На правах рукописи

ЧУБИНСКИЙ-НАДЕЖДИН

Владислав Игоревич

РОЛЬ МЕМБРАННОГО ХОЛЕСТЕРИНА В РЕГУЛЯЦИИ

МЕХАНОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ИОННЫХ КАНАЛОВ И АКТИНОВОГО

ЦИТОСКЕЛЕТА

03.03.04 – Клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии Российской академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук Елена Алексеевна Морачевская Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Сергей Михайлович Антонов Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург доктор биологических наук Ирина Акивовна Гамалей Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии им. И.П.Павлова РАН, Санкт-Петербург

Защита состоится «14» декабря 2012 года в 12 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.230.01 на базе Института цитологии РАН по адресу:

194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. Сайт института: www.cytspb.rssi.ru Адрес электронной почты института: [email protected] Факс института (812)297-03-

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН Реферат разослан «_» ноября 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.В.Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования Механозависимые процессы являются неотъемлемой составляющей жизнедеятельности клетки, как в норме, так и при различных патологиях. Изучение молекулярной природы механочувствительности занимает важное место в решении проблем современной клеточной биологии. В механотрансдукции ключевую роль играют ионные каналы плазматической мембраны, реагирующие на изменение ее механического статуса Такие каналы называют механоуправляемыми [1].

или механочувствительными, они чрезвычайно широко (mechanogated) распространены в живой природе и, в то же время, остаются наименее изученными.

Один из центральных вопросов регуляции механочувствительных каналов в клетках эукариот – исследование вклада липидного бислоя и актинового цитоскелета.

Анализ функциональных взаимосвязей ионных каналов с липидным окружением и структурами цитоскелета необходим для выяснения физиологических путей их активации в нативных клетках.

Холестерин (холестерол) — это один из основных липидных компонентов плазматической мембраны клеток млекопитающих. Известно, что динамические параметры липидного бислоя зависят от состава и концентрации стеролов [2, 3].

Традиционно присутствие стеролов в клеточных мембранах связывали, прежде всего, с их механическими свойствами. Однако за последние десятилетия возникло новое понимание роли липидов в жизнедеятельности клеток, сформировались новые концепции и гипотезы относительно организации клеточных мембран. Согласно современным представлениям, принципиальной особенностью их структурнофункциональной организации является латеральная гетерогенность бислоя, зависящая, в первую очередь, от липидного состава. Уровень мембранного холестерина имеет определяющее значение для структуры и целостности липидных микродоменов (рафтов), участков, характеризующихся более плотной упаковкой, повышенным содержанием холестерина, сфинголипидов и насыщенных жирнокислотных остатков [4-6].

Высказываются многочисленные гипотезы о роли холестерина и рафтов в передаче сигнала с поверхности мембраны к внутриклеточным структурам и, в частности, в процессах реорганизации и динамики актинового цитоскелета.

Первоначально рафты рассматривались как некие «фокальные точки», обеспечивающие связь мембраны с кортикальными микрофиламентами [4, 7, 8].

При этом предполагалось, что деструкция рафтов при частичной экстракции холестерина (cholesterol depletion) приводит к разобщению плазматической мембраны и цитоскелета и сопровождается повышением ее деформируемости.

Однако, как показали дальнейшие исследования, в том числе анализ изменений механических свойств комплекса «мембрана–цитоскелет» при варьировании уровня стеролов [9-11], такая точка зрения является весьма упрощенной. Пока остаются открытыми вопросы о связи динамики липидных рафтов и примембранного актина.

Нарушения структуры рафтов, по-видимому, могут инициировать различные процессы реорганизации цитоскелета, включая сборку микрофиламентов [12].

Таким образом, до недавнего времени регуляторная роль холестерина в составе клеточных мембран оставалась недооцененной и неясной. В настоящее время проблемы участия холестерина и рафтов в процессах механотрансдукции в живых клетках приобретают особую актуальность и значимость. В мировой науке эта новая область молекулярной физиологии начинает интенсивно разрабатываться, поскольку представляет интерес с точки зрения как фундаментальных проблем клеточной сигнализации, так и новых направлений клеточной медицины. Ряд данных указывает на связь клеточной механотрансдукции и опухолевой механочувствительных каналов и липидных рафтов в сигнальных процессах, связанных с адгезией и миграцией клеток [14-15]. Все сказанное определило основные задачи данной работы, направленной на выявление функционального вклада мембранного холестерина в механозависимые реакции живой клетки.

Цель работы – выяснение роли мембранного холестерина и липидных микродоменов (рафтов) в регуляции механочувствительных ионных каналов и актинового цитоскелета.

В связи с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Сопоставить эффекты акцептора стеролов метил-бета-циклодекстрина и его механочувствительных каналов плазматической мембраны.

2. С помощью атомно-силовой микроскопии выявить влияние экстракции холестерина на механические свойства клеток.

3. Оценить изменения липидного бислоя и рафтов в плазматической мембране клеток с пониженным содержанием холестерина.

