядка превышали KОС, при этом коэффициент корреляции между ними составлял 0.12. Кроме того для KOC наиболее тесную корреляцию наблюдали с содержанием CAr в ГВ, тогда как для KОСD такая взаимосвязь отсутствовала. Найденная закономерность увеличения защитного действия ГВ при переходе от использования в качестве тестобъекта многоклеточного организма (растения) к одноклеточному (водоросли) позволяет предположить наличие взаимосвязи между защитными свойствами ГВ и их поглощением тест-организмами. Действительно, для KОСD нами была установлена