2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования. Согласно данным Всемирной
организации здравоохранения в современном мире заболеваемость
гепатобилиарной патологией превышает 2 млрд. человек. Во всем мире ведутся
активные поиски гепатопротекторных лекарственных средств.
Нарушение функции печени возникает при различных патологических
состояниях и сопровождается метаболическими расстройствами, иногда с развитием токсикозов.
Одним из тяжелых осложнений заболеваний печени является печеночная недостаточность. Фармакологическая коррекция заболеваний печени является одной из актуальных задач современной медицины и фармации.
В настоящее время именно адеметионин считается одним из наиболее эффективных гепатопротекторов. Это связано с тем, что наряду с высокой активностью он проявляет низкую токсичность, уменьшает воспалительный процесс, стимулирует регенерацию печени, улучшает естественный метаболизм в печени. Эти свойства адеметионина имеют доказательную клиническую базу.
На Российском фармацевтическом рынке присутствует несколько препаратов адеметионина. Российские фармацевтические фирмы Лэнс-фарм, Верофарм выпускают препарат Гептор (S-аденозилметионин) в виде таблеток, порошка для приготовления раствора для внутривенного и внутримышечного применения; компания Экомир предлагает адеметионин в виде биологически активной добавки к пище в таблетированной форме. Под торговым наименованием Гептрал (S-аденозилметионина1,4-бутандисульфонат и Sаденозилметионина дисульфат п-толуолсульфонат) в России реализуют свою продукцию зарубежные фирмы Эббот (США), Хоспира (США), Фамар (Франция), Эбботт С.п.А. (Италия).
Все эти препараты изготовлены из субстанции, произведенной в Китае фирмой Zhejiang hisun pharmaceutical, Сo.ltd. В России же субстанция адеметионина не выпускается.
Недостатками всех этих препаратов являются относительная дороговизна, химическая нестабильность (малый срок хранения ввиду постепенного распада действующего вещества) и низкая биодоступность при пероральном применении.
Таким образом, особо актуальным для Российской фармацевтической промышленности является поиск путей получения стабильной субстанции адеметионина для производства препаратов.
Степень разработанности темы исследования. Современной науке известны несколько способов получения адеметионина. Все они охраняются патентами на изобретения разных стран. Известные способы получения адеметионина можно разделить на химические и ферментативные. Они имеют свои недостатки, однако применяются при получении субстанций солей адеметионина с различными кислотными производными.
Несмотря на широкое производство лекарственных форм адеметионина, в настоящее время отсутствует российское производство субстанции адеметионина.
В этой связи разработка способов получения стабильных солей адеметионина для российского производства субстанции, является актуальной задачей.
Цель и задачи. Целью настоящей работы явилось разработка способов получения стабильных солей адеметионина для фармацевтического производства, разработка нормативной документации на данные субстанции.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Изучить условия осаждения адеметионин-иона из его водного раствора с помощью производных таурина и сульфокислот.
2. Разработать биосинтетический способ получения адеметионина.
3. Разработать способы получения солей адеметионина со стеарилтаурином, лаурилсульфокислотой, хондроитинсульфокислотой, а также с серной и птолуолсульфокислотой.
4. Разработать методики анализа полученных солей.
5. Изучить стабильность и установить сроки годности солей адеметионина.
6. Разработать проект Фармакопейной статьи предприятия на двойную соль адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой.
Научная новизна. В результате проведенных исследований предложен способ получения двойной соли адеметионина с серной и птолуолсульфокислотой.
Предложена схема получения стеарилтаурина. Установлены условия, при которых происходит полное формирование осадков солей адеметионин-иона со стеарилтаурином, лаурилсульфокислотой, хондроитинсульфокислотой. С помощью спектрометрического метода анализа установлено содержание адеметионин-иона в полученных солях.
Разработаны и валидированы методики анализа соединений адеметионина со стеарилтаурином, лаурилсульфокислотой, хондроитинсульфокислотой.
Усовершенствован способ получения субстанции адеметионина из дрожжевой массы. На стадии очистки раствора адеметионина используют 5% водный раствор пикролоновой кислоты. Для полученной субстанции разработаны и валидированы методики качественного и количественного анализа компонентов.
