МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

имени М.В. Ломоносова

На правах рукописи

УДК 577.353.2

КАРПОВА ЛАРИСА ВИКТОРОВНА

Участие -изоформ Na,K-АТPазы в активации

Erk1/2 киназы в нейрональных и подобных им клетках

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Специальность 03.01.04 – биохимия Москва, 2010

Работа выполнена на кафедре биохимии Биологического факультета МГУ имени М.В.

Ломоносова

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Болдырев Александр Александрович

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор Гривенников Игорь Анатольевич Доктор физико-математических наук, профессор Твердислов Всеволод Александрович

Ведущая организация: Биолого-почвенный факультет Санкт-Петербургского государственного университета

Защита состоится 24 мая 2010 г. в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском государственном университете имени М.В.

Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Биологический факультет, Большая биологическая аудитория (ББА).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан _ 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, Кандидат биологических наук М.В. Медведева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Представления о роли облигатного мембранного белка Na,K-АТPазы (синоним Na-насос) в жизни животной клетки помимо выполнения основной функции поддержание ионных градиентов Na+ и К+, в настоящее время дополнились фактами, свидетельствующими об участии этого белка в процессах клеточной сигнализации. Было показано, что Na,K-АТPаза может выступать в роли рецептора кардиотонических стероидов, связывание которых с Na,K-ATPазой приводит к инициации сигнального каскада, завершающегося активацией транскрипционных факторов, регулирующих гены раннего и позднего ответов (Kometiani et al, 1998; Xie et al, 1999; Peng et al, 2006).

Исследование сигнального каскада с участием Na,K-ATPазы проводилось преимущественно на кардиомиоцитах и клетках почечного эпителия, где присутствуют (почечный эпителий, кардиомиоциты) и 2 изоформы (кардиомиоциты) Na,K-ATPазы (Xie, Askari, 2002; Aizman, Aperia, 2003; Akimova et al, 2005), различающиеся по чувствительности к переносимым ионам Na+ и К+, АТФ (Mobasheri et al, 2000) и активным формам кислорода (АФК) (Huang et al, 1994; Boldyrev et al, 2003), а у некоторых животных - и по чувствительности к кардиотоническим стероидам (Charlemagne et al, 1993).

Наиболее интересным, на наш взгляд, является исследование участия Na-насоса в сигнальных каскадах нейрональных клеток, поскольку Na,K-АТPаза имеет особое значение для функционирования нервной ткани. В тканях мозга Na,K-АТPаза представлена 1, 2 и 3 изоформами, причем 2 типична преимущественно для глиальных клеток, а 3 – для нейронов (Urayama et al, 1989; McGrail et al, 1991; Peng et al, 1997). Показано, что мутация 3 изоформы Na,K-ATPазы сопряжена с развитием нейрональных заболеваний, таких как паркинсонизм и семейная гемиплегическая мигрень II типа (Aguiar et al, 2004); а 2 изоформа отвественна за повышение кровяного давления, в результате накопления уабаина в кровеном русле после продолжительного введение уабаина в организм (Dostanic et al, 2005; Van Huysse, 2007). Другая особенность нервной ткани – это разнообразие глутаматных рецепторов, нарушение функций которых приводит к развитию окислительного стресса и, как следствие, к развитию ряда нейродегенеративных заболеваний (Boldyrev et al, 2004). Наиболее важными для этих процессов являются глутаматные рецепторы, активирумые N-метил-D-аспартатом (NMDA). Более того, было показано, что низкие концентрации уабаина оказывают нейропротекторное действие и предотвращают развитие апоптоза клеток нервной ткани, вызванное действием каиновой кислоты (агонист глутаматных рецепторов) (Golden et al, 2006).

В этом отношении возникает оправданный вопрос, существует ли взаимодействие между этими белками – Na,K-ATPaзой и глутаматными рецепторами. Показано, что гиперактивация NMDA-рецепторов, относящихся к классу ионотропных глутаматных рецепторов, приводит к снижению активности только 2 и 3, но не 1 изоформы Na,KATPазы в гранулярных клетках мозжечка (Boldyrev et al, 2003). Нельзя исключить и обратного влияния – Na,K-ATPазы на активность глутаматных рецепторов.

