На правах рукописи

АФАНАСЬЕВА Евгения Георгиевна

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ МЕЖВИДОВЫХ БАРЬЕРОВ

В ПЕРЕДАЧЕ ПРИОННОГО СОСТОЯНИЯ У ДРОЖЖЕЙ

Специальность 03.01.03 – молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Москва 2011

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики Института экспериментальной кардиологии ФГУ «РКНПК» МЗ и СР РФ.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Кушниров Виталий Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Колб Вячеслав Адамович кандидат биологических наук Каменский Пётр Андреевич

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Защита состоится «24» июня 2011 г. в часов на заседании Совета Д 501.001. по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского, ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан « » мая 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Крашенинников И.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Некоторые белки человека и животных, растворимые в норме, могут иногда полимеризоваться и накапливаться в виде внутри- или внеклеточных агрегатов или бляшек, что приводит к болезни. У человека известно более 30 белков, образующих такие агрегаты, называемые амилоидами. Амилоидные болезни, или амилоидозы, не поддаются лечению. Они широко распространены, и их встречаемость возрастает с увеличением возраста. К их числу относятся, в частности, болезни Альцгеймера и Паркинсона. Амилоидозы в большинстве случаев неинфекционны, за исключением прионных болезней, связанных с белком PrP.

Прионные агрегаты PrP представляют уникальный пример инфекционного агента без генетической программы в виде ДНК или РНК. Прионные болезни редки, однако недавняя эпизоотия губчатой энцефалопатии коров в Великобритании нанесла многомиллиардный урон экономике, и поставила под угрозу жизни людей в связи с возможностью передачи этого заболевания человеку при употреблении в пищу говядины. Следует отметить, что межвидовая передача прионов обычно затруднена или невозможна, что удивительно ввиду небольших видовых отличий в последовательности прионного белка. Поэтому изучение барьеров в межвидовой передаче прионной инфекции важно и для медицины, и для понимания общих свойств прионов.

Имеющиеся в литературе данные по изучению передачи прионного состояния между разными видами млекопитающих ограничиваются в основном фактами существования прионных барьеров, однако об их молекулярных механизмах почти ничего не известно. Прионы дрожжей Saccharomyces являются удобной моделью для изучения молекулярных процессов, лежащих в основе межвидовых прионных барьеров. При этом наиболее информативным является использование прионогенных белков из близкородственных видов дрожжей, степень гомологии которых сопоставима с таковой для белков PrP млекопитающих. Использование близкородственных прионогенных белков Ure2 позволило воспроизвести все основные закономерности прионной передачи у млекопитающих, хотя молекулярные основы событий, происходящих при межвидовой прионной передаче, выявлены не были (Edskes et al., 2009).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение механизмов межвидовых барьеров в передаче прионного состояния между близкородственными белками Sup35 в дрожжах S. cerevisiae. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить возможность передачи различных вариантов прионного состояния Sup35 S. cerevisiae гибридным белкам Sup35 с прионными доменами из близкородственных видов дрожжей.

2. Охарактеризовать физическое взаимодействие (кополимеризацию) этих белков с прионной формой белка Sup35 S. cerevisiae.

3. Выявить области гетерологичных прионных доменов Sup35, ответственные за барьер в передаче приона [PSI+].

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе были изучены и определены количественно (1) возможность передачи прионного состояния между близкородственными белками Sup35, (2) способность гетерологичных белков Sup нарушать поддержание исходного приона, и (3) способность гетерологичных белков Sup35 кополимеризоваться с прионными фибриллами Sup35 S. cerevisiae.

Способность гетерологичных Sup35 препятствовать поддержанию приона была обнаружена в данной работе, и является важным проявлением взаимодействия белков.

Впервые было показано, что передача амилоидной полимеризации между родственными прионогенными белками может происходить без передачи прионных свойств. Анализ полученных данных позволил восстановить подробную картину молекулярных событий, приводящих к барьеру в передаче прионов и к дестабилизации исходного приона, причем сценарии взаимодействия белков в существенной мере зависели от белка Sup35 и от варианта [PSI+]. Это позволило заключить, что: (1) причиной барьера является в одних случаях неспособность гетерологичных белков Sup35 кополимеризоваться, а в других - кополимеризация без передачи прионных свойств, то есть способности к наследованию. Причиной дестабилизации приона было образование неприонных амилоидов и/или блокирование прионной полимеризации гетерологичными белками Sup35. В работе были также определены области гетерологичных прионных доменов Sup35, ответственные за барьер в передаче прионного состояния.

Апробация работы. Результаты работы были апробированы на межлабораторном семинаре Института экспериментальной кардиологии ФГУ РНКПК МЗ и СР РФ (15.04.2011), а также представлены на международной конференции Жака Моно CNRS (2010, Роскофф, Франция), международном конгрессе “Yeast, an evergreen model”, (2010, Рим, Италия), II междисциплинарном микологическом форуме (2010, Москва), международном симпозиуме по структуре амилоидных фибрилл и механизме образования амилоидов, (2009, Галле, Германия), 24-й международной конференции по генетике и молекулярной биологии дрожжей (2009, Манчестер, Англия), V съезде ВОГИС (2009, Москва).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи и 6 тезисных сообщений.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы».

