На правах рукописи

Яньшоле Вадим Владимирович

ИЗУЧЕНИЕ ФОТОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ С УЧАСТИЕМ МОЛЕКУЛЯРНОГО

УФ-ФИЛЬТРА КИНУРЕНИНА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ – КСАНТУРЕНОВОЙ КИСЛОТЫ

И КОНЪЮГАТОВ КИНУРЕНИНА С НИТРОКСИЛЬНЫМИ РАДИКАЛАМИ

01.04.17 – химическая физика, горение и взрыв, физика экстремальных состояний вещества

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Новосибирск - 2011

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте «Международный томографический центр» Сибирского отделения РАН доктор химических наук

Научный руководитель Центалович Юрий Павлович доктор физико-математических наук, профессор

Официальные оппоненты Соколова Ирина Владимировна кандидат физико-математических наук Евгений Михайлович Глебов Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля

Ведущая организация РАН

Защита состоится “16” марта 2011 г. в 15:00 на заседании диссертационного совета Д 003.014.01 в Институте Химической Кинетики и Горения Сибирского отделения Российской академии наук по адресу: 630090, Новосибирск 90, ул. Институтская 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеках Института Химической Кинетики и Горения СО РАН и МТЦ СО РАН.

Автореферат разослан “14” февраля 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор химических наук А.А. Онищук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Хрусталик глаза является уникальным органом человеческого тела. Он наделн всеми необходимыми свойствами для обеспечения хорошего зрения человека – проведением падающих световых лучей и их фокусировкой на сетчатке. Дополнительным свойством хрусталика является фильтрация проходящего через него ультрафиолетового (УФ) излучения, которая осуществляется благодаря семейству низкомолекулярных соединений – кинуренину (KN) и его производным. KN и его производные являются химически и фотохимически стабильными, в этих молекулах происходит конверсия поглощенной световой энергии в тепловую в результате безызлучательного перехода S1 S0.

Вследствие особенностей строения в хрусталике замедлен обмен метаболитов, который осуществляется только за счт диффузии, а также не происходит обновления белков и клеток.

Таким образом, полученные вследствие каких-либо воздействий повреждения белков могут аккумулироваться, и в хрусталике может развиться заболевание, известное как катаракта. По данным Всемирной организации здравоохранения, это заболевание является главной причиной нарушения зрения на планете. Молекулярные механизмы образования катаракты на данный момент остаются невыясненными. В настоящее время катаракту можно вылечить лишь хирургическим вмешательством – удалить естественный помутневший хрусталик и имплантировать искусственный. Очевидно, что свойства имплантата далеки от природных, и поэтому зрение не может быть восстановлено в полной мере. Не существует и лекарства, способного восстанавливать прозрачность хрусталика. Поэтому выяснение молекулярных механизмов образования катаракты является важным для прикладных приложений.

Недавно в литературе было сделано предположение, что химические и фотохимические реакции с участием УФ-фильтров могут приводить к образованию более высокореакционных соединений, способных модифицировать белки хрусталика. В частности, УФ-облучение водных растворов KN приводит к образованию триплетного состояния TKN. Триплетное состояние является химически высокоактивным и способно претерпевать реакции переноса электрона с аминокислотными остатками белков, образуя радикалы. Кроме того, в ходе метаболизма KN в хрусталике может образоваться 4,8-дигидроксихинолин-2-карбоксильная кислота (ксантуреновая кислота, XAN). В литературе сообщалось, что XAN способствует фотоокислению белков хрусталика. Более того XAN и е гликозид был обнаружен только в катарактальных человеческих хрусталиках; в нормальных человеческих хрусталиках данных соединений обнаружено не было. Поэтому исследование свойств данного соединения может помочь определить, может ли данное соединение являться хромофором, участвующим в процессе образования катаракты.

Солнечное излучение полезно для организма, однако при длительном воздействии солнечного излучения может произойти повреждение кожных покровов. Для защиты кожи от избыточной солнечной радиации современная косметология предлагает широкий выбор солнцезащитных кремов и лосьонов. Основными действующими компонентами этих средств являются молекулы, эффективно поглощающие или рассеивающие УФ-A и УФ-B излучение.

Одним из основных минусов солнцезащитных препаратов является образование свободных радикалов из активных компонентов этих средств вследствие их разложения под воздействием УФ-излучения. В свою очередь, свободные радикалы способствуют образованию активных форм кислорода (АФК), тем самым вызывая перекисное окисление липидов, что приводит к преждевременному старению клеток и даже к увеличению риска образования злокачественной меланомы.