В данной работе мы предполагали исследовать внутриклеточные события, к которым приводит ингибирующее действие уабаина на работу Na,K-АТPазы в нейрональных клетках, а также определить роль разных изоформ Na,K-ATPазы в осуществлении этих событий. Поскольку известно, что в других типах клеток действие уабаина приводит к активации митоген-зависимого сигнального каскада, мы сконцентрировали наши исследования впервую очередь на участниках именно этого сигнального каскада. Кроме того, мы предполагали оценить вовлечение глутаматных рецепторов NMDA-класса в процесс активации сигнального каскада, вызванного действием уабаина на нейрональные клетки.

Цель и задачи работы Целью данной работы явилась оценка участия разных изоформ -субъединицы Na,K-ATPазы в реализации возможного сигнального каскада, активирующегося в нейрональных и подобных им клетках, при действии уабаина. Для выполнения этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Исследовать активацию Erk1/2 киназы, центрального белка митоген-активируемого сигнального каскада, в нейрональных клетках при действии различных концентраций уабаина 2. Выявить зависимость активации Erk1/2 киназы от свободных радикалов и концентрации внутри- и внеклеточного Ca2+ при действии уабаина в нейрональных 3. Выявить участие различных протеинкиназ в активации Erk1/2 киназы в нейрональных клетках 4. Создать клетки с раздельным подавлением в них экспрессии 1 и 3 изоформ Na,KATPазы 5. Оценить жизнеспособность клеток, в которых подавлена экспрессия 1 или изоформы Na,K-ATPазы при действии уабаина 6. Сравнить активацию уабаином Erk1/2 киназы в клетках с подавленной экспрессией 1 или 3 изоформы Na,K-ATPазы Научная и практическая новизна Впервые показано, что в активации Erk1/2 киназы, вызванной ингибированием Na,K-ATPазы уабаином в нейрональных клетках, принимают участие NMDA-рецепторы.

Впервые были созданы разные типы клеток нейробластомы SK-N-AS, в которых осуществляется раздельное подавление экспрессии преимущественно 1 или 3 изоформы Na,K-ATPазы с помощью механизма РНК-интерференции и охарактеризовано действие уабаина на их жизнеспособность. Обнаружено, что удаление любой из исследованных изоформ Na,K-ATPазы приводит к гибели клеток. Это указывает, что в условиях активации сигнального каскада, вызванного ингибирующим действием уабаина на работу Na,K-AТPазы, ни одна из исследованных изоформ Na,K-АТPазы не способна компенсировать отсутствие другой. Исследование клеток нейробластомы SK-N-AS с подавленной экспрессией 3 изоформы Na,K-ATPазы, показало непосредственное участие этой изоформы в активации Erk1/2 киназы, что отражает сигнальную роль 3 изоформы в этих клетках и указывает на функциональные различия изоформ субъединицы фермента. Полученные данные о сигнальной роли 3 изоформы в клетках могут стать основой для уточнения молекулярных механизмов различных нейродегенеративных заболеваний, поскольку известно, что их развитие сопряжено с наличием мутаций в гене 3 изоформы Na,K-ATPазы (Vanmolkot et al, 2003; de Carvalho Aguiar et al, 2004).

Апробация работы и публикации Результаты диссертационной работы были представлены на VII Международной конференции по АТPазам, связанным с различной клеточной активностью (Киренчестер, Англия, 2007), XII Международной конференции по АТPазам P-типа (Орхус, Дания, 2008), II Международном семинаре по исследованию экспрессии, структуры и функции мембранных белков (Флоренция, Италия, 2009). Диссертация апробирована на заседании кафедры биохимии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (2010 г). По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, среди которых 2 статьи в изданиях, входящих в список ВАК РФ.