4. Выяснить, чем обусловлено подавление механозависимой активации каналов после экстракции мембранного холестерина.

5. Определить, как влияет снижение холестерина и разрушение липидных рафтов на организацию актинового цитоскелета.

Разрушение липидных микродоменов после экстракции мембранного холестерина приводит к повышению жесткости плазматической мембраны клеток лейкемии человека и ингибирует активацию механочувствительных каналов.

механочувствительных каналов в клетках с пониженным содержанием холестерина.

Участие мембранного холестерина и рафтов в процессах клеточной механотрансдукции и регуляции ионных каналов опосредовано реорганизацией актинового цитоскелета.

Экстракция мембранного холестерина и разрушение липидных микродоменов может приводить как к сборке, так и к разборке актинового цитоскелета.

Направление перестроек системы микрофиламентов определяется степенью развития актиновых структур, а именно, соотношением глобулярной и фибриллярной форм актина в клетке.

Впервые получены данные о роли холестерина и липидных микродоменов в регуляции механочувствительных каналов и организации цитоскелета. Установлено, что частичная экстракция мембранного холестерина и разрушение рафтов приводит к подавлению механозависимой активации ионных токов. С помощью метода атомно-силовой микроскопии исследована зависимость механических свойств живых клеток от содержания холестерина. Впервые показано, что ингибирование механочувствительных каналов и повышение жесткости клеток после снижения уровня холестерина обусловлено реорганизацией актиновой сети, инициированной разрушением липидных микродоменов. Выявлено нарушение структуры рафтов при снижении уровня холестерина в различных типах клеток. Обнаружено, что влияние холестерина и рафтов на актиновый цитоскелет зависит от исходного состояния сети микрофиламентов. Впервые показано, что холестерин-зависимые перестройки цитоскелета определяются балансом глобулярного и фибриллярного актина в клетке. Результаты демонстрируют новую роль мембранного холестерина в регуляции ионных каналов и клеточной механотрансдукции.

Все экспериментальные процедуры и обработка результатов выполнены автором лично. Измерения жесткости клеток были проведены на атомно-силовом микроскопе NTegra Aura в Физико-техническом институте им. А.Ф. Иоффе РАН.

Материалы, вошедшие в представленную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научным руководителем.

Теоретическое и практическое значение работы Полученные данные существенны для понимания роли холестерина и липидных рафтов в модуляции мембранных функций клеток. Выявление физиологических механизмов регуляции механочувствительных каналов важно для понимания феномена механотрансдукции на уровне клеток и тканей.

Фундаментальное значение имеет анализ взаимосвязей мембраны и цитоскелета как ключевого звена в передаче сигнала. Исследование действия модификаторов липидного состава, в том числе циклодекстринов, представляет интерес как для разработки новых препаратов противоопухолевой терапии, так и для анализа плейотропных эффектов статинов – веществ, широко используемых для коррекции липидного профиля. Результаты демонстрируют принципиальные различия клеточных и модельных мембран и ограничения в применимости последних при исследовании регуляции каналов и роли мембранных липидов. Данные могут быть использованы в курсах лекций по физиологии, биофизике и клеточной биологии.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ (3 статьи и 7 тезисов) в отечественных и зарубежных рецензируемых изданиях.

Материалы работы доложены и обсуждены на конференциях «Неделя науки СПбГПУ» (Санкт-Петербург, 2008, 2009), конференции Европейского общества молекулярной биологии (Сан-Фелю, 2010), конференции «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2011), I Всероссийской конференции "Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет" (Санкт-Петербург, 2011), международном симпозиуме «Нобелевские каналы» (Наймеген, 2011), III Конференции молодых ученых ИНЦ РАН (Санкт-Петербург, 2012), III съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2012), на семинарах ИНЦ РАН.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего ссылок. Диссертация изложена на страницах и иллюстрирована 1 таблицей и рисунками.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проекты 08-04-00574, 12-04Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», Правительства Санкт-Петербурга.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточные культуры. Клеточные линии получены из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург). Клетки миелоидной лейкемии человека К562 культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки и 80 мкг/мл гентамицина.

Перед началом экспериментов клетки высевали на покровные стекла, покрытые поли-L-лизином. Эмбриональные фибробласты мыши линий BALB/3T3, 3T3BSV40, клетки HEK293 культивировали на среде DMEM с добавлением 10 % сыворотки. Для снижения уровня мембранного холестерина использовали метилбета-циклодекстрин (МбЦД) – циклический олигосахарид, являющийся селективным акцептором стеролов. Для снижения содержания холестерина клетки инкубировали с МбЦД в среде без добавления сыворотки в течение 1 ч (37 °С, 5 % СО2).

Регистрация ионных токов. С помощью метода локальной фиксации потенциала (patch-clamp) регистрировали ионные токи через одиночные каналы в участке плазматической мембраны нативной клетки (вариант cell-attached) или в изолированном мембранном фрагменте (inside-out). Для исследования механозависимых токов использовали известный способ механической стимуляции участка клеточной мембраны, который состоял в натяжении мембраны посредством