Недавние исследования показали, что присутствие радикальных ловушек в солнцезащитных препаратах может дать заметный положительный эффект как с точки зрения замедления старения кожи, так и для уменьшения фотоповреждений кожных покровов, вызванных продолжительным солнечным облучением. В литературе с этой целью был предложен синтез хромофора – октилметоксициннамата (ОМС), ковалентно связанного с нитроксильными радикалами (нитроксидами, RNO•). Было показано, что полученные конъюгаты ОМС-RNO• поглощают УФ-излучение, а также обладают антиоксидантными свойствами, обусловленными способностью нитроксильных радикалов захватывать свободные радикалы. Однако квантовый выход фоторазложения OMC близок к единице ( = 0.51.0). Таким образом, поиск более фотостабильного соединения для синтеза подобного конъюгата является актуальной прикладной задачей для изготовления солнцезащитных препаратов.

В данной работе была предпринята попытка синтеза производных кинуренина, ковалентно связанных с нитроксильными радикалами (конъюгаты KN-RNO•). Выбор KN в качестве хромофора обусловлен его свойствами. Во-первых, кинуренин поглощает УФизлучение в области 300400 нм, т.е. УФ-A и УФ-B областях. Во-вторых, это природная аминокислота, которая выполняет функцию УФ-фильтра в хрусталике глаза человека и приматов, защищает ткани сетчатки и самого хрусталика от фотоиндуцированных повреждений и обладает высокой химической и фотохимической стабильностью. И в-третьих, дезактивация фотовозбужденных молекул УФ-фильтров происходит по механизму внутренней конверсии и не приводит к образованию радикальных частиц.

Основными целями работы являются:

1. Исследовать свойства XAN в основном и фотовозбужднном состояниях, изучить фотоиндуцированные процессы в молекуле XAN в различных растворителях.

2. Установить механизмы тушения триплетного состояния TKN нитроксидами.

3. Исследовать фотостабильность и оптические свойства конъюгатов KN-RNO•.

Научная новизна работы. Впервые установлены предпочтительные формы XAN в основном состоянии в различных растворителях. Показано, что при физиологических условиях (нейтральный водный раствор) основным изомером является анионная кето-форма. Установлено, что основным каналом гибели фотовозбужднного S1 состояния XAN в водных и спиртовых растворах является таутомеризация в енольную форму основного состояния, протекающая с участием молекул растворителя в пикосекундном временном диапазоне, с последующим восстановлением исходной кето-формы, в котором также участвуют молекулы растворителя. В апротонных средах увеличивается вклад других каналов дезактивации возбужднного состояния, приводящих к образованию короткоживущих промежуточных форм XAN в триплетном и основном состояниях.

Обнаружено, что нитроксильные радикалы являются эффективными тушителями триплетного состояния кинуренина; при этом тушение происходит благодаря ускоренной интеркомбинационной конверсии вследствие обменного механизма, что не приводит к образованию дополнительных продуктов реакции.

Установлено, что ковалентное присоединение нитроксидов к молекуле кинуренина приводит к значительному уменьшению времени жизни триплетного состояния, а основным каналом дезактивации триплетного состояния является интеркомбинационная конверсия по обменному механизму, что также не приводит к образованию дополнительных продуктов реакции. Однако вследствие внутримолекулярного переноса электрона от фотовозбужднной кинурениновой части к нитроксильной в конъюгатах наблюдается образование катионрадикала, что делает конъюгаты KN-RNO• менее фотостабильными, чем исходная молекула KN.

Практическая ценность. Выявленные механизмы дезактивации возбужднного состояния XAN могут быть использованы для дальнейших исследований по выяснению молекулярных механизмов катарактогенеза, а также при разработке препаратов, предотвращающих или замедляющих процесс образования катаракты. Сочетание эндогенного хромофора кинуренина с нитроксидами обещает быть весьма перспективным для использования в солнцезащитных препаратах. Разработка новых активных компонентов солнцезащитных препаратов, основанных на конъюгатах «хромофор-нитроксид», требует поиска соединений, для которых образование триплетного состояния и перенос электрона минимальны.

Личный вклад соискателя. Автор диссертации участвовал в постановке задач, решаемых в диссертационной работе, получил оригинальные результаты методами оптической, флуоресцентной и ЯМР-спектроскопии, методами лазерного импульсного и стационарного фотолиза, ВЭЖХ-анализом, а также квалифицированно провел обсуждение результатов. Результаты, представленные в диссертации, получены лично автором либо при его непосредственном участии.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и обсуждались на международной конференции «5th International Conference on Nitroxide Radicals SPIN 2008»

(Анкона, Италия, 7–11 сентября 2008 г.); на XXI Симпозиуме «Современная химическая физика» (Туапсе, Россия, 25 сентября – 6 октября 2009 г.), на Международном симпозиуме «Advanced Science in Organic Chemistry» (Мисхор, Крым, 21–25 июня 2010 г.), на Международном симпозиуме «XXIII IUPAC Symposium on Photochemistry» (Феррара, Италия, 11– Июля 2010 г.), на Молодежной школе-конференции «Актуальные проблемы органической химии» (Новосибирск, Россия, 12–19 сентября 2010).