Структура и объем диссертации Работа изложена на 113 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц и рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 194 отечественных и зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования Исследования особенностей сигнального каскада, активирующегося в нейрональных клетках при действии уабаина, осуществляли в гранулярных клетках мозжечка. Суспензию клеток выделяли из мозжечка 9-12 дневных крыс. В суспензии гранулярных клеток мозжечка одновременно присутствуют нейроны, экспрессирующие 1 и 3 изоформы, и глиальные клетки, экспрессирующие 1 и 2 изоформы Na,KATPазы (Казей, 2006). Высокочувствительными к уабаину являются 2 и 3 изоформы, а 1 изоформа Na,K-ATPазы резистентна к этому сердечному гликозиду (Marks, Seeds, 1978). Изменение уровня Са2+, свободных радикалов и активацию Erk1/2 киназы после действия различных концентраций уабаина оценивали в нейрональных клетках, присутствующих в суспензии гранулярных клеток мозжечка, методом проточной цитометрии, позволяющим избирательно анализировать различные популяции клеток.

Первичную культуру гранулярных клеток мозжечка, в которой предварительно подавляли пролиферацию глиальных клеток, использовали для определения способности уабаина вызывать апоптотическую гибель нейрональных клеток.

Изучение роли разных изоформ субъединицы Na,K-ATPазы в сигнальном каскаде, опосредованном действием уабаина, осуществляли в клетках нейробластомы человека SK-N-AS.

Культивирование клеток Получение первичной культуры гранулярных клеток мозжечка крыс осуществляли в стерильных условиях с использованием 0,02% раствора трипсин-ЭДТА, для разрушения межнейронных контактов. Выделенные клетки культивировали в среде NBM (Neurobasal Medium) (Gibco, США), содержащей 2% Supplement B-27 (Gibco, США), 0,5 мM GlutaMax (Gibco, США), 100 U/мл смеси пенициллин/стрептомицин (Gibco, США) и 20 мM KCl (Sigma, CША) в 24-луночных планшетах после преинкубации с 10 µг/мл поли-D-лизином (Sigma, США), применяемым для улучшения адгезии клеток на поверхности лунок.

Условия культивации стандартные (37°С, 5% СО2, относительная влажность 98%). На 3- сутки культивирования в среду инкубации добавляли 5 µМ арабинозинмоноцитозида (Sigma, США) для остановки пролиферации глиальных клеток.

Культивирование клеток нейробластомы SK-N-AS осуществляли в среде DMEM (Dulbecco’s modified Eagle Medium) (PromoCell, Германия), содержащей 10% эмбриональной сыворотки телят (PromoCell, Германия) и 100 ед/мл смеси пенициллина и стрептомицина (Pen/Strep) (PromoCell, Германия). Культивирование осуществляли в чашках Петри (диаметр 10 см) или 6-луночных планшетах при температуре 37°С, 5% СО и относительной влажности 98%.

Проточная цитометрия Данным методом проводили детекцию уровня Са2+, свободных радикалов, активации (фосфорилирования) Erk1/2 киназы, а также тип клеточной смерти. При соответствующие нейронам, таким образом действие низкой концентраций уабаина, относилось к ингибированию высокочувствительной 3 изоформы Na,K-ATPазы.

Для измерения уровня Са2+ использовали флуоресцентный зонд Fluo-3-AM (пентаацетоксиметиловый эфир [2-амино-5-(2,7-дихлор-6-гидрокси-3-оксо-9ксантенил)фенокси]-2-(2-амино-5-метилфенокси)этан-N,N,N',N'-тетрауксусная кислоты) (Calbiochem, Германия) (ex = 488 нм, em = 530 нм). Концентрация Fluo-3-AM составляла 20 µМ. Уровень свободных радикалов оценивали с помощью DCFН2-DA (2,7дихлордигидрофлуоресцеин-диацетат) (Invitrogen, Германия) (ex = 485 нм, em = нм). Концентрация DCFН2-DA составляла 100 µМ. Определение доли мертвых клеток в исследуемой популяции проводили по окраске клеток йодидом пропидия (PI) (Sigma, США) (ex = 485 нм, em = 610 нм). Концентрация PI составляла 10 µМ.

Для детекции типа клеточной смерти использовали набор «TACSTM Annexin V-FITC apoptosis detection kit» (Molecular Probes, США). Измерение активации Erk1/2 киназы осуществляли с помощью моноклональных антител к суммарному (или общему) белку Erk1/2 и фосфорилированному белку Erk1/2 киназы согласно протоколу производителя.