Работа изложена на страницах и включает 21 рисунок, 8 таблиц и список литературы, содержащий 102 ссылки.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы S. cerevisiae и E. coli. В работе были использованы штаммы дрожжей: 22VH63S (MATa ura3–52 leu2–3,112his3-200 ade2–1 SUQ5 sup35::TRP1 [PSI+] или [psi-]) (Shkundina et al., 2006), 74-D694S (MATa ura3–52 leu2–3,112 his3-200 ade1– 14 sup35::TRP1 [psi-] [PIN+] pRS313-3ATG) (Alexandrov, et al. 2008). Для молекулярного клонирования использовали штамм E. coli DH5 [supE44 lac U (80 lacZM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1] (Sambrook et al. 1989).

Генетические методы. Трансформация микроорганизмов. В работе применяли стандартные методики генетики дрожжей (Sherman et al., 1986). Трансформацию дрожжей S. cerevisiae проводили согласно Gietz et al. (2002) с небольшими изменениями. Трансформацию E. coli DH5 (Sambrook et al., 1989) осуществляли в соответствие с методом Inoue et al. (1990). Для выявления детерминанта [PSI+] использовали генетические системы, основанные на супрессии мутаций ade2-1 и ade1-14, позволяющие определить наличие детерминанта [PSI+] визуально по цвету колоний. Клетки [psi-], т.е. не содержащие [PSI+], не растут на среде, не содержащей аденин, и имеют красный цвет колоний на полной среде. Колонии клеток [PSI+] имеют розовый или белый цвет в зависимости от варианта [PSI+] и растут при отсутствии аденина в среде.

Конструирование плазмид и другие генно-инженерные манипуляции. Выделение плазмидной ДНК из клеток E. coli и конструирование плазмид проводили в соответствии со стандартным протоколом Sambrook et al. (1989). Нуклеотидные последовательности, кодирующие N-концевые прионные домены белков Sup четырёх видов дрожжей рода Saccharomyces: S. paradoxus, S. mikatae, S. bayanus и S.

kudriavzevii, амплифицировали методом ПЦР из геномной ДНК соответствующих видов дрожжей. Эти виды дрожжей были получены от проф. Г.И. Наумова из коллекции РосНИИ Генетика. Первичная структура белков Sup35 S. bayanus, S.

mikatae и S. paradoxus была получена из белковой базы данных, нуклеотидная последовательность участка гена SUP35 S. kudriavzevii, кодирующая прионный домен, была определена в настоящей работе (номер в базе данных NCBI - JF715427). Вставку последовательности AACTACCAG, кодирующей аминокислотную последовательность NYQ, в ген SUP35-kud осуществляли путём ПЦР.

Белковый гель-электрофорез, иммуноблоттинг. Электрофорез денатурированных белков в полиакриламидном геле проводили согласно Laemmli (1970). Для оценки наличия и размера прионных полимеров был использован электрофоретический подход SDD-AGE (Kryndushkin et al., 2003). Для разделения полимерной и мономерной форм белка Sup35 в одном геле метод электрофореза по Laemmli (1970) был модифицирован согласно Shkundina et al. (2006). Для анализа белков методом иммуноблоттинга после проведения электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану и инкубировали либо с поликлональными кроличьими антителами против N и M доменов Sup35, либо с моноклональными мышиными антителами против 3HA тэга, а затем с видоспецифичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, активность которой проявляли с помощью хемилюминесцентного субстрата.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Структура гибридных белков Sup35. Чтобы исследовать механизмы межвидовых барьеров в передаче прионного состояния в дрожжевой модели, мы сконструировали набор генов SUP35, кодирующих гибридные белки Sup35 с N-концевыми прионными доменами из белков Sup35 следующих видов дрожжей рода Saccharomyces: S. mikatae, S. kudriavzevii, S. paradoxus и S. bayanus. В этих белках М участок и С-концевой домен, участвующий в терминации трансляции, были общими и происходили из белка Sup35 S. сerevisiae (рис. 1). Тем самым мы исключили влияние неприонных участков белка Sup35 на его прионные свойства. Это влияние невелико, и его исключение позволило существенно уменьшить изучаемую область. Для изучения взаимодействия гибридных Sup35 с прионными полимерами был создан дополнительный набор гибридных генов SUP35 с последовательностью, кодирующей 3HA тэг в С-концевой части неприонного М домена Sup35, что позволило отличать гибридные Sup35 от Sup35 S. cerevisiae по электрофоретической подвижности и по 3НА антигену.