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 4 статьях, а также в 6 тезисах докладов на международных и российских симпозиумах и конференциях.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 182 наименования. Работа изложена на 121 странице, содержит 4 таблицы, 27 рисунков и 15 схем.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

.

Во введении отражена актуальность проблемы, решению которой посвящена данная диссертация, сформулированы основные цели работы и дано описание структуры диссертации.

В первой главе представленной диссертации приведен литературный обзор, в котором описаны термические и фотохимические реакции с участием кинуренина и ксантуреновой кислоты, рассмотрены трхспиновые системы и системы «хромофор-нитроксид». Первая часть главы описывает образование KN из триптофана и образование высокореакционных соединений – карбоксикетоалкенов и триплетных состояний в ходе термических и фотохимических реакций кинуренина, соответственно. Показано, что данные соединения способны модифицировать аминокислотные остатки белков хрусталика. Вторая часть главы посвящена описанию свойств ксантуреновой кислоты. Обсуждаются механизмы образования XAN и е гликозида в процессе метаболизма, рассмотрено содержание данных соединений в хрусталике в зависимости от возраста и степени выраженности катаракты. Дано описание свойств схожих с XAN соединений – гидроксихинолинов – в основном и фотовозбужднном состояниях. В третьей части главы описаны циклические нитроксильные радикалы (RNO•), их история создания и различные применения. Рассмотрены антиоксидантные свойства, т.е.

реакции RNO• со свободными радикалами. Особое внимание уделено механизмам тушения возбужднных состояний нитроксильными радикалами. В четвртой части дано описание трхспиновых систем, рассмотрены принципы спинового катализа. Показано, что в конъюгатах «хромофор-нитроксид» происходит самотушение возбужднного состояния, и вследствие этого данные системы способны генерировать синглетный кислород. Рассмотрено применение конъюгатов «хромофор-нитроксид» в качестве активного компонента солнцезащитных кремов.

Во второй главе описан синтез используемых нитроксильных радикалов и гидроксиламинов, а также синтез конъюгатов KN-RNO•. Подробно описаны используемые в работы методы исследования и методики проведения экспериментов. Стационарные методы исследования включают в себя оптическую (УФ и видимый спектр, ИК, флуоресценция) спектроскопию, стационарный фотолиз, масс-спектрометрию, ЭПР, ЯМР, высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), квантовохимические расчты. Времяразрешнные измерения проводились на установках наносекундного лазерного импульсного фотолиза, фемтосекундного лазерного импульсного фотолиза (pump-probe), флуоресценции с фемтосекундным временным разрешением (upconversion). В данной главе дано подробное описание перечисленных установок и приведены их блок-схемы. Также перечислено программное обеспечение, использованное для анализа данных.

Третья глава посвящена исследованию свойств XAN в основном и фотовозбужднном состояниях. Прослежена фотоиндуцированная динамика в молекуле XAN в различных растворителях с временным разрешением от пикосекунд до нескольких микросекунд. В первой части главы исследованы свойства XAN в основном состоянии. Ксантуреновая кислота является гидроксихинолином, поэтому для этого соединения возможны реакции кето-енольной таутомеризации. Все возможные таутомерные формы молекулы XAN для различной кислотности приведены на Схеме 1.

Оптические спектры поглощения XAN в нейтральном, кислом и щелочном водном растворе приведены на Рис. 1a. При анализе спектров обнаружено, что у данного соединения имеется более одного сайта протонирования. Зависимость оптического поглощения раствора XAN от pH (вставка на Рис. 1a) наблюдали на длине волны =255 нм, на которой различие между состояниями с разной степенью протонирования наиболее выражено.

Схема. 1 Таутомерные преобразования XAN.

ДМСО (Рис. 1b) спектры также похожи между собой, но значительно отличаются от спектров в протонных растворителях.

Квантовохимическими расчтами вычислены предпочтительные формы XAN в различных растворителях. Расчты подтверждены рядом флуоресцентных, оптических и ЯМРизмерений. Оказалось, что в нейтральной водной среде и в спиртах предпочтительной формой XAN является кето-форма XAN (Схема 1).