Получены соль адеметионина с хондроитинсульфокислотой и двойная соль адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой. Способы их получения заявлены как изобретения РФ.
Изучена стабильность и установлены сроки годности всех полученных солей адеметионина.
Теоретическая и практическая значимость.
Теоретическая значимость исследования заключается в расширении способов получения устойчивых солей адеметионина, в возможности получения субстанции адеметионина на территории Российской Федерации.
Полученные данные могут служить основанием для получения субстанции адеметионина.
Практическая значимость исследования заключается в том, что получена двойная соль адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой, установлен срок ее годности, и на ее основе предложена для промышленного производства в РФ субстанция адеметионина.
Разработан унифицированный подход к стандартизации субстанции в соответствии с современными требованиями.
Разработан проект ФСП «S-аденозилметионин, субстанция».
Методология и методы исследования. Методологической основой совершенствованию способов получения адеметионина и его устойчивых солей.
Исследования проводились с использованием различных физикохимических методов: хроматография тонкослойная (ТСХ), спектрометрия в УФ-области спектра и ИК - спектроскопия.
Положения, выносимые на защиту:
Результаты исследований по выбору условий осаждения адеметионин-иона из водного раствора.
стеарилтаурином, луарилсульфокислотой и хондроитинсульфокислотой.
Результаты изучения возможности получения адеметионин-иона из дрожжевой массы.
Результаты получения соли адеметионина с хондроитинсульфокислотой.
Результаты получения двойной соли адеметионина с серной и птолуолсульфокислотой.
Показатели и нормы качества субстанции адеметионина – двойной соли с серной и п-толуолсульфокислотой для разработки проекта нормативной документации.
Результаты изучения стабильности полученной субстанции.
Степень достоверности и апробация результатов. Оценка степени достоверности полученных результатов определяется большим объемом проанализированной информационной базы, использованием современных физико-химических методов анализа, позволяющих получать достоверные результаты, которые подвергнуты математико-статистической обработке. Все разработанные методики анализа валидированы.
Разработанный проект Фармакопейной статьи предприятия «Sаденозилметионин, субстанция» апробирован в условиях фармацевтического производства ФГУП «НПО Микроген» Минздрава России, филиал в г.
Ставрополе «Аллерген» (акт апробации от 25.01.2014 года).
«Республиканский центр контроля качества и сертификации лекарственных средств» МЗ Республики Северная Осетия-Алания (акт апробации от 08.10. года).
Материалы исследования доложены и обсуждены на региональных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (г. Пятигорск, 2013 г., 2014 г.), Всероссийской научной Интернетконференции с международным участием «Спектрометрические методы анализа», г. Казань, 2013 г.
По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, из них 5 - в изданиях, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 155 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Объекты и методы исследования», пяти глав экспериментальной части, заключения, списка литературы и приложений. В работе содержится 53 таблицы, 20 рисунков. Список литературы включает источника, из них – 127 - на иностранных языках.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Анализ литературных данных позволил выявить несколько способов получения солей адеметионина. Известные способы получения устойчивых солей адеметионина включают использование токсичных реактивов, что требует длительной и сложной очистки, а также особые приемы и методы контроля качества. Нами получены соли адеметионина со стеарилтаурином, лаурилсульфокислотой, хондроитинсульфокислотой, серной и птолуолсульфокислотой. Все соли получены по принципиально новым схемам синтеза.предварительно был синтезирован стеарилтаурин. На первой стадии был получен хлорангидрид стеариновой кислоты. В качестве растворителя использовали хлороформ, хлорирующим агентом являлся тионилхлорид, а в качестве катализатора – диметилформамид. На второй стадии получали стеарилтаурин, путем прибавления к полученному раствору хлорангидрида суспензии таурина в триэтиламине. По окончании реакции избыток таурина и образовавшийся триэтиламина гидрохлорид удаляли фильтрацией. Полученный стеарилтаурин использовался нами для осаждения адеметионина.
В ходе исследований были найдены оптимальные условия получения солей адеметионина со стеарилтаурином, лаурилсульфокислотой, хондроитинсульфокислотой.