Рис. 1. А. Сравнение аминокислотных последовательностей прионных доменов белков Sup S. cerevisiae, S. mikatae, S. kudriavzevii, S. paradoxus и S. bayanus. Точками показаны аминокислотные остатки, идентичные последовательности Sup35 S. cerevisiae. Различия в последовательности обозначены в однобуквенном аминокислотном коде. Делеции обозначены знаком «-».

Б. Схематическое изображение гибридных белков Sup35. Дополнительный набор белков содержал 3НА тэг, после 251 аминокислотного остатка. Напротив каждого гетерологичного прионного домена показан уровень его гомологии с соответствующим доменом Sup35-cer (для простоты подсчёта вставки, делеции и замены аминокислотных остатков считали равными).

В дальнейшем, гибридные гены SUP35 и кодируемые ими белки называются с добавлением суффикса из первых трех букв вида дрожжей, из которого произошел прионный домен. Например, ген SUP35-cer или белок Sup35-mik.

Гибридные белки Sup35 способны переходить в прионное состояние в клетках S.

cerevisiae. Понятие межвидовых барьеров на пути передачи прионного состояния имеет нетривиальный смысл лишь в том случае, если гибридные белки Sup способны самостоятельно поддерживать прионное состояние в клетках S. cerevisiae.

Для определения такой способности в клетках [psi- ] штамма 22V-H63S плазмида с геном SUP35 S. cerevisiae была заменена на плазмиды с соответствующими гибридными генами SUP35, после чего индуцировали возникновение прионного состояния гибридных белков Sup35 путём их сверхпродукции. Все гибридные белки были способны принимать прионное состояние. Надо отметить, что [PSI+] на основе гибридных белков Sup35 различались по своей стабильности (табл. 1).

Таблица 1. Сравнение стабильности [PSI+] на основе различных гибридных Sup35. [PSI+] на основе белков Sup35-mik и Sup35-bay были преимущественно слабого типа.

Разнообразие вариантов является одним из фундаментальных свойств прионов.

Оно связано со способностью прионного белка приобретать различные стабильно наследуемые прионные конформации. Для сильных вариантов [PSI+] характерна эффективная супрессия нонсенс мутации ade2-1 и белый цвет колоний из-за следующих взаимосвязанных свойств: низкой концентрации свободного белка Sup35, большого количества прионных фибрилл, имеющих малый размер вследствие их эффективной фрагментации шапероном Hsp104. Слабые варианты [PSI+] определяют розовый цвет колоний и малоэффективную супрессию нонсенс мутации ade2-1, большее количество свободного Sup35 и большой размер прионных фибрилл в результате их малоэффективной фрагментации.

Между близкородственными белками Sup35 существуют барьеры передачи [PSI+]. Клетки дрожжей штамма 22V-H63S с четырьмя разными вариантами [PSI+], сильным (S) и тремя слабыми (W1, W2, W3), были трансформированы центромерными плазмидами с гибридными генами SUP35, а также, в качестве контроля, плазмидой с геном SUP35-cer.

В этих клетках, коэкспрессирующих два гена SUP35, индуцировали спонтанную потерю исходной плазмиды с геном SUP35-cer, после чего оценивали уровень передачи четырёх вариантов [PSI+] гибридным белкам Sup35. Результаты данного эксперимента представлены в таблице 2.

Из таблицы 2 следует отсутствие передачи всех вариантов [PSI+] белкам Sup35mik, Sup35-bay и Sup35-kud. Уровень прионной передачи белку Sup35-par зависел от варианта прионного состояния, составляя от 5% (W3 [PSI+]) до 68% (S [PSI+]).

Таблица 2. Эффективность передачи четырёх вариантов [PSI+] гибридным белкам, определенная методом спонтанной потери плазмиды.

Экспрессия гибридных SUP35 в клетках с [PSI+] приводит к антисупрессорному фенотипу. Трансформация клеток дрожжей с четырьмя разными вариантами [PSI+] (S, W1, W2 и W3) центромерными плазмидами с гибридными генами SUP35 приводила к антисупрессорному фенотипу клеток. Этот фенотип свидетельствовал о затруднённой кополимеризации гибридных белков Sup35 с прионными полимерами Sup35-cer, в результате чего значительное количество гибридного белка Sup35 было в растворимой форме, активной в терминации трансляции.

Рис. 2. Фенотипы клеток дрожжей штамма 22V-H63S с разными вариантами [PSI+] (S, W1, W2 и W3) при экспрессии в них гибридных генов SUP35. Экспрессия всех гибридных генов SUP35 без последовательности, кодирующей 3HA тэг, приводит к антисупрессорному фенотипу клеток дрожжей.

Гибридные белки Sup35 способны дестабилизировать [PSI+]. В настоящей работе было обнаружено негативное влияние гетерологичных белков на поддержание исходного приона: экспрессия гибридных генов SUP35 приводила к потере [PSI+].

Частота потери зависела как от варианта приона, так и от аминокислотной последовательности продуцируемого гибридного Sup35 (таблица 3).

Плазмида с