Рис. 1. (a) Спектры оптического поглощения XAN в H2O при различных pH. Вставка: зависимость оптического поглощения от pH при =255 нм. (b) Спектры оптического поглощения XAN в ДМФ и в ДМСО.

В щелочных растворах возможно наличие одновременно кето- ( XAN 2 ) и енольной форм ( XAN e1 ). В апротонных ДМФ и ДМСО также присутствует две формы – кетоновая (XANk) и енольная (XANe).

Во второй части главы описаны фотохимические свойства XAN. Рассмотрены интермедиаты, образующиеся при УФ-облучении растворов XAN, а также прослежена динамика самой молекулы XAN. При интенсивном лазерном облучении XAN претерпевает двухфотонную ионизацию с образованием сольватированного электрона. При фотолизе также наблюдаются сигналы от радикала XAN• и электронного аддукта, которые образуются в результате ионизации исходного вещества с последующим захватом электрона молекулой XAN в основном состоянии. Для минимизации эффектов двухфотонной ионизации послеk дующие эксперименты проводились при низких энергиях лазера и в присутствии 10-2 M ацетона – известного акцептора сольватированного электрона.

Эволюцию флуоресценции XAN с фемтосекундным временным разрешением (upconversion) во времени наблюдали в H2O (pH 5.3). Анализ полученных данных показал, что наилучшее согласие между экспериментальными и расчетными данными достигается с использованием суммы трх экспонент. Временные константы 1 = 0.6 пс, 2 = 1.5 пс, and 3 = 11 пс, соответственно. Результаты по флуоресценции можно интерпретировать следующим образом: при pH 5.3 XAN присутствует в водном растворе по большей части в кето-форме XAN (Схема 1), и возбуждение на 370 нм приводит к заселению первого возбужденного го синглетного состояния к термическому равновесию включает в себя сольватационную динамику – диффузионное движение молекул растворителя вокруг фотовозбужднной молекулы XAN, а также релаксацию колебательных и вращательных степеней свободы. Самая быстрая временная константа флуоресцентной динамики 1 соответствует описанным процессам.

Процессы, описываемые временными константами 2 и 3, могут относиться к двухэтапной реакции кето-енольной трансформации (Схема 2) – протонированием кислорода карбонильной группы и депротонированием аминогруппы. Следовательно, вторую временную константу 2 следует отнести к уменьшению населнности синглетного состояния, а 3 – к уменьшению населенности короткоживущего состояния интермедиата, образованного после первого этапа реакции. Однако из полученных данных представляется трудным определить, какая реакция – отрыв или присоединение протона – происходит быстрее. Возможный механизм дезактивации состояния S1 представлен на Схеме 2. Для простоты присоединение протона к карбонильной группе изображено первым этапом.

Схема 2. Фотохимические процессы в молекуле XAN.

Описанная ультрабыстрая динамика в молекуле XAN подтверждена измерениями на установке фемтосекундного лазерного импульсного фотолиза (pump-probe). В результате анализа данных по промежуточному поглощению получены значения временных констант 1a и 2a для буферных и небуферных растворов, а также для слабокислых и щелочных условий. Временные константы 1a и 2a при всех условиях имеют сходные значения, усредннные значения равны 1a = 1.4±0.5 пс и 2a = 12.9±1.5 пс, что соответствует константам 2 и 3, полученным во флуоресцентных измерениях.

Последующая динамика в молекуле XAN исследовалась на установке наносекундного лазерного импульсного фотолиза при низких энергиях лазера и в присутствии ацетона. В данных условиях сигнал от таутомерной енольной формы XANe, образованный при изомеXAN, с полосами поглощения в области 370-430 нм (с макризации фотовозбужднной S симумом в 400 нм) и короче 300 нм (Рис. 2) был единственной наблюдаемой в фотолизе частицей. Скорость спада сигнала не зависит от исходной концентрации XAN; кинетика и интенсивность сигнала не изменяется в присутствии ацетона или кислорода. Интенсивность сигнала от XANe прямо пропорциональна энергии импульса лазера, т.е. указанный интермедиат образуется по однофотонному механизму.

Отрицательное значение поглощения с максимумом в 340 нм относится к выгоранию исходного образца. Эволюция данного сигнала происходит в несколько этапов с различными небуферного раствора XAN через 50 нс (кружки) и 200 нс (квадраты) после импульса лазера. На вставках показаны временные профили при указанных длинах волн. Линиями показаны спектры оптического поглощения: точечная линия – нейтральный раствор 1.2 10- сплошная линия – разностный спектр.

группы XANe и протонирование атома азота. На Схеме 2 показана наиболее простая цепь возможных путей реакции также нельзя исключить.