При концентрации адеметионин-иона 0,005 г/мл и значении рН среды 2- адеметионин-ион полностью осаждается в виде соли со стеарилтаурином; при концентрации адеметионин-иона 0,01 г/мл и таком же значении рН среды – происходит полное осаждение адеметионин-иона лаурилсульфокислотой.
Установлено, что образование стабильной соли адеметионин-иона с хондроитинсульфокислотой возможно в водно–спиртовой среде, при использовании в качестве осадителя ацетона. Установлена минимальная концентрация адеметионин-иона при которой происходит полное образование осадка соли – 0,005 г/мл.
Соль адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой получали следующим образом: к навеске стандартного образца адеметионина 1,4бутандисульфоната, растворенного в воде, добавляли при перемешивании 5% водный раствор пикролоновой кислоты. Получали сухой осадок, к которому добавляли при перемешивании водные растворы 0,1М птолуолсульфокислоты, 0,05М кислоты серной и 36 мл н-бутанола. Содержимое колбы переливали в делительную воронку, отстаивали в течение 20 минут.
Затем органическую фазу удаляли, а к водному слою добавляли н-бутанол, чтобы избавиться от следов пикролоновой кислоты.
Получали водный раствор, содержащий адеметионин-ион.
К полученному раствору добавляли медленно при перемешивании спирт этиловый 95%. Образовывался белый, гигроскопичный осадок двойной соли адеметионина с серной и п-толулсульфокислотой. Отличительной особенностью данного способа получения двойной соли адеметионина с серной и п-толулсульфокислотой является использование водного раствора пикролоновой кислоты.
Для полученных солей адеметионина установлен количественный состав компонентов (таблица 1), разработаны и валидированы методики качественного и количественного анализа (таблица 2), а также определены предварительные сроки годности методом ускоренного старения.
Исследования проводили с помощью спектрофотометрического метода анализа. При изучении количественного состава полученных нами солей адеметионина со стеарилтаурином и лаурилсульфокислотой использовали прямую спектрофотометрию, так как предварительно нами было доказано, что кислотные остатки не поглощают в аналитической области адеметионина (рисунок 1).
Рисунок 1 - Спектры поглощения: 1 - 0,0025% водно-спиртового (1:3) раствора соли адеметионина лаурилсульфоната, с концентрацией адеметиониниона; 2 - 0,002% водно-спиртового (1:3) раствора соли адеметионина стеарилтаурината, с концентрацией адеметионин-иона; 3 - 0,00155% водноспиртового (1:3) раствора СО адеметионина сульфата, с концентрацией лаурилсульфокислоты и стеарилтаурина хондроитинсульфокислотой предварительно установили влияние хондроитинсульфокислоты на возможность проведения идентификации адеметионин-иона прямым спектрофотометрическим методом. Были зарегистрированы спектры поглощения растворов стандартных образцов адеметионина сульфата и хондроитинсульфокислоты (рисунок 2).
Рисунок 2 - Спектры поглощения: 1 - водного раствора СО адеметионина сульфата 0,003%; 2 - водного раствора СО хондроитинсульфокислоты 0,004% Из рисунка следует, что полосы поглощения веществ перекрываются и делают невозможным непосредственное спектрофотометрическое определение адеметионин-иона и хондроитинсульфокислоты. Поэтому для определения их содержания нами был использован метод Фирордта.
В результате исследований было установлено содержание адеметиониниона в полученных солях.
Таблица 1 - Результаты определения компонентов в солях адеметионина со стеарилтаурином, лаурилсульфокислотой и хондроитинсульфокислотой фокислотой Далее, для полученных солей адеметионина были разработаны и валидированы методики качественного и количественного анализа.
Идентификацию предложено проводить как спектрофотометрическим методом анализа, так и с помощью химических реакций на функциональные группы компонентов солей.
При установлении подлинности спектр водно-спиртового раствора (1:3) соли адеметионина со стеарилтаурином должен полностью совпадать со спектром стандартного образца адеметионина сульфата и иметь максимум поглощения при длине волны 258±2 нм.