Разведение антител соответствовало рекомендованному значению протокола производителя и составляло 1:100. Для окрашивания связавшихся первичных антител использовали ФИТЦ-коньюгат вторичных антител (1:1000) (Alexa Fluor® 488, США).

Измерения проводили на приборе «EPICS XL» (Beckman Coulter, США), оснащенном аргоновым лазером с длиной волны возбуждения 488 нм. В каждом измерении регистрировали 10000 событий (клеток). Результаты анализировали с помощью программы «WinMDI 2.7» (Scripps Institute, La Jolla, USA). С помощью данной программы оценивали распределение в популяциях клеток интенсивности флуоресценции в красной и зеленой областях и получали среднее значение флуоресценции (или медиану флуоресценции).

Подавление биосинтеза мРНК субъединицы Na,K-ATPазы Изменение биосинтеза мРНК 1 и 3 изоформ Na,K-ATPазы в клетках нейробластомы SK-N-AS осуществляли с помощью малых интерферирующих РНК (сиРНК). Концентрация сиРНК для 1 и 3 изоформ Na,K-ATPазы составляла 100 нМ.

Для доставки сиРНК в клетки использовали липосомную трансфекцию с помощью липофектамина-2000.

ОТ-ПЦР мРНК выделяли с помощью набора «QIAGEN RNeasy Mini Kit» (Qiagen, Германия).

ОТ-ПЦР проводили с праймерами, специфичными к 1, 2 и 3 изоформам Na,K-ATPазы и NR1, NR2A, NR2B, NR2C и NR2D субъединицам NMDA-рецепторов с помощью набора «QIAGEN OneStep RT-PCR Kit» (Qiagen, Германия) и прибора «MasterCycler Gradient»

(Eppendorf, Германия).

Конфокальная микроскопия Для визуализации белка 1 и 3 изоформ Na,K-ATPазы после липосомной трансфекции сиРНК клетки нейробластомы SK-N-AS раздельно окрашивали антителами на 1 и 3 изоформы Na,K-ATPазы согласно протоколу производителя (Santa Cruz Biotechnology, США). В качестве вторичных антител использовали антитела, конъюгированные с ФИТЦ (Alexa Fluor® 488, США). Получение изображения проводили на конфокальном микроскопе «Leica TCS SPE», объектив 63х.

Вестерн-блоттинг Данным методом проводили оценку активации (фосфорилирования) различных белков, участников сигнальных каскадов, при действии уабаина на клетки нейробластомы SK-N-AS. Первичные антитела использовали в разведении, указанном в протоколе производителя (Cell Signaling Technology, Германия). Связывание первичных антител детектировали методом усиленной хемилюминесценции (ECL) с помощью набора «Amersham™ ECL Plus Western Blotting Detection Reagents» (GE Healthcare Life Sciences, Германия).

Оценка жизнеспособности клеток (MTT-тест) Изменение количества живых клеток нейробластомы SK-N-AS до и после подавления экспрессии 1 и 3 изоформ Na,K-ATPазы проводили с помощью МТТ (3диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид) (AppliChem, Германия).

Концентрация MTT составляла 0,5 мг/мл. Оптическую плотность формазана, образовавшегося в живых клетках, определяли при 540 нм с помощью «Labsystems iEMS Reader MF». Для работы с прибором использовали программу «Genesis».

Статистическая обработка результатов «GraphPadPrism4». Достоверную значимость отличий в данных, полученных методом вестерн-блоттинг, проверяли с помощью одностороннего непараметрического критерия Манна-Уитни и критерия Дунетта. Для статистической обработки результатов, полученных методом проточной цитометрии, использовали критерий СмирноваКолмогорова (коэффициент D/S(n), который отражает достоверность различий двух гистограмм), а для результатов остальных экспериментов - t-критерий Стьюдента.

Данные, полученные методом МТТ-теста, анализировали методом «One-Way ANOVA» с поправкой Дуннета, проводя сопоставление всех данных по отношению к контролю.