Сопоставление данных по лазерному импульсному фотолизу и стационарным оптическим измерениям подтверждает предположенную кинетическую схему (Схема 2). На Рис. линиями показаны спектры поглощения XAN в щелочном (pH 9.5, пунктирная линия) и нейтральном (pH 6.5, точечная линия) водных растворах, а линией чрного цвета показана разность этих двух спектров. Последняя почти идеально сходится со спектром промежуточного поглощения (квадраты) через 200 нс после лазерного импульса в небуферном растворе XAN, подтверждая депротонированную форму ксантуреновой кислоты XAN2- в качестве короткоживущего интермедиата при фотолизе водных растворов XAN.

Спектры промежуточного поглощения, полученные при фотолизе XAN в метаноле и этаноле очень похожи на спектры, полученные в водных растворах. Максимум поглощения сдвинут по сравнению с водным раствором в красную область на 420 нм в метаноле и на нм в этаноле. Скорость уменьшения XANe (наблюдаемая на 410 нм), как и в водных растворах, равна скорости восстановления исходного вещества (наблюдаемой на 345 нм), и также не зависит от присутствия ацетона или кислорода в растворе. Временные константы в спиртах значительно выше, чем в водных растворах.

При фотолизе в апротонных ДМФ и ДМСО наблюдается иная картина. На Рис. 3 показан спектр промежуточного поглощения, зарегистрированный через 200 нс после лазерного XAN в ДМФ под аргоном. На вставках показаны временные профили при указанных длинах волн.

560 и 580 нм) позволило выявить, что скорость спада поглощения триплета зависит от длины волны наблюдения. Данное наблюдение свидетельствует о наличии более одной таутомерной формы триплетного состояния.

Остальные сигналы соответствуют поглощению короткоживущих интермедиатов, образующихся одновременно с триплетными состояниями, т.е. их предшественниками являются возбужденные синглетные состояния кето- и енольных форм XAN. Из вида кинетических кривых на разных длинах волн (вставки на Рис. 3) понятно, что сразу несколько частиц вносят вклады в спектр. Формы кинетических кривых не зависят от концентрации исходного вещества или интенсивности лазера. Наиболее вероятно, что спектральные изменения в промежуточном поглощении обусловлено таутомерными преобразованиями различных форм XAN в основном состоянии. Анализ показывает, что по крайней мере три интермедиата участвует в реакции; тем не менее, вследствие сильного перекрытия спектров представляется затруднительным выделить индивидуальный вклад каждой частицы в спектр промежуточного поглощения и предложить однозначную схему реакции. Похожие спектры и кинетики наблюдаются при фотолизе растворов XAN в ДМСО, что свидетельствует о схожей схеме реакций в обоих апротонных растворителях.

Реакции переноса протона между молекулой XAN и растворителем определяют высокую фотостабильность молекулы XAN: основным каналом гибели фотовозбужднного состояния XAN в водных и спиртовых растворах является таутомеризация в енольную форму с участием молекул растворителя, с последующим восстановлением исходной кето-формы, в котором также задействованы молекулы растворителя. В отсутствие доноров протонов (в апротонных растворителях) происходит значительное увеличение времени жизни фотовозбужднного S1 состояния, таким образом, другие каналы дезактивации S1 – флуоресценция, интеркомбинационная конверсия и внутримолекулярный перенос протона – становятся основными.

В четвртой главе описано тушение триплетного кинуренина (TKN) нитроксильными радикалами (RNO•) различного строения. Тушение TKN нитроксидами исследовалось на установке наносекундного лазерного импульсного фотолиза. Спектр промежуточного поглощения, наблюдаемый через 280 нс после лазерного импульсного облучения водного раствора кинуренина (1.6 10-4 М, буферный раствор рН 7.2), приведен на Рис. 4a. Аналогичные спектры наблюдались и при облучении растворов KN в присутствии RNO•. Отрицательное поглощение с максимумом на 360 нм соответствует импульсному уменьшению концентрации кинуренина в основном состоянии, а положительное поглощение относится к TKN, оптический спектр которого имеет максимумы на длинах волн 280, 340 и 430 нм.

Кинетика гибели триплетного кинуренина TKN регистрировалась в максимуме его поглощения на длине волны 430 нм. На Рис. 4b показан спад сигнала TKN в отсутствие добавок, а также в присутствии различных концентраций RNO•. В присутствии радикала спад сигнала хорошо описывается экспоненциальной зависимостью. Полученные в результате эксперимента значения наблюдаемой константы линейно зависели от концентрации нитроксильных радикалов в диапазоне от 10-3 до 10-2 М. Значения констант скорости тушения для всех исследуемых радикалов, определенные по наклону зависимости наблюдаемой константы скорости гибели триплетного кинуренина от концентрации добавленного радикала, лежат в диапазоне 36 108 М-1с-1.