При установлении подлинности спектр водно-спиртового раствора (1:3) раствора соли адеметионина с лаурилсульфокислотой должен полностью совпадать со спектром раствора СО адеметионина сульфата и иметь максимум поглощения при длине волны 258±2 нм.
хондроитинсульфокислотой спектр поглощения водного раствора испытуемого образца должен иметь 2 максимума поглощения при длинах волн 231±2 нм (хондроитинсульфокислота) и 258±2 нм (адеметионин-ион), которые должны быть идентичными спектрам водных растворов СО адеметионина сульфата и хондроитинсульфокислоты.
Для количественного анализа солей разработаны и валидированы методики спектрофотометрического метода анализа: для солей адеметионина со стеарилтаурином и лаурилсульфокислотой – прямая спектрофотометрия; для соли с хондроитинсульфокислотой – метод Фирордта (таблица 2).
Таблица 2 – Валидационные характеристики методик анализа солей хондроитинсульфокислотой характеристики адеметионина со адеметионина с с хондроитинстеарилтаурином лаурилсуль- сульфокислотой Уравнение y = 201,3х+0,0097 у = 203,4х+0,0083 y = 206,1х+0, коэффициент корреляции Воспроизводи- адеметионин-ион: адеметионин-ион: адеметионин-ион:
Правильность адеметионин-ион: адеметионин-ион: адеметионин-ион:
Таким образом, разработаны и валидированы методики прямого спектрофотометрического анализа солей адеметионина со стеарилтаурином (содержание лаурилсульфокислотой (содержание адеметионин-иона - не менее 32,05%).
Показана возможность использования метода Фирордта в анализе соли адеметионина с хондроитинсульфокислотой: разработана и валидирована методика анализа данной соли, найдено количественное содержание адеметионин-иона (не менее 19,25%) и хондроитинсульфокислоты (не менее 79,32%).
Получение соли адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой Для получения адеметионин-иона биосинтетическим способом использовали активные сухие дрожжи – Saccharomyces cerevisiae - в качестве продуцента адеметионин-иона для его накопления в клетках дрожжей, а в качестве питательной среды - среда Шлёнка.
Накопление адеметионин-иона осуществляли в колбах, снабженных устройством аэрации и мешалкой. После истечения времени дрожжи собирали путем центрифугирования ферментативной жидкости. Собранные дрожжи промывали дважды избытком холодной воды, затем подвергали лизису с помощью добавления этилацетата и воды. По окончании лизиса остатки дрожжевых клеток отделяли от лизата центруфигурованием.
Далее прибавляли к лизату при перемешивании 5% водный раствор пикролоновой кислоты. Образовавшийся осадок пикролоната адеметионина центрифугирования. Полученный осадок промывали трижды избытком холодной воды, затем высушивали.
На заключительной стадии получали стабильную соль адеметионина следующим образом: к полученному осадку пикролоната адеметионина добавляли при перемешивании 0,1М водный раствор п-толуолсульфокислоты, 0,05М раствор кислоты серной и н-бутанол. После отстаивания органическую фазу удаляли, а к водному слою добавляли обесцвечивающий уголь, отфильтровывали. Получали бесцветный раствор адеметионин-иона, свободный от примесей. Наличие примесей контролировали методом ТСХ.
К полученному раствору добавляли медленно при перемешивании спирт этиловый 95%. В результате получали осадок двойной соли адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой.
Для снижения гигроскопичности к полученному осадку добавляли лактозу в соотношении 1:1.
Для полученной субстанции разработаны и валидированы методики качественного и количественного анализа.
Для качественного анализа двойной соли адеметионина использовали известные химические реакции, а также ИК и УФ-спектроскопию.
Для установления подлинности использовали спектрофотометрический метод, а также химические реакции на функциональные группы компонентов соли.
Спектр поглощения раствора соли адеметионина с серной и птолуолсульфокислотой имеет 2 максимума поглощения при длинах волн нм (п-толуолсульфокислота) и 258±2 нм (адеметионин-ион), и 231± полностью совпадает со спектром раствора стандартного образца (рисунок 3).