Для одного из радикалов была измерена температурная зависимость константы скорости тушения триплетного кинуренина, из которой были определены значения параметров Аррениуса для этой константы: предэкспоненциальный множитель log(A) = 12.0±0.7 и энергию активации Еа = 18±3 кДж/моль. Полученное значение Еа очень близко к энергии активации для вязкости воды (19 кДж/моль), что свидетельствует о том, что реакция тушения является диффузионно-контролируемой.

Рис. 4. (a) Спектры промежуточного поглощения при фотолизе водного раствора KN в присутствии RNO•: 1 – 280 нс после лазерного импульса, 2 – 8 мкс после лазерного импульса. Сплошная линия 3 – спектр поглощения исходного KN. (b) Кинетические кривые спада сигнала TKN в присутствии различных концентраций RNO•: 0 мМ (1), 0.53 мМ (2), 1.6 мМ (3) и 4.8 мМ (4). Сплошные линии – расчетные кривые. На вставке – зависимость наблюдаемой константы скорости гибели TKN от концентрации RNO•.

Из Рис. 4а видно, что при тушении триплетного кинуренина нитроксильными радикалами (спектр, наблюдаемый через 8 мкс после лазерного импульса) в растворе не происходит формирования новых парамагнитных или диамагнитных продуктов реакции. Если бы тушение протекало по механизму переноса заряда, в спектрах наблюдались бы заметные сигналы поглощения этих радикалов. Таким образом, был сделан вывод, что тушение триплетного кинуренина нитроксильными радикалами происходит по обменному механизму:

где стрелками обозначены спины электронов взаимодействующих частиц.

Другим возможным механизмом тушения триплета кинуренина может быть перенос энергии с образованием возбужднного RNO•*, с последующей быстрой дезактивацией возбужднного состояния. Оба механизма – обменный и перенос энергии – не приводят к образованию дополнительных продуктов реакции. В дальнейшем, для удобства будем считать, что тушение происходит по обменному механизму.

В результате проведенной работы установлено, что нитроксильные радикалы являются эффективными тушителями триплетных состояний кинуренина; при этом тушение происходит по обменному механизму, не приводящему к образованию дополнительных продуктов.

Пятая глава посвящена исследованию фотохимических свойств конъюгатов KN-RNO•.

Методом лазерного импульсного фотолиза исследовано несколько различных по строению конъюгатов KN-RNO• (Схема 3) в водных и спиртовых растворах. На Рис. 5 показаны спектры промежуточного поглощения, полученные при облучении водного раствора KN-RNO через 100 нс и 2 мкс после лазерного импульса.

Спектр, зарегистрированный через 100 нс после импульса лазера, аналогичен спектру, наблюдаемому при фотолизе KN (Рис 4а): отрицательное поглощение с максимумом на нм соответствует импульсному уменьшению концентрации исходного вещества в основном состоянии, а положительное поглощение, очевидно, следует отнести к триплетному состоянию TKN-RNO. Однако интенсивность сигналов, наблюдаемая при фотолизе KN-RNO, оказалась значительно больше интенсивности сигналов при фотолизе KN в аналогичных экспериментальных условиях.

Рис. 5. Спектры промежуточного поглощения, наостаточное поглощение следует отнести к блюдаемые через 100 нм (квадраты) и 2 мкс (кружки) после лазерного импульса при облучении вод- поглощению короткоживущих радикалов, ных растворов KN-RNO в анаэробных условиях.

после импульса схож со спектром катион-радикала KN+.

Рис. 6. Кинетические кривые промежуточного поглощения, наблюдаемые на 430 нм при фотолизе водного раствора KN-R2NO• в присутствии TEMPOL и без добавок в анаэробных условиях.

скорости гибели триплетных состояний для разных образцов заметно различаются. Несмотря на это, во всех случаях время жизни и интенсивность сигналов триплетов в метаноле больше, чем в воде, а интенсивность поглощения радикала, образовавшегося после гибели триплета, ниже. Квантовые выходы триплетного состояния и образования короткоживущих радикалов определены по начальной интенсивности сигналов (поглощение триплетного состояния) и по интенсивности сигнала после завершения процесса гибели триплета (поглощение катионрадикала), измеренного при 430 нм. Для каждого образца значения получены при 4-5 измерениях с различной интенсивностью лазера – от 30 до 120 мДж/импульс. Результаты сопоставлены со значениями для TKN, полученными при фотолизе растворов KN в аналогичных экспериментальных условиях. Таким образом, определены значения квантовых выходов триплетных состояний T и образования радикалов R при фотолизе KN-RNO относительно квантового выхода триплетного кинуренина T(KN). Вычисленные значения квантовых выходов представлены в Таблице 1.

Методом стационарного фотолиза измерена фотостабильность некоторых образцов в различных растворителях. Стационарный фотолиз KN и конъюгатов KN-RNO проводился в аэробных (насыщенных кислородом) и анаэробных (насыщенных аргоном) условиях. Скорости разложения вещества померены на линейном участке кинетики, при уровне распада вещества не более 30% методом ВЭЖХ. По полученным данным посчитаны значения квантовых выходов фоторазложения при аэробных (ox) и анаэробных (ar) условиях. Результаты вычислений приведены в Таблице 1.

Таблица 1. Значения времени жизни триплетного состояния (T) и квантовых выходов образования триплетного состояния (T), радикала (R), квантовых выходов фоторазложения KN-RNO при анаэробных (ar) и аэробных (ox) условиях.

Соединение Растворитель KN-R3NO KN-R3NO В конъюгатах KN-RNO нитроксильная часть молекулы расположена близко к кинурениновой, и может взаимодействовать не только с относительно долгоживущим триплетным состоянием, но и с возбужденным синглетным KN. Общая схема фотохимических процессов в KN-RNO изображена на Схеме 4.

При фотолизе конъюгатов KN-RNO выход триплетного состояния в среднем в 7 раз KN-RNO, в результате которой происходит восстановление исходного вещества в основT ном состоянии.

В отсутствие тушителей время жизни триплета TKN составляет десятки микросекунд.

Время жизни триплета TKN-RNO варьируется от 59 нс до 1160 нс (Таблица 1), и зависит от используемого растворителя и присоединнной нитроксильной части конъюгата. Наиболее короткое время жизни триплета (59 нс) было зарегистрировано для TKN-R4NO в водном растворе; в данном конъюгате соединительный мост между кинурениновой и нитроксильной частью является самым коротким, следовательно, при более коротком мосте усиливается обменное взаимодействие. По этой же причине квантовый выход катион-радикала +KN-RNOH при фотолизе KN-R4NO значительно выше, чем у остальных конъюгатов.

Квантовый выход фоторазложения является интегральным показателем фотохимических процессов, представленных на Схеме 4. К примеру, ускорение интеркомбинационной конверсии из возбужднного синглетного состояния в триплетное может способствовать увеличению выхода АФК в реакции триплета с молекулярным кислородом, в то же время интеркомбинационная конверсия из триплетного состояния в основное, индуцированная спиновым обменом, усиливает фотостабильность молекулы. Как видно из Таблицы 1 основным фактором, определяющим фотостабильность конъюгатов KN-RNO, является квантовый выход образования радикалов R. Вследствие внутримолекулярного переноса электрона квантовые выходы фоторазложения для всех конъюгатов KN-RNO выше, чем для KN; соединение KN-R4NO, имеющее наибольший квантовый выход образования радикалов, также показывает максимальный выход фоторазложения.

Ковалентное присоединение нитроксидов к молекуле кинуренина приводит к уменьшению времени жизни триплетов с десятков микросекунд до сотен наносекунд, а основным каналом дезактивации триплетного состояния является интеркомбинационная конверсия по механизму спинового обмена. Однако увеличение образования триплетных состояний данных соединений и, что наиболее важно, внутримолекулярный перенос электрона от фотовозбужднной кинурениновой части к нитроксильной, делают конъюгаты KN-RNO менее фотостабильными, чем исходная молекула KN. Тем не менее, фотостабильность синтезированных в данной работе конъюгатов KN-RNO гораздо выше, чем у циннаматов, которые широко используются в современной косметологии в качестве УФ-фильтра в солнцезащитных препаратах: сообщалось, что квантовый выход фотоизомеризации данных компонентов составляет 0.51.0. Таким образом, сочетание эндогенного хромофора кинуренина с нитроксидами обещает быть весьма полезным при использовании в солнцезащитных препаратах.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

Предпочтительная форма ксантуреновой кислоты XAN в основном состоянии существенно зависит от растворителя. При физиологических условиях (нейтральный водный раствор) основным изомером является анионная кето-форма. В апротонных растворителях XAN присутствует в как в кето-, так и в енольной формах, в щелочных растворах также возможно наличие двух таутомерных форм.