Рисунок 3 - Спектр поглощения 0,005% водного раствора соли адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой, с концентрацией адеметионин-иона (1); спектр поглощения 0,004% водного раствора СО адеметионина сульфата п-толуолсульфоната, с концентрацией адеметиониниона (2) С целью изучения спектральных свойств полученного продукта нами анализировались ИК-спектры, интерпретация которых значительно усложнялась присутствием в образце лактозы.
В ИК-спектре полученной соли (рисунок 4) наблюдаются полосы поглощения аминогрупп фрагмента аденина и остатка метионина в области 3550 – 3350 см-1. Максимум поглощения 2900 см-1 характеризует валентные колебания О-Н сульфогруппы. Карбонильная группа остатка метионина проявляется в виде пика в области 1655 см-1.
Множественность и уширенность полос в области 3550 – 3350 см- свидетельствует о протонированности атомов азота гетероцикла. Однако отнесение их к конкретным положениям невозможно из-за сложности и многообразия возможных вариантов.
Рисунок 4- ИК-спектр соли адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой Для количественного определения компонентов соли адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой нами разработана спектрофотометрическая методика анализа. Изучив спектры поглощения водных растворов СО адеметионина сульфата и п-толуолсульфокислоты, было сделано заключение о невозможности использования непосредственного спектрофотометрического метода (рисунок 5).
Рисунок 5 - Спектры поглощения: 1- 0,003% водного раствора СО адеметионина сульфата; водного раствора СО птолуолсульфокислоты Как следует из рисунка 5, полосы поглощения веществ перекрываются и делают невозможным непосредственное спектрофотометрическое определение адеметионин-иона и п-толуолсульфокислоты.
Поэтому для определения их содержания нами был использован метод Фирордта.
В результате количественного определения установлено содержание адеметионин-иона и п-толуолсульфокислоты (таблица 3).
Таблица 3 - Результаты определения компонентов в соли адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой Разработанная нами методика количественного определения адеметионина и п-толуолсульфокислоты в двойной соли валидирована по показателям специфичность, линейность, воспроизводимость, правильность (таблица 4).
Таблица 4 - Валидационные характеристики методик анализа соли адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой Валидационные характеристики Соль адеметионина с серной и птолуолсульфокислотой Таким образом, нами разработана и валидирована методика анализа субстанции адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой с добавлением лактозы в соотношении 1:1 и установлен ее количественный состав:
адеметионина – 25,0%; п-толуолсульфокислоты – 11,0%; кислоты серной – 14,0%; лактозы – 50,0%.
Определение предварительных сроков годности полученных солей проводили согласно «Временной инструкции по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода ускоренного старения при повышенной температуре». Предварительный срок годности для соли адеметионина со стеарилтаурином составил 1 год; для соли адеметионина с лаурилсульфокислотой – 1,5 года; для соли адеметионина с хондроитинсульфокислотой - 1 год; для соли адеметионина с серной и птолуолсульфокислотой – 2 года.
На основании проведенных исследований нами разработан проект Фармакопейной статьи предприятия на субстанцию адеметионина с серной и птолуолсульфокислотой. Спецификация представлена в таблице 5.
Таблица 5 - Нормы качества субстанции адеметионина с серной и птолуолсульфокислотой Описание Визуальный Кристаллический порошок белого или почти Подлинность: УФ-спектро- УФ -спектр раствора препарата в области от адеметионин скопия 200 до 300 нм имеет 2 максимума поглощения рH раствора ГФ ХII, От 1,0 до 2,0 (5% водный раствор) Посторонние ТСХ Содержание суммы посторонних примесей не чистота Прозрачность ГФ ХII Должен быть прозрачным (5% водный раствор Цветность ГФ ХII Раствор, полученный для испытания на Количест- УФ-спектро- Содержание адеметионин-иона от 24,25 до венное фотометрия, 26,5% (в пересчете на безводное вещество) определение: метод Содержание п-толуолсульфокислоты от 10,0% адеметионин Фирордта до 12% (в пересчете на безводное вещество) п-толуолсульфокислота с добавлением лактозы в соотношении 1:
«