Основным каналом гибели фотовозбужднного S1 состояния XAN в водных и спиртовых растворах является таутомеризация в енольную форму основного состояния с участием молекул растворителя, протекающая в пикосекундном временном диапазоне, с последующим восстановлением исходной кето-формы, в котором также участвуют молекулы растворителя. В процессе дезактивации состояния S1 растворитель играет определяющую роль: в менее протонном растворителе дезактивация происходит за большее время. В апротонных растворителях молекула XAN не может претерпеть реакции переноса протона с участием молекул растворителя, что приводит к образованию короткоживущих промежуточных форм XAN в триплетном и основном состояниях.

Тушение TKN нитроксильными радикалами RNO• происходит по обменному механизму, что не приводит к формированию новых парамагнитных или диамагнитных продуктов реакции. Восстановленные формы нитроксильных радикалов, RNOH, не вступают в реакцию с триплетным состоянием кинуренина.

Ковалентное присоединение нитроксидов к молекуле кинуренина приводит к уменьшению времени жизни триплетного состояния с десятков микросекунд до сотен наносекунд, а основным каналом дезактивации триплетного состояния коньюгатов KN-RNO является интеркомбинационная конверсия, индуцированная внутримолекулярным обменом спинами. Таким образом, сочетание эндогенного хромофора кинуренина с нитроксидами является весьма перспективным для создания новых активных компонентов солнцезащитных препаратов.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

В. В. Яньшоле, И. А. Кирилюк, И. А. Григорьев, С. В. Морозов, Ю. П. Центалович. Изучение антиоксидантных свойств нитроксильных радикалов и гидроксиламинов при взаимодействии с триплетным и дезаминированным кинуренином // Изв. АН Сер. хим.

2010. №1. с.67–75.

2. V. V. Yanshole, P. S. Sherin, N. P. Gritsan, O. A. Snytnikova, V. I. Mamatyuk, J. Grilj, E.

Vauthey, Yu. P. Tsentalovich. Photoinduced tautomeric transformations of xanthurenic acid // Phys. Chem. Chem. Phys. 2010. V.12. P. 9502–9515.

3. P. S. Sherin, J. Grilj, L. V. Kopylova, V. V. Yanshole, Yu. P. Tsentalovich and E. Vauthey.

Photophysics and photochemistry of UV filter kynurenine covalently attached to amino acids and to a model protein // J. Phys. Chem. B. 2010. V.114. P. 11909–11919.

Yu. P. Tsentalovich, V. V. Yanshole, Yu. F. Polienko, S. V. Morozov, I. A. Grigor’ev. Deactivation of excited states of kynurenine covalently linked to nitroxide radicals. // Photochem.

Photobiol. 2011. V.87. P. 22–31.

V. Yanshole, Yu. Tsentalovich, S. Morozov, I. Kirilyuk, I. Grigor’ev, “Reactions of nitroxides with kynurenine-derived intermediates”, 5th International Conference on Nitroxide Radicals SPIN 2008, 7–11 September 2008, Ancona, Italy. P58.

Яньшоле В.В., Центалович Ю.П., Шерин П.С., Грицан Н.П., “Фотоиндуцированные таутомерные преобразования ксантуреновой кислоты”, XXI Симпозиум “Современная химическая физика”, 25 сентября – 6 октября 2009, Туапсе, Россия, с.42.

7. Yu. P. Tsentalovich, O. A. Snytnikova, P. S. Sherin, L. V. Kopylova and V. V. Yanshole.

“Photochemical and thermal reactions of UV filters contained in the human lens” Central European conference on photochemistry (CECP 2010), 7–11 February 2010, Bad Hofgastein, Austria, p. 43, O24.

Ю. Ф. Полиенко, И. А. Григорьев, С. В. Морозов, Е. И. Черняк, В. В. Яньшоле, Ю. П.

Центалович “Новые УФ-фильтры на основе спин-меченого DL-кинуренина”, Международный симпозиум "Advanced Science in Organic Chemistry", 21-25 июня, 2010, Мисхор, Крым, У-38. (International Symposium on Advanced Science in Organic Chemistry, Miskhor, Crimea, June 21–25, 2010) Vadim Yanshole, Yuri Tsentalovich, Peter Sherin, Nina Gritsan, Eric Vauthey “Photochemical properties of xanthurenic acid – a chromophore present in the cataractous lens”, XXIII IUPAC Symposium on Photochemistry, 11–16 July, 2010, Ferrara, Italy, p. 456.

10. Ю.Ф. Полиенко, И.А. Григорьев, С.В. Морозов, Е.И. Черняк, В.В. Яньшоле, «Новые УФ-фильтры на основе спин-меченого DL-кинуренина», XIII Молодежная школаконференция «Актуальные проблемы органической химии», 12–19 сентября 2010, Новосибирск, Россия., с